Summary
يوضح هذا البروتوكول أساليب تمكين الثقافة الموسعة في المختبر من xenografts المستمدة من المريض (PDX). خطوة واحدة يعزز القدرة على البقاء العام للثقافات العنقودية متعددة الخلايا في الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد، من خلال إزالة مباشرة من الخلايا الفردية غير قابلة للحياة. خطوة ثانوية توضح أفضل الممارسات لثقافة PDX في منصة microfluidic perfused.
Abstract
xenografts المستمدة من المريض (PDX) ، التي تم إنشاؤها عندما يتم نقش أنسجة ورم المريض مُجَذَّبًا مباشرةً إلى فئران مُنَاعِدة ، تظل مستقرة بيولوجيًا ، وبالتالي الحفاظ على الميزات الجزيئية والوراثية والهظرية ، وكذلك عدم تجانس الورم الأصلي. ومع ذلك ، فإن استخدام هذه النماذج لإجراء العديد من التجارب ، بما في ذلك فحص المخدرات ، هو أمر باهظ سواء من حيث التكلفة والوقت. تُنظر إلى أنظمة الاستزراع ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع على أنها منصات تحتفظ فيها الخلايا السرطانية بسلامتها البيولوجية من خلال التفاعلات الكيميائية الحيوية، والمورفولوجيا، والهندسة المعمارية. فريقنا لديه خبرة واسعة في زراعة خلايا PDX في المختبر باستخدام مصفوفات ثلاثية الأبعاد مكونة من حمض الهيالورونيكس (HA). من أجل فصل الخلايا الليفية الليفية الماوس الخلايا الضموية المرتبطة PDXs، ونحن نستخدم ثقافة التناوب، حيث الخلايا القوية تلتزم سطح الأنسجة ثقافة معالجة لوحات بينما خلايا الورم PDX تفكك تعويم والنفس المنتسبين في مجموعات متعددة الخلايا. تطفو أيضا في عظمى هي واحدة، وخلايا ميتة في كثير من الأحيان، والتي تشكل تحديا في جمع مجموعات PDX قابلة للحياة لتغليف المصب في الهيدروجيلز لثقافة الخلية 3D. من أجل فصل هذه الخلايا الفردية من مجموعات الخلايا الحية، لدينا استخدام كثافة الخطوة الطرد المركزي. البروتوكول الموصوف هنا يسمح باستنفاد الخلايا الفردية غير القابلة للحياة من السكان الأصحاء من مجموعات الخلايا التي سيتم استخدامها لمزيد من التجارب في المختبر. في دراساتنا، ونحن دمج الثقافات 3D في لوحات microfluidic التي تسمح لضخ وسائل الإعلام أثناء الثقافة. بعد تقييم الثقافات الناتجة باستخدام مقايسة قابلة للتطبيق تستند إلى الصور الفلورية للخلايا النقية مقابل الخلايا غير النقية ، تظهر نتائجنا أن خطوة الفصل الإضافية هذه خفضت بشكل كبير عدد الخلايا غير القابلة للحياة من ثقافاتنا.
Introduction
على مدى العقد الماضي، وقد أظهرت مجال أبحاث السرطان الحماس المتجدد لxenografts المستمدة من المريض (PDXs) كأداة لتقييم الاعتماد على مسار الخلايا السرطانية وحساسية المخدرات1. يتم تأسيس نماذج PDX الأكثر شيوعًا عن طريق زراعة الخلايا السرطانية البشرية تحت الجلد أو العظام — وهي جزء من الورم ، أو مجموعة من الخلايا المتفرعة عن الورم المنفصلة ، أو عينة من الخلايا السرطانية المنتشرة المعزولة (CTCs) - في مضيف القوارض. إذا كان الورم "اتخاذ" ناجحا، سوف تتكاثر خلايا xenograft، والأوعية الدموية، والتفاعل خلاف ذلك مع الأنسجة المضيفة لخلق ورم، والتي يمكن حصادها في الحجم الأمثل، وتقسيمها، وإعادة زرعها في المضيفين الآخرين. من بين مزاياها العديدة كنظام نموذجي ، تحتفظ PDXs عادة بجزء كبير من عدم تجانس خلايا الورم الأصلية وتمكن من تقييم المسارات البشرية الخاصة واستجابات الخلايا2،3. في سياق vivo تمكن التفاعل الورم مع الأوعية الدموية وغيرها من السترمة المجاورة وتلخص خصائص الأنسجة مثل ديناميات انتشار المخدرات، والتوتر الأكسجين، وتأثير المصفوفة خارج الخلية التي تؤثر بيولوجيا وميكانيكيا تطور الورم. الجانب السلبي من PDXs هو اعتمادها على مضيف القوارض ، سواء لتوسيع الورم وفي نهاية المطاف لاختبار الفرضية. لأن العديد من PDXs لا يمكن أن تتكيف مع الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) على زراعة الأنسجة البوليسترين دون أن تفقد العديد من خصائصها المرغوبة ، كان هناك الحد الأدنى من الأرضية الوسطى للباحثين بين هذه الطريقة التي تسيطر عليها نسبيا في المختبر ، والزيادة الكبيرة في النفقات والمرافق ومتطلبات الوقت لاستخدام في الطب البصري PDX.
لقد وصفنا نماذج متعددة في المختبر التي تنفذ ثقافة الخلايا 3D داخل مصفوفة داعمة، وتوسعت مؤخرا أن العمل لإثبات ثقافة الجسم الحي السابق من سرطان البروستاتا متعددة (PCa) المشتقة PDXs، سواء وحدها وفي الثقافة المشتركة مع الخلايا الليفية المشتقة من نخاع العظم4،5. حمض الهيالوروني (HA) القائم على المصفوفات hydrogel توفير الدعم للتخصيص والبيولوجيا ذات الصلة لكلا النوعين الخلية، مع السيطرة السهل على خصائص هيدروجيل والوضوح البصري للتصوير من خلال عمق هيدروجيل6.
أنسجة الورم PDX ناضجة تضم خليط متغير من الخلايا السرطانية البشرية غير متجانسة والماوس ستروما (الخلايا الليفية، والخلايا البطانية، الخ). لدراسة مساهمات محددة من نوع الخلية في تطور الورم في المختبر ، يمكن أن يكون من المفيد فصل الأورام ، وفصل مجموعات الخلايا ، ودمجها تجريبيًا بطريقة منظمة لتشريح مسارات التواصل بين الخلايا. مجموعات الخلايا المختلطة داخل هضم الأنسجة لديها توافق التفاضلية مع ظروف ثقافة محددة. على سبيل المثال، يستلزم قابلية البقاء الليفية المرتبطة بالورم إما الالتزام السطحي أو مصفوفات ثلاثية الأبعاد وظيفية مع أربطة integrin، في حين أن خلايا PDX المشتقة من الظهارية لا تحتوي عادة على هذه المتطلبات، بدلاً من ذلك تفضل تفاعلات الخلايا الخلية. يمكن استغلال هذه الاختلافات لتحقيق فصل فعال من خلايا PDX من الخلايا الماوس اللوّث stromal. تسمح ثقافة الدوران في هضم الأنسجة بتمسك الخلايا الضمية بسطح ثقافة الأنسجة بينما تدفع التصاقات الخلايا الخلوية خلايا PDX العائمة فوق سطح الثقافة الدوارة لتشكيل مجموعات متعددة الخلايا في المابير في 24−48 ساعة. وتختلف الخصائص المحددة لهذه المجموعات مع PDX (مثل، مجموعات كبيرة، ضيقة، كروية للغاية أو مجاميع أصغر وفكها تشبه عناقيد العنب)، ولكنها عادة ما تكون ذات أحجام ذات صلة بيولوجيا (قطر 50-250 ميكرومتر)، كافية لتقييم التفاعلات الخلوية التي تعتمد على الاتصالات بين الخلايا.
يؤدي استرجاع الورم ومعالجته إلى درجة ما من موت الخلايا الجانبية، إما بسبب الأضرار قصيرة الأجل الناجمة عن الاضطراب الميكانيكي/الأنزيمي، أو عدم التوافق على المدى الطويل بين السكان الفرعيين وظروف الثقافة المختارة. على الرغم من فائدة ثقافة التناوب كفصل كبير أولي ، يتم نقل الخلايا الميتة أو المحتضرة لا محالة مع مجموعات PDX ويمكن أن تؤثر على الثقافة الناتجة. هذه الخلايا الميتة غالباً ما تكون خلايا PDX الفردية التي لم يتم دمجها في كتلة، الماوس الخلايا الليفية الليفية الليفية الضمائية التي لا يمكن البقاء على قيد الحياة في ظروف الثقافة المحددة، أو خلايا بطانة الرحم الهشة بشكل خاص. ويمكن لهذه الخلايا المحتضرة أن تؤثر على النتائج التجريبية من "الناجين" ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على القياس الكمي، على سبيل المثال، عن طريق مقايسات فحص قابلية البقاء القائمة على الصور الفلورية. لتحسين اختيار خلايا PDX الحية من هذه الطريقة، قمنا بتكييف طرق الطرد المركزي مع خطوات الكثافة لإزالة الخلايا الميتة /المحتضرة الفردية بسهولة من مخاليط PDX والاحتفاظ بمجموعات متعددة الخلايا حية في الغالب.
لتعزيز دراسة الناتجة PDX المستمدة من المجموعات في الثقافة 3D، استخدمنا منصة ثقافة الضخ microfluidics القائم على، OrganoPlate (الشكل 1)، وهو جهاز عالية الإنتاجية على رقاقة منصة تسمح للثقافة في وقت واحد تصل إلى 96 الفردية الم perfused ، 3D الثقافات على 384 جيدا microtiter لوحة القاعدة(الشكل 1A)7،8. في لوحة microfluidic 2 حارة، يتم توصيل شريحة نسيج واحد من قبل اثنين من القنوات microfluidic(الشكل 1B، هلام قناة: الأحمر، قناة التسريب: الأزرق) التي تمتد أربعة آبار في صف واحد. يتم فصل القناتين microfluidic من قبل سلسلة من البلاستيك قصيرة تسمى Phaseguide الذي يمنع تجاوز قناة واحدة في قناة جارتها المجاورة ، ويسمح في وقت واحد لواجهة خالية من الغشاء بين محتويات هلام و perfusion قناة9. لأن الجزء السفلي من لوحة microfluidic يتكون من الزجاج المجهر الصف، يمكن الاطلاع على الثقافات في نافذة المراقبة من خلال الجزء السفلي من لوحة مع مجهر قياسي أو الآلي. يتم تأسيس Perfusion في لوحة microfluidic مع الروك برمجة، وذلك باستخدام الجاذبية لدفع وسائل الإعلام من خلال قنوات microfluidic، بين آبار الخزان (الشكل 1C). يحاكي تدفق القذف بشكل أدق يلخص البيئة الدقيقة للورم من الثقافة الساكنة ، مما يسمح بدمج إجهاد القص وتعزيز توزيع الغازات والمواد المغذية. وقد سبق وصف فوائد الحفاظ على ثقافة الخلايا السرطانية الم PERFUSED في لوحة microfluidic كما أظهرت الثقافات سرطان الثدي perfused القدرة على البقاء الأمثل بالمقارنة مع ثقافة 3D ثابت من نفس الخلايا7.
ويصف هذا التقرير طريقة للانفروج المركزي للكثافة المكيفة لعزل مجموعات PDX الحية متعددة الخلايا، ويبين فائدتها في إنشاء ثقافات PDX ثلاثية الأبعاد داخل ألواح الفلورويديك القابلة للانحلال. ونظرًا لأن عددًا متزايدًا من مختبرات الأبحاث يبحث عن طرق لتسهيل استخدام PDX ، فإننا نتوقع أن تكون البروتوكولات المعروضة هنا ذات فائدة فورية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على أنسجة الورم بموافقة المريض ووفقا لبروتوكول مجلس المراجعة المؤسسية المعتمد (IRB). تم زرع Xenografts ، ونمت ، وحصد وفقا لاتفاقية رعاية الحيوان المؤسسية المقبولة واستخدامها (IACUC) بروتوكول.
ملاحظة: كل العمل هو أن يتم تنفيذها في مجلس الوزراء سلامة البيولوجية المعقمة للحفاظ على العقم. وينبغي إجراء جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.
1. إعداد مواد لمعالجة PDX
- ملقط الأوتوكلاف ومشرط مقبض أو شفرات الحلاقة.
- ذوبان محلول انزيم الانفصام عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو في درجة حرارة الغرفة في نفس اليوم الذي ينفصل فيه النسيج.
ملاحظة: لا ينصح ذوبان في 37 درجة مئوية، لأن هذا يمكن أن تعطيل بعض الانزيمات الانفصام. - إعداد ما لا يقل عن 100 مل من PDX ثقافة المتوسطة (Dulbecco المعدلة النسر المتوسطة المغذيات خليط F-12 [DMEM-F12] مع 100 U/mL البنسلين وstreptomycin و 30٪ مصل الأبقار الجنين [FBS])، وعلى الأقل 25 مل من PDX معالجة المتوسطة (DMEM-F12 مع 100 U/mL البنسلين وstreptomycin وليس FBS). يُخزن عند 4 درجة مئوية حتى يصبح جاهزاً للاستخدام.
2. PDX تفكك وتنقية الأولية من المكون stromal
- جمع الأواني autoclaved، 70 مصافي الخلايا μm (2−3)، 60 ملم أطباق زراعة الأنسجة المستديرة (2)، 6-جيدا لوحات الأنسجة، عقيمة 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية، والملوحة المعقمة 1x الفوسفات المخزنة (PBS). ثقافة دافئة متوسطة إلى 37 درجة مئوية والسماح للتفكك محلول انزيم أنزيم أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة.
- عندما يصل قطر أنسجة PDX إلى 1.0−1.5 سم في مضيف الماوس، قم بإزالة الورم جراحيًا من الماوس بالوسائل القياسية (على سبيل المثال، تحت التخدير المقبول) وتخزينه على الثلج في أنبوب 50 مل مع وسط ثقافة PDX(الشكل 2A). معالجة الأنسجة على الفور، عن طريق الخطوات أدناه، لتعظيم صلاحية الخلية، ويفضل أن يكون داخل 1-2 ساعة بعد الحصاد.
- نقل أنسجة الورم إلى أنبوب مخروطي وزنها قبل وزنها 50 مل. شطف 6x مع 30 مل من برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة الدم والملوثات. إزالة أكبر قدر ممكن من السائل و وزن أنسجة الورم.
- نقل أنسجة الورم إلى 60 ملم حول طبق زراعة الأنسجة و mince إلى ~ 1 مم3 قطع باستخدام شفرة حلاقة معقمة أو مشرط.
- إضافة 5 مل من PDX تجهيز المتوسطة لجمع الطين الورم ونقلها إلى أنبوب جديد معقم 50 مل. شطف طبق الثقافة مع آخر 5 مل من PDX معالجة المتوسطة، ثم مع حل انزيم الانفصام (10 مل / غرام الورم، على الأقل 5 مل)، مضيفا جميع يشطف إلى أنبوب 50 مل.
- احتضان 20 دقيقة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف. دوامة الأنبوب بلطف في منتصف الطريق من خلال وقت الحضانة.
- الماصات صعودا وهبوطا بلطف مع ماصة المصلية لتفريق كتل. خلايا تصفية مع مصفاة خلية 70 ميكرومتر وضعت على أنبوب جديد معقم 50 مل.
ملاحظة: قد يكون من الضروري أكثر من مصفاة واحدة. - جهاز طرد مركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق إلى خلايا بيليه. إزالة فائقة و resuspend في 2-3 مل من وسط ثقافة PDX. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا التلقائي.
- استخدم الجدول 1 لتقدير العدد المطلوب من الخلايا المشتقة من PDX المنفصلة اللازمة لتحقيق كثافة الخلايا المطلوبة لكل شريحة.
ملاحظة: القيم في الجدول 1 المقصود أن تكون نقطة بداية. وسوف تختلف القيم الفعلية بسبب صلاحية الأنسجة / الخلية وفقدان الخلية من تجميد / الانتعاش. الأورام PDX هي الأفراد حتى داخل نوع معين من السرطان لذلك ينبغي تعديل هذه القيم تجريبيا. - من العدد المحسوب في الخطوة 2.9، لوحة 1-2 × 106 الخلايا في 5 مل من PDX ثقافة المتوسطة لكل بئر من 6-بئر النسيج لوحة. احتضان (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،95٪ الرطوبة) لمدة 48 ساعة مع اهتزاز لطيف (50-55 دورة في الدقيقة) لتعزيز تشكيل الكتلة(الشكل 2B). بعد تشكيل المجموعة، انتقل إلى القسم 3 للطرد المركزي.
- Cryopreserve غير المستخدمة خلايا PDX من تفكك الأولي في 50٪ FBS + 40٪ DMEM-F12 + 10٪ ثنائي الفينيل سلفوكسيد (DMSO) أو خلية الأولية المتاحة تجاريا تجميد المتوسطة.
ملاحظة: يمكن أيضاً استعادة الخلايا الوماتية الماوس من سطح لوحة الأنسجة، إذا رغبت في ذلك، عن طريق الشطف لفترة وجيزة مع متوسطة الثقافة والتوسع بالوسائل القياسية. - لاستخدام لاحق من خلايا الورم PDX cryopreserved / الماوس ستروما, تذوب الخلايا في حمام مائي 37 °C لمدة 2 دقيقة. عد وطبقة في لوحة ثقافة الأنسجة 6-جيدا كما هو موضح في الخطوة 2.10 قبل الشروع في القسم 3. زيادة عدد خلايا PDX بنسبة ~ 20٪ لاستيعاب الخسائر القابلة للتطبيق من الحفظ بالتبريد.
3. الكثافة التدرج على أساس الطرد المركزي فصل من الكتل المشتقة من PDX من الخلايا الفردية
- إعداد 20 مل من 100٪ حل التدرج الكثافة عن طريق خلط دقيق 18 مل من حل الطاردة المركزية الانحدار الكثافة مع 2 مل من محلول الملح المتوازن 10x هانكس العقيمة (HBSS) في أنبوب مخروطي معقم 50 مل. جعل 10 مل كل من 20٪، 30٪، 40٪، و 55٪ حلول التدرج الكثافة من خلال تخفيف هذا الحل 100٪ مع HBSS 1x العقيمة وخلط جيدا.
ملاحظة: وحدات التخزين هذه كافية لتدرجين 15 مل التي يمكن استخدامها لفصل ~ 15 × 106 الخلايا لكل منهما. إذا كان يفصل أقل من ~ 15 × 106 الخلايا، يجب استخدام التدرج الثاني كتوازن للطرد المركزي. - إضافة 3 مل من 55٪ محلول التدرج كثافة إلى الجزء السفلي من أنبوب مخروطي 15 مل. عقد الأنبوب في زاوية، طبقة بلطف جدا 3 مل من 40٪ حل التدرج كثافة على رأس طبقة 55٪، وصرف ببطء السائل على الجانب الزاوية من الأنبوب لتجنب خلط الطبقات. كرر مع حل التدرج الكثافة 30٪ .
- جمع فائقة من الثقافات دوران PDX مع ماصة المصلية 5 مل، سطح لوحة الشطف بلطف. جهاز طرد مركزي في 200 × ز لمدة 2 دقيقة إلى خلايا بيليه.
- إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه الخلية في 3 مل من 20% حل التدرج الكثافة وفقا لعدد من التدرجات اللازمة لفصل الخلايا. طبقة بعناية 20% كثافة حل التدرج مع الخلايا على الجزء العلوي من التدرج (ق). إذا كان استخدام أنبوب واحد فقط لتدرج الخلايا، أعلى أنبوب التدرج التوازن مع خلية خالية من 20% حل التدرج الكثافة.
- اِكْفَ الأنابيب والطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دوار دلو أرجوحة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية، 2000 x g،و0 فرامل.
- بعد الطرد المركزي، وسوف تكون الكسور مرئية(الشكل 2C). جمع 2−3 مل من الكسور في أنابيب 15 مل الطازجة. إضافة 3−4 مجلدات من 1x HBSS معقمة لكل كسر وعكس لخلط دقيق.
- جهاز طرد مركزي في 1000 س ز لمدة 3 دقائق إلى خلايا بيليه. إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1−2 مل من PDX متوسطة المعالجة.
ملاحظة: عادة ما توجد مجموعات خلايا PDX القابلة للتطبيق في واجهة حل التدرج الكثافة 40-55%(الشكل 2D)مع خلايا وحيدة ميتة/ميتة تتراكم في واجهة حل التدرج الكثافة 20-40% لمعظم PDXs التي تم اختبارها. - إزالة صغيرة, ممثل aliquot (50-100 μL) لإعادة تفكك مع حجم مساو من محلول انزيم الانفصام لتقييم رقم الخلية في نظام التعليق خلية متفاوتة المسافات. عد الخلايا مع قياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي.
4. Hydrogel إعداد وبذات microfluidic بذر
- إعادة تشكيل ها هيدروجيل الحلول (THIOL المعدلة HA، ها-SH؛ ثيول التفاعلية البولي ايثيلين جلايكول دياكريلات، PEGDA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميكرولتر من HBSS إلى جميع الآبار في أعمدة نافذة المراقبة (العمود 3، 7، 11، 15، 19، 23) من لوحة ميكروفلويدية 2 حارة للحفاظ على الرطوبة الثقافة وظروف التصوير الأمثل.
- حساب حجم تعليق الخلية من القسم 3 اللازمة ل50 ميكرولتر من الهيدروجيل في كثافة الخلية المطلوبة (أي، 5000 خلية / μL). لبذات واحد microfluidic لوحة، aliquot الحجم المحسوب في كل من 4 أنابيب أجهزة الطرد المركزي 1.5 مل معقم.
ملاحظة: ها هيدروجيلس لديهم وقت ثابت للجلات. ضبط حجم aliquots حل هلام لكفاءة المستخدم في الاستغناء إذا يحدث الجيل المبكر. - اضبط درجة حُس الحل HA-SH إلى 8.0 مع 1 N NaOH قبل الاستخدام مباشرة. إجراء اختبار هلام عن طريق خلط 40 ميكرولتر من HA-SH مع 10 ميكرولتر من PEGDA ورصد هلام مع مرور الوقت. يبدأ الجيلي عادةً 5−8 دقائق بعد خلط HA-SH مع ال crosslinker PEGDA.
- اسكوت تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة (200 × ز، درجة حرارة الغرفة) لخلايا بيليه. قم بإزالة الخلايا فائقة النيا والخلايا ذات الحفّاب في الحجم المناسب لـ HA-SH.
ملاحظة: الهيدروجيل النهائي هو حل HA-SH:PEGDA 4:1 (حسب الحجم) بحيث يجب إعادة اعتماد الخلايا في 40 ميكرولتر من HA-SH للحصول على حجم نهائي 50 ميكرولتر. - إضافة 10 μL من PEGDA إلى aliquot واحد من الخلايا في HA. تخلط جيدا وانتظر 1−3 دقيقة (اعتمادا على الوقت هلام من الخطوة 4.4) قبل البذر لوحة microfluidic.
ملاحظة: السماح لرد فعل الجلات من بداية قبل البذر يساعد على تقليل تسوية الخلية. - ضع نصيحة للاستغناء عن وحدات تخزين 1.5 ميكرولتر إلى قناة واحدة تكرر ماصة وتحميلها مع الخلايا في حل هيدروجيل HA. تذكر أن تبقي على aliquot هيدروجيل مختلطة جيدا لضمان توزيع الخلايا حتى.
- لذرية لوحة microfluidic، محاذاة تلميح ماصة عمودي على لوحة في حين وضع بلطف تلميح في وسط مدخل هلام (الأعمدة 1، 5، 9، 13، 17، 21) لضمان الاتصال ولكن لا ضغط عند الاستغناء عن حل هيدروجيل. تعمل بسرعة لمنع التجمد الهيدروجيل المبكر، الاستغناء 1.5 ميكرولتر من محلول هلام في كل مدخل هلام.
- مراقبة حالة التعبئة للقنوات microfluidic من خلال عرض من أعلى لوحة، أسفل لوحة، أو عن طريق المجهر، وتقييم التحميل، وذلك باستخدام الشكل 3 كدليل (تحميل ناجحة في الشكل 3A، pipet تحديد المواقع التوجيه في الشكل 3B، غاب التحميل في الشكل 3C، لا شغلها إلى نهاية في الشكل 3D، تجاوز في الشكل 3E). تحديد أية تعديلات ضرورية في التقنية التي قد تحسن نجاح التعبئة للجولة التالية من الرقائق (راجع مناقشة لنصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها).
- كرر الخطوات 4.6−4.9 مع 3 بقية من 3 aliquots من الخلايا في حل HA. عكس لوحة أثناء إعداد aliquot المقبل (~ 1 دقيقة).
ملاحظة: إن مدة الانتظار لمدة دقيقة وانعكاس اللوحة يؤديان إلى تحسين التوزيع ثلاثي الأبعاد للخلايا عن طريق تقليل استقرار الخلية عند حدوث الجل. - بعد ملء جميع الرقائق، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب حتى يتم الانتهاء من هلام (~ 45 دقيقة).
- باستخدام دليل المقدمة، وضمان تركيب الروك perfusion في حاضنة ثقافة الخلية مع إعدادات التسريب الصحيح (14 درجة زاوية، 4 فترات دقيقة).
- أضف 50 ميكرولتر من ثقافة PDX متوسطة لجميع المداخل المتوسطة (الأعمدة 2، 6، 10، 14، 18، 22) وتحقق مما إذا كانت القنوات قد ملأت بشكل صحيح عن طريق قلب اللوحة. اضغط بلطف على اللوحة مقابل السطح لتشجيع السائل على ملء القنوات microfluidic.
- أضف 50 ميكرولتر من DMEM-F12 (10% FBS) لجميع منافذ البيع المتوسطة (العمود 4، 8، 12، 16، 20، 24). إذا كانت أي فقاعات الهواء محاصرين في قناة الضخ، إزالة عن طريق النقر بلطف على لوحة على سطح.
- باستخدام المجهر وشكل لوحة تخطيط(الشكل التكميلي 1)،سجل رقاقة ملء النجاح. استبعاد الرقائق المعبأة بشكل غير صحيح من الاستخدام التجريبي الإضافي.
- ضع لوحة على الروك إمالة تعيين إلى 14 درجة إمالة ودورة 4 دقائق لبدء perfusion. استبدال PDX المتوسطة ثقافة كل 2 أيام (أول 50 ميكرولتر في مدخل، ثم 50 ميكرولتر في منفذ).
5. تلطيخ الخلية، والتصوير، وكمية الصورة
- إعداد حل الخلية قابلية البقاء فحص تحتوي على ثلاثة الأصباغ الفلورية (Hoechst 33342، ethidium homodimer-1، calcein acetoxymethyl [صباحا]).
- تحضير حلول الأسهم من كل صبغة على النحو التالي: Hoechst 33342 في 1.6 mM (1 ملغ /مليلتر) في المياه الأيونية؛ calcein AM عند 4 mM في DMSO اللامائية؛ ethidium هوممير-1 في 2 mM في DMSO / H2O (1:4، v/v).
ملاحظة: يتم توفير حلول الأسهم calcein AM و ethidium homodimer-1 في مجموعة لوازم في جدول المواد. - إعداد حل عمل واحد في HBSS أو الفينول الحمراء الخالية من المتوسطة، التي تحتوي على جميع الأصباغ الثلاثة. تحسين التركيز النهائي للعمل لكل نوع خلية ومصفوفة، ضمن نطاقات 1.6−8.0 ميكرومتر لـ Hoechst 33342 و0.1−10 ميكرومتر لـ calcein AM و0.1−10 ميكرومتر للـ ethidium homodimer-1.
- تحضير حلول الأسهم من كل صبغة على النحو التالي: Hoechst 33342 في 1.6 mM (1 ملغ /مليلتر) في المياه الأيونية؛ calcein AM عند 4 mM في DMSO اللامائية؛ ethidium هوممير-1 في 2 mM في DMSO / H2O (1:4، v/v).
- إزالة المتوسطة الثقافة وتطبيق حل صبغة قابلة للتطبيق للعمل على رقائق microfluidic المطلوب (75 ميكرولتر في مدخل، 25 ميكرولتر في منفذ) ووضع مرة أخرى على الروك perfusion في ح ح ثقافة الخلية.
- صورة نوافذ المراقبة من الثقافات الملون باستخدام دليل أو المجهر confocal الآلي(جدول المواد)مع مرشحات الفلورسنت (المدرجة على أنها استثارة / موجات الانبعاثات، في نانومتر) لمراقبة جميع النوى (Hoechst 33342، 350/461)، نوى الخلايا الميتة (الإتوديمر المتجانس-1، 528/617)، والخلايا الحية سيتوبلازم (calcein AM، 494/517).
- التقط 140 ميكرومتراً من Z-المكدسات بحجم خطوة ≤1 ميكرومتر باستخدام هدف هواء 20x. هناك حاجة إلى ثلاثة مجالات للعرض لتصوير القناة الدقيقة بأكملها مع قدر صغير من التداخل. لتجنب أخذ العينات المزدوجة، صورة حقلين فقط من عرض لكل رقاقة.
ملاحظة: يجب تحسين ظروف التصوير لضمان أخذ عينات Nyquist المناسبة. في تجربة المؤلفين ، نظام التصوير السريع ، الذي يعتمد إما على فك الاستئصال لمصدر الفلورية الشعاعية التقليدية أو وضع المسح بالرنين على الدمج ، ضروريًا لفحص كامل لـ Z-stack ، مع ثلاثة ألوان ليزر ، عبر 96 رقائق على طبق في غضون فترة زمنية معقولة (حوالي 3.5 ساعة مع التصوير الآلي ، بما في ذلك الإعداد). - باستخدام برنامج تحليل الصور، قم بتحليل صور Z-stack للبيانات الكمية المطلوبة، مثل التشكل أو حالة التجميع أو الميزات الأخرى. لقياس جدوى الخلية، عد عدد الخلايا الميتة (الحمراء) والنوى الخلية الإجمالية (الأزرق).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إعداد الروك perfusion للبرمجة في حاضنة ثقافة الخلية المياه جاكيد القياسية، وتم إعداد لوحات microfluidic اثنين حارة في مجلس الوزراء السلامة الحيوية القياسية للتحميل (الشكل 1). تم توسيع ورم PDX MDA-PCA-118b في الجسم الحي، وحصد عندما كان قد وصل إلى أقصى حجم، وفك كما هو موضح في قسم البروتوكول 2 لإنشاء تعليق الطين من الخلايا، في حالة خلية واحدة تقريبا (الشكل 2A). تم الاستغناء عن الطين في 6-جيدا لوحات الأنسجة، ووضعها على الدوار XY كما هو موضح، لمدة 48 ساعة. الماوس ستروما تعلق على الجزء السفلي من لوحة ثقافة الأنسجة، كما سبق وصفها، وظلت خلايا PDX الإنسان عائمة في الوسط، وتجميعها في مجموعات (الشكل 2B). كانت الخلايا الفردية غير المُكَتَمَلة مرئية في جميع أنحاء الحل أيضًا.
وقد تم إنشاء تدرج كثافة الخطوة في أنبوب الطرد المركزي باستخدام الطرق في القسم 3 من البروتوكول. تم استنشق التعليق الفائق لخلايا PDX بلطف من لوحة متعددة المستويات، وتم تحميله على تدرج الخطوة، وتم طرده على النحو الموصوف. بعد الطرد المركزي ، كان هناك نطاق ضبابي ، يحتوي على مجموعات PDX ، مرئيًا بالقرب من الواجهة بين الكسور 2 و 3 ، وتم تحديد الخلايا الفردية عند الواجهة بين الكسور 1 و 2 (الشكل 2D). تم جمع الكسور كما هو موضح، وتم تخفيفها في HBSS، وطردها مرة أخرى لإزالة حل تدرج الكثافة. تم ستنشق افر، وأعيد توزيع الكريات الخلية الناتجة في وسط معالجة PDX. تم تقييم aliquot صغيرة من كل كسر المعالجة عن طريق المجهر، للتأكد من أن الكسر المتوقع يحتوي على كتلة PDX، وأن الكسر منفصلة تحتوي على خلايا واحدة في المقام الأول.
وقد أعيد تشكيل حلول الهيدروجيل HA كما هو موضح في القسم 4 من البروتوكول، وأعيد اعتماد مجموعات PDX في محلول الهيدروجيل. تم تحميل حلول PDX في رقائق على لوحة microfluidic وتقييمها للتحميل الناجح(الشكل 3). في معظم الحالات، تم تحميل 90% من الرقائق بنجاح بعد بعض الممارسة مع تقنية وتعديل وحدات تخزين التحميل. بعد تحميل العدد المطلوب من رقائق، والاحتضان للجلات كما هو موضح، تمت إضافة متوسطة ثقافة PDX إلى لوحة microfluidic، وزرع لوحة مع perfusion.
باستخدام الأصباغ الفلورية والأساليب في قسم البروتوكول 5، والمجهر confocal، 3D microfluidic PDX ثقافة البقاء ومورفولوجيا تم تقييمها في كل من ظروف فصل الانحدار الانحدار غير المشوشة وكثافة(الشكل 4A). وقد تم تسجيل صور هذه اللوحات كـ Z-مكدسات على المجهر confocal وتقييمها لقابلية الخلية في برامج تحليل الصور. في اليوم 1، تلك الثقافات التي خضعت لطريقة الفصل عرضت 10 أضعاف أقل واحد، خلايا ميتة (أحمر)، مقارنة بالثقافات غير المشوشة(الشكل 4B). الأهم من ذلك، مجموعات منفصلة تتألف في المقام الأول من الخلايا الحية (الأخضر). لم يتم تحديد أي فرق ذي دلالة إحصائية لتوزيع حجم الكتلة(الشكل 4C).
كما تم الحفاظ على الثقافات في لوحة microfluidic لمدة سبعة أيام (الشكل 5A). وقد تم تقييم العينات بشكل دوري، باستخدام نفس طرق التصوير وتحديد الكميات كما سبق. بقي العدد الإجمالي للخلايا الحية ثابتًا(الشكل 5B)واحتفظت المجموعات بـ 80% قابلة للحياة(الشكل 5C)على مدى حياة الثقافة. كثافة الخلية في حالة غير مخنث هو ما يقرب من ثلث حالة فصل لأن الخلايا المفردة على قيد الحياة أثناء عد الخلايا، ولكن سرعان ما يموت داخل الهيدروجيل. هناك أيضا أكثر تقلب في حجم الكتلة دون الفصل التدرج الكثافة.
الشكل 1: لوحة الـ 2 حارة القابلة للانكدام المجهري. (أ)لوحة microfluidic 2-حارة هو معيار 384-جيدا لوحة microtiter مع أسفل معدلة تتكون من قنوات microfluidic جزءا لا يتجزأ بين لوحات الزجاج. كل لوحة تتكون من 96 رقائق الأنسجة لثقافة الخلية 3D. (B) كما هو مُطل من أعلى اللوحة، تتكون شريحة ميكروفلويديك واحدة من 2 حارة من 4 آبار في صف متصل بواسطة قناة الجيل (الحمراء) وقناة الضخ (الأزرق)؛ مدخل الجل، مدخل الضخ، نافذة المراقبة، ومخرج التسريب. (C)يتم تحقيق perfusion في لوحة microfluidic مع الروك برمجة التي تستخدم الجاذبية لدفع وسائل الإعلام بين مدخل ضخ وآبار منفذ التي هي خزانات وسائل الإعلام. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عزل كتلة PDX. (A)تشريح أنسجة PDX الأولية وتفكك في تعليق خلية واحدة تحتوي على كل من الخلايا PCa الإنسان ورم الماوس ستروما. إما cryopreserve خليط الخلايا المنفصلة أو (B) إضافة إلى ثقافة التناوب لإعادة تجميع الخلايا السرطانية والسماح للماوس stromal الخلايا التصنت على التمسك بطبقة ثقافة الأنسجة (48 ساعة). (C) استخدام كثافة الطاردة المركزية للتدرج لإزالة الخلايا المفردة الميتة المتبقية، و (D)جمع مجموعات PDX قابلة للتطبيق عند الواجهة بين طبقات التدرج الكثافة 40٪ و 55٪ (مربع أحمر متقطع). (E) استرداد مجموعات PDX, resuspend في محلول السلائف هيدروجيل, والاستغناء على لوحة مع ماصة تكرار. (F)مثال الحسابات، المقابلة للجدول 1،تثبت أرقام الخلايا الأولية اللازمة للوصول إلى تركيز الخلية النهائية المطلوبة لجميع رقائق عبر لوحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: رصد تحميل الألواح الدقيقة. تحميل النجاح والأخطاء، ويمكن تقييمها عن طريق العين (في وجهات النظر العلوية والسفلى)، مع تأكيد عن طريق المجهر. (A) يتم تحديد التحميل الناجح من خلال ممر التفريغ المفتوح (الساطع) في الإطلالات العلوية والسفلى ، وممر هلام أغمق قليلاً في المنظر السفلي. التصور عن طريق المجهر يؤكد أن لين هلام كانت مليئة تماما مع الخلايا وسلائف هلام، دون أن تمتد إلى حارة المجاورة. (B) الرسوم المتحركة مما يدل على الصحيح التنسيب تلميح pipet خلال الاستغناء هلام، مع الموضع الصحيح يجري فقط فوق منفذ مدخل (يسار) ووضع غير صحيحة يجري خارج مركز (وسط) أو تطبيق القوة إلى منفذ مدخل (يمين). (C) الممرات الساطعة في جميع وجهات النظر تشير إلى التحميل غاب, مما يشير إلى أن تلميح pipet لم توضع بشكل صحيح داخل مدخل هلام. (D) يتم تحديد تعبئة جزئية من حارة هلام (لم تملأ إلى نهاية) من قبل السهم الأحمر، والذي يظهر حيث تم مقاطعة الجبهة حل هلام المتقدمة، إما عن طريق فقاعة الهواء المحاصرين، أو وقفة سابقة لأوانها في التحميل. السهم الأحمر في عرض المجهر يحدد نفس الموقع. (E) محتويات حارة هلام فاض دليل PhaseGuide ، وانسكب في حارة القذف ومنعت في نهاية المطاف. هذا تجاوز مرئي في المنظر السفلي من خلال المظهر المظلم لكلا من الممرات هلام و perfusion. شريط مقياس = 200 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تلطّخ الخلية وتقييم قابليتها للبقاء في لوحة المايكروفلوري. (A)باستخدام البقع الفلورية، تم تقييم الجدوى في مجموعات خلايا PCa غير المُفصلة والمفصلة التي تُزرع في الصفيحة الدقيقة الدقيقة (جميع النوى: Hoechst 33342، الأزرق؛ الخلايا الميتة: الإتوديوم هومومير-1، أحمر؛ وخلايا حية: كالسين آم، أخضر). شريط مقياس = 50 ميكرومتر (ب) تم كمية الخلايا الميتة الإجمالية في اليوم 1 من الثقافة وفصلت MDA-PCa-118b الثقافات PDX أظهرت انخفاضا كبيرا في عدد الخلايا الميتة. (ج)أظهر القياس الكمي لحجم الكتلة بالنسبة لـ PCa PDXs، في الثقافات المنفصلة وغير المفصولة، زيادة طفيفة ولكن لا يوجد فرق ذي دلالة إحصائية. تمثل الأشرطة وأشرطة الخطأ في اللوحة B الانحراف المعياري المتوسط والواصفي لـ 4 صور لكل حالة (ورقان مع صورة/رقاقة 2). تمثل النجمة (*) فروقاً ذات دلالة إحصائية (p < 0.05) مقارنة بالحالة غير المُخفَبة باستخدام اختبار t للطالب. بالنسبة للمربع والخفقان في اللوحة C، يشير الرمز المتقاطع إلى الوسط، ويمثل الخط الأفقي المتوسط، 4 صور لكل حالة (2 رقائق مع صورة/رقاقة 2). يحتوي المربع على 50% من البيانات بينما تمتد الخفقان إلى القطر الدنيا والقصوى للكتلة لكل حالة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: توصيف فصل MDA-PCa-118b في لوحة microfluidic. (أ)فصل (يسار) وغير مفكك (يمين) تم بذر مجموعات الخلايا السرطانية PCa في لوحة microfluidic و perfused لمدة تصل إلى سبعة أيام. كانت الثقافات ملطخة بثلاثة أصباغ محددة لجميع النوى (Hoechst 33342، الأزرق)، والخلايا الميتة (الإثيديوم هومديمر-1، أحمر)، وخلايا حية (كالسين صباحا، أخضر). شريط مقياس = 50 ميكرومتر (B, C) كمية من عدد الخلايا و قابلية الثقافة من الصور على مدى أسبوع واحد من الثقافة في كثافة البذر من 8000 الخلايا / μL. أشرطة وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المتوسط والمعيار من أربع صور لكل حالة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| كثافة الخلايا المرغوبة النهائية في شريحة واحدة (خلايا / μL) | وحدة التخزين المحملة لكل شريحة (μL) | عدد من رقائق على لوحة microfluidic | Mutiplier لحجم إضافي | الشكل 2C: عدد الخلايا المنفصلة المطلوبة لصفيحة ميكروويل كاملة (الخطوة 3-8) | مضاعف لل فقدان الخلايا (إزالة السترما، موت الخلية) |
الشكل 2B: بدء # خلايا PDX المنفصلة للبروتوكول (الخطوة 2.8) |
| 2,500 | 1.5 | 96 | 1.3 | 4.7E +05 | 3 | 1.4E+06 |
| 5,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 9.4E+05 | 3 | 2.8E+06 |
| 10,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 1.9E+06 | 3 | 5.7E+06 |
| 20,000 | 1.5 | 96 | 1.3 | 3.7E+06 | 3 | 1.1E+07 |
الجدول 1: تقريبيّة أوليّة ونهائيّة [بدإكس] مادة يتطلّب أن ينّا إلى تحميل واحدة 2-حارة لوحة دقيقة.
الشكل التكميلي 1: تخطيط اللوحة الدقيقة ذات المسارين. بعد البذر لوحة microfluidic، سجل الفردية نجاح تحميل رقاقة (ناجحة، غاب التحميل، لا تملأ إلى نهاية، أو تجاوز) باستخدام تخطيط لوحة 2-حارة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نحن وصف طريقة لمعالجة واستزراع خلايا الورم القابلة للحياة PDX المستمدة في نظام ثقافة 3D عالية الإنتاجية. في حين أن هذا البروتوكول يستخدم أنسجة PCa PDX ، فهو فعال بنفس القدر للأورام الأخرى المشتقة من الظهارية. تختلف خصائص الورم بين خطوط PDX الفردية حتى داخل نفس النسيج الأصلي (البروستاتا والثدي وما إلى ذلك). بعض خطوط PCa PDX هي أكثر ليفية ويصعب عزل الخلايا القابلة للحياة من بينما البعض الآخر أكثر خلوية. يمكن أن يختلف حجم الورم المشار إليه هنا ضمن إرشادات IACUC لتوفير المزيد من الأنسجة للأورام منخفضة الغلة بشكل خاص. بالإضافة إلى ذلك، يمكن جمع شظايا الورم بعد الخطوة 2.7، وإعادة هضمها، وتجميعها مع الهضم الأولي لزيادة العائد. وهذا مفيد بشكل خاص للأورام الثقيلة المصفوفة خارج الخلية. جولات إضافية من الهضم الماضي اثنين عادة ما يؤدي إلى انخفاض القدرة على البقاء وانخفاض العائد وليس من المستحسن.
تنقية السكان المستمدة من PDX ، لإزالة الخلايا الميتة / الموت أو تلويث الخلايا المضيفة ، مفيد لثقافة 3D الموسعة وتكميم الخلايا السرطانية المطلوبة. الخطوة الأولى من تنقية المذكورة هنا -تعليق الثقافة في حجم كبير نسبيا من وسائل الإعلام جنبا إلى جنب مع دوران XY في سرعات معتدلة يعزز 1) استخراج انتقائي من الخلايا التي تعتمد على التصاق للغاية، وعادة الماوس الليفي الليفية، و 2) تشكيل مجاميع الخلية لتوفير الموالية للبقاء اتصال الخلية. كفاءة استخراج الخلايا الليفية الليفية الماوس المستمدة من المضيف خلال 48 h XY خطوة التناوب عالية جدا، كما هو موضح في فونغوآخرون. الثقافات المشتركة PCa-Fibroblast هي بالتأكيد قابلة للتنفيذ، كما أثبتنا، ولكنها تتطلب مصفوفة مضبوطة (لدعم التصاق الخلايا الليفية بالمصفوفة) ونسبة أكبر من الخلايا الليفية. PDX عرضية، وعادة ما تكون تلك التي الصفات أكثر mesenchymal، وسوف تلتزم بسهولة أكبر لأسطح ثقافة الأنسجة خلال 48 ساعة دورة ثقافة الخطوة. خطوط PDX يجب أن تراقب عن كثب في المرة الأولى التي يتم فيها تنفيذ هذا البروتوكول، والمناعة لHNA، لتحديد نسبة الخلايا البشرية في السكان المنضمين وغير المنضمين. وينبغي استخدام اللوحات المعالجة في زراعة الأنسجة غير النسيجية لتشكيل الكتلة باستخدام هذه الخلايا الوماضة ( PDXs) ، وستظل الخلايا الوماتية الماوس تلتصق في النهاية بالسطح ، ولكن الفصل لن يكون فعالاً.
وبعد ثقافة التناوب، تتم معالجة الساكن الذي يحتوي على السكان غير المنضمين من خلال طريقة الطرد المركزي للتدرجات الكثافة الموصوفة. يمكن تبسيط البروتوكول المبلغ عنه هنا لاستبعاد خطوة كثافة واحدة على الأقل (على سبيل المثال، استخدام 20% و40% و 55% من الحلول فقط)، ولكن يجب استخدام الأربعة عند إنشاء هذه الطريقة مع كل PDX جديدة. يتم فصل الكتل متعددة الخلايا بسهولة من الخلايا الفردية بواسطة هذا الأسلوب، والاحتفاظ بها إلى حد كبير النمط الظاهري متفاوت المسافات وخصائص أخرى. يمثل الهُجَرُ المُنتَجُزُة أحادية الخلية إما (أ) الخلايا التي كانت ميتة/تموت قبل خطوة الدوران 48 ساعة، وبالتالي لم تُدمج أبداً في كتلة، أو (ب) الخلايا التي بقيت حية بعد دوران 48 ساعة، ولكنها لم تندمج بعد في مجموعات. ومن المهم ملاحظة أن المجموعة (ب) قد تشمل خلايا يجدها بعض المحققين مستصوبة؛ على سبيل المثال، وصفت بعض التقارير ثقافات الخلايا الأولية التي تحتوي على الخلايا الجذعية/السلف المبكرة، أو الخلايا المقاومة للأدوية، التي تطفو داخل ناطورة كخلايا مفردة ضعيفة التصنت فوق مجموعة سكانية منضمة خلاف ذلك10. ذات الصلة لدراسات السرطان، والخلايا السرطانية المتداولة (CTCs)، والخلايا بدء الورم (TICs)، أو غيرها من أنواع الخلايا التي تعزز الانبثاث مماثلة يمكن أن تكون جزءا من هذه الخلية واحدة السكان. لذلك، يجب على المحققين الذين يستخدمون بروتوكولنا تحليل مجموعة الخلايا الوحيدة المهملة بعناية لضمان عدم فقدان أي خلايا ذات أهمية. في أيدينا، والغالبية العظمى من هذه الخلايا المفردة هي إما جزء صغير من الخلايا السرطانية التي هي ميتة / الموت بسبب بروتوكول تفكك الأنسجة الأولية، أو الخلايا الليفية القوارض التي تسير بالفعل من خلال anoikis.
من المستحسن بشدة ممارسة تقنية بذر لوحة microfluidic مع خلايا أقل قيمة لضمان النجاح عند العمل مع مادة PDX محدودة وقيمة. كن على علم بوضع التلميح أثناء الاستغناء، حيث من المحتمل أن تؤدي التقنية غير السليمة إلى 1) تجاوز السعة إذا تم تطبيق الضغط أثناء التحميل، أو 2) قنوات فارغة أو مملوءة جزئيًا إذا لم يكن الطرف مركزًا فوق منفذ المدخل. وسوف يسبب الجيلية المبكرة أيضا القنوات لا ملء حتى النهاية. إذا حدث ذلك، تقليل وقت الانتظار بين إضافة الرابط المتقاطع PEGDA والاستغناء عن حل الجل، أو العمل مع aliquots أصغر من حل هلام في وقت. يتم تحسين وحدات التخزين الاستغناء المستخدمة في هذا البروتوكول بشكل جيد للنجاح مع الهيدروجيلات ها. استخدام حلول أكثر لزوجة مثل Matrigel في هذا النظام يتطلب زيادة في حجم الاستغناء إلى ~ 2 ميكرولتر لملء السليم من القنوات microfluidic. لاحظ أيضا أن اختيار 50 μL الزيادات في الخطوة 4.3، وإعداد أربع كريات الخلية في هذه الخطوة نفسها، وتكرار resuspensions في الخطوة 4.10 هي متعمدة؛ على الرغم من أنها تسفر عن المزيد من المواد من الضروري، كما أنها توفر زيادة لحساب الخسائر من الماصات المتكررة.
وتجدر الإشارة إلى أن كل PDX من المرجح أن يكون لها مورفولوجيا فريدة من نوعها وتوزيع حجم داخل هذا النموذج ثقافة 3D. من ناحية ، هذا متوقع ، بسبب تنوع مرض المريض ، وتاريخ الأنسجة ، والمعلمات المصفوفة ، والعديد من العوامل الأخرى. وأظهر تقييم توسعي لخطوط سرطان البروستاتا المتعددة في ماتريجل هذا التنوع المحتمل11. ومع ذلك، قد يفاجأ المحققون بالعثور على تباين واسع في المعلمات المذكورة أعلاه. في مخطوطة قيد الإعداد، نقدم نظرة واسعة على العديد من PDXs على هذه المنصة الثقافية. تحافظ الخلايا على استجابة متناسقة داخل كل نوع PDX، ولكن يمكن أن تختلف بشكل كبير عبر العينات، مما يؤدي إلى مجموعات تكون، على سبيل المثال، كبيرة مع كثافة خلايا عالية لكل كتلة، أو أصغر، مع اتصالات أكثر مرونة بين الخلايا. وينبغي تقييم السلوك المحدد لكل PDX من قبل المحققين على مدى تجارب متعددة، لتأكيد مورفولوجيا يمكن التنبؤ بها وخاصية. يمكن للمحققين أن يتوقعوا أن تتبع العينات السلوكيات العامة المبينة في هذه الورقة.
باختصار ، يقدم البروتوكول المقدم للباحثين طريقة جديدة لتوظيف PDXs السابق في منصة تسمح بضبط ظروف الثقافة ودمج الإشارات البيئية ثلاثية الأبعاد ذات الصلة مثل مصفوفة الأنسجة المحددة خارج الخلية (ECM) وتدفق القذف ، مما يتيح بقاء الخلايا الممتدة على مدى عدة أيام أو أسابيع. وقد تحقق توصيف مفصل لهذه الثقافات من خلال التحليلات الملطخة والمرفرفة التي تم إظهارها هنا. وبالإضافة إلى ذلك، إذا لزم الأمر، يمكن تقديم الثقافات إلى المقايسات المستندة إلى قارئ لوحة، ووضع العلامات immunofluorescent، أو استخدامها لإعداد lysates تمكين مزيد من التوصيف الجزيئي. على الرغم من أننا قد نشرت سابقا بعض عناصر من ثقافة PDX 3D داخل الهيدروجيلس، وهذا التطبيق من تنقية متعددة الep هو جديد، وسهلة الاستخدام في مختبر قياسي، وناجحة في الحفاظ على الثقافات التمثيلية عالية الجدوى. توفر منصة OrganoPlate ، في أصنافها ذات الممرين و 3 حارات ، المزيد من التعقيد من خلال نموذجها لضخ الأنسجة ، وفرصة رئيسية لاستخدام خلايا أقل في التجربة الواحدة. بالمقارنة مع نماذجنا السابقة، خفضت منصة microfluidic متطلبات الخلايا بمعامل 30 ~، لكل تجربة، والتي هي فائدة هائلة، نظرا لتوافر نادرة من أنسجة الورم PDX في معظم المختبرات. يمكّن النظام الدقيق الفلوريومي التصوير الممتد، وتطوّع المناعة، والتصوير السهل عبر مجموعة خلايا كبيرة بما يكفي (ن = 2000-4000 خلية لكل نافذة تصوير) للسماح بالتكين الكمي للنمط الظاهري في سياق التنظيم المكاني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة الوطنية للسرطان المرحلة الأولى SBIR (HHSN26120700015C) وP01CA098912.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
