Forbedret levedygtighed for Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer af patient-afledte Xenografts i en perfunderet microfluidic platform

Summary

Denne protokol demonstrerer metoder til at muliggøre udvidet in vitro-kultur af patientafledte xenografts (PDX). Et skridt øger den samlede levedygtighed af flercellede klyngekulturer i 3D-hydrogels ved simpel fjernelse af ikke-levedygtige enkeltceller. Et sekundært trin demonstrerer bedste praksis for PDX-kultur i en perfunderet mikrofluidisk platform.

Abstract

Patient-afledte xenografts (PDX), genereret, når resected patient tumorvæv er indskrevet direkte i immunkompromitterede mus, forblive biologisk stabil, og dermed bevare molekylære, genetiske, og histologiske træk, samt heterogenitet af den oprindelige tumor. Men ved hjælp af disse modeller til at udføre en lang række eksperimenter, herunder narkotika screening, er uoverkommelige både med hensyn til omkostninger og tid. Tre-dimensionelle (3D) kultursystemer er bredt betragtet som platforme, hvor kræftceller bevarer deres biologiske integritet gennem biokemiske interaktioner, morfologi, og arkitektur. Vores team har stor erfaring med at dyrke PDX-celler in vitro ved hjælp af 3D-matricer, der består af hyaluronsyre (HA). For at adskille musefibroblast stromale celler forbundet med PDX'er, bruger vi rotationskultur, hvor stromale celler klæber til overfladen af vævskulturbehandlede plader, mens dissocierede PDX-tumorceller flyder og forbinder sig selv i flercellede klynger. Også flydende i supernatant er enkelt, ofte døde celler, som udgør en udfordring i indsamlingen levedygtige PDX klynger til downstream indkapsling i hydrogels for 3D-celle kultur. For at adskille disse enkelte celler fra levende celle klynger, har vi ansat densitet trin gradient centrifugering. Den protokol, der er beskrevet her, giver mulighed for udtømning af ikke-levedygtige enkeltceller fra den sunde population af celleklynger, der vil blive brugt til yderligere in vitro-eksperimenter. I vores undersøgelser inkorporerer vi 3D-kulturer i mikrofluidiske plader, som giver mulighed for medieperfusion under kulturen. Efter at have vurderet de resulterende kulturer ved hjælp af en fluorescerende billedbaseret levedygtighedsanalyse af renset versus ikke-rensede celler, viser vores resultater, at dette yderligere adskillelsestrin reducerede antallet af ikke-levedygtige celler fra vores kulturer betydeligt.

Introduction

I løbet af det seneste årti, inden for kræftforskning har vist fornyet begejstring for patient-afledte xenografts (PDXs) som et redskab til vurdering af kræft celle vej afhængighed og narkotika modtagelighed¹. De mest almindelige PDX modeller er etableret ved subkutan eller ortotopisk implantation af menneskelige tumorceller-en tumor fragment, en klynge af dissocierede tumor-afledte celler, eller en prøve af isolerede cirkulerende tumorceller (CTC'er) -i en gnaver vært. Hvis tumoren "tage" er en succes, xenograft celler vil formere sig, vaskularisere, og ellers interagere med værten væv til at skabe en tumor, som kan høstes på en optimal størrelse, opdelt, og re-implanteret i andre værter. Blandt deres mange fordele som model system, PDXs typisk bevare en betydelig del af den indfødte tumor celle befolkningens heterogenitet og muliggøre vurderingen af human-specifikke veje og celle svar^2,3. In vivo-konteksten muliggør tumorinteraktion med vaskulatur og andre tilstødende stroma og opsummerer vævsegenskaber såsom lægemiddeldiffusionsdynamik, iltspænding og ekstracellulær matrix indflydelse, der biologisk og mekanisk påvirker tumorprogression. Et negativt aspekt af PDXs er deres afhængighed af en gnaver vært, både for tumor ekspansion og i sidste ende for hypotese test. Fordi mange PDXs ikke kan tilpasse sig traditionelle to-dimensionelle (2D) kultur på vævskultur polystyren uden at miste mange af deres ønskelige egenskaber, har der været minimal mellemvej for forskere mellem denne relativt kontrollerede in vitro-metode, og den betydelige stigning i bekostning, faciliteter og tidskrav til in vivo PDX brug.

Vi har beskrevet flere in vitro-modeller, der gennemfører 3D-cellekultur inden for en støttende matrix, og for nylig udvidet dette arbejde for at demonstrere ex vivo kultur flere prostatakræft (PCa)-afledte PDXs, både alene og i co-kultur med knoglemarv-afledte fibroblaster^4,5. Hyaluronsyre (HA)-baserede hydrogelmaskrømme giver brugerdefinerbar og biologisk relevant støtte til begge celletyper med letkøbskontrol over hydrogelegenskaber og optisk klarhed for billeddannelse gennem hydrogeldybden⁶.

Ældre PDX tumorvæv omfatter en variabel blanding af heterogene humane kræftceller og mus stroma (fibroblaster, endotelceller, osv.). At studere celle-type specifikke bidrag til tumor progression in vitro, Det kan være en fordel at adskille tumorer, adskille cellepopulationer, og eksperimentelt indarbejde dem på en organiseret måde at dissekere veje intercellulære kommunikation. De blandede cellepopulationer i vævsgravere har differentialkompatibilitet med specifikke kulturbetingelser. For eksempel, tumor-associeret fibroblast levedygtighed kræver enten overflade tilslutning eller 3D matricer funktionaliseret med integrin ligands, mens epitel-afledte PDX celler ikke typisk har disse krav, i stedet favorisere celle-celle interaktioner. Disse forskelle kan udnyttes til at opnå effektiv adskillelse af PDX celler fra forurenende mus stromale celler. Rotationskultur af vævssideestater gør det muligt at danne stromale celletilhold til vævskulturoverfladen, mens cellecellevoksninger driver PDX-celler, der flyder over den roterende kulturoverflade for at danne flercellede klynger i supernatanten i 24-48 h. Disse klyngers særlige karakteristika varierer med PDX (f.eks. store, stramme, meget sfæriske klynger eller mindre, løsere aggregater, der ligner bundter af druer), men er typisk af biologisk relevante størrelser (50-250 μm diameter), der er tilstrækkelige til at vurdere cellulære interaktioner, der er afhængige af intercellulære kontakter.

Tumor hentning og behandling uundgåeligt resulterer i en vis grad af sikkerhedsstillelse celledød, enten på grund af kortsigtede skader fra mekanisk / enzymatisk forstyrrelser, eller langsigtet uforenelighed af delpopulationer med de valgte kulturbetingelser. På trods af nytten af rotation kultur som en indledende bulk adskillelse, døde eller døende celler er uundgåeligt overføres med PDX klynger og kan påvirke den deraf følgende kultur. Disse døde celler er ofte individuelle PDX celler, der ikke var integreret i en klynge, mus stromale fibroblaster, der ikke kan overleve i udvalgte kulturbetingelser, eller særligt skrøbelige endotelceller. Sådanne døende celler kan påvirke eksperimentelle resultater fra "overlevende" og kan i væsentlig grad påvirke kvantificering, f.eks. For at forbedre udvælgelsen af levende PDX-celler fra denne metode tilpassede vi centrifugeringsmetoder med tæthedstrin for nemt at fjerne individuelle døde/døende celler fra PDX-blandinger og bevare overvejende levende flercellede klynger.

For at forbedre studiet af resulterende PDX-afledte klynger i 3D-kultur, vi udnyttede en microfluidics-baserede perfusion kultur platform, OrganoPlate (Figur 1), som er en høj-throughput organ-on-a-chip platform, der giver mulighed for samtidig kultur på op til 96 individuelle perfunderes, 3D kulturer på en 384-godt microtiter plade-base (Figur 1A)^7,8. I den 2-lane mikrofluidic plade, en enkelt væv chip er forbundet med to microfluidic kanaler(Figur 1B,gel kanal: rød, perfusion kanal: blå), som spænder over fire brønde i træk. De to mikrofluidiske kanaler er adskilt af en kort plastik højderyg kaldet en Phaseguide, som forhindrer overløb af en kanal i sin tilstødende nabo kanal, og samtidig giver mulighed for en membran-fri grænseflade mellem indholdet af gel og perfusion kanal⁹. Fordi bunden af mikrofluidic plade er sammensat af mikroskop-grade glas, kan kulturerne ses i observationsvinduet gennem bunden af pladen med en standard eller automatiseret mikroskop. Perfusion er etableret i den mikrofluidiske plade med en programmerbar rocker, ved hjælp af tyngdekraften til at drive medier gennem de mikrofluidiske kanaler, mellem reservoir brønde (Figur 1C). Den perfusion flow-efterligner tættere opsummerer tumor mikromiljø end statisk kultur, giver mulighed for inkorporering af forskydningsstress og forbedret fordeling af gasser og næringsstoffer. Fordelene ved at opretholde en perfunderet kræftcellekultur i mikrofluidic-pladen er tidligere blevet beskrevet som perfunderes brystkræft kulturer udstillet optimal levedygtighed i forhold til en statisk 3D-kultur af de samme celler⁷.

Denne rapport beskriver en tilpasset tæthedsgradientcentrifugeringsmetode til isolering af levende flercellede PDX-klynger og demonstrerer dens anvendelighed til at etablere 3D PDX-kulturer inden for perfusable mikrofluidiske plader. Fordi et stigende antal forskningslaboratorier søger metoder til at lette PDX brug, forventer vi, at de protokoller, der præsenteres her, vil være af umiddelbar nytte.

Protocol

Tumorvæv blev opnået med patientens samtykke og i henhold til en godkendt Institutional Review Board (IRB) protokol. Xenografts blev implanteret, dyrket og høstet i henhold til en accepteret Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokol.

BEMÆRK: Alt arbejde skal udføres i et sterilt biologisk sikkerhedsskab for at opretholde sterilitet. Alle trin skal udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

1. Fremstilling af materialer til PDX-forarbejdning

1. Autoklave kraftvipper og skalpel håndtag eller barberblade.
2. Optø enzymopløsning ved 4 °C natten over eller ved stuetemperatur samme dag som vævsafledning.
   BEMÆRK: Optøning ved 37 °C tilrådes ikke, da dette kan inaktivere nogle dissociationsenzymer.
3. Forbered mindst 100 ml PDX kultur medium (Dulbecco modificerede Eagle medium-næringsstof blanding F-12 [DMEM-F12] med 100 U/ml penicillin og streptomycin og 30 % føtalt kvægserum [FBS]) og mindst 25 ml PDX-forarbejdningsmedium (DMEM-F12 med 100 U/ml penicillin og streptomycin og ingen FBS). Opbevares ved 4 °C, indtil den er klar til brug.

2. PDX dissociation og indledende rensning af stromal komponent

1. Saml autoklaverede redskaber, 70 μm cellesien (2-3), 60 mm rund vævskulturretter (2), 6-brønds vævskulturplader, sterile 50 ml koniske centrifugerør og sterile 1x fosfat-buffered saltvand (PBS). Varm kultur medium til 37 °C og lad dissociation enzym opløsning at komme til stuetemperatur.
2. Når PDX-væv har nået en diameter på 1,0-1,5 cm i en musevært, fjernes tumoren kirurgisk fra musen ved hjælp af standardmidler (f.eks. under accepteret anæstesi) og opbevares på is i et 50 ml rør med PDX-kulturmedium (Figur 2A). Beting vævet straks, via nedenstående trin, for at maksimere cellernes levedygtighed, helst inden for 1−2 timer efter høst.
3. Overfør tumorvæv til en forvejet steril 50 ml konisk rør. Skyl 6x med 30 ml steril PBS for at fjerne blod og forurenende stoffer. Fjern så meget væske som muligt og vejer tumorvæv.
4. Overfør tumorvæv til en 60 mm rund vævskulturskål og hakkekød i ~ 1 mm^{3 stykker} ved hjælp af et sterilt barberblad eller skalpel.
5. Tilføj 5 ml PDX behandling medium til at indsamle tumor gylle og overførsel til en ny steril 50 ml rør. Skyl kulturskålen med yderligere 5 ml PDX-behandlingsmedium, derefter med dissociationsenzymopløsning (10 ml/g tumor, mindst 5 ml), og tilsættes alle skyl til 50 ml-røret.
6. Inkuber 20 min ved 37 °C med let omrystning. Hvirvle røret forsigtigt halvvejs gennem inkubationstiden.
7. Pipette op og ned forsigtigt med en serologisk pipette til at bryde op klumper. Filtrer celler med en 70 μm celle si placeret over en ny steril 50 ml rør.
   BEMÆRK: Mere end én si kan være nødvendig.
8. Centrifuge ved 200 x g i 5 min til pelletceller. Fjern supernatant og resuspend i 2−3 ml PDX kultur medium. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller.
9. Brug tabel 1 til at anslå det nødvendige antal dissocierede PDX-afledte celler, der er nødvendige for at opnå den ønskede celletæthed pr. chip.
   BEMÆRK: Værdierne i tabel 1 er beregnet til at være et udgangspunkt. De faktiske værdier vil variere på grund af vævs levedygtighed/cellulære og celletab fra frysning/nyttiggørelse. PDX tumorer er individer selv inden for en given kræfttype, så disse værdier bør justeres empirisk.
10. Af det tal, der er beregnet i trin 2.9, plade 1−2 x 10⁶ celler i 5 ml PDX-kulturmedium pr. brønd af en 6-brønds vævskulturplade. Inkuberes (37 °C, 5% CO_2,95% luftfugtighed) i 48 timer med let omrystning (50−55 omdr./min.) for at fremme klyngedannelse (Figur 2B). Når klyngen er dannet, skal du fortsætte til afsnit 3 for centrifugering.
11. Cryopreserve ubrugte PDX-celler fra den oprindelige dissociation i 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% dimethylsulfoxid (DMSO) eller et kommercielt tilgængeligt primært cellefrysningsmedium.
    BEMÆRK: Klæbende musestrommale celler kan også genvindes fra vævspladens overflade, hvis det ønskes, ved at skylle kort med kulturmedium og udvide med standardmidler.
12. Til senere brug af cryopreserved PDX tumorceller / mus stroma, tø celler i en 37 °C vandbad i 2 min. Tæl og plade i en 6-brønd vævskulturplade som beskrevet i trin 2.10, før du fortsætter til afsnit 3. Øge antallet af PDX celler med ~ 20% for at imødekomme levedygtighed tab fra kryopræservering.

3. Densitetsgradientrifugeringsbaseret adskillelse af PDX-afledte klynger fra enkelte celler

1. Der klargøres 20 ml 100% tæthedsgradientopløsning ved grundigt at blande 18 ml tæthedsgradientedisugeringsopløsning med 2 ml steril 10x Hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS) i et sterilt 50 ml konisk rør. Lav 10 ml hver af 20%, 30%, 40% og 55% tæthed gradientopløsninger ved at fortynde denne 100% opløsning med sterile 1x HBSS og blande godt.
   BEMÆRK: Disse volumener er tilstrækkelige til to 15 ml-forløb, som kan bruges til at adskille ~15 x 10⁶ celler hver. Hvis der adskilles færre end ~15 x 10⁶ celler, skal det andet forløb anvendes som balance for centrifugering.
2. Der tilsættes 3 ml 55% tæthedsgradientopløsning til bunden af et 15 ml konisk rør. Holde røret i en vinkel, meget forsigtigt lag 3 ml 40% tæthed gradient løsning på toppen af 55% lag, langsomt dispensere væsken på den vinklede side af røret for at undgå at blande lagene. Gentag med 30% tæthed gradient løsning.
3. Opsaml supernatanten af PDX-rotationskulturer med en 5 ml serologisk pipette, skyllepladeoverfladen forsigtigt. Centrifuge ved 200 x g i 2 min til pelletceller.
4. Fjern supernatant og resuspend cell pellet i 3 ml 20% tæthed gradient løsning i henhold til antallet af gradienter er nødvendige for at adskille cellerne. Lag omhyggeligt 20% tæthedsgradientopløsning med celler på toppen af forløbet(erne). Hvis der kun anvendes ét gradientrør til celler, skal du toppe balancegradientrøret med cellefri 20% tæthedsgradientopløsning.
5. Rørene og centrifugen i en svingspandrotorcentrifuge i 30 minutter ved 4 °C, 2.000 x gog 0 bremse.
6. Efter centrifugering vil brøker være synlige (Figur 2C). 2−3 ml fraktioner opsamls i friske 15 ml rør. Tilsæt 3−4 volumener sterile 1x HBSS til hver fraktion og inverteres for at blande grundigt.
7. Centrifuge ved 1.000 x g i 3 min til pellet celler. Fjern supernatant og resuspend cell pellet i 1−2 ml PDX forarbejdning medium.
   BEMÆRK: Levedygtige PDX-celleklynger findes typisk ved grænsefladen 40−55% tæthedsgradient solution(Figur 2D) med enkelte døde/døende celler, der akkumuleres ved 20−40% densitetsgradient-løsningsgrænsefladen for de fleste testede PDX'er.
8. Fjern en lille, repræsentativ aliquot (50−100 μL) for genslyngning med et tilsvarende volumen af dissociationsenzymopløsning til vurdering af cellenummeret i klyngecellesuspensionen. Tæl celler med et hæmocytometer eller automatiseret celletæller.

4. Hydrogel forberedelse og mikrofluidisk plade såning

1. Rekonstituere HA hydrogelopløsninger (thiol-modificeret HA, HA-SH; thiol-reaktiv polyethylenglycoldiacrylat, PEGDA) i henhold til producentens anvisninger.
2. Ved hjælp af en multikanalpipette tilsættes 50 μL HBSS til alle brønde i observationsvindueskolonner (kolonne 3, 7, 11, 15, 19, 23) af en 2-sporet mikrofluidic plade for at opretholde kulturfugthed og optimale billeddannelsesforhold.
3. Cellesuspensionen beregnes ud fra afsnit 3, der er nødvendigt for 50 μL hydrogel ved den ønskede celletæthed (dvs. 5.000 celler/μL). Til såning af en mikrofluidisk plade skal det beregnede volumen anbringes i hvert af de 4 sterile 1,5 ml centrifugerør.
   BEMÆRK: HA hydrogels har en fast tid til gelering. Juster mængden af gelopløsning aliquots for brugerens effektivitet ved dispensering, hvis der forekommer for tidlig gelering.
4. HA-SH-opløsningens pH-pH-pH-værdien justeres til 8,0 med 1 N NaOH umiddelbart før brug. Der udføres en testgelé ved at blande 40 μL HA-SH med 10 μL PEGDA og overvåge gelering over tid. Gelering begynder typisk 5−8 min efter blanding af HA-SH med PEGDA crosslinker.
5. Centrifuge celle suspension aliquots i 2 min (200 x g,stuetemperatur) til pellet celler. Fjern forsigtigt supernatanten og resuspenderede celler i den relevante mængde HA-SH.
   BEMÆRK: Endelig hydrogel er en 4:1 HA-SH:PEGDA opløsning (volumen), så cellerne skal opslæmes i 40 μL HA-SH for en 50 μL endelig volumen.
6. Der tilsættes 10 μL PEGDA til en aliquot af celler i HA. Bland godt og vent 1−3 min (afhængigt af geleringstiden fra trin 4.4), før der sås mikrofluidpladen.
   BEMÆRK: Hvis du lader geleringsreaktionen komme i gang før såning, er det med til at minimere celleafbæltningen.
7. Påsætte en spids til dispensering af 1,5 μL volumener på en enkelt kanal gentage pipette og belastning med celler i HA hydrogel opløsning. Husk at holde hydrogel aliquot godt blandet for at sikre jævn cellefordeling.
8. For at sætte mikrofluidic plade, justere pipetten spidsen vinkelret på pladen, mens forsigtigt placere spidsen i midten af gelindtag (kolonne 1, 5, 9, 13, 17, 21) for at sikre kontakt, men intet tryk, når dispensere hydrogel opløsning. Arbejde hurtigt for at forhindre for tidlig hydrogel størkning, dispensere 1,5 μL gel opløsning i hver gel indløb.
9. Observere fyld status af de mikrofluidiske kanaler ved at se fra toppen af pladen, bunden af pladen, eller ved mikroskop, og vurdere belastning, ved hjælp af figur 3 som en guide (vellykket belastning i figur 3A, pipet positionering vejledning i figur 3B, ubesvarede belastning i figur 3C, ikke fyldt til ende i figur 3D, overløb i figur 3E). Identificer eventuelle nødvendige justeringer i teknik, der kan forbedre påfyldning succes for den næste runde af chips (se diskussion for fejlfinding tips).
10. Trin 4.6−4.9 gentages med de resterende 3 aliquots af celler i HA-opløsning. Inverter pladen, mens du forbereder den næste aliquot (~ 1 min).
    BEMÆRK: Den 1 min ventetid og inversion af pladen forbedrer cellernes 3D-fordeling ved at reducere cellefedtningen, efterhånden som geleringen finder sted.
11. Når alle spåner er fyldt, inkuberes pladen ved 37 °C i en befugtet inkubator, indtil geleringen er færdig (~45 min).
12. Ved hjælp af den medfølgende manual skal du sikre dig, at perfusion rockeren er installeret i cellekulturkubvøsen med de korrekte perfusionsindstillinger (14° vinkel, 4 min intervaller).
13. Der tilsættes 50 μL PDX-kulturmedium til alle mellemstore indløb (kolonne 2, 6, 10, 14, 18, 22), og kontroller, om kanalerne er fyldt korrekt ved at vende pladen. Bank forsigtigt pladen mod en overflade for at tilskynde væsken til at fylde mikrofluiderne.
14. Der tilsættes 50 μL DMEM-F12 (10% FBS) for alle mellemtag (kolonne 4, 8, 12, 16, 20, 24). Hvis der fanges luftbobler i perfusionskanalen, skal du fjerne den ved forsigtigt at banke pladen mod en overflade.
15. Ved hjælp af et mikroskop og plade layout form (Supplerende figur 1), post chip påfyldning succes. Udeluk forkert fyldte chips fra yderligere eksperimentel brug.
16. Placer plade på en vippe rocker indstillet til en 14 ° tilt og en 4 min cyklus for at begynde perfusion. Udskift PDX-kulturmediet hver anden dag (først 50 μL i indløb og derefter 50 μL i udløb).

5. Cellefarvning, billedbehandling og billedkvantificering

1. Der klargøres en analyseopløsning for cellernes levedygtighed, der indeholder tre fluorescerende farvestoffer (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]).
   1. Der forbered følgende lageropløsninger af hvert farvestof: Hoechst 33342 ved 1,6 mM (1 mg/ml) i deioniseret vand; calcein AM ved 4 mM i vandfri DMSO ethidium homodimer-1 ved 2 mM i DMSO/H₂O (1:4, v/v).
      BEMÆRK: Lager calcein AM og ethidium homodimer-1 løsninger leveres i det noterede kit i Tabel over Materialer.
   2. Forbered en enkelt arbejdsopløsning i HBSS eller phenol rødfrit medium, der indeholder alle tre farvestoffer. Optimer den endelige arbejdskoncentration for hver celletype og matrix inden for intervallerne 1,6-8,0 μM for Hoechst 33342, 0,1−10 μM for calcein AM og 0,1-10 μM for ethidium homodimer-1.
2. Udskælger kulturmediet, og påfør arbejdsetygtighedsfarveopløsningen på ønskede mikrofluidiske spåner (75 μL i indløb, 25 μL i udløb) og placer den perfusionsrocker i cellekulturkubvøsen tilbage i 1 time.
3. Afbilde observationsvinduerne for de farvede kulturer ved hjælp af et manuelt eller automatiseret konfokal mikroskop (materialetabel) med fluorescerende filtre (opført som excitation/emission wavelengths i nm) at observere alle kerner (Hoechst 33342, 350/461), døde cellekerner (ethidium homodimer-1, 528/617) og levende celle cytoplasma (calcein AM, 494/517).
4. Opfang 140 μm Z-stakke med en trinstørrelse på ≤ 1 μm ved hjælp af et 20x luftmål. Der er brug for tre synsfelter for at afbilde hele mikrokanalen med en lille mængde overlapning. For at undgå dobbelt sampling, billede kun to synsfelter pr chip.
   BEMÆRK: Billeddannelsesforhold bør optimeres for at sikre korrekt NyQuist-prøvetagning. I forfatternes erfaring, en hurtig billeddannelse system, baseret enten på deconvolution af en konventionel epi-fluorescens kilde eller resonans scanning tilstand på en konfokal, er nødvendig for fuldt ud at analysere en komplet Z-stack, med tre laser farver, på tværs af 96 chips på en plade inden for en rimelig tid (ca. 3,5 h med automatiseret billeddannelse, herunder opsætning).
5. Ved hjælp af billedanalyse software, assay Z-stack billeder for de ønskede kvantificerede data, såsom morfologi, aggregering tilstand, eller andre funktioner. Hvis du vil kvantificere cellernes levedygtighed, skal du tælle antallet af døde celler (rød) og samlede cellekerner (blå).

Representative Results

En programmerbar perfusion rocker blev udarbejdet i en standard vand-jacked celle kultur inkubator, og to-sporet mikrofluidic plader blev udarbejdet i en standard biosikkerhed kabinet til lastning (Figur 1). En MDA-PCA-118b PDX tumor blev udvidet in vivo, høstet, når den havde nået en maksimal størrelse, og dissocieret som beskrevet i protokol afsnit 2 for at skabe en gylle suspension af celler, på ca en enkelt celle tilstand (Figur 2A). Gyllen blev udskrevet i 6-brønd væv kultur plader, og placeret på en XY rotator som beskrevet, i 48 timer. Museslimma fastgjort til bunden af vævskulturpladen, som det tidligere er blevet beskrevet, og de humane PDX-celler forblev flydende i mediet, samlet i klynger (Figur 2B). Usamlede enkelte celler var også synlige i hele opløsningen.

Der blev etableret et trintæthedsgradient i et centrifugerør ved hjælp af metoderne i protokolaf afsnit 3. Supernatantaffjedringen af PDX-celler blev aspireret forsigtigt fra multiwellpladen, indlæst på tringradienten og centrifugeret som beskrevet. Efter centrifugering var et diset bånd, der indeholdt PDX-klyngerne, synligt nær grænsefladen mellem fraktionerne 2 og 3, og enkelte celler blev identificeret ved grænsefladen mellem fraktionerne 1 og 2 (Figur 2D). Fraktioner blev indsamlet som beskrevet, fortyndet yderligere i HBSS og centrifugeret igen for at fjerne tæthedensgradientopløsning. Supernatanten blev aspireret, og de resulterende cellepiller blev resuspenderet i PDX-behandlingsmediet. En lille aliquot af hver forarbejdet fraktion blev vurderet efter mikroskop for at bekræfte, at den forventede fraktion indeholdt PDX-klynge, og at den separate fraktion primært indeholdt enkelte celler.

HA hydrogelopløsninger blev rekonstitueret som beskrevet i protokolaf afsnit 4, og PDX-klynger blev resuspenderet i hydrogelopløsningen. PDX-løsninger blev indlæst i spåner på mikrofluidpladen og vurderet for vellykket belastning (figur 3). I de fleste tilfælde blev >90% af chips indlæst med succes efter nogle praksis med teknikken og justering af lastevolumener. Efter at have læsset det ønskede antal spåner og inkuberet til gelering som beskrevet blev PDX-kulturmediet tilsat mikrofluidpladen, og pladen blev dyrket med perfusion.

Ved hjælp af fluorescerende farvestoffer og metoderne i protokolaf afsnit 5 og konfokal mikroskopi blev 3D-mikrofluidic PDX-dyrgtighed og morfologi evalueret i både uparerede og tæthedsgradientueringsseparerede betingelser (Figur 4A). Billeder af disse plader blev optaget som Z-stakke på konfokale mikroskop og vurderet for celle levedygtighed i billedanalyse software. På dag 1 udviste de kulturer, der gennemgik separationsmetoden, 10 gange færre enkeltstående, døde celler (rød) sammenlignet med uparerede kulturer (figur 4B). Det er vigtigt, at de adskilte klynger primært bestod af levende celler (grøn). Der blev ikke identificeret nogen statistisk signifikant forskel for klyngestørrelsesfordelingen (figur 4C).

Kulturer blev yderligere opretholdt i mikrofluidic plade i syv dage (Figur 5A). Prøverne blev vurderet med jævne mellemrum ved hjælp af de samme billedbehandlings- og kvantificeringsmetoder som ovenfor. Det samlede antal levende celler forblev konsistent (figur 5B) og klynger bevarede ~80% levedygtighed (figur 5C) i kulturens levetid. Celletætheden i den ikke-parerede tilstand er ca. en tredjedel af den adskilte tilstand, fordi enkelte celler er i live under celletælling, men dør hurtigt i hydrogelen. Der er også mere variation i klyngestørrelse uden tæthedsgradens adskillelse.

Figur 1: Den 2-sporet perfusable microfluidic plade. (A) Den 2-sporet mikrofluidic plade er en standard 384-godt microtiter plade med en modificeret bund bestående af mikrofluidic kanaler indlejret mellem glasplader. Hver plade består af 96 vævschips til 3D-cellekultur. (B) Set fra toppen af pladen, en enkelt 2-sporet microfluidic chip består af 4 brønde i træk forbundet med gel kanal (rød) og perfusion kanal (blå); gelindgangen, perfusionindgangen, observationsvinduet og perfusionsudløbet. (C) Perfusion opnås i mikrofluidic plade med en programmerbar rocker, der bruger tyngdekraften til at drive medier mellem perfusion indløb og udløbsbor, som er medier reservoirer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: ISOLATION AF PDX-klynger. (A)Disseker primær PDX væv og dissociere i en enkelt celle suspension, der indeholder både menneskelige PCa celler og mus tumor stroma. Enten kryopræservere dissocieret celle blanding eller (B) føje til rotation kultur at recluster tumorceller og tillade mus stromale celler til at overholde væv kultur plade (48 h). (C) Brug massegradientcentrifugering til at fjerne resterende døde enkeltceller, og(D)indsamle levedygtige PDX-klynger ved grænsefladen mellem tæthedsgradientlag 40 % og 55 % (rød stiplede boks). eE) Genvind PDX-klynger, der skal opspørges i hydrogelprækursoropløsning, og på pladen dispenseres af med en gentaget pipette. (F) Eksempelberegninger, der svarer til tabel 1, viser de nødvendige indledende celletal , der er nødvendige for at opnå en endelig ønsket cellekoncentration for alle spåner på tværs af en plade. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Overvågning af mikrofluidisk pladebelastning. Loading succes og fejl, kan vurderes ved øjet (i top og bund visninger), med bekræftelse af mikroskop. (A) Vellykket belastning er identificeret ved en åben (lyse) perfusion lane i top og bund visninger, og en lidt mørkere gel lane i nederste visning. Visualisering af mikroskop bekræfter, at gelbanen var fyldt helt med celler og gel forløber, uden at spilde over i den tilstødende vognbane. (B) Cartoon demonstrere korrekt pipet tip placering under gel dispensering, med korrekt placering er lige over indløbsporten (venstre) og forkert placering er off-centreret (i midten) eller anvende kraft til indløbsporten (højre). (C) Lyse baner i alle visninger indikerer en ubesvaret belastning, hvilket tyder på, at pipet spidsen ikke var korrekt placeret i gel indløb. (D) En delvis fyldning af gelbanen (ikke fyldt til ende) identificeres ved den røde pil, som viser, hvor den fremrykkende gelopløsningsfront blev afbrudt, enten af en fanget luftboble eller en for tidlig pause i lastningen. Den røde pil i mikroskopvisningen identificerer den samme placering. (E)Indholdet af gelbanen oversvømmede PhaseGuide og bredte sig ind i perfusionsbanen og blokerede den i sidste ende. Dette overløb er synligt i nederste visning af det mørke udseende af både gel og perfusion baner. Skalalinje = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Vurdering af cellenfarvning og levedygtighed i mikrofluidicpladen. a )Vedhjælp af fluorescerende pletter blev levedygtigheden vurderet i adskilte og adskilte PCa-celleklynger seedet i mikrofluidicpladen (alle kerner: Hoechst 33342, blå; døde celler: ethidium homodimer-1, rød; og levende celler: calcein AM, grøn). Skalabar = 50 μm. (B) Samlede døde celler blev quantitedet på kulturens dag 1 og adskilte MDA-PCa-118b PDX-kulturer viste et betydeligt fald i antallet af døde celler. c) Kvantificering af klyngestørrelse for PCa PDX'er i adskilte og ikke-adskilte kulturer viste en lille stigning, men ingen statistisk signifikant forskel. Søjler og fejllinjer i panel B repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen på 4 billeder pr. betingelse (2 chips med 2 billeder/chip). Stjerne (*) repræsenterer statistisk signifikante forskelle (p < 0,05) sammenlignet med den ikke-parerede tilstand ved hjælp af en elevs t-test. For boksen og whisker plot i panel C, krydsikonet angiver middelværdien, og den vandrette linje repræsenterer medianen, af 4 billeder pr betingelse (2 chips med 2 billede / chip). Boksen indeholder 50% af dataene, mens whiskers strækker sig til minimum og maksimum klynge diameter for hver betingelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Karakterisering af adskilt MDA-PCa-118b i mikrofluidic pladen. (A)Adskilt (venstre) og unseparated (højre) PCa kræft celle klynger blev seedet i mikrofluidic plade og perfunderes i op til syv dage. Kulturer blev plettet med tre farvestoffer specifikke for alle kerner (Hoechst 33342, blå), døde celler (ethidium homodimer-1, rød), og levende celler (calcein AM, grøn). Skalalinje = 50 μm. (B,C) Antal celler og kultur levedygtighed fra billeder over en uges kultur ved en såningstæthed på 8.000 celler/μL. Søjler og fejlbjælker repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen for fire billeder pr. betingelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Endelig ønsket celletæthed i enkeltspån (celler/μL)	Volumen indlæst pr. chip (μL)	Antal spåner på mikrofluidisk plade	Mutiplier for ekstra volumen	Figur 2C: Antal adskilte celler, der kræves til en fuld mikroopgang (trin 3.8)	Multiplikator for celletab (fjernelse af stroma, celledød)	Figur 2B: Start # af dissocierede PDX-celler til protokol (trin 2.8)
2,500	1.5	96	1.3	4.7E+05	3	1.4E+06
5,000	1.5	96	1.3	9.4E+05	3	2.8E+06
10,000	1.5	96	1.3	1.9E+06	3	5.7E+06
20,000	1.5	96	1.3	3.7E+06	3	1.1E+07

Tabel 1: Omtrentligt indledende og endeligt PDX-materiale, der kræves for at indlæse en enkelt 2-sporet mikrofluidisk plade.

Supplerende figur 1: Det 2-00de mikrofluidiske pladelayout. Efter såning af mikrofluidic plade, registrere individuelle chip lastning succes (vellykket, ubesvarede lastning, ikke fyldt til ende, eller overløb) ved hjælp af 2-sporet plade layout. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her beskriver vi en metode til behandling og dyrkning levedygtige PDX-afledte tumorceller i et høj-gennemløb, perfunderet 3D-kultursystem. Mens denne protokol udnytter PCa PDX væv, Det er lige så effektiv for andre epitel-afledte tumorer. Tumor egenskaber varierer mellem de enkelte PDX linjer selv inden for samme væv af oprindelse (prostata, bryst, osv.). Nogle PCa PDX linjer er mere fibrotiske og vanskelige at isolere levedygtige celler fra, mens andre er mere cellulære. Tumoren størrelse bemærkes her kan varieres inden for IACUC retningslinjer for at give mere væv til særligt lavtydende tumorer. Derudover, tumor fragmenter kan indsamles efter trin 2.7, re-fordøjet, og samlet med den oprindelige fordøjelse for at øge udbyttet. Dette er især nyttigt for mere ekstracellulære matrix-tunge tumorer. Yderligere runder af fordøjelsen forbi to typisk resultere i lav levedygtighed og lavt udbytte og anbefales ikke.

Rensningen af PDX-afledte populationer, for at fjerne døde/ døende celler eller forurenende værtsceller, er gavnlig for den udvidede 3D-kultur og kvantificering af de ønskede kræftceller. Det første trin i rensningen beskrevet her-suspension kultur i en relativt stor mængde medier sammen med XY rotation ved moderate hastigheder-fremmer 1) selektiv ekstraktion af meget vedhæftning-afhængige celler, typisk mus stromale fibroblaster, og 2) dannelsen af celle aggregater til at levere pro-overlevelse celle-celle kontakt. Effektiviteten af udvinding vært-afledte mus fibroblaster i løbet af 48 h XY rotation trin er meget høj, som beskrevet i Fong et al.⁵. Forsætlig PCa-fibroblast co-kulturer er helt sikkert muligt, som vi har vist, men kræver en tunet matrix (for at støtte fibroblast vedhæftning til matrix) og en større andel af fibroblaster. Den lejlighedsvise PDX, som regel dem med mere mesenkymale egenskaber, vil holde sig lettere til væv kultur overflader i løbet af 48-timers rotation kultur trin. PDX linjer bør overvåges nøje første gang denne protokol udføres, og immunstained for HNA, at identificere andelen af humane celler i de klæbende og ikke-klæbende populationer. Ikke-vævskulturbehandlede plader bør anvendes til klyngedannelse med disse PDX'er.

Efter rotationskulturen forarbejdes den supernatant, der indeholder den ikke-tilholdsne population, ved hjælp af den beskrevne tæthedsgradientueringsmetode. Den protokol, der rapporteres her, kan forenkles for at udelukke mindst ét tæthedstrin (f.eks. ved kun at bruge 20 %, 40 % og 55 %-løsninger), men alle fire bør anvendes ved fastlæggelsen af denne metode med hver ny PDX. Flercellede klynger er let adskilt fra de enkelte celler ved denne metode, og stort set bevarer deres klyngen fænotype og andre egenskaber. Den kasserede encellede population repræsenterer enten (a) celler, der var døde/døende før rotationstrinnet på 48 timer og dermed aldrig integreret i en klynge, eller (b) celler, der forblev i live efter 48 timers rotation, men stadig ikke integrerede sig i klynger. Det er vigtigt at bemærke, at gruppe (b) kan omfatte celler, som nogle efterforskere finder ønskelige; f.eks. har nogle rapporter beskrevet primære cellekulturer, der indeholder tidlige stamceller/progenitorceller, eller lægemiddelresistente celler, der flyder i supernatant som dårligt klæbende enkelte celler over en ellers klæbende population¹⁰. Relevant for kræftundersøgelser, cirkulerende tumorceller (CTC'er), tumor initierende celler (TIC'er), eller andre lignende metastase-fremmende celletyper kunne være en del af denne enkelt celle befolkning. Derfor bør efterforskere, der bruger vores protokol, omhyggeligt analysere den kasserede encellede population for at sikre, at alle celler af interesse ikke er gået tabt. I vores hænder, langt de fleste af disse enkeltceller er enten en lille brøkdel af kræftceller, der er døde / døende på grund af den oprindelige væv dissociation protokol, eller gnaver fibroblaster, der allerede fortsætter gennem anoikis.

Det anbefales kraftigt at praktisere teknikken med såning af mikrofluidic plade med mindre dyrebare celler for at sikre succes, når du arbejder med begrænset og værdifuldt PDX materiale. Vær opmærksom på tipplacering under udlevering, da forkert teknik sandsynligvis vil resultere i 1) overløb, hvis der trykkes under indlæsning, eller 2) tomme eller delvist fyldte kanaler, hvis spidsen ikke er centreret over indløbsporten. For tidlig gelering vil også medføre kanaler til ikke at fylde til enden. Hvis dette sker, skal ventetiden nedsættes mellem tilsætning af PEGDA-krydslinkeren og dispensering af gelopløsningen, eller der arbejdes med mindre aliquots gelopløsning ad gangen. De dispenseringsmængder, der anvendes i denne protokol, er godt optimeret til succes med HA hydrogels. Brug af flere viskøse opløsninger såsom Matrigel i dette system kræver en stigning i dispenseringsvolumen til ~ 2 μL for korrekt påfyldning af de mikrofluidiske kanaler. Bemærk også, at valget af 50 μL intervaller i trin 4.3, fremstilling af fire cellepiller i samme trin, og den gentagne resuspensions i trin 4.10 er bevidst; selv om de giver mere materiale end nødvendigt, giver de også overage for at tage højde for tab fra den gentagne pipette.

Det skal bemærkes, at hver PDX sandsynligvis vil have en unik morfologi og størrelsesfordeling inden for denne 3D-kulturmodel. I en vis forstand forventes dette, på grund af mangfoldigheden af patientsygdom, væv historie, matrix parametre, og mange andre faktorer. En ekspansiv vurdering af flere prostatakræft linjer i Matrigel viste denne potentielle mangfoldighed¹¹. Stadig, efterforskere kan blive overrasket over at finde en bred variation i ovenstående parametre. I et manuskript under udarbejdelse præsenterer vi et bredt kig på flere PDX'er på denne kulturplatform; cellerne opretholder et ensartet respons inden for hver PDX-type, men kan variere betydeligt på tværs af prøver, hvilket resulterer i klynger, der for eksempel er store med høj celletæthed pr. klynge eller mindre med løsere intercellulære forbindelser. Den specifikke adfærd af hver PDX bør vurderes af efterforskere over flere forsøg, for at bekræfte en forudsigelig og karakteristisk morfologi. Efterforskere kan forvente prøver til at følge den generelle adfærd, der er skitseret i dette papir.

Sammenfattende tilbyder den præsenterede protokol forskere en ny metode til at anvende PDXs ex vivo i en platform, der giver mulighed for finjustering af kulturbetingelser og indarbejdelse af relevante 3D miljøsignaler såsom vævsspecifikke ekstracellulære matrix (ECM) og perfusion flow, der muliggør udvidet celle overlevelse over flere dage eller uger. Detaljeret karakterisering af disse kulturer blev opnået ved farvning og morfologiske analyser vist her. Desuden kan kulturer, hvis det er nødvendigt, underkastes pladelæserbaserede analyser, immunfluorescerende mærkning eller anvendes til fremstilling af lysater, der muliggør yderligere molekylær karakterisering. Selv om vi tidligere har offentliggjort nogle elementer af PDX 3D-kultur inden for hydrogels, denne anvendelse af multistep rensning er ny, let at ansætte i en standard laboratorium, og succes med at bevare høj levedygtighed repræsentative kulturer. OrganoPlate-platformen, i sine 2-lane og 3-lane sorter, tilbyder yderligere kompleksitet gennem sin model af væv perfusion, og en vigtig mulighed for at bruge endnu færre celler pr eksperiment. Sammenlignet med vores tidligere modeller reducerede den mikrofluidiske platform cellebehov med en faktor på ~ 30 pr. eksperiment, hvilket er en enorm fordel i betragtning af den knappe tilgængelighed af PDX tumorvæv i de fleste laboratorier. Det mikrofluidiske system muliggør udvidet billeddannelse, immunstaining og facile-billeddannelse på tværs af en cellepopulation, der er stor nok (n = ~2.000−4.000 celler pr. billedvindue) til at muliggøre kvantificering af fænotype inden for rammerne af den rumlige organisation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable