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Cancer Research

एक Perfused Microfluidic मंच में रोगी-व्युत्पन्न Xenografts के पूर्व वीवो 3 डी हाइड्रोजेल संस्कृतियों के लिए बढ़ी हुई व्यवहार्यता

Published: December 5, 2020 doi: 10.3791/60872
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1,5,6, 1,7, 2, 3, 1,5,6
1Department of BioSciences, Rice University, 2Mimetas US Inc, 3Department of Genitourinary Medical Oncology Research, Division of Cancer Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Mimetas B.V., 5Department of Bioengineering, Rice University, 6Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center, 7Sheikh Ahmed Center for Pancreatic Cancer Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Summary

यह प्रोटोकॉल रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ (पीडीएक्स) की विट्रो संस्कृति में विस्तारित को सक्षम करने के तरीकों को दर्शाता है। एक कदम गैर-व्यवहार्य एकल कोशिकाओं को सीधे हटाने के माध्यम से 3 डी हाइड्रोगेल में बहुकोशिकीय क्लस्टर संस्कृतियों की समग्र व्यवहार्यता को बढ़ाता है। एक द्वितीयक कदम एक छिद्रित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में पीडीएक्स संस्कृति के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं को दर्शाता है।

Abstract

रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स), उत्पन्न जब रोगी ट्यूमर ऊतक को सीधे इम्यूनोसमझीज़ चूहों में संलग्न किया जाता है, जैविक रूप से स्थिर रहते हैं, जिससे आणविक, आनुवंशिक और हिस्टोलॉजिकल सुविधाओं के साथ-साथ मूल ट्यूमर की विषमता भी होती है। हालांकि, इन मॉडलों का उपयोग करने के लिए दवा स्क्रीनिंग सहित प्रयोगों की एक भीड़ प्रदर्शन, लागत और समय दोनों के मामले में निषेधात्मक है । त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों को व्यापक रूप से प्लेटफार्मों के रूप में देखा जाता है जिसमें कैंसर कोशिकाएं जैव रासायनिक बातचीत, आकृति विज्ञान और वास्तुकला के माध्यम से अपनी जैविक अखंडता को बनाए रखती हैं। हमारी टीम के पास हायलूरोनिक एसिड (एचए) से बने 3डी मैट्रिस का उपयोग करके विट्रो में पीडीएक्स कोशिकाओं को बनाने का व्यापक अनुभव है। पीडीएक्स से जुड़े माउस फाइब्रोब्लास्ट स्ट्रोमल कोशिकाओं को अलग करने के लिए, हम रोटेशन संस्कृति का उपयोग करते हैं, जहां स्ट्रोमल कोशिकाएं ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेटों की सतह का पालन करती हैं जबकि अलग-अलग पीडीएक्स ट्यूमर कोशिकाएं बहुकोशिकीय समूहों में तैरती हैं और स्वयं-सहयोगी होती हैं। इसके अलावा सुपरनैंट में तैरने वाली एकल, अक्सर मृत कोशिकाएं होती हैं, जो 3 डी सेल संस्कृति के लिए हाइड्रोगेल में डाउनस्ट्रीम एनकैप्सुलेशन के लिए व्यवहार्य पीडीएक्स क्लस्टर एकत्र करने में एक चुनौती पेश करती हैं। इन एकल कोशिकाओं को लाइव सेल क्लस्टर से अलग करने के लिए, हमने घनत्व चरण ढाल अपकेंद्रित्र को नियोजित किया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल सेल समूहों की स्वस्थ आबादी से गैर-व्यवहार्य एकल कोशिकाओं की कमी के लिए अनुमति देता है जिसका उपयोग आगे विट्रो प्रयोग के लिए किया जाएगा। हमारे अध्ययनों में, हम माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटों में 3 डी संस्कृतियों को शामिल करते हैं जो संस्कृति के दौरान मीडिया परफ्यूजन की अनुमति देते हैं। शुद्ध बनाम गैर-शुद्ध कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवि-आधारित व्यवहार्यता परख का उपयोग करके परिणामी संस्कृतियों का आकलन करने के बाद, हमारे परिणाम बताते हैं कि इस अतिरिक्त पृथक्करण कदम ने हमारी संस्कृतियों से गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को काफी कम कर दिया।

Introduction

पिछले एक दशक में, कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में कैंसर सेल मार्ग निर्भरता और दवा संवेदनशीलता1का आकलन करने के लिए एक उपकरण के रूप में रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDXs) के लिए नए सिरे से उत्साह का प्रदर्शन किया है । सबसे आम पीडीएक्स मॉडल मानव ट्यूमर कोशिकाओं के चमड़े के नीचे या ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण द्वारा स्थापित किए जाते हैं- एक ट्यूमर टुकड़ा, अलग ट्यूमर-व्युत्पन्न कोशिकाओं का एक समूह, या अलग परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) का एक नमूना- एक कृंतक मेजबान में। यदि ट्यूमर "ले" सफल होता है, तो ज़ेनोबेड़ा कोशिकाएं पैदा होंगी, संवहनी करेंगी, और अन्यथा एक ट्यूमर बनाने के लिए मेजबान ऊतक के साथ बातचीत करेंगी, जिसे इष्टतम आकार में काटा जा सकता है, उपविभाजित किया जा सकता है, और अन्य मेजबानों में फिर से प्रत्यारोपित किया जा सकता है। एक मॉडल प्रणाली के रूप में उनके कई फायदों में, पीडीएक्स आमतौर पर देशी ट्यूमर सेल आबादी की विषमता का एक बड़ा हिस्सा बनाए रखते हैं और मानव-विशिष्ट मार्गों और सेल प्रतिक्रियाओं2,,3के आकलन को सक्षम करते हैं। वीवो संदर्भ में वैक्यूलेचर और अन्य आसन्न स्ट्रोमा के साथ ट्यूमर बातचीत को सक्षम बनाता है और ऊतक विशेषताओं जैसे दवा प्रसार गतिशीलता, ऑक्सीजन तनाव और बाह्य मैट्रिक्स प्रभाव को पुनः प्राप्त करता है जो जैविक और यांत्रिक रूप से ट्यूमर प्रगति को प्रभावित करता है। पीडीएक्स का एक नकारात्मक पहलू ट्यूमर विस्तार के लिए और अंततः परिकल्पना परीक्षण के लिए एक कृंतक मेजबान पर उनकी निर्भरता है। क्योंकि कई पीडीएक्स अपनी कई वांछनीय विशेषताओं को खोए बिना ऊतक संस्कृति पॉलीस्टीरिन पर पारंपरिक दो-आयामी (2डी) संस्कृति के अनुकूल नहीं हो सकते हैं, इस अपेक्षाकृत नियंत्रित इन विट्रो विधि के बीच शोधकर्ताओं के लिए न्यूनतम मध्य भूमि रही है, और वीवो पीडीएक्स उपयोग में खर्च, सुविधाओं और समय आवश्यकताओं में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है।

हमने कई इन विट्रो मॉडलों का वर्णन किया है जो एक सहायक मैट्रिक्स के भीतर 3 डी सेल संस्कृति को लागू करते हैं, और हाल ही में विस्तारित किया गया है कि कई प्रोस्टेट कैंसर (पीसीए) की पूर्व वीवो संस्कृति को प्रदर्शित करने के लिए काम करें- व्युत्पन्न पीडीएक्स, दोनों अकेले और सह-संस्कृति में बोन मैरो-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट4,,5के साथ। हायलूरोनिक एसिड (एचए) आधारित हाइड्रोगेल मैट्रिस हाइड्रोगेल गहराई6के माध्यम से इमेजिंग के लिए हाइड्रोजेल विशेषताओं और ऑप्टिकल स्पष्टता पर फेसियल नियंत्रण के साथ दोनों सेल प्रकारों के लिए अनुकूलन योग्य और जैविक रूप से प्रासंगिक समर्थन प्रदान करते हैं।

परिपक्व पीडीएक्स ट्यूमर ऊतकों में विषम मानव कैंसर कोशिकाओं और माउस स्ट्रोमा (फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाओं, आदि) का एक चर मिश्रण शामिल है। विट्रो में ट्यूमर प्रगति के लिए सेल-प्रकार विशिष्ट योगदान का अध्ययन करने के लिए, ट्यूमर को अलग करना, कोशिका आबादी को अलग करना, और पारस्परिक रूप से उन्हें अंतरकोशिकीय संचार के रास्तों को विच्छेदन करने के लिए संगठित तरीके से शामिल करना लाभप्रद हो सकता है। ऊतक डाइजेस्ट के भीतर मिश्रित कोशिका आबादी में विशिष्ट संस्कृति स्थितियों के साथ अंतर अनुकूलता होती है। उदाहरण के लिए, ट्यूमर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट व्यवहार्यता को या तो सतह पालन या 3डी मैट्रिस को इंटीग्रिन लिगांड के साथ कार्यात्मक होना आवश्यक है, जबकि एपिथेलियल-व्युत्पन्न पीडीएक्स कोशिकाओं में आमतौर पर ये आवश्यकताएं नहीं होती हैं, इसके बजाय सेल-सेल इंटरैक्शन का पक्ष लेते हैं। इन मतभेदों को दूषित माउस स्ट्रोमल कोशिकाओं से PDX कोशिकाओं के प्रभावी जुदाई प्राप्त करने के लिए शोषण किया जा सकता है । ऊतक डाइजेस्ट की रोटेशन संस्कृति स्ट्रोमल कोशिका को ऊतक संस्कृति सतह का पालन करने की अनुमति देती है जबकि सेल-सेल आसंजन 24−48 घंटे में सुपरनेट में बहुकोशिकीय समूह बनाने के लिए घूर्णन संस्कृति सतह के ऊपर तैरते पीडीएक्स कोशिकाओं को ड्राइव करता है। इन समूहों की विशिष्ट विशेषताएं पीडीएक्स (उदाहरण के लिए, बड़े, तंग, अत्यधिक गोलाकार समूहों या छोटे, लूजर समुच्चय अंगूर के गुच्छों जैसी होती हैं), लेकिन आम तौर पर जैविक रूप से प्रासंगिक आकार (50−250 माइक्रोन व्यास) के होते हैं, जो अंतरकोशिकीय संपर्कों पर भरोसा करने वाले सेलुलर इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए पर्याप्त होते हैं।

ट्यूमर पुनर्प्राप्ति और प्रसंस्करण अनिवार्य रूप से कुछ हद तक संपाश्र्वक कोशिका मृत्यु में परिणाम देता है, या तो यांत्रिक/एंजाइमेटिक व्यवधान से अल्पकालिक क्षति के कारण, या चुने हुए संस्कृति स्थितियों के साथ उपआबादी की दीर्घकालिक असंगति । एक प्रारंभिक थोक जुदाई के रूप में रोटेशन संस्कृति की उपयोगिता के बावजूद, मृत या मरने वाली कोशिकाओं को अनिवार्य रूप से पीडीएक्स समूहों के साथ स्थानांतरित कर दिया जाता है और परिणामी संस्कृति को प्रभावित कर सकता है। ये मृत कोशिकाएं अक्सर व्यक्तिगत पीडीएक्स कोशिकाएं होती हैं जिन्हें क्लस्टर में एकीकृत नहीं किया जाता था, माउस स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट जो चयनित संस्कृति स्थितियों, या विशेष रूप से नाजुक एंडोथेलियल कोशिकाओं में जीवित नहीं रह सकते हैं। इस तरह के मरने वाली कोशिकाएं "जीवित बचे" से प्रायोगिक परिणामों को प्रभावित कर सकती हैं और फ्लोरोसेंट छवि-आधारित व्यवहार्यता स्क्रीनिंग परख के माध्यम से मात्राकरण को काफी हद तक प्रभावित कर सकती हैं। इस विधि से जीवित पीडीएक्स कोशिकाओं के चयन में सुधार करने के लिए, हमने पीडीएक्स मिश्रण से व्यक्तिगत मृत/मरने वाली कोशिकाओं को आसानी से हटाने और मुख्य रूप से लाइव बहुकोशिकीय समूहों को बनाए रखने के लिए घनत्व चरणों के साथ अपकेंद्रित्र विधियों को अनुकूलित किया।

3 डी संस्कृति में परिणामी पीडीएक्स-व्युत्पन्न समूहों के अध्ययन को बढ़ाने के लिए, हमने एक माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित परफ्यूजन कल्चर प्लेटफॉर्म, ऑर्गेनोप्लेट(चित्रा 1)का उपयोग किया, जो एक उच्च-थ्रूपुट अंग-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म है जो 384-वेल माइक्रोटिटर प्लेट-बेस(चित्रा 1A)7, 8,8पर 96 व्यक्तिगत परफ्यूस्ड, 3 डी संस्कृतियों की एक साथ संस्कृति के लिए अनुमति देता है। 2-लेन माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में, एक ऊतक चिप दो माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों(चित्रा 1B,जेल चैनल: लाल, पर्फ्यूजन चैनल: नीला) से जुड़ा हुआ है जो एक पंक्ति में चार कुओं का विस्तार करता है। दो माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को एक छोटे प्लास्टिक रिज द्वारा अलग किया जाता है जिसे फेजगाइड कहा जाता है जो एक चैनल के ओवरफ्लो को अपने निकटवर्ती पड़ोसी चैनल में रोकता है, और साथ ही जेल और परफ्यूजन चैनल9की सामग्री के बीच झिल्ली मुक्त इंटरफ़ेस की अनुमति देता है। क्योंकि माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट के नीचे माइक्रोस्कोप ग्रेड ग्लास से बना है, संस्कृतियों को एक मानक या स्वचालित माइक्रोस्कोप के साथ प्लेट के नीचे के माध्यम से अवलोकन खिड़की में देखा जा सकता है। पर्फ्यूजन माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में एक प्रोग्रामेबल रॉकर के साथ स्थापित किया गया है, जो जलाशय कुओं(चित्रा 1C)के बीच माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के माध्यम से मीडिया को चलाने के लिए गुरुत्वाकर्षण का उपयोग कर रहा है। पर्फ्यूजन प्रवाह-नकल स्थिर संस्कृति की तुलना में ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को अधिक बारीकी से पुनः रीकैपिटुलेट करता है, जिससे कतरनी तनाव के समावेश और गैसों और पोषक तत्वों के उन्नत वितरण की अनुमति मिलती है। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में एक परफुसेस कैंसर सेल संस्कृति को बनाए रखने के लाभों को पहले वर्णित किया गया है क्योंकि स्तन कैंसर संस्कृतियों ने एक ही कोशिकाओं की स्थिर 3 डी संस्कृति की तुलना में इष्टतम व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है7।

वर्तमान रिपोर्ट में लाइव मल्टीसेलुलर पीडीएक्स समूहों को अलग-थलग करने के लिए एक अनुकूलित घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र विधि का वर्णन किया गया है और पर्फ्यूसाबल माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटों के भीतर 3 डी पीडीएक्स संस्कृतियों की स्थापना में इसकी उपयोगिता को दर्शाता है। क्योंकि अनुसंधान प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या PDX उपयोग की सुविधा के तरीकों की मांग कर रहे हैं, हम आशा है कि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल तत्काल उपयोगिता का होगा ।

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Protocol

ट्यूमर ऊतक रोगी सहमति के साथ और एक अनुमोदित संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) प्रोटोकॉल के अनुसार प्राप्त किया गया था । एक स्वीकृत संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) प्रोटोकॉल के अनुसार Xenografts प्रत्यारोपित, उगाया और काटा गया था।

नोट: सभी काम एक बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना है बांझपन बनाए रखने के लिए । सभी कदम कमरे के तापमान पर आयोजित किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो।

1. पीडीएक्स प्रसंस्करण के लिए सामग्री की तैयारी

  1. ऑटोक्लेव संदंश और स्केलपेल हैंडल या रेजर ब्लेड।
  2. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर या कमरे के तापमान पर ऊतक वियोजन के रूप में उसी दिन गल वियोजन एंजाइम समाधान।
    नोट: 37 डिग्री सेल्सियस पर विगलन की सलाह नहीं दी जाती है, क्योंकि यह कुछ वियोजन एंजाइमों को निष्क्रिय कर सकता है।
  3. पीडीएक्स कल्चर मीडियम (दुल्बेको के संशोधित ईगल मीडियम-न्यूट्रिएंट मिक्सचर एफ-12 [डीएमईएम-एफ12] के साथ 100 यू/एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के कम से कम 100 एमएल तैयार करें और 30% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस]), और पीडीएक्स प्रोसेसिंग माध्यम के कम से कम 25 एमएल (डीएमईएम-एफ12 के साथ 100 यू/एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन और कोई एफबीएस नहीं)। उपयोग करने के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. पीडीएक्स वियोजन और स्ट्रोमल घटक का प्रारंभिक शुद्धिकरण

  1. ऑटोक्लेव किए गए बर्तन, 70 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर्स (2−3), 60 एमएम राउंड टिश्यू कल्चर डिश (2), 6-वेल टिश्यू कल्चर प्लेट्स, बाँझ 50 एमएल शंकुल सेंट्रलाइज ट्यूब, और बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) इकट्ठा करें। गर्म संस्कृति मध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस तक और वियोजन एंजाइम समाधान को कमरे के तापमान पर आने की अनुमति देती है।
  2. जब पीडीएक्स ऊतक माउस होस्ट में 1.0−1.5 सेमी के व्यास तक पहुंच गया है, तो शल्य चिकित्सा मानक साधनों से माउस से ट्यूमर को हटा दें (उदाहरण के लिए, स्वीकृत संज्ञाहरण के तहत) और पीडीएक्स संस्कृति माध्यम(चित्रा 2 ए)के साथ 50 एमएल ट्यूब में बर्फ पर स्टोर करें। ऊतक को तुरंत संसाधित करें, नीचे दिए गए चरणों के माध्यम से, कोशिका व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए, अधिमानतः फसल के बाद 1−2 घंटे के भीतर।
  3. ट्यूमर ऊतक को पूर्व-तौला बाँझ 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। रक्त और संदूषकों को हटाने के लिए बाँझ पीबीएस के 30 एमएल के साथ 6x कुल्ला। जितना हो सके तरल निकालें और ट्यूमर ऊतक का वजन करें।
  4. एक बाँझ रेजर ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग कर ~ 1 मिमी3 टुकड़ों में एक 60 मिमी दौर ऊतक संस्कृति पकवान और कीमा में ट्यूमर ऊतक हस्तांतरण।
  5. ट्यूमर घोल इकट्ठा करने और एक नई बाँझ 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए पीडीएक्स प्रसंस्करण माध्यम के 5 एमएल जोड़ें। पीडीएक्स प्रसंस्करण माध्यम के एक और 5 एमएल के साथ संस्कृति पकवान कुल्ला, तो वियोजन एंजाइम समाधान (10 एमएल/जी ट्यूमर, कम से 5 मिलीएल) के साथ, ५० एमएल ट्यूब के लिए सभी कुल्ला जोड़ने ।
  6. कोमल मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट इनक्यूबेट। इनक्यूबेशन समय के माध्यम से ट्यूब धीरे आधे रास्ते भंवर ।
  7. ऊपर और नीचे धीरे से एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ गुच्छे को तोड़ने के लिए । एक नई बाँझ 50 एमएल ट्यूब पर रखा एक 70 माइक्रोन सेल छलनी के साथ फिल्टर कोशिकाओं।
    नोट: एक से अधिक छन्नी आवश्यक हो सकता है।
  8. 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज पैलेट कोशिकाओं के लिए। पीडीएक्स कल्चर मीडियम के 2−3 एमएल में सुपरनेट और रिसिपेंड को हटा दें। हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  9. प्रति चिप वांछित सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए आवश्यक अलग-अलग पीडीएक्स-व्युत्पन्न कोशिकाओं की आवश्यक संख्या का अनुमान लगाने के लिए तालिका 1 का उपयोग करें।
    नोट: तालिका 1 में मान एक प्रारंभिक बिंदु होने का इरादा कर रहे हैं । ठंड/वसूली से ऊतक व्यवहार्यता/सेलुलरिटी और सेल लॉस के कारण वास्तविक मूल्य भिन्न होंगे । PDX ट्यूमर भी एक दिया कैंसर प्रकार के भीतर व्यक्तियों रहे है तो इन मूल्यों अनुभवजन्य समायोजित किया जाना चाहिए ।
  10. चरण 2.9 में गणना की गई संख्या में से, प्लेट 1−2 x10 6 कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रति अच्छी तरह से पीडीएक्स संस्कृति माध्यम के 5 एमएल में प्लेट करें। क्लस्टर गठन (चित्रा2B) को बढ़ावा देने के लिए कोमल झटकों (50−55 आरपीएम) के साथ 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता) । क्लस्टर बनने के बाद, अपकेंद्रित्रीकरण के लिए धारा 3 पर आगे बढ़ें।
  11. 50% एफबीएस + 40% DMEM-F12 + 10% डिमेथाइल सल्फॉक्साइड (DMSO) या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्राथमिक सेल ठंड माध्यम में प्रारंभिक वियोजन से अप्रयुक्त पीडीएक्स कोशिकाओं को क्रायोप्रिजर्वर्व किया।
    नोट: अनुयायी माउस स्ट्रोमल कोशिकाओं को भी ऊतक प्लेट सतह से बरामद किया जा सकता है, यदि वांछित हो, तो संस्कृति माध्यम के साथ संक्षेप में कुल्ला करके और मानक साधनों से विस्तार करके।
  12. क्रायोप्रीवित पीडीएक्स ट्यूमर कोशिकाओं/माउस स्ट्रोमा के बाद के उपयोग के लिए, 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में कोशिकाओं को गल। गिनती और एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट में थाली के रूप में 3 अनुभाग के लिए आगे बढ़ने से पहले कदम २.१० में वर्णित है । क्रायोप्रिजर्वेशन से व्यवहार्यता नुकसान को समायोजित करने के लिए पीडीएक्स कोशिकाओं की संख्या ~ 20% तक बढ़ाएं।

3. एकल कोशिकाओं से पीडीएक्स-व्युत्पन्न समूहों का घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र-आधारित पृथक्करण

  1. बाँझ 50 एमएल शंकु नली में बाँझ 10x हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएस) के 2 एमएल के साथ 18 मिली घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र समाधान को अच्छी तरह से मिलाकर 100% घनत्व ढाल समाधान के 20 एमएल तैयार करें। बाँझ 1x एचबीएसएस के साथ इस 100% समाधान को कमजोर करके और अच्छी तरह से मिश्रण करके 20%, 30%, 40%, और 55% घनत्व ढाल समाधान में से प्रत्येक को 10 एमएल बनाएं।
    नोट: ये वॉल्यूम दो 15 एमएल ग्रेडिएंट्स के लिए पर्याप्त हैं जिनका उपयोग ~ 15 x 106 कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जा सकता है। यदि ~ 15 x 106 कोशिकाओं से कम अलग कर रहा है, तो दूसरे ढाल को अपकेंद्रित्रीकरण के लिए संतुलन के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  2. 15 एमएल शंकु नली के नीचे 55% घनत्व ढाल समाधान के 3 एमएल जोड़ें। एक कोण पर ट्यूब होल्डिंग, बहुत धीरे परत 55% परत के शीर्ष पर 40% घनत्व ढाल समाधान के 3 ml, धीरे धीरे ट्यूब के कोण पक्ष पर तरल वितरण परतों मिश्रण से बचने के लिए। 30% घनत्व ढाल समाधान के साथ दोहराएं।
  3. 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट, रिंसिंग प्लेट सतह के साथ पीडीएक्स रोटेशन संस्कृतियों के सुपरनेट को धीरे-धीरे इकट्ठा करें। 2 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज पैलेट कोशिकाओं के लिए।
  4. कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक ढाल की संख्या के अनुसार 20% घनत्व ढाल समाधान के 3 एमसीएल में सेल पेलेट को सुपरनेट निकालें और फिर से खर्च करें। सावधानी से ढाल (ओं) के शीर्ष पर कोशिकाओं के साथ 20% घनत्व ढाल समाधान परत । यदि केवल कोशिकाओं के लिए एक ढाल ट्यूब का उपयोग कर, सेल मुक्त 20% घनत्व ढाल समाधान के साथ शेष ढाल ट्यूब शीर्ष ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस, 2,000 x ग्राम,और 0 ब्रेक पर 30 मिनट के लिए एक स्विंग बाल्टी रोटर अपकेंद्रित्र में ट्यूबों और अपकेंद्रित्र टोपी।
  6. अपकेंद्रित्र के बाद, अंश दिखाई देंगे(चित्रा 2C)। ताजा 15 एमएल ट्यूबों में अंशों के 2−3 एमएल ले लीजिए। प्रत्येक अंश में बाँझ 1x एचबीएसएस के 3−4 वॉल्यूम जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए उलटा।
  7. 3 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज पैलेट कोशिकाओं के लिए। सुपरनेट निकालें और पीडीएक्स प्रोसेसिंग मीडियम के 1−2 एमएल में सेल पेलेट को रीसस्ट करें।
    नोट: व्यवहार्य पीडीएक्स सेल क्लस्टर आमतौर पर 40−55% घनत्व ग्रेडिएंट सॉल्यूशन इंटरफेस(चित्रा 2D)में पाए जाते हैं, जिसमें अधिकांश पीडीएक्स के लिए 20−40% घनत्व ढाल समाधान इंटरफेस पर जमने वाली एकल मृत/मरने वाली कोशिकाएं होती हैं।
  8. संकुल सेल निलंबन में सेल संख्या का आकलन करने के लिए वियोजन एंजाइम समाधान की एक समान मात्रा के साथ फिर से वियोजन के लिए एक छोटे, प्रतिनिधि aliquot (50−100 μL) निकालें । हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।

4. हाइड्रोजेल तैयारी और माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट सीडिंग

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एचए हाइड्रोगेल समाधान (थिओल-संशोधित एचए, एचए-एसएच; थिओल-रिएक्टिव पॉलीथीन ग्लाइकोल डायक्रिलेट, पेगडा) का पुनर्गठन करें।
  2. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, संस्कृति आर्द्रता और इष्टतम इमेजिंग स्थितियों को बनाए रखने के लिए 2-लेन माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट के अवलोकन खिड़की कॉलम (कॉलम 3, 7, 11, 15, 19, 23) में सभी कुओं में एचबीबीएस के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  3. वांछित कोशिका घनत्व (यानी, 5,000 कोशिकाओं/μL) पर हाइड्रोजेल के 50 माइक्रोन के लिए आवश्यक धारा 3 से सेल निलंबन की मात्रा की गणना करें। एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सीडिंग के लिए, गणना की गई मात्रा को 4 बाँझ 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूबों में से प्रत्येक में एलिकोट करें।
    नोट: एचए हाइड्रोगेल के पास जेलेशन के लिए एक निश्चित समय होता है। यदि समय से पहले जेलेशन होता है तो वितरण पर उपयोगकर्ता दक्षता के लिए जेल समाधान एलिकोट्स की मात्रा को समायोजित करें।
  4. उपयोग से तुरंत पहले 1 एन नाओएच के साथ एचए-एसएच समाधान के पीएच को 8.0 तक समायोजित करें। पेगडा के 10 माइक्रोन के साथ एचए-एसएच के 40 माइक्रोन को मिलाकर और समय के साथ जेलेशन की निगरानी करके एक परीक्षण जेलेशन करें। जेलेशन आमतौर पर पेगडा क्रॉसलिंकर के साथ एचए-एसएच को मिलाने के बाद 5−8 मिनट शुरू होता है।
  5. पैलेट कोशिकाओं के लिए 2 मिनट (200 x ग्राम,कमरे का तापमान) के लिए सेंट्रलाइज सेल सस्पेंशन एलिकोट्स। ध्यान से एचए-एसएच की उचित मात्रा में सुपरनैंट और रिसिप्ट कोशिकाओं को हटा दें।
    नोट: अंतिम हाइड्रोगेल एक 4:1 एचए-एसएच: PEGDA समाधान (मात्रा से) है तो कोशिकाओं को एक ५० μL अंतिम मात्रा के लिए एचए-एसएच के ४० μL में फिर से निलंबित किया जाना चाहिए ।
  6. एचए में कोशिकाओं के एक aliquot में PEGDA के 10 μL जोड़ें । माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सीडिंग करने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं और 1−3 मिनट (चरण 4.4 से जेलेशन समय के आधार पर) प्रतीक्षा करें।
    नोट: सीडिंग से पहले शुरू की जेलेशन प्रतिक्रिया की अनुमति देने से सेल बसने को कम करने में मदद मिलती है।
  7. एक चैनल को 1.5 माइक्रोन वॉल्यूम वितरित करने के लिए एक टिप को चिपकाएं जो पिपेट को दोहराते हैं और एचए हाइड्रोगेल समाधान में कोशिकाओं के साथ लोड करते हैं। यहां तक कि सेल वितरण सुनिश्चित करने के लिए हाइड्रोगेल एलिकोट को अच्छी तरह से मिश्रित रखना याद रखें।
  8. माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को बीज करने के लिए, प्लेट में पिपेट टिप लंबवत संरेखित करें, जबकि धीरे-धीरे जेल इनलेट (कॉलम 1, 5, 9, 13, 17, 21) के केंद्र में टिप रखने के लिए संपर्क सुनिश्चित करने के लिए, लेकिन हाइड्रोगेल समाधान वितरण करते समय कोई दबाव नहीं। समय से पहले हाइड्रोगेल ठोसकरण को रोकने के लिए जल्दी से काम करना, प्रत्येक जेल इनलेट में 1.5 माइक्रोन जेल समाधान वितरित करें।
  9. प्लेट के ऊपर से, प्लेट के नीचे, या माइक्रोस्कोप द्वारा देखने के द्वारा माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों की स्थिति को भरने की स्थिति का निरीक्षण करें, और लोडिंग का आकलन करें, एक गाइड के रूप में चित्रा 3 का उपयोग करके (चित्रा 3 एमें सफल लोडिंग, चित्रा 3 बीमें पाइपट पोजिशनिंग मार्गदर्शन, चित्रा 3 सी में लोडिंग को याद किया, चित्रा 3डी में समाप्त नहीं हुआ, चित्रा 3Eमें ओवरफ्लो) । तकनीक में किसी भी आवश्यक समायोजन की पहचान करें जो चिप्स के अगले दौर के लिए सफलता भरने में सुधार कर सकता है (समस्या निवारण सुझावों के लिए चर्चा देखें)।
  10. एचए समाधान में शेष 3 एलिकोट्स कोशिकाओं के साथ चरण 4.6−4.9 दोहराएं। अगले एलिकोट (~ 1 मिनट) तैयार करते समय प्लेट को उलटें।
    नोट: 1 मिनट प्रतीक्षा समय और प्लेट के उलटा कोशिकाओं के 3 डी वितरण में सुधार के रूप में जेलेशन होता है बसने सेल को कम करने ।
  11. सभी चिप्स भरने के बाद, एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें जब तक कि जेलेशन पूरा न हो जाए (~ 45 मिनट)।
  12. प्रदान किए गए मैनुअल का उपयोग करते हुए, यह सुनिश्चित करें कि परफ्यूजन रॉकर सही परफ्यूजन सेटिंग्स (14 डिग्री कोण, 4 मिनट अंतराल) के साथ सेल कल्चर इनक्यूबेटर में स्थापित किया गया है।
  13. सभी मध्यम इनलेट्स (कॉलम 2, 6, 10, 14, 18, 22) में पीडीएक्स कल्चर मीडियम के 50 माइक्रोन जोड़ें और चेक करें कि क्या चैनल प्लेट को फ्लिप करके ठीक से भरे जाते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को भरने के लिए तरल को प्रोत्साहित करने के लिए धीरे-धीरे प्लेट को सतह के खिलाफ टैप करें।
  14. सभी मध्यम आउटलेट (कॉलम 4, 8, 12, 16, 20, 24) के लिए डीएमईएम-एफ12 (10% एफबीएस) के 50 माइक्रोन जोड़ें। यदि कोई हवा के बुलबुले परफ्यूजन चैनल में फंस जाते हैं, तो धीरे-धीरे एक सतह के खिलाफ प्लेट को टैप करके हटा दें।
  15. माइक्रोस्कोप और प्लेट लेआउट फॉर्म(पूरक चित्रा 1),रिकॉर्ड चिप भरने की सफलता का उपयोग करना। आगे प्रयोगात्मक उपयोग से अनुचित तरीके से भरे हुए चिप्स को बाहर करें।
  16. एक झुकाव घुमाव पर प्लेट रखें जो 14 डिग्री झुकाव और 4 मिनट के चक्र के लिए सेट किया गया है। हर 2 दिन में पीडीएक्स कल्चर मीडियम (इनलेट में पहले 50 माइक्रोन, फिर आउटलेट में 50 माइक्रोल) को बदलें।

5. सेल धुंधला, इमेजिंग, और छवि मात्राकरण

  1. तीन फ्लोरोसेंट रंगों (होचस्ट 33342, एथिडियम होमाडिमर-1, कैल्सीन एसीटॉक्सीमिथाइल [AM]) वाले सेल फिजिबिलिटी परख समाधान तैयार करें।
    1. प्रत्येक डाई के स्टॉक समाधान इस प्रकार तैयार करें: होचस्ट 33342 डिओनाइज्ड पानी में 1.6 mm (1 मिलीग्राम/एमएल) पर; कालसिन AM 4 mM पर निर्जल DMSO में; डीएमएसओ/एच 2 ओ (1:4, v/v) में2mM पर एथिडियम होमोडिमर-1 ।
      नोट: स्टॉक कैल्सीन एएम और एथिडियम होमेमर-1 समाधान सामग्री की तालिका में विख्यात किट में प्रदान किए जाते हैं।
    2. एचबीएसएस या फिनॉल रेड-फ्री मीडियम में सिंगल वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें, जिसमें तीनों रंग होते हैं । प्रत्येक सेल प्रकार और मैट्रिक्स के लिए अंतिम कार्य एकाग्रता का अनुकूलन करें, Hoechst 33342 के लिए 1.6−8.0 माइक्रोन, कैल्सीन एएम के लिए 0.1−10 माइक्रोन, और एथिडियम होमोडिम-1 के लिए 0.1−10 माइक्रोनएम।
  2. संस्कृति माध्यम निकालें और वांछित माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स (इनलेट में 75 माइक्रोल, आउटलेट में 25 माइक्रोल) के लिए काम करने की व्यवहार्यता डाई समाधान लागू करें और 1 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में परफ्यूजन रॉकर पर वापस रखें।
  3. फ्लोरोसेंट फिल्टर (उत्तेजन/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के रूप में सूचीबद्ध) के साथ मैनुअल या स्वचालित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके दाग संस्कृतियों की अवलोकन खिड़कियों की छवि, एनएम में) सभी नाभिक (Hoechst 33342, 350/461), मृत कोशिका नाभिक (एथिडियम होमडिमर-1, 528/617), और लाइव सेल साइटोप्लाज्म (कैल्सीन एएम, 494/517) का निरीक्षण करने के लिए।
  4. 20x एयर ऑब्जेक्ट का उपयोग करके ≤1 माइक्रोन के चरण आकार के साथ 140 माइक्रोन जेड-स्टैक कैप्चर करें। देखने के तीन क्षेत्रों ओवरलैप की एक छोटी राशि के साथ पूरे माइक्रोचैनल छवि की जरूरत है । डबल सैंपलिंग से बचने के लिए, प्रति चिप देखने के केवल दो फ़ील्ड की छवि।
    नोट: इमेजिंग शर्तों को उचित NyQuist नमूना सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। लेखकों के अनुभव में, एक तेजी से इमेजिंग प्रणाली, या तो एक पारंपरिक epi-फ्लोरेसेंस स्रोत या एक कॉन्फोकल पर गूंज स्कैनिंग मोड के deconvolution पर आधारित है, पूरी तरह से एक पूर्ण जेड-स्टैक परख करने के लिए आवश्यक है, तीन लेजर रंगों के साथ, एक प्लेट पर 96 चिप्स के पार उचित समय के भीतर (सेटअप सहित स्वचालित इमेजिंग के साथ लगभग 3.5 एच)।
  5. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, वांछित मात्रात्मक डेटा के लिए जेड-स्टैक छवियों को परखें, जैसे कि आकृति विज्ञान, एकत्रीकरण राज्य, या अन्य विशेषताएं। कोशिका व्यवहार्यता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, मृत कोशिकाओं (लाल) और कुल कोशिका नाभिक (नीला) की संख्या की गणना करें।

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Representative Results

एक प्रोग्रामेबल परफ्यूजन रॉकर को एक मानक पानी-लानत सेल कल्चर इनक्यूबेटर में तैयार किया गया था, और लोडिंग(चित्रा 1)के लिए एक मानक जैव सुरक्षा कैबिनेट में दो-लेन माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटें तैयार की गई थीं। एक एमडीए-पीसीए-118b पीडीएक्स ट्यूमर को वीवो में विस्तारित किया गया था, जब यह अधिकतम आकार तक पहुंच गया था, और लगभग एकल-सेल राज्य(चित्रा 2 ए)में कोशिकाओं के घोल निलंबन बनाने के लिए प्रोटोकॉल सेक्शन 2 में वर्णित के रूप में अलग किया गया था। घोल 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में तिरस्कृत किया गया था, और एक XY रोटेटर पर रखा के रूप में वर्णित है, ४८ घंटे के लिए । माउस स्ट्रोमा ऊतक संस्कृति प्लेट के नीचे से जुड़ा हुआ है, जैसा कि पहले वर्णित किया गया है, और मानव पीडीएक्स कोशिकाएं माध्यम में तैरती रहीं, समूहों(चित्रा 2B)में इकट्ठा हुईं। समाधान के दौरान भी असेंबल की गई एकल कोशिकाएं दिखाई दे रही थीं।

प्रोटोकॉल सेक्शन 3 में तरीकों का इस्तेमाल करते हुए एक सेंट्रलाइज ट्यूब में एक स्टेप डेंसिटी रेडिएंट स्थापित किया गया था । पीडीएक्स कोशिकाओं के सुपरनेट निलंबन को मल्टीवेल प्लेट से धीरे-धीरे एस्पिट किया गया था, जो कदम ढाल पर लोड किया गया था, और वर्णित के रूप में अपकेंद्रित्र किया गया था। अपकेंद्रित्र के बाद, पीडीएक्स क्लस्टर युक्त एक धुंधला बैंड, अंश 2 और 3 के बीच इंटरफ़ेस के पास दिखाई दे रहा था, और अंश 1 और 2(चित्रा 2डी)के बीच इंटरफ़ेस में एकल कोशिकाओं की पहचान की गई थी। अंशों को वर्णित के रूप में एकत्र किया गया था, एचबीबीएस में आगे पतला किया गया था, और घनत्व ढाल समाधान को हटाने के लिए फिर से अपकेंद्रित्र किया गया था। सुपरनेट को एस्पेरेटेड किया गया था, और परिणामी सेल छर्रों को पीडीएक्स प्रसंस्करण माध्यम में फिर से निलंबित कर दिया गया था। प्रत्येक प्रसंस्कृत अंश का एक छोटा सा एलिकोट माइक्रोस्कोप द्वारा मूल्यांकन किया गया था, इस बात की पुष्टि करने के लिए कि अपेक्षित अंश में पीडीएक्स क्लस्टर शामिल था, और यह कि अलग-अलग अंश में मुख्य रूप से एकल कोशिकाएं निहित थीं।

एचए हाइड्रोगेल समाधानों का पुनर्गठन प्रोटोकॉल धारा 4 में वर्णित किया गया था, और हाइड्रोजेल समाधान में पीडीएक्स समूहों को फिर से निलंबित कर दिया गया था। पीडीएक्स समाधानों को माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट पर चिप्स में लोड किया गया था और सफल लोडिंग(चित्र 3)के लिए मूल्यांकन किया गया था। ज्यादातर मामलों में, लोडिंग वॉल्यूम की तकनीक और समायोजन के साथ कुछ अभ्यास के बाद चिप्स का 90% सफलतापूर्वक लोड किया गया था। चिप्स की वांछित संख्या लोड करने के बाद, और वर्णित जेलेशन के लिए इनक्यूबेटिंग के बाद, पीडीएक्स संस्कृति माध्यम को माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में जोड़ा गया था, और प्लेट को परफ्यूजन के साथ सुसंस्कृत किया गया था।

फ्लोरोसेंट रंगों और प्रोटोकॉल सेक्शन 5 में तरीकों का उपयोग करना, और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, 3 डी माइक्रोफ्लुइडिक पीडीएक्स संस्कृति व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान दोनों में मूल्यांकन किया गया था और घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र अंतरण अलग स्थितियों(चित्रा 4A)में मूल्यांकन किया गया था। इन प्लेटों की छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर जेड-स्टैक के रूप में दर्ज किया गया था और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में सेल व्यवहार्यता के लिए मूल्यांकन किया गया था। 1 दिन, उन संस्कृतियों जो जुदाई विधि से गुजरना 10 गुना कम एकल, मृत कोशिकाओं (लाल), असंरृप्त संस्कृतियों(चित्रा 4B)की तुलना में प्रदर्शित किया । महत्वपूर्ण बात यह है कि अलग किए गए समूहों में मुख्य रूप से जीवित कोशिकाएं (हरी) शामिल थीं। क्लस्टर आकार वितरण(चित्रा 4C)के लिए कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर की पहचान नहीं की गई थी।

सात दिनों(चित्रा 5A)के लिए माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में संस्कृतियों को आगे बनाए रखा गया था। नमूनों का मूल्यांकन समय-समय पर किया जाता था, ऊपर के रूप में एक ही इमेजिंग और मात्राकरण विधियों का उपयोग करके। जीवित कोशिकाओं की कुल संख्या लगातार बनी रही(चित्रा 5B)और समूहों ने संस्कृति के जीवन पर ~ 80% व्यवहार्यता(चित्रा 5C)बनाए रखा। असंपादित स्थिति में सेल घनत्व लगभग एक तिहाई अलग स्थिति है क्योंकि कोशिका गणना के दौरान एकल कोशिकाएं जीवित हैं, लेकिन हाइड्रोगेल के भीतर जल्दी से मर जाती हैं। घनत्व ढाल जुदाई के बिना क्लस्टर आकार में भी अधिक परिवर्तनशीलता है।

Figure 1
चित्रा 1: 2 लेन perfusable microfluidic प्लेट । (क)2 लेन की माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट एक मानक ३८४-वेल माइक्रोटिटर प्लेट है जिसमें एक संशोधित बॉटम होता है जिसमें ग्लास प्लेटों के बीच एम्बेडेड माइक्रोफ्लुइडिक चैनल होते हैं । प्रत्येक प्लेट में 3 डी सेल संस्कृति के लिए 96 ऊतक चिप्स होते हैं। (ख)जैसा कि प्लेट के ऊपर से देखा जाता है, एक एकल 2-लेन माइक्रोफ्लुइडिक चिप जेल चैनल (लाल) और परफ्यूजन चैनल (नीला) से जुड़ी पंक्ति में 4 कुओं से बना है; जेल इनलेट, पर्फ्यूजन इनलेट, ऑब्जर्वेशन विंडो और परफ्यूजन आउटलेट। (ग)परफ्यूजन माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में एक प्रोग्रामेबल रॉकर के साथ हासिल किया जाता है जो परफ्यूजन इनलेट और आउटलेट कुओं के बीच मीडिया को चलाने के लिए गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करता है जो मीडिया जलाशय हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पीडीएक्स क्लस्टर अलगाव। (A)प्राथमिक पीडीएक्स ऊतक को विच्छेदन करें और मानव पीसीए कोशिकाओं और माउस ट्यूमर स्ट्रोमा दोनों युक्त एकल कोशिका निलंबन में अलग करें। या तो क्रायोप्रिजर्विज डेस सेल मिश्रण या(बी)ट्यूमर कोशिकाओं को शांत करने के लिए रोटेशन संस्कृति में जोड़ें और माउस स्ट्रोमल कोशिकाओं को ऊतक संस्कृति प्लेट (48 एच) का पालन करने की अनुमति दें। (ग)अवशिष्ट मृत एकल कोशिकाओं को हटाने के लिए घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र का उपयोग करें, और(डी)घनत्व ढाल परतों 40% और 55% (लाल धराशायी बॉक्स) के बीच इंटरफेस पर व्यवहार्य पीडीएक्स क्लस्टर एकत्र करें। (ई)पीडीएक्स क्लस्टरों को ठीक करें, हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान में पुनर्संकल करें, और एक दोहराने वाले पिपेट के साथ प्लेट पर वितरित करें। (एफ)उदाहरण गणना, तालिका 1के अनुरूप, एक प्लेट में सभी चिप्स के लिए एक अंतिम वांछित सेल एकाग्रता तक पहुंचने के लिए आवश्यक प्रारंभिक सेल संख्या प्रदर्शित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट लोडिंग की निगरानी। सफलता और त्रुटियों को लोड करता है, माइक्रोस्कोप द्वारा पुष्टि के साथ आंख (ऊपर और नीचे के दृश्यों में) द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। (क)सफल लोडिंग की पहचान ऊपर और नीचे के दृश्यों में एक खुली (उज्ज्वल) परफ्यूजन लेन और नीचे देखने में थोड़ा गहरा जेल लेन द्वारा की जाती है। माइक्रोस्कोप द्वारा दृश्य इस बात की पुष्टि करता है कि जेल लेन पूरी तरह से कोशिकाओं और जेल अग्रदूत के साथ भरी हुई थी, बिना बगल की लेन में फैलने के। (ख)जेल वितरण के दौरान सही पिपेट टिप प्लेसमेंट का प्रदर्शन करने वाला कार्टून, सही प्लेसमेंट के साथ इनलेट पोर्ट (बाएं) के ठीक ऊपर होने के साथ और गलत प्लेसमेंट ऑफ-केंद्रित (मध्य) या इनलेट पोर्ट (दाएं) पर बल लागू करना। (ग)सभी दृश्यों में उज्ज्वल लेन एक चूक लोडिंग का संकेत देती है, जिससे यह सुझाव मिलता है कि पिपेट टिप को जेल इनलेट के भीतर सही ढंग से नहीं रखा गया था। (घ)जेल लेन (अंत तक नहीं भरा) का एक आंशिक भरने लाल तीर से पहचाना जाता है, जो दिखाता है कि आगे बढ़ने वाले जेल समाधान सामने बाधित किया गया था, या तो एक फंस हवा बुलबुले से, या लोडिंग में समय से पहले ठहराव । माइक्रोस्कोप दृश्य में लाल तीर एक ही स्थान की पहचान करता है। (ई)जेल लेन की सामग्री PhaseGuide बह निकला, परफ्यूजन लेन में फैल गया और अंततः इसे अवरुद्ध । यह ओवरफ्लो जेल और पर्फ्यूजन दोनों गलियों की अंधेरी उपस्थिति से नीचे देखने में दिखाई देता है। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में सेल धुंधला और व्यवहार्यता मूल्यांकन। (क)फ्लोरोसेंट दाग का उपयोग करते हुए, व्यवहार्यता का आकलन माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट (सभी नाभिक: होचस्ट 33342, नीली; मृत कोशिकाओं: एथिडियम होमोडिमर-1, लाल; और जीवित कोशिकाओं: कैल्सीन एएम, ग्रीन) में बिना किसी अक्षर और अलग पीसीए सेल समूहों में मूल्यांकन किया गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन.(बी)कुल मृत कोशिकाओं संस्कृति के दिन 1 पर मात्रा निर्धारित की गई थी और अलग एमडीए-पीसीए-118b पीडीएक्स संस्कृतियों ने मृत कोशिकाओं की संख्या में उल्लेखनीय कमी का प्रदर्शन किया। (ग)अलग और असंपादित संस्कृतियों में पीसीए पीडीएक्स के लिए क्लस्टर आकार के क्वांटिफिकेशन ने मामूली वृद्धि दिखाई लेकिन सांख्यिकीय रूप से कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा । पैनल बी में सलाखों और त्रुटि सलाखों के मतलब और शर्त प्रति 4 छवियों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते है (2 छवि के साथ 2 चिप्स/ एस्टरस्क (*) एक छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके असंपादित स्थिति की तुलना में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मतभेदों (पी एंड एलटी; 0.05) का प्रतिनिधित्व करता है। बॉक्स और पैनल सी में मूंछ साजिश के लिए, पार आइकन मतलब इंगित करता है, और क्षैतिज लाइन औसत का प्रतिनिधित्व करता है, 4 छवियों के प्रति शर्त (2 छवि के साथ 2 चिप्स/ बॉक्स में 50% डेटा होता है जबकि मूंछ प्रत्येक स्थिति के लिए न्यूनतम और अधिकतम क्लस्टर व्यास तक फैली होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में अलग एमडीए-पीसीए-118b का लक्षण वर्णन। (A)अलग (बाएं) और असंपादित (दाएं) पीसीए कैंसर सेल क्लस्टर माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट में वरीयता प्राप्त थे और सात दिनों तक के लिए perfused थे । संस्कृतियों को सभी नाभिक (Hoechst 33342, नीला), मृत कोशिकाओं (एथिडियम होमाडिमर-1, लाल), और लाइव कोशिकाओं (कैल्सीन एएम, ग्रीन) के लिए विशिष्ट तीन रंगों से सना हुआ था। स्केल बार = 50 माइक्रोन (बी, सी)8,000 कोशिकाओं/ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एकल चिप में अंतिम वांछित सेल घनत्व (कोशिकाओं/ प्रति चिप लोड की मात्रा (μL) माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट पर चिप्स की संख्या अतिरिक्त मात्रा के लिए म्यूटिपियर चित्रा 2C: एक पूर्ण माइक्रोवेल प्लेट के लिए आवश्यक अलग कोशिकाओं की संख्या (चरण 3.8) गुणक के लिए
सेल नुकसान (स्ट्रोमा हटाने, सेल मौत)		 चित्रा 2B: प्रोटोकॉल के लिए अलग PDX कोशिकाओं के # शुरू (चरण 2.8)
2,500 1.5 96 1.3 4.7E+05 3 1.4E+06
5,000 1.5 96 1.3 9.4E+05 3 2.8E+06
10,000 1.5 96 1.3 1.9E+06 3 5.7E+06
20,000 1.5 96 1.3 3.7E+06 3 1.1E+07

तालिका 1: एक 2-लेन माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट लोड करने के लिए आवश्यक अनुमानित प्रारंभिक और अंतिम पीडीएक्स सामग्री।

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1: 2 लेन माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट लेआउट। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को सीडिंग करने के बाद, 2-लेन प्लेट लेआउट का उपयोग करके व्यक्तिगत चिप लोडिंग सफलता (सफल, छूटे हुए लोडिंग, अंत तक नहीं भरा गया, या ओवरफ्लो) रिकॉर्ड करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम एक उच्च थ्रूपुट, perfused 3 डी संस्कृति प्रणाली में व्यवहार्य पीडीएक्स-व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसंस्करण और खेती के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। जबकि यह प्रोटोकॉल पीसीए पीडीएक्स ऊतक का उपयोग करता है, यह अन्य एपिथेलियल-व्युत्पन्न ट्यूमर के लिए समान रूप से प्रभावी है। ट्यूमर विशेषताओं भी मूल के एक ही ऊतक (प्रोस्टेट, स्तन, आदि) के भीतर व्यक्तिगत PDX लाइनों के बीच बदलती हैं । कुछ पीसीए पीडीएक्स लाइनें अधिक फाइब्रोटिक होती हैं और व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग-थलग करना मुश्किल होता है जबकि अन्य अधिक सेलुलर होते हैं। ट्यूमर आकार यहां उल्लेख किया IACUC दिशा निर्देशों के भीतर विविध किया जा सकता है विशेष रूप से कम उपज ट्यूमर के लिए और अधिक ऊतक प्रदान करते हैं । इसके अतिरिक्त, ट्यूमर के टुकड़े चरण 2.7 के बाद एकत्र किए जा सकते हैं, फिर से पचा सकते हैं, और उपज बढ़ाने के लिए प्रारंभिक पाचन के साथ एकत्र किए जा सकते हैं। यह अधिक बाहेल मैट्रिक्स-भारी ट्यूमर के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। पाचन के अतिरिक्त दौर पिछले दो आम तौर पर कम व्यवहार्यता और कम उपज में परिणाम है और सिफारिश नहीं कर रहे हैं ।

पीडीएक्स-व्युत्पन्न आबादी का शुद्धिकरण, मृत/मरने वाली कोशिकाओं को हटाने या मेजबान कोशिकाओं को दूषित करने के लिए, विस्तारित 3 डी संस्कृति और वांछित कैंसर कोशिकाओं के परिमाणीकरण के लिए फायदेमंद है । शुद्धिकरण का पहला कदम यहां वर्णित है - मध्यम गति पर XY रोटेशन के साथ मीडिया की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में निलंबन संस्कृति - 1 को बढ़ावा देता है) अत्यधिक आसंजन-निर्भर कोशिकाओं के चयनात्मक निष्कर्षण, आमतौर पर माउस स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट, और 2) प्रो-सर्वाइवल सेल-सेल संपर्क की आपूर्ति के लिए सेल समुच्चय का गठन। 48 एच XY रोटेशन चरण के दौरान मेजबान-व्युत्पन्न माउस फाइब्रोब्लास्ट निकालने की दक्षता बहुत अधिक है, जैसा कि फोंग एट अल में वर्णितहै। जानबूझकर पीसीए-फाइब्रोब्लास्ट सह-संस्कृतियां निश्चित रूप से संभव हैं, जैसा कि हमने प्रदर्शित किया है, लेकिन एक देखते हुए मैट्रिक्स (मैट्रिक्स के लिए फाइब्रोब्लास्ट आसंजन का समर्थन करने के लिए) और फाइब्रोब्लास्ट का एक बड़ा अनुपात की आवश्यकता होती है। कभी-कभी पीडीएक्स, आमतौर पर अधिक मेसेंचिमल विशेषताओं वाले, 48 घंटे के रोटेशन संस्कृति कदम के दौरान ऊतक संस्कृति सतहों का अधिक आसानी से पालन करेंगे। पीडीएक्स लाइनों पर बारीकी से नजर रखी जानी चाहिए पहली बार इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया जाता है, और हना के लिए इम्यूनो दाग, अनुयायी और गैर-अनुयायी आबादी में मानव कोशिकाओं के अनुपात की पहचान करने के लिए। गैर-ऊतक संस्कृति उपचारित प्लेटों का उपयोग इन पीडीएक्स के साथ क्लस्टर गठन के लिए किया जाना चाहिए। माउस स्ट्रोमल कोशिकाएं अभी भी अंततः सतह का पालन करेंगी, लेकिन अलगाव उतना कुशल नहीं होगा।

रोटेशन संस्कृति के बाद, गैर-अनुयायी आबादी वाले सुपरनेट को वर्णित घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र विधि के माध्यम से संसाधित किया जाता है। यहां रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल को कम से कम एक घनत्व चरण (उदाहरण के लिए, केवल 20%, 40%, और 55% समाधानों का उपयोग करके) को बाहर करने के लिए सरल बनाया जा सकता है, लेकिन प्रत्येक नए पीडीएक्स के साथ इस विधि को स्थापित करते समय सभी चार का उपयोग किया जाना चाहिए। बहुकोशिकीय समूहों को इस विधि से आसानी से अलग-अलग कोशिकाओं से अलग किया जाता है, और काफी हद तक उनके संकुल फेनोटाइप और अन्य विशेषताओं को बनाए रखते हैं। खारिज एकल कोशिका आबादी या तो (क) कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है कि मर रहे थे/४८ एच रोटेशन कदम से पहले मर रहे हैं, और इस तरह एक क्लस्टर, या (ख) कोशिकाओं है कि ४८ एच रोटेशन के बाद जीवित रहे में एकीकृत कभी नहीं, लेकिन अभी भी समूहों में एकीकृत नहीं किया । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि समूह (ख) में कोशिकाएं शामिल हो सकती हैं जो कुछ जांचकर्ताओं को वांछनीय लगती हैं; उदाहरण के लिए, कुछ रिपोर्टों में प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों का वर्णन किया गया है जिनमें प्रारंभिक स्टेम/जनक कोशिकाएं, या दवा प्रतिरोधी कोशिकाएं हैं, जो सुपरनेट के भीतर खराब-अनुयायी एकल कोशिकाओं के रूप में तैरती हैं, जो अन्यथा अनुयायीआबादी 10से ऊपर हैं । कैंसर के अध्ययन के लिए प्रासंगिक, परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी), ट्यूमर शुरू कोशिकाओं (TICs), या अंय इसी तरह के मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने के सेल प्रकार इस एकल सेल आबादी का हिस्सा हो सकता है । इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर जांचकर्ताओं को ध्यान से खारिज एकल सेल आबादी का विश्लेषण करना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ब्याज की किसी भी कोशिकाओं को खो नहीं दिया गया है । हमारे हाथों में, इन एकल कोशिकाओं के विशाल बहुमत या तो कैंसर की कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश है कि मर रहे है/प्रारंभिक ऊतक वियोजन प्रोटोकॉल, या कृंतक फाइब्रोब्लास्ट है कि पहले से ही anoikis के माध्यम से आगे बढ़ रहे है के कारण मर रहे हैं ।

सीमित और मूल्यवान पीडीएक्स सामग्री के साथ काम करते समय सफलता सुनिश्चित करने के लिए कम कीमती कोशिकाओं के साथ माइक्रोफ्लुइडिक प्लेट को बोने की तकनीक का अभ्यास करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। वितरण के दौरान टिप प्लेसमेंट के बारे में पता रखें, क्योंकि अनुचित तकनीक के परिणामस्वरूप 1) ओवरफ्लो होने की संभावना है यदि लोडिंग के दौरान दबाव लागू किया जाता है, या 2) खाली या आंशिक रूप से भरे हुए चैनल यदि टिप इनलेट पोर्ट पर केंद्रित नहीं है। समय से पहले जेलेशन के कारण चैनल भी अंत तक नहीं भर पाएंगे। यदि ऐसा होता है, तो पेगडा क्रॉसलिंकर के अलावा और जेल समाधान को वितरित करने के बीच प्रतीक्षा समय को कम करें, या एक समय में जेल समाधान के छोटे एलिकोट्स के साथ काम करें। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली वितरण मात्रा एचए हाइड्रोगेल के साथ सफलता के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित हैं। इस प्रणाली में मैट्रिक्स जैसे अधिक चिपचिपा समाधानों के उपयोग के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को उचित भरने के लिए वितरण मात्रा में ~ 2 माइक्रोल तक की वृद्धि की आवश्यकता होती है। यह भी ध्यान दें कि चरण 4.3 में 50 माइक्रोन वेतन वृद्धि का विकल्प, इसी चरण में चार सेल छर्रों की तैयारी, और चरण 4.10 में दोहराने वाले पुनः पेंशन जानबूझकर किए जाते हैं; यद्यपि वे आवश्यकता से अधिक सामग्री प्राप्त करते हैं, वे दोहराने वाले पिपेट से नुकसान के लिए ओवरएज भी प्रदान करते हैं।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रत्येक पीडीएक्स में इस 3 डी संस्कृति मॉडल के भीतर एक अद्वितीय आकृति विज्ञान और आकार वितरण होने की संभावना है। एक मायने में, रोगी रोग, ऊतक इतिहास, मैट्रिक्स मापदंडों और कई अन्य कारकों की विविधता के कारण यह उम्मीद की जाती है। मातृजेल में प्रोस्टेट कैंसर की कई रेखाओं के विशाल आकलन ने इस संभावित विविधता का प्रदर्शन किया11. फिर भी, जांचकर्ताओं को उपरोक्त मापदंडों में व्यापक भिन्नता मिलने पर आश्चर्य हो सकता है। तैयारी में एक पांडुलिपि में, हम इस संस्कृति मंच पर कई पीडीएक्स पर एक व्यापक नज़र पेश करते हैं; कोशिकाएं प्रत्येक पीडीएक्स प्रकार के भीतर एक सुसंगत प्रतिक्रिया बनाए रखते हैं, लेकिन नमूनों में काफी भिन्न हो सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप क्लस्टर होते हैं, उदाहरण के लिए, बड़े रूप से उच्च सेल घनत्व प्रति क्लस्टर, या छोटे, लूजर इंटरसेलुलर कनेक्शन के साथ। प्रत्येक पीडीएक्स के विशिष्ट व्यवहार का मूल्यांकन जांचकर्ताओं द्वारा कई परीक्षणों पर किया जाना चाहिए, ताकि एक उम्मीद के मुताबिक और विशेषता आकृति विज्ञान की पुष्टि की जा सके। जांचकर्ता इस पेपर में उल्लिखित सामान्य व्यवहारों का पालन करने के लिए नमूनों की उम्मीद कर सकते हैं।

संक्षेप में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को एक मंच में पीडीएक्सएस पूर्व वीवो को नियोजित करने के लिए एक नई विधि प्रदान करता है जो संस्कृति की स्थिति की ठीक ट्यूनिंग और ऊतक विशिष्ट बाह्रात्पूर्ण मैट्रिक्स (ईसीएम) और परफ्यूजन प्रवाह जैसे प्रासंगिक 3 डी पर्यावरणीय संकेतों को शामिल करने की अनुमति देता है, जिससे कई दिनों या हफ्तों में विस्तारित सेल अस्तित्व को सक्षम किया जा सकता है। इन संस्कृतियों का विस्तृत लक्षण वर्णन यहां प्रदर्शित धुंधला और रूपात्मक विश्लेषण द्वारा प्राप्त किया गया था। इसके अलावा, यदि आवश्यक हो, तो संस्कृतियों को प्लेट रीडर-आधारित परख, इम्यूनोफ्लोरेसेंट लेबलिंग, या आगे आणविक लक्षण वर्णन को सक्षम करने के लिए lysates की तैयारी के लिए उपयोग किया जा सकता है। यद्यपि हमने पहले हाइड्रोगेल के भीतर पीडीएक्स 3 डी संस्कृति के कुछ तत्वों को प्रकाशित किया है, मल्टीस्टेप शुद्धिकरण का यह अनुप्रयोग नया है, एक मानक प्रयोगशाला में नियोजित करना आसान है, और उच्च व्यवहार्यता प्रतिनिधि संस्कृतियों को बनाए रखने में सफल है। ऑर्गेनोप्लेट प्लेटफॉर्म, अपनी 2-लेन और 3-लेन किस्मों में, ऊतक परफ्यूजन के अपने मॉडल के माध्यम से आगे जटिलता प्रदान करता है, और प्रति प्रयोग कम कोशिकाओं का उपयोग करने का एक महत्वपूर्ण अवसर प्रदान करता है। हमारे पिछले मॉडलों की तुलना में, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म ने अधिकांश प्रयोगशालाओं में पीडीएक्स ट्यूमर ऊतक की दुर्लभ उपलब्धता को देखते हुए प्रति प्रयोग, जो एक बहुत बड़ा लाभ है, ~ 30 के कारक द्वारा सेल आवश्यकताओं को कम किया। माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम स्थानिक संगठन के संदर्भ में फेनोटाइप के मात्राकरण की अनुमति देने के लिए एक कोशिका आबादी में विस्तारित इमेजिंग, इम्यूनोस्टेपिंग और फेसियल इमेजिंग को सक्षम बनाता है जो काफी बड़ी है (एन = ~ 2,000−4,000 कोशिकाएं प्रति इमेजिंग विंडो)।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान राष्ट्रीय कैंसर संस्थान SBIR चरण 1 (HHSN26120700015C) और P01CA098912 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1N NaOH any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes any suitable
6-well tissue culture plates any suitable
70 µm cell strainers Corning 431751 or equivalent
Centrifuge Eppendorf 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes or equivalent
Density gradient centrifugation solution Millipore Sigma P1644 Percoll
Dimethylsulfoxide any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution StemCell Technologies 07921 ACCUMAX
DMEM-F12 ThermoFisher Scientific 11039021 or equivalent
Forceps any suitable
HA hydrogel kit ESI BIO GS311 HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution Lonza 10-527F or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum Atlanta Biologicals S11150
Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-51B Hausser BrightLine or equivalent
Hoechst 33342 ThermoFisher Scientific H1398 or equivalent
Image processing software Oxford Instruments Imaris 9.3 or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) ThermoFisher Scientific L3224 or equivalent
Microfluidic culture plate Mimetas 9603-400-B 2-lane OrganoPlate
Microscope Nikon A1R or equivalent
Multichannel pipette Eppendorf 3125000036 or equivalent
PDX-derived tumor tissue obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 or equivalent
Perfusion rocker Mimetas OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9) any suitable
Phosphate-buffered saline solution Lonza 17-516F or equivalent
Razor blades any suitable
Rotating xy-shaker VWR Advanced 3500 Orbital Shaker or equivalent
Scalpel handle any suitable
Single channel repeating pipette Eppendorf 22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes any suitable

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References

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कैंसर रिसर्च अंक 166 3डी कल्चर हाइड्रोगेल्स माइक्रोफ्लुइडिक्स पेशेंट-व्युत्पन्न क्सेनोग्राफ प्रोस्टेट कैंसर इन विट्रो कैंसर मॉडल हाई-थ्रूपुट ड्रग स्क्रीनिंग परफ्यूजन
एक Perfused Microfluidic मंच में रोगी-व्युत्पन्न Xenografts के पूर्व वीवो 3 डी हाइड्रोजेल संस्कृतियों के लिए बढ़ी हुई व्यवहार्यता
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Sablatura, L. K., Bircsak, K. M.,… More

Sablatura, L. K., Bircsak, K. M., Shepherd, P., Queiroz, K., Farach-Carson, M. C., Constantinou, P. E., Saleh, A., Navone, N., Harrington, D. A. Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (166), e60872, doi:10.3791/60872 (2020).

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