Summary
Этот протокол демонстрирует методы, позволяющие расширенную культуру in vitro ксенотрансплантатов пациентов (PDX). Один из шагов повышает общую жизнеспособность многоклеточных кластерных культур в 3D гидрогелях, путем прямого удаления не жизнеспособных одиночных клеток. Вторичный шаг демонстрирует лучшие практики для культуры PDX в перфлитированных микрофлюидных платформ.
Abstract
Ксенотрансплантаты пациентов (PDX), генерируемые при ресектировании опухолевой ткани пациента, присвякаются непосредственно в иммунокомпромиссных мышей, остаются биологически стабильными, тем самым сохраняя молекулярные, генетические и гистологические особенности, а также неоднородность первоначальной опухоли. Однако использование этих моделей для проведения множества экспериментов, включая скрининг на наркотики, является непомерно высоким как с точки зрения затрат, так и с точки зрения времени. Трехмерные (3D) системы культуры широко рассматриваются как платформы, в которых раковые клетки сохраняют свою биологическую целостность посредством биохимических взаимодействий, морфологии и архитектуры. Наша команда имеет большой опыт культивирования клеток PDX in vitro с использованием 3D матриц, состоящих из гиалуроновой кислоты (HA). Для того, чтобы отделить мышь фибробластов стромальных клеток, связанных с PDXs, мы используем культуру вращения, где стромальные клетки придерживаются поверхности ткани культуры обработанных пластин в то время как диссоциированные клетки опухоли PDX плавать и самостоятельно ассоциировать в многоклеточных кластеров. Кроме того, плавающие в supernatant являются одними, часто мертвые клетки, которые представляют собой проблему в сборе жизнеспособных кластеров PDX для инкапсуляции вниз по течению в гидрогели для 3D-клеточной культуры. Для того, чтобы отделить эти одиночные клетки от живых клеточных кластеров, мы использовали градиентную центрифугирование плотности. Описанный здесь протокол допускает истощение не жизнеспособных одиночных клеток из здоровой популяции клеточных кластеров, которые будут использоваться для дальнейших экспериментов в пробирке. В наших исследованиях мы включаем 3D-культуры в микрофлюидные пластины, которые позволяют перфузии средств массовой информации во время культуры. После оценки результатных культур с использованием флуоресцентного изображения на основе анализа жизнеспособности очищенных по сравнению с неочищенные клетки, наши результаты показывают, что этот дополнительный шаг разделения существенно сократили число нежизнеспособных клеток из наших культур.
Introduction
За последнее десятилетие, область исследований рака продемонстрировала новый энтузиазм для пациентов, полученных ксенотрансплантатов (PDXs) в качестве инструмента для оценки рака клеток пути опоры и лекарственнойвосприимчивости 1. Наиболее распространенные модели PDX устанавливаются подкожной или ортопедической имплантацией опухолевых клеток человека – фрагментом опухоли, скоплением диссоциированных опухолевых клеток или образцом изолированных циркулирующих опухолевых клеток (КТК) — в хозяина грызунов. Если опухоль "взять" успешно, ксенотрансплантат клетки будут размножаться, васкуляризации, и в противном случае взаимодействовать с принимающей ткани для создания опухоли, которые могут быть собраны при оптимальном размере, подразделяется, и повторно имплантированы в других хозяев. Среди их многочисленных преимуществ в качестве модели системы, PDXs обычно сохраняют значительную часть неоднородности популяции опухолевых клеток и позволяют оценить человека конкретных путей и клеточныхреакций 2,3. Контекст in vivo позволяет взаимодействие опухоли с сосудами и другими смежными стромами и резюмирует характеристики тканей, такие как динамика диффузии наркотиков, кислородное напряжение и внеклеточное матричное влияние, которое биологически и механически влияет на прогрессирование опухоли. Негативным аспектом PDX является их зависимость от грызунов хозяина, как для расширения опухоли и в конечном итоге для тестирования гипотез. Поскольку многие PDX не могут адаптироваться к традиционной двумерной (2D) культуре тканей полистирола, не теряя при этом многих из своих желательных характеристик, существует минимальная середина для исследователей между этим относительно контролируемым методом in vitro, и значительным увеличением расходов, средств и требований времени для использования in vivo PDX.
Мы описали несколько моделей in vitro, которые реализуют культуру 3D клеток в рамках поддерживающей матрицы, а недавно расширили эту работу, чтобы продемонстрировать культуру ex vivo множественного рака простаты (PCa) полученных PDXs, как в одиночку, так и в совместной культуре с костным мозгом полученныхфибробластов 4,5. Гиалуроновая кислота (HA) на основе гидрогеля матрицы обеспечивают настраиваемую и биологически релевантную поддержку для обоих типов клеток, с поверхностным контролем над характеристиками гидрогеля и оптической ясности для визуализации через гидрогельглубины 6.
Зрелые опухолевые ткани PDX состоят из переменной смеси неоднородных раковых клеток человека и стромы мыши (фибробласты, эндотелиальные клетки и т.д.). Для изучения клеточного типа конкретных вкладов в прогрессирование опухоли в пробирке, это может быть выгодно, чтобы отделить опухоли, отделить популяции клеток, и экспериментально включить их в организованном порядке, чтобы вскрыть пути межклеточной связи. Смешанные популяции клеток в тканях дигестатов имеют дифференциальную совместимость с конкретными культурными условиями. Например, связанная с опухолью фибробластная жизнеспособность требует либо поверхностного присоединения, либо 3D матриц, функционируют с лигандами интегрина, в то время как эпителиальные клетки PDX обычно не имеют этих требований, вместо этого отдающих предпочтение взаимодействиям клеток и клеток. Эти различия могут быть использованы для достижения эффективного отделения клеток PDX от загрязняющих мыши стромальных клеток. Культура вращения тканей дигеста позволяет стромальной клеточной приверженности поверхности культуры тканей в то время как клеточные спайки диск PDX клетки, плавающие над вращающейся поверхностью культуры, чтобы сформировать многоклеточные кластеры в супернатант в 24-48 ч. Специфические характеристики этих скоплений варьируются в зависимости от PDX (например, большие, плотные, высокосферические кластеры или меньшие, более свободные агрегаты, напоминающие гроздь винограда), но, как правило, имеют биологически релевантные размеры (диаметр 50–250 мкм), достаточные для оценки клеточных взаимодействий, которые опираются на межклеточные контакты.
Поиск и обработка опухолей неизбежно приводит к определенной степени сопутствующей гибели клеток либо из-за кратковременного повреждения в результате механических/энзиматических нарушений, либо к длительной несовместимости субпопуляций с выбранными культурными условиями. Несмотря на полезность культуры вращения как первоначального массового разделения, мертвые или умирающие клетки неизбежно передаются с кластерами PDX и могут влиять на связанную с этим культуру. Эти мертвые клетки часто являются отдельными клетками PDX, которые не были интегрированы в кластер, мыши стромальные фибробласты, которые не могут выжить в определенных условиях культуры, или особенно хрупкие эндотелиальные клетки. Такие умирающие клетки могут влиять на экспериментальные результаты "выживших" и могут существенно влиять на количественную оценку, например, с помощью анализов флуоресцентного скрининга жизнеспособности на основе изображений. Чтобы улучшить выбор живых клеток PDX из этого метода, мы адаптировали методы центрифугации с шагами плотности, чтобы легко удалить отдельные мертвые/умирающие клетки из смесей PDX и сохранить преимущественно живые многоклеточные кластеры.
Для повышения изучения результатов PDX полученных кластеров в 3D-культуре, мы использовали микрофлюиды основе перфузии культуры платформы, OrganoPlate (Рисунок 1), который является высокой пропускной способностью орган-на-чипе платформы, которая позволяет для одновременной культуры до 96 отдельных проникнуты, 3D культур на 384-ну микротитер пластины базы (,Рисунок 1A)7.8 В 2-полосной микрофлюидной пластине один чип ткани соединен двумя микрофлюидными каналами(рисунок 1B,гель-канал: красный, перфузионый канал: синий), которые охватывают четыре скважины подряд. Два микрофлюидных канала разделены коротким пластиковым хребтом под названием Phaseguide, который предотвращает переполнение одного канала в соседний соседний канал, и одновременно позволяет без мембраны интерфейс между содержимым геля и перфузииканала 9. Поскольку дно микрофлюидной пластины состоит из микроскопического стекла, культуры можно рассматривать в окне наблюдения через дно пластины со стандартным или автоматизированным микроскопом. Перфузия устанавливается в микрофлюидной пластине с программируемой рокер, используя гравитацию для привода средств массовой информации через микрофлюидные каналы, междускважинами резервуара (рисунок 1C). Перфузионный поток-мимикрирует более тесно recapitulates микроокноронности опухоли, чем статическая культура, что позволяет для включения стресса стрижки и расширение распределения газов и питательных веществ. Преимущества поддержания перфлитой культуры раковых клеток в микрофлюидной пластине ранее были описаны как переплетаются культуры рака молочной железы выставлены оптимальной жизнеспособности по сравнению со статической 3D-культуры тех жеклеток 7.
В настоящем докладе описывается адаптированный метод центрифугирования плотности для изоляции живых многоклеточных кластеров PDX и демонстрируется его полезность в создании 3D культур PDX в пределах перфузируемых микрофлюидных пластин. Поскольку все большее число исследовательских лабораторий ищут методы для облегчения использования PDX, мы ожидаем, что представленные здесь протоколы будут иметь непосредственную полезность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Опухолевая ткань была получена с согласия пациента и в соответствии с утвержденным протоколом Институционального совета по обзору (IRB). Ксенотрансплантаты были имплантированы, выращены и собраны в соответствии с принятым институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся работа должна быть выполнена в стерильном биологическом шкафу безопасности для поддержания стерильности. Все шаги должны проводиться при комнатной температуре, если не указано иное.
1. Подготовка материалов для обработки PDX
- Автоклавы миппы и скальпель ручка или лезвия бритвы.
- Раствор фермента диссоциации оттепели при температуре 4 градусов по Цельсию на ночь или при комнатной температуре в тот же день, что и диссоциация тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Таяние при 37 градусов по Цельсию не рекомендуется, так как это может инактивировать некоторые диссоциации ферментов. - Подготовьте не менее 100 мл среды культуры PDX (модифицированная смесь среднего питательного вещества Eagle Dulbecco F-12 «DMEM-F12» со 100 U/mL пенициллином и стрептомицином и 30% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и не менее 25 мл среды обработки PDX (DMEM-F12 со 100 U/mL пенициллином и стрептомицином и без FBS). Хранить при 4 градусов по Цельсию до готовности к использованию.
2. Диссоциация PDX и первоначальная очистка стромального компонента
- Соберите автоклавную посуду, 70 мкм клеточных ситечкой (2х3), 60 мм круглых тканей культуры посуды (2), 6-хорошо ткани культуры пластины, стерильные 50 мл конической центрифуги трубки, и стерильные 1x фосфат-буферный солевой раствор (PBS). Теплая культура среднего до 37 градусов по Цельсию и позволяют диссоциации фермента раствор прийти к комнатной температуре.
- Когда ткань PDX достигла диаметра 1,0-1,5 см в мышиного хозяина, хирургическим путем удалить опухоль из мыши стандартными средствами (например, под принятой анестезией) и хранить на льду в 50 мл трубки с PDX культурысреды (рисунок 2A). Обработать ткани быстро, через шаги ниже, чтобы максимизировать жизнеспособность клеток, предпочтительно в течение 1'2 ч после сбора урожая.
- Передача опухолевой ткани в предварительно взвешенную стерильную коническую трубку 50 мл. Промыть 6x с 30 мл стерильных PBS для удаления крови и загрязняющих веществ. Удалите как можно больше жидкости и взвесить опухолевые ткани.
- Передача опухолевой ткани в 60 мм круглые ткани культуры блюдо и фарш в 1мм 3 штук с помощью стерильного лезвия бритвы или скальпеля.
- Добавьте 5 мл среды обработки PDX для сбора опухолевой суспензии и перенесите в новую стерильную трубку 50 мл. Промыть культуру блюдо с другой 5 мл PDX обработки среды, а затем с диссоциации фермента раствора (10 мл / г опухоли, по крайней мере 5 мл), добавив все полоскания в 50 мл трубки.
- Инкубировать 20 мин при 37 градусов по Цельсию с нежной тряской. Закружить трубку мягко на полпути через инкубацио время.
- Pipette вверх и вниз мягко с серологическим пипеткой, чтобы разбить сгустки. Фильтр-клетки с 70-метровым ситечком клеток помещаются над новой стерильной трубкой 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться более одного ситечко. - Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин для гранулированных клеток. Удалите супернатант и повторное перерасход в 2-3 мл среды культуры PDX. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
- Используйте таблицу 1 для оценки необходимого количества диссоциированных клеток, полученных из PDX, необходимых для достижения желаемой плотности клеток на чип.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения в таблице 1 предназначены для отправной точки. Фактические значения будут варьироваться в зависимости от жизнеспособности тканей / клеточной и потери клеток от замораживания / восстановления. Опухоли PDX являются отдельными лицами даже в пределах данного типа рака, поэтому эти значения должны быть скорректированы эмпирически. - Из числа, рассчитанного в шаге 2.9, пластина 1'2 x 106 клеток в 5 мл среды культуры PDX на колодец пластины культуры 6-хорошо ткани. Инкубационный (37 градусов по Цельсию, 5% CO2, влажность 95%) для 48 ч с нежной тряской (50-55 об/мин) для содействия образованию кластера(рисунок 2B). После формирования кластера переходите к разделу 3 для центрифугации.
- Cryopreserve неиспользованные клетки PDX от первоначальной диссоциации в 50% FBS - 40% DMEM-F12 - 10% диметилсуфсид (DMSO) или коммерчески доступной среде замораживания первичных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приверженцы мыши стромальных клеток также могут быть извлечены из поверхности пластины ткани, при желании, путем полоскания кратко с культурой среды и расширения стандартными средствами. - Для более позднего использования криоконсервированных опухолевых клеток PDX/мышиной стромы, талых клеток в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин. Подсчитайте и плита в плите культуры 6-хорошо ткани как описано в шаге 2.10 перед продолжать к разделу 3. Увеличьте количество ячеек PDX на 20%, чтобы учесть потери жизнеспособности от криоконсервации.
3. Отделение кластеров, полученных из PDX, на основе градиентной центрифугации от одиночных ячеек
- Приготовьте 20 мл градиентного раствора 100% плотности, тщательно смешивая 18 мл раствора градиентной центрифугации плотности с 2 мл стерильного 10x хэнксового сбалансированного соленого раствора (HBSS) в стерильной конической трубке 50 мл. Сделать 10 мл каждый из 20%, 30%, 40%, и 55% плотность градиентных решений путем разбавления этого 100% раствора с стерильным 1x HBSS и смешивания хорошо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этих объемов достаточно для двух градиентов 15 мл, которые могут быть использованы для размечения 15 х 106 ячеек каждый. При разделении менее 15 х 106 ячеек второй градиент следует использовать в качестве баланса для центрифугации. - Добавьте 3 мл градиентного раствора плотности 55% на дно конической трубки 15 мл. Удерживая трубку под углом, очень осторожно слой 3 мл 40% плотности градиентного раствора на верхней части 55% слоя, медленно распределяя жидкость на угловой стороне трубки, чтобы избежать смешивания слоев. Повторите с градиентом плотности 30%.
- Соберите супернатант культур вращения PDX с помощью серологического пипетки 5 мл, мягко опоясыв поверхность пластины. Центрифуга при 200 x g в течение 2 мин к гранулам.
- Удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в 3 мл градиентного раствора плотности 20% в зависимости от количества градиентов, необходимых для разъединю клеток. Тщательно слой 20% плотность градиентного раствора с клетками на верхней части градиента (ы). Если только с помощью одной градиентной трубки для клеток, верхней баланс градиентной трубки с клеткой, свободной 20% плотность градиентного раствора.
- Крышка трубки и центрифуги в качели ведро ротор центрифуги в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию, 2000 хг , и 0 тормоза.
- После центрифугации будут видны фракции(рисунок 2C). Соберите 2,3 мл фракций в свежие трубы 15 мл. Добавьте 3,4 тома стерильного 1x HBSS к каждой фракции и инвертировать, чтобы тщательно перемешать.
- Центрифуга при 1000 х г в течение 3 мин для гранулированных клеток. Удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в 1-2 мл среды обработки PDX.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособные кластеры ячеек PDX обычно находятся на интерфейсе градиентного решения плотности 40-55%(рисунок 2D)с одиночными мертвыми/умирающими ячейками, накапливаемыми на интерфейсе градиентного решения плотности 20-40% для большинства протестированных PDX. - Удалите небольшую репрезентативную алицитацию (50–100 мкл) для повторной диссоциации с равным объемом раствора фермента диссоциации для оценки количества клеток в кластерной клеточной суспензии. Подсчитайте клетки с гемоцитометром или автоматизированным счетчиком клеток.
4. Гидрогель подготовки и микрофлюидных пластин посева
- Восстановленные гидрогельные растворы HA (тиол-модифицированный HA, HA-SH; тиол-реактивный полиэтиленгликоль диакрилат, PEGDA) в соответствии с инструкциями производителя.
- Используя многоканальный пипетку, добавьте 50 л HBSS ко всем скважинам в столбцах окна наблюдения (колонка 3, 7, 11, 15, 19, 23) 2-полосной микрофлюидной пластины для поддержания влажности культуры и оптимальных условий визуализации.
- Рассчитайте объем клеточной суспензии из раздела 3, необходимого для 50 МКЛ гидрогеля при желаемой плотности клеток (т.е. 5000 клеток/КЛ). Для посева одной микрофлюидной пластины, aliquot рассчитанный объем в каждом из 4 стерильных 1,5 мл центрифуг трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: HA гидрогели имеют фиксированное время для гелеобразования. Отрегулируйте объем гелеобразующих растворов aliquots для эффективности пользователя при диспансеризации, если происходит преждевременное гелеобразование. - Отрегулируйте рН раствора HA-SH до 8.0 с 1 N NaOH непосредственно перед использованием. Выполните тест гелеобразования путем смешивания 40 МКЛ HA-SH с 10 йл PEGDA и мониторинга гелеобразования с течением времени. Гелация обычно начинается через 5-8 минут после смешивания HA-SH с кросслинкером PEGDA.
- Центрифуга клеточной подвески aliquots в течение 2 мин (200 х г, комнатная температура) гранулы клеток. Тщательно удалите супернатантные и повторное течение клеток в соответствующем объеме HA-SH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный гидрогель 4:1 HA-SH:PEGDA решение (по объему), поэтому клетки должны быть повторно использованы в 40 йл HA-SH для 50 йл конечного объема. - Добавьте 10 МКЛ PEGDA к одной алиците клеток в HA. Хорошо перемешайте и подождите 1-3 мин (в зависимости от времени геля от шага 4.4) перед посевом микрофлюидной пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение гелеобразной реакции начала перед посевом помогает свести к минимуму оседание клеток. - Прикрепите наконечник для распределения объемов 1,5 мкл к одному каналу, повторяющего пипетку, и загрузите ячейками в растворе гидрогеля HA. Не забудьте сохранить гидрогель aliquot хорошо смешанные для обеспечения равномерного распределения клеток.
- Чтобы посеять микрофлюидную пластину, выровнять наконечник пипетки перпендикулярно пластине, аккуратно поместив кончик в центр входного геля (колонки 1, 5, 9, 13, 17, 21), чтобы обеспечить контакт, но без давления при дозирования раствора гидрогеля. Работая быстро, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание гидрогеля, обойтись 1,5 мл гель раствора в каждом входе геля.
- Наблюдайте за состоянием заполнения микрофлюидных каналов, просматривая с верхней части пластины, нижней части пластины, или микроскопом, и оценить нагрузку, используя рисунок 3 в качестве руководства (успешная загрузка на рисунке 3A, пипетное позиционирование руководство на рисунке 3B, пропущенная загрузка на рисунке 3C, не заполнены до конца на рисунке 3D, переполнение на рисунке 3E). Определите любые необходимые корректировки в технике, которые могут улучшить успех заполнения для следующего раунда чипов (см. обсуждение советов по устранению неполадок).
- Повторите шаги 4.6-4.9 с оставшимися 3 aliquots ячеек в растворе HA. Инвертировать пластину при подготовке следующего aliquot (1 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мин время ожидания и инверсии пластины улучшить 3D распределение клеток за счет сокращения клеток урегулирования, как гелеобразование происходит. - После того, как все микросхемы будут заполнены, инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию во влажном инкубаторе до тех пор, пока гелеобразование не будет завершено (45 мин).
- Используя предоставленное руководство, убедитесь, что перфузионная рокер установлена в инкубаторе культуры клеток с правильными настройками перфузии (угол 14 градусов, интервалы 4 мин).
- Добавьте 50 МКЛ среды культуры PDX ко всем средним входам (колонки 2, 6, 10, 14, 18, 22) и проверьте, заполнены ли каналы должным образом, перелистыв пластину. Аккуратно коснитесь пластины о поверхность, чтобы стимулировать жидкость для заполнения микрофлюидных каналов.
- Добавьте 50 МКЛ DMEM-F12 (10% FBS) для всех средних точек (колонка 4, 8, 12, 16, 20, 24). Если какие-либо пузырьки воздуха оказались в ловушке в канале перфузии, удалите, осторожно нажав пластины против поверхности.
- Использование микроскопа и формы макета пластины(Дополнительный рисунок 1), запись чип заполнения успеха. Исключите неправильно заполненные чипы из дальнейшего экспериментального использования.
- Поместите пластину на наклонный рокер, установленный на наклон 14 "и 4 мин цикла, чтобы начать перфузии. Заменить PDX культуры среды каждые 2 дня (сначала 50 йл в входе, а затем 50 йл в розетке).
5. Окрашивание клеток, визуализация и количественная оценка изображений
- Подготовьте клеточное решение для анализа жизнеспособности, содержащее три флуоресцентных красителя (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, кальциин ацетоксиметил (AM).
- Подготовка фондовых растворов каждого красителя следующим образом: Hoechst 33342 при 1,6 мМ (1 мг/мл) в деионизированной воде; кальцеин АМ на 4 мм в ангидроусе ДМСО; этидий гомодимер-1 на 2 мМм в ДМСО/Н2O (1:4, в/в).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовый кальцеин AM и этидий гомодимер-1 решения предоставляются в отмеченном комплекте в таблице материалов. - Подготовье единого рабочего решения в среде HBSS или фенола, свободной от фенола, содержащей все три красителя. Оптимизируйте окончательную рабочую концентрацию для каждого типа клетки и матрицы в пределах 1,6–8,0 МКМ для Hoechst 33342, 0,1–10 МКМ для кальцеина AM и 0,1–10 МКм для ethidium homodimer-1.
- Подготовка фондовых растворов каждого красителя следующим образом: Hoechst 33342 при 1,6 мМ (1 мг/мл) в деионизированной воде; кальцеин АМ на 4 мм в ангидроусе ДМСО; этидий гомодимер-1 на 2 мМм в ДМСО/Н2O (1:4, в/в).
- Удалите культурную среду и примените решение для красителя рабочей жизнеспособности к желаемым микрофлюидным чипам (75 МКЛ в входе, 25 л в розетке) и поместите обратно на перфузионную рокер в инкубаторе клеточной культуры на 1 ч.
- Изображение окна наблюдения окрашенных культур с помощью ручного или автоматизированного конфокального микроскопа (Таблица материалов) с флуоресцентными фильтрами (перечисленные как возбуждение / выброс длин волн, в нм) наблюдать все ядра (Hoechst 33342, 350/461), ядра мертвых клеток (ethidium homodimer-1, 528/617) и цитоплазму живых клеток (calcein AM, 494/517).
- Захват 140 мкм-стеки с размером шага ≤1 мкм с помощью 20x воздушной цели. Для изображения всего микроканал с небольшим количеством перекрытия необходимы три поля зрения. Чтобы избежать двойной выборки, изображение только два поля зрения на чип.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия визуализации должны быть оптимизированы для обеспечения надлежащей выборки NyQuist. По опыту авторов, быстрая система визуализации, основанная либо на деконволюции обычного источника эпифлуоресценции, либо в режиме резонансного сканирования на конфокаляции, необходима для полного анализа полного стека, с тремя лазерными цветами, через 96 фишек на пластине в течение разумного периода времени (примерно 3,5 ч с автоматизированной визуализацией, включая установку). - Используя программное обеспечение для анализа изображений, проконсализуйте изображения, полученные с помощью q-stack, для получения желаемых количественных данных, таких как морфология, состояние агрегации или другие функции. Для количественной оценки жизнеспособности клеток подсчитайте количество мертвых клеток (красных) и общих ядер клеток (голубых).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Программируемый перфузионый рокер был подготовлен в стандартном инкубаторе культуры клеток с водяным гнездом, а двухполосные микрофлюидные пластины были подготовлены в стандартном кабинете биобезопасности дляпогрузки (рисунок 1). MDA-PCA-118b PDX опухоль была расширена in vivo, собраны, когда он достиг максимального размера, и разобщены, как описано в протоколе раздел 2 для создания суспензии суспензии клеток, примерно в одноклеточном состоянии(рисунок 2A). Суспензия была обойтись в 6-хорошо ткани культуры пластин, и помещены на XY ротатор, как описано, для 48 ч. Мышь Строма прилагается к нижней части ткани культуры пластины, как было описано ранее, и человеческие клетки PDX остались плавающие в среде, собранные в кластеры (Рисунок 2B). Несогласованные одиночные клетки были видны по всему решению, а также.
Градиент плотности шага был установлен в центрифуге трубки с использованием методов в протоколе раздел 3. Сверхнатантная подвеска клеток PDX мягко аспирировалась с многоусадной пластины, загружалась на градиент шага и центрифугалась, как описано. После центрифугации рядом с интерфейсом между фракциями 2 и 3 была видна туманная полоса, содержащая кластеры PDX, и на стыке между фракциями 1и 2 (рисунок 2D) были определены одиночные ячейки. Фракции были собраны, как описано, разбавленные далее в HBSS, и центрифугированы снова, чтобы удалить градиентный раствор плотности. Супернатант был аспирирован, и в результате клеточные гранулы были повторно использованы в среде обработки PDX. Небольшая алицита каждой обработанной фракции была оценена микроскопом, чтобы подтвердить, что ожидаемая фракция содержит кластер PDX, и что отдельная фракция содержит в основном одиночные клетки.
Решения HA гидрогеля были восстановлены, как описано в протокольной части 4, и кластеры PDX были повторно использованы в растворе гидрогеля. Решения PDX были загружены в чипы на микрофлюидной пластине и оценены для успешной загрузки(рисунок 3). В большинстве случаев, после некоторой практики с техникой и корректировкой объемов загрузки, 90% микросхем были успешно загружены. После загрузки нужного количества микросхем и инкубации для гелеобразования, как описано, среда культуры PDX была добавлена в микрофлюидную пластину, а пластина была обучена перфузией.
Использование флуоресцентных красителей и методов в протоколе раздел 5, и конфокальные микроскопии, 3D микрофлюидных PDX культуры жизнеспособности и морфологии были оценены как в неразлучной и плотности градиентной центрифугации разделенных условиях(рисунок 4A). Изображения этих пластин были записаны в качестве стеков на конфокальных микроскопах и оценивались на жизнеспособность клеток в программном обеспечении для анализа изображений. На 1-й день, те культуры, которые прошли метод разделения выставлены в 10 раз меньше одиночных, мертвых клеток (красный), по сравнению с неразмещенных культур (Рисунок 4B). Важно отметить, что разделенные кластеры в основном состояли из живых клеток (зеленых). Статистически значимой разницы для распределения размера кластера (рисунок4C) выявлено не было.
Культуры также поддерживались в микрофлюидной пластине в течение семи дней(рисунок 5A). Образцы оценивались периодически, используя те же методы визуализации и количественной оценки, что и выше. Общее количество живых клеток оставалось неизменным(рисунок 5B),а кластеры сохраняли жизнеспособность на 80%(рисунок 5C)в течение жизни культуры. Плотность клеток в неразлучном состоянии составляет примерно одну треть от разделенного состояния, потому что одиночные клетки живы во время подсчета клеток, но быстро умирают в гидрогеле. Существует также большая изменчивость в размере кластера без разделения градиента плотности.
Рисунок 1: 2-полосная перфузаемая микрофлюидная пластина. (A)2-полосная микрофлюидная пластина является стандартной 384-ну микротитр пластины с измененным дном, состоящий из микрофлюидных каналов, встроенных между стеклянными пластинами. Каждая пластина состоит из 96 чипов тканей для 3D-клеточной культуры. (B)Если смотреть с верхней части пластины, один 2-полосный микрофлюидный чип состоит из 4 скважин подряд, соединенных гелеобразным каналом (красным) и перфузионом каналом (синий); вход геля, вход перфузии, окно наблюдения, и выход перфузии. (C)Perfusion достигается в микрофлюидной пластине с программируемой рокер, который использует гравитацию для привода средств массовой информации между перфузии вход и выход скважин, которые являются медиа-резервуаров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: изоляция кластера PDX. (A) Вскрыть первичную ткань PDX и разобщить в одноклеточную подвеску, содержащую как клетки PCa человека и мыши опухоли стромы. Либо криопресерв разобщенной клеточной смеси или ( B ) добавитьккультуре вращения отшельник опухолевых клеток и позволяют мыши стромальных клеток придерживаться пластины культуры тканей (48 ч). (C)Используйте центрифугу градиента плотности для удаления остаточных мертвыходиночных ячеек, и (D)собирать жизнеспособные кластеры PDX на стыке между слоями градиента плотности 40% и 55% (красная тиреая коробка). (E)Восстановить PDX кластеров, повторного перерасхода в растворе прекурсора гидрогеля, и обойтись на пластину с повторяющейся пипетки. (F)Пример расчетов, соответствующих таблице 1 , демонстрируют необходимыепервоначальные номера клеток, необходимые для достижения окончательной желаемой концентрации клеток для всех фишек по всей тарелке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Мониторинг загрузки микрофлюидных пластин. Загрузка успеха и ошибок, может быть оценена глазом (в верхней и нижней зрениях), с подтверждением с помощью микроскопа. (A)Успешная загрузка идентифицируется открытой (яркой) полосой перфузии в верхнем и нижнем видах и немного более темной полосой геля в нижнем углу. Визуализация с помощью микроскопа подтверждает, что гель-лейн был полностью заполнен клетками и гелеобразующих, не проливаясь в соседнюю полосу. (B) Мультфильм, демонстрирующий правильное размещение наконечника трубы во время дозирования геля, с правильным размещением чуть выше входного порта (слева) и неправильным размещением, не по центру (в середине) или применением силы к порту входов (справа). (C)Яркие полосы движения во всех видах указывают на пропущенную загрузку, что свидетельствует о том, что наконечник трубы не был правильно помещен в вход геля. (D) Частичное заполнение полосы геля (не заполнены до конца) идентифицируется красной стрелкой, которая показывает, где продвижение гель решение фронт был прерван, либо захваченных пузырь воздуха, или преждевременной паузы в погрузке. Красная стрелка в представлении микроскопа определяет одно и то же местоположение. (E) Содержимое полосы геля переполнило PhaseGuide, выплеснулось в полосу перфузии и в конечном итоге заблокировало ее. Этот перелив виден в нижнем виде темным появлением как гель, так и перфузионых полос. Масштабная планка 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 4: Окрашивание клеток и оценка жизнеспособности микрофлюидной пластины. (A) Использование флуоресцентных пятен, жизнеспособность была оценена в неотделенных и разделенных скоплений клеток PCa посеяны в микрофлюидной пластины (все ядра: Hoechst 33342, синий; мертвые клетки: этидий гомодимер-1, красный; и живые клетки: кальцин AM, зеленый). Шкала бар 50 мкм. (B) Всего мертвых клеток были количественно на 1 день культуры и разделенных MDA-PCa-118b PDX культур продемонстрировали значительное снижение числа мертвых клеток. CC) Количественная оценка размера кластера для PCa PDXs в разделенных и неотлученных культурах показала небольшое увеличение, но не статистически значимую разницу. Бары и бары ошибок в панели B представляют среднее и стандартное отклонение 4 изображения на условие (2 чипа с 2 изображениями/чипом). Звездочка (к) представляет статистически значимые различия (p lt; 0.05) по сравнению с неразмещенным состоянием с помощью т-теста студента. Для коробки и усов участок в панели C, крест значок указывает среднее, и горизонтальная линия представляет медиану, 4 изображения на условие (2 чипа с 2 изображения / чип). Коробка содержит 50% данных, в то время как усы распространяются на минимальный и максимальный диаметр кластера для каждого состояния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Характеристика разделенного MDA-PCa-118b в микрофлюидной пластине. (A) Разделенные (слева) и неразлучные (справа) кластеры раковых клеток PCa были посеяны в микрофлюидной пластине и пронизылись на срок до семи дней. Культуры были окрашены тремя красителями, специфичными для всех ядер (Hoechst 33342, синий), мертвых клеток (этидий гомодимер-1, красный), и живые клетки (кальциин AM, зеленый). Шкала бар No 50 мкм . (B,C) Квантиция количества клеток и жизнеспособности культуры от изображений в течение одной недели культуры при плотности посева 8000 клеток / йл. Бары и ошибки баров представляют собой среднее и стандартное отклонение четырех изображений в состоянии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Окончательная желаемая плотность клеток в одном чипе (клетки/КЛ) | Объем загружен на чип (ОЛ) | Количество фишек на микрофлюидной пластине | Mutiplier для дополнительного объема | Рисунок 2C: Количество разделенных ячеек, необходимых для полной пластины микроуэлла (шаг 3.8) | Мультипликатор для потери клеток (удаление стромы, гибель клеток) |
Рисунок 2B: Начиная с диссоциированных ячеек PDX для протокола (шаг 2.8) |
| 2,500 | 1.5 | 96 | 1.3 | 4.7E-05 | 3 | 1.4E-06 |
| 5,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 9.4E-05 | 3 | 2.8E-06 |
| 10,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 1.9E-06 | 3 | 5,7ЭЗ06 |
| 20,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 3.7E-06 | 3 | 1.1E-07 |
Таблица 1: Приблизительный исходный и окончательный материал PDX, необходимый для загрузки одной 2-полосной микрофлюидной пластины.
Дополнительный рисунок 1: 2-полосная микрофлюидная плита макета. После посева микрофлюидной пластины, запись индивидуального успеха загрузки чипа (успешная, пропущенная загрузка, не заполнены до конца, или переполнения) с помощью 2-полосной плиты макета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем метод обработки и культивирования жизнеспособных опухолевых клеток, полученных PDX, в высокой пропускной способности, пролитой 3D-культуре. Хотя этот протокол использует PCa PDX ткани, он одинаково эффективен для других эпителиальных полученных опухолей. Характеристики опухоли различаются между отдельными линиями PDX даже в пределах одной и той же ткани происхождения (простата, грудь и т.д.). Некоторые линии PCa PDX более фиброзные и трудно изолировать жизнеспособные клетки от в то время как другие более клеточные. Размер опухоли отметил здесь могут быть разнообразны в рамках руководящих принципов МАКУК, чтобы обеспечить больше ткани для особенно низкодоходных опухолей. Кроме того, фрагменты опухоли могут быть собраны после шага 2.7, повторно усваивается, и объединились с первоначальным пищеварением для повышения урожайности. Это особенно полезно для более внеклеточных матричных тяжелых опухолей. Дополнительные раунды пищеварения последние два, как правило, приводят к низкой жизнеспособности и низкой урожайности и не рекомендуется.
Очистка популяций, полученных из PDX, для удаления мертвых/умирающих клеток или загрязнения клеток-хозяй, полезна для расширенной 3D-культуры и количественной оценки желаемых раковых клеток. Первый шаг очищения описано здесь-подвеска культуры в относительно большом объеме средств массовой информации вместе с XY вращения на умеренных скоростях-способствует 1) селективной экстракции высоко адгезии зависимых клеток, как правило, мыши стромальных фибробластов, и 2) формирование клеток агрегатов для снабжения про-выживание клеточного контакта. Эффективность извлечения мышей, полученных хостом, во время шага вращения 48 ч XY очень высока, как описано в Fong et al.5. Преднамеренные PCa-fibroblast co-культуры, безусловно, осуществимы, как мы показали, но требуют настроенной матрицы (для поддержки фибробластовой адгезии к матрице) и большей доли фибробластов. Случайные PDX, как правило, те, с более мезенхимальных характеристик, будет придерживаться более легко поверхностей культуры тканей во время 48-часового шага культуры вращения. Линии PDX должны быть тщательно проверены при первом исполнении этого протокола и иммунотемины для HNA, чтобы определить долю человеческих клеток в популяциях адептов и неприемленных. Неткани культуры обработанные пластины должны быть использованы для формирования кластера с этими PDXs. Мышь стромальных клеток будет по-прежнему придерживаться в конечном итоге на поверхность, но разделение не будет так эффективно.
Следуя культуре вращения, супернатант, содержащий неприемленную популяцию, обрабатывается методом градиентной центрифугации описанной плотности. Протокол, о которых сообщается здесь, может быть упрощен, чтобы исключить хотя бы один шаг плотности (например, используя только 20%, 40% и 55% решений), но все четыре должны быть использованы при создании этого метода с каждым новым PDX. Многоклеточные кластеры легко отделяются от отдельных клеток этим методом и в значительной степени сохраняют свой кластерный фенотип и другие характеристики. Отбрасываемая одноклеточная популяция представляет либо (а) клетки, которые были мертвы/умирали до 48-часового шага вращения и, таким образом, никогда не интегрировались в кластер, либо b) клетки, которые остались в живых после вращения 48 ч, но все еще не интегрировались в кластеры. Важно отметить, что группа b) может включать ячейки, которые некоторые исследователи считают желательными; например, в некоторых докладах описаны первичные клеточные культуры, содержащие ранние стволовые/прародительные клетки, или лекарственно-устойчивые клетки, которые плавают в супернатанте как плохо адепты одиночных клетокнад популяцией 10. Отношение к изучению рака, циркулировать клетки тумора (CTCs), клетки инициируя тумора (TICs), или другие подобные метастаз-продвигая типы клетки смогли быть частью этой одноклеточной населенности. Поэтому исследователи, использующие наш протокол, должны тщательно проанализировать отбрасываемую популяцию одноклеточных клеток, чтобы убедиться, что любые ячейки, представляющие интерес, не были потеряны. В наших руках, подавляющее большинство этих одиночных клеток либо небольшая часть раковых клеток, которые мертвы / умирают из-за первоначального протокола диссоциации тканей, или грызунов фибробластов, которые уже проходят через anoikis.
Настоятельно рекомендуется практиковать технику посева микрофлюидной пластины с менее ценными клетками, чтобы обеспечить успех при работе с ограниченным и ценным материалом PDX. Будьте в курсе размещения чаевых во время дозирования, так как неправильный метод может привести к 1) переполнению, если давление применяется во время загрузки, или 2) пустые или частично заполненные каналы, если наконечник не по центру над портом входов. Преждевременное гелеобразование также приведет к каналам, чтобы не заполнить до конца. Если это происходит, уменьшить время ожидания между добавлением КРОССлинкера PEGDA и дозирования гель решение, или работать с меньшими aliquots гель решение за один раз. Объемы дозирования, используемые в этом протоколе, хорошо оптимизированы для успеха с помощью гидрогелей HA. Использование более вязких решений, таких как Matrigel в этой системе, требует увеличения объема дозирования до 2 мл для правильного заполнения микрофлюидных каналов. Обратите внимание также, что выбор 50 йл шагом 4.3, подготовка четырех клеточных гранул на этом же этапе, и повторные повторы в шаге 4.10 являются преднамеренными; хотя они дают больше материала, чем это необходимо, они также обеспечивают перевес для учета потерь от повторяющейся пипетки.
Следует отметить, что каждый PDX, вероятно, будет иметь уникальную морфологию и распределение размеров в рамках этой 3D-модели культуры. В каком-то смысле это ожидается, в связи с разнообразием болезней пациентов, историей тканей, матричными параметрами и многими другими факторами. Обширная оценка нескольких линий рака простаты в Matrigel продемонстрировала это потенциальное разнообразие11. Тем не менее, исследователи могут быть удивлены, чтобы найти широкое различие в вышеуказанных параметров. В готовясьной рукописи мы представляем широкий взгляд на несколько PDX на этой культурной платформе; клетки поддерживают последовательную реакцию в каждом типе PDX, но могут существенно различаться в зависимости от образцов, в результате чего кластеры, которые, например, большие с высокой плотностью клеток на кластер, или меньше, с более свободными межклеточными соединениями. Специфическое поведение каждого PDX должно быть оценено следователями в течение нескольких испытаний, чтобы подтвердить предсказуемую и характерную морфологию. Исследователи могут ожидать, что образцы будут следовать общему поведению, изложенного в этой статье.
Таким образом, представленный протокол предлагает исследователям новый метод использования PDXs ex vivo на платформе, которая позволяет тонкой настройки условий культуры и включения соответствующих 3D экологических сигналов, таких как ткани конкретных внеклеточной матрицы (ECM) и перфузии потока, что позволяет расширенной выживаемости клеток в течение нескольких дней или недель. Подробная характеристика этих культур была достигнута путем окрашивания и морфологического анализа, продемонстрированого здесь. Кроме того, при необходимости культуры могут быть представлены на основе анализа на основе считывателей пластин, иммунофлуоресцентной маркировки или использованы для подготовки лисатов, позволяющих продать дополнительную молекулярную характеристику. Хотя мы уже публиковали ранее некоторые элементы культуры PDX 3D в гидрогелях, это применение многоступенчатой очистки является новым, простым в использовании в стандартной лаборатории и успешным в сохранении высокой жизнеспособности репрезентативных культур. Платформа OrganoPlate, в ее 2-полосных и 3-полосных сортов, предлагает дальнейшую сложность через свою модель перфузии тканей, и ключевую возможность использовать еще меньше клеток за эксперимент. По сравнению с нашими предыдущими моделями, микрофлюидная платформа снизила требования к клеткам в 30 раз, что является огромным преимуществом, учитывая скудную доступность опухолевой ткани PDX в большинстве лабораторий. Микрофлюидная система позволяет расширенную визуализацию, иммуностепенинг и поверхностную визуализацию по всей популяции клеток, которая достаточно велика (n - 2000-4000 клеток на окно изображения), чтобы позволить количественную оценку фенотипа в контексте пространственной организации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Национального института рака SBIR Фаза I (HHSN26120700015C) и P01CA098912.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
