Förbättrad livskraft för Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer av patient-derived Xenografts i en Perfused mikrofluidisk plattform

Summary

Detta protokoll demonstrerar metoder för att möjliggöra utökad in vitro-kultur av patient-härledda xenografts (PDX). Ett steg förstärker den totala livskraften hos flercelliga klusterkulturer i 3D-hydrogeler, genom okomplicerat avlägsnande av icke-livskraftiga enstaka celler. Ett sekundärt steg visar bästa praxis för PDX-kultur i en perfused mikrofluidisk plattform.

Abstract

Patient-härledda xenografts (PDX), som genereras när resected patienten tumör vävnad är engrafted direkt i immunkomprometterade möss, förbli biologiskt stabil, därigenom bevara molekylära, genetiska och histologiska funktioner, samt heterogenitet ursprungliga tumör. Men med hjälp av dessa modeller för att utföra en mängd experiment, inklusive drogscreening, är oöverkomliga både när det gäller kostnad och tid. Tredimensionella (3D) kultursystem ses allmänt som plattformar där cancerceller behåller sin biologiska integritet genom biokemiska interaktioner, morfologi och arkitektur. Vårt team har lång erfarenhet av att kultföra PDX-celler in vitro med hjälp av 3D-matriser som består av hyaluronsyra (HA). För att separera musfibroblast stromal celler i samband med PDXs, använder vi rotationskultur, där stromal celler följer ytan av vävnad kultur-behandlade plattor medan dissociated PDX tumörceller flyta och själv-associera i flercelliga kluster. Också flytande i supernatanten är singel, ofta döda celler, som presenterar en utmaning, i att samla in livsdugliga PDX-klungor för downstream inkapsling in hydrogels för 3D-cellkultur. För att skilja dessa enstaka celler från levande cell kluster, har vi anställd densitet steg gradient centrifugation. Det protokoll som beskrivs här möjliggör utarmning av icke-livskraftiga enstaka celler från den friska populationen av cellkluster som kommer att användas för ytterligare in vitro-experiment. I våra studier införlivar vi 3D-kulturerna i mikrofluidiska plattor som möjliggör mediaperfusion under kulturen. Efter att ha bedömt de resulterande kulturerna med hjälp av en fluorescerande bild-baserade viability assay av renas kontra icke-renas celler, våra resultat visar att denna ytterligare separation steg avsevärt minskat antalet icke-livskraftiga celler från våra kulturer.

Introduction

Under det senaste årtiondet har området cancerforskning visat förnyad entusiasm för patient-derived xenografts (PDXs) som ett verktyg för att bedöma cancer cellväg beroende och läkemedelskänning¹. De vanligaste PDX-modellerna är etablerade genom subkutan eller orthotopic implantation av mänskliga tumörceller-en tumör fragment, ett kluster av dissocierade tumör-härledda celler, eller ett prov av isolerade cirkulerande tumörceller (CTC)-till en gnagare värd. Om tumören "ta" är framgångsrik, xenograft cellerna kommer att föröka sig, vaskulär, och på annat sätt interagera med värdvävnaden för att skapa en tumör, som kan skördas i en optimal storlek, subdivided, och åter implanteras i andra värdar. Bland deras många fördelar som ett modellsystem, PDXs behåller vanligtvis en betydande del av den inhemska tumörcellpopulationens heterogenitet och möjliggör bedömning av human-specifika vägar och cellsvar^2,3. In vivo sammanhang möjliggör tumör interaktion med vasculature och andra intilliggande stroma och rekapituler vävnad egenskaper såsom läkemedel diffusion dynamik, syre spänning och extracellulära matris inflytande som biologiskt och mekaniskt inverkan tumör progression. En negativ aspekt av PDXs är deras tillit till en gnagare värd, både för tumör expansion och i slutändan för hypotestestning. Eftersom många PDXs inte kan anpassa sig till traditionella tvådimensionella (2D) kultur på vävnad kultur polystyren utan att förlora många av sina önskvärda egenskaper, har det varit minimal medelväg för forskare mellan denna relativt kontrollerade in vitro-metoden, och den betydande ökningen av kostnader, anläggningar och tidskrav för in vivo PDX användning.

Vi har beskrivit flera in vitro-modeller som implementerar 3D-cellkultur inom en stödjande matris, och nyligen utökat det arbetet med att demonstrera den ex vivo-kulturen av multipel prostatacancer (PCa)-derived PDXs, både ensam och i samkultur med benmärgshärledda fibroblaster^4,5. Hyaluronsyra (HA)-baserade hydrogelmatriser ger anpassningsbart och biologiskt relevant stöd för båda celltyperna, med facile kontroll över hydrogelegenskaper och optisk klarhet för avbildning genom hydrogeldjupet⁶.

Mogna PDX tumör vävnader omfattar en variabel blandning av heterogena mänskliga cancerceller och mus stroma (fibroblaster, endotelceller, etc.). För att studera cell-typ specifika bidrag till tumörprogression in vitro, kan det vara fördelaktigt att dissociate tumörer, separera cellpopulationerna, och experimentellt införliva dem på ett organiserat sätt att dissekera vägar av intercellulär kommunikation. De blandade cellpopulationerna inom vävnadsrentappat har differentiell kompatibilitet med specifika odlingsförhållanden. Till exempel, tumör-associerade fibroblast livskraft kräver antingen yta följsamhet eller 3D matriser funktionaliserade med integrin ligander, medan epitelial-härledda PDX celler inte vanligtvis har dessa krav, i stället gynnar cell-cell interaktioner. Dessa skillnader kan utnyttjas för att uppnå effektiv separation av PDX-celler från förorenande mus stromal celler. Rotationskultur av vävnadsuppspjäll tillåter stromal cell adherence till vävnadskulturens yta medan cell-cell adhesions driver PDX-celler som flyter ovanför den roterande odlingsytan för att bilda flercelliga kluster i supernatanten i 24−48 h. De specifika egenskaperna hos dessa kluster varierar med PDX (t.ex. stora, täta, mycket sfäriska kluster eller mindre, lösare aggregat som liknar druvklasar), men är typiskt av biologiskt relevanta storlekar (50−250 μm diameter), tillräckligt för bedömning av cellulära interaktioner som är beroende av intercellulära kontakter.

Tumör hämtning och bearbetning oundvikligen resulterar i en viss grad av säkerheter celldöd, antingen på grund av kortsiktiga skador från mekaniska/enzymatiska störningar, eller långsiktiga inkompatibilitet av subpopulations med de valda odlingsförhållandena. Trots nyttan av rotation kultur som en inledande bulk separation, döda eller döende celler överförs oundvikligen med PDX kluster och kan påverka den resulterande kulturen. Dessa döda celler är ofta enskilda PDX-celler som inte integrerades i ett kluster, mus stromal fibroblaster som inte kan överleva i utvalda odlingsförhållanden, eller särskilt bräckliga endotelceller. Sådana döende celler kan påverka experimentella resultat från "överlevande" och kan avsevärt påverka kvantifiering, t.ex. För att förbättra urvalet av levande PDX-celler från denna metod anpassade vi centrifugeringsmetoder med densitetssteg för att enkelt avlägsna enskilda döda/döende celler från PDX-blandningar och behålla övervägande levande flercelliga kluster.

För att förbättra studiet av resulterande PDX-härledda kluster i 3D-kultur, vi utnyttjade en microfluidics-baserade perfusion kultur plattform, den OrganoPlate (Figur 1), som är en hög genomströmning organ-på-ett-chip plattform som möjliggör samtidig kultur av upp till 96 enskilda perfunderas, 3D kulturer på en 384-väl mikrotiter plattan-bas (Figur 1A)^7,8. I den 2-flik mikrofluidiska plattan, är en enda vävnad chip ansluten med två mikrofluidiska kanaler (Figur 1B, gel kanal: röd, perfusion kanal: blå) som spänner över fyra brunnar i rad. De två mikrofluidiska kanalerna är åtskilda av en kort plast ås kallas en Phaseguide som förhindrar överflöd av en kanal i sin intilliggande granne kanal, och samtidigt möjliggör ett membranfritt gränssnitt mellan innehållet i gelen och perfusion kanal⁹. Eftersom botten av den mikrofluidiska plattan består av mikroskop-grade glas, kan kulturerna ses i observationsfönstret genom botten av plattan med en standard eller automatiserad mikroskop. Perfusion är etablerad i den mikrofluidiska plattan med en programmerbar vipp, med hjälp av tyngdkraften för att driva media genom de mikrofluidiska kanalerna, mellan reservoar brunnar (Figur 1C). Perfusion flöde-härma närmare rekapituler tumören mikromiljö än statisk kultur, vilket möjliggör införlivande av skjuvning stress och förbättrad fördelning av gaser och näringsämnen. Fördelarna med att upprätthålla en perfunderad cancer cell kultur i mikrofluidic plattan har tidigare beskrivits som perfused bröstcancer kulturer uppvisade optimal livskraft jämfört med en statisk 3D-kultur av samma celler⁷.

Den föreliggande rapporten beskriver en anpassad densitet gradient centrifugation metod för att isolera levande multicellulära PDX kluster och visar sitt nytta i upprättandet 3D PDX kulturer inom perfusable microfluidic plattor. Eftersom ett ökande antal forskningslaboratorier söker metoder för att underlätta PDX-användning, räknar vi med att de protokoll som presenteras här kommer att vara av omedelbar nytta.

Protocol

Tumör vävnad erhölls med patientens samtycke och enligt en godkänd Institutionella Review Board (IRB) protokoll. Xenografts implanterades, odlades och skördades enligt ett accepterat IACUC-protokoll (Institutional Animal Care and Use Committee).

OBS: Allt arbete ska utföras i ett sterilt biologiskt säkerhetsskåp för att bibehålla steriliteten. Alla steg ska genomföras i rumstemperatur om inte annat anges.

1. Beredning av material för PDX-bearbetning

1. Autoklavten tut och skalpell handtag eller rakblad.
2. Enzymlösning för töavsjälvväder vid 4 °C över natten eller vid rumstemperatur samma dag som vävnadsupplösning.
   OBS: Tinning vid 37 °C rekommenderas inte, eftersom detta kan inaktivera vissa dissociation enzymer.
3. Förbered minst 100 mL PDX odlingsmedium (Dulbeccos modifierade Eagle medium-nutrient blandning F-12 [DMEM-F12] med 100 U/mL penicillin och streptomycin och 30% fetala nötkreatur serum [FBS]), och minst 25 mL PDX bearbetningsmedium (DMEM-F12 med 100 U/mL penicillin och streptomycin och ingen FBS). Förvaras vid 4 °C tills den är klar att användas.

2. PDX-dissociation och initial rening av stromal komponent

1. Samla autoklaverade redskap, 70 μm cellsiler (2−3), 60 mm runda vävnadsodlingsrätter (2), 6-brunnsvävnadskulturplattor, sterila 50 mL koniska centrifugrör och sterila 1x fosfatbuffrade saltlösning (PBS). Varmt odlingsmedium till 37 °C och låt dissociation enzymlösning komma till rumstemperatur.
2. När PDX vävnad har nått en diameter på 1,0−1,5 cm i en mus värd, kirurgiskt ta bort tumören från musen med standard medel (t.ex. under accepterad anestesi) och lagra på is i en 50 mL rör med PDX kultur medium (Figur 2A). Bearbeta vävnaden omgående, via stegen nedan, för att maximera cellernas viabilitet, helst inom 1−2 h efter skörd.
3. Överför tumörvävnad till en pre-vägd steril 50 mL koniska röret. Skölj 6x med 30 mL steril PBS för att avlägsna blod och föroreningar. Ta bort så mycket vätska som möjligt och väg tumörvävnaden.
4. Överför tumörvävnad till en 60 mm rund vävnadskulturskål och färs till ~1 mm^{3 stycken} med hjälp av ett sterilt rakblad eller skalpell.
5. Lägg till 5 mL PDX-bearbetningsmedium för att samla tumörslam och överför till ett nytt sterilt 50 mL-rör. Skölj odlingsfatet med ytterligare 5 mL PDX-bearbetningsmedium, sedan med dissociation enzymlösning (10 mL/g tumör, minst 5 mL), lägga alla sköljningar till 50 mL röret.
6. Inkubera 20 min vid 37 °C med varsam skakning. Snurra röret försiktigt halvvägs genom inkubationstiden.
7. Pipett upp och ner försiktigt med en serologisk pipett för att bryta upp klumpar. Filtrera celler med en 70 μm cellsil placerad över ett nytt sterilt 50 mL-rör.
   OBS: Mer än en sil kan vara nödvändig.
8. Centrifugera vid 200 x g i 5 min till pelletsceller. Ta bort supernatant och resuspend i 2−3 mL av PDX odlingsmedium. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare.
9. Använd tabell 1 för att uppskatta det erforderliga antalet dissocierade PDX-härledda celler som behövs för att uppnå önskad celltäthet per chip.
   OBS: Värdena i tabell 1 är avsedda att vara en utgångspunkt. Faktiska värden kommer att variera på grund av vävnads viabilitet/cellalitet och cellförlust från frysning/återhämtning. PDX tumörer är individer även inom en viss cancer typ så dessa värden bör justeras empiriskt.
10. Av det antal som beräknats i steg 2.9, plåt 1−2 x 10⁶ celler i 5 mL pdx odlingsmedium per brunn av en 6-väl vävnadsodlingsplatta. Inkubera (37 °C, 5 % CO₂, 95 % luftfuktighet) i 48 h med skonsam skakning (50−55 rpm) för att främja klusterbildning (figur 2B). Efter att cluster har bildats, fortsätt till avsnitt 3 för centrifugeringen.
11. Cryopreserve oanvända PDX-celler från den initiala dissociationen i 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% dimetylsulfoxid (DMSO) eller ett kommersiellt tillgängligt primärcellfrysningsmedium.
    OBS: Vidhäftande mus stromal celler kan också återvinnas från vävnadsplattan yta, om så önskas, genom att skölja kort med odlingsmedium och expandera med standard medel.
12. För senare användning av cryopreserved PDX tumörceller/ mus stroma, tina celler i en 37 °C vattenbad i 2 min. Räkna och platta i en 6-väl vävnad kulturplatta som beskrivs i steg 2.10 innan du fortsätter till avsnitt 3. Öka antalet PDX-celler med ~ 20% för att tillgodose lönsamhetsförluster från kryobevaring.

3. Densitetsgradientcentrifugeringsbaserad separation av PDX-härledda kluster från enstaka celler

1. Förbered 20 mL 100% densitetsgradientlösning genom att noggrant blanda 18 mL densitetsgradientcentrifugeringslösning med 2 mL steril 10x Hanks balanserade saltlösning (HBSS) i ett sterilt koniskt rör på 50 mL. Gör 10 mL vardera av 20%, 30%, 40%, och 55% densitet gradient lösningar genom att späda denna 100% lösning med steril 1x HBSS och blanda väl.
   OBS: Dessa volymer är tillräckliga för två 15 mL-gradienter som kan användas för att separera ~ 15 x 10^{6 celler} vardera. Om färre än ~15 x 10^{6 celler separeras} bör den andra övertoningen användas som balans för centrifugeringen.
2. Lägg till 3 mL av 55% densitet gradient lösning till botten av en 15 mL koniska röret. Hålla röret i en vinkel, mycket försiktigt lager 3 mL av 40% densitet gradient lösning ovanpå 55% skikt, långsamt dispensering av vätskan på den vinklade sidan av röret för att undvika blandning av skikten. Upprepa med 30% densitet gradient lösning.
3. Samla supernatanten av PDX-rotationskulturer med en 5 mL serologisk pipett, sköljplåtsyta försiktigt. Centrifugera vid 200 x g i 2 min till pelletsceller.
4. Avlägsna supernatant och resuspend cell pelleten i 3 mL av 20% densitet gradient lösning enligt antal gradienter som behövs för att separera cellerna. Försiktigt lager 20% densitet gradient lösning med celler på toppen av övertoning (er). Om bara använda en toning röret för celler, toppa balansen toning röret med cell-free 20% densitet gradient lösning.
5. Kapa rören och centrifugen i en svänghink rotorcentrifug i 30 min vid 4 °C, 2 000 x g, och 0 broms.
6. Efter centrifugeringen kommer fraktioner att synas (Bild 2C). Samla 2−3 mL av fraktioner i färska 15 mL-rör. Tillsätt 3−4 volymer av steril 1x HBSS till varje fraktion och invertera för att blanda ordentligt.
7. Centrifugera vid 1 000 x g i 3 min till pelletsceller. Ta bort supernatant och resuspend cell pelleten i 1−2 mL av PDX bearbetning medium.
   OBS: Livskraftiga PDX-cellkluster finns vanligtvis vid gränssnittet för 40−55% densitetsgradientlösning (Bild 2D) med enstaka döda/döende celler som ackumuleras vid 20−40% densitetsgradientlösningsgränssnittet för de flesta PDX-testade.
8. Avlägsna en liten, representativ alikvot (50−100 μL) för återuppdelning med en lika stor volym dissociationsenzymlösning för att bedöma cellnummer i den klustrade cellfjädringen. Räkna celler med en hemocytometer eller automatiserad cellräknare.

4. Hydrogelberedning och mikrofluidisk plattsådd

1. Rekonstruerade HA hydrogellösningar (thiol-modifierad HA, HA-SH; tioolreaktiv polyetylenglykoldiarylat, PEGDA) enligt tillverkarens anvisningar.
2. Med hjälp av en flerkanalig pipett, tillsätt 50 μL HBSS till alla brunnar i observationsfönsterkolonner (kolumn 3, 7, 11, 15, 19, 23) av en 2-lig mikrofluidisk platta för att bibehålla odlingsfuktighet och optimala bildförhållanden.
3. Beräkna volymen av cellupphängning från avsnitt 3 som behövs för 50 μL hydrogel vid önskad celltäthet (dvs. 5 000 celler/μL). För sådd en mikrofluidisk platta, alikvotera den beräknade volymen i var och en av 4 sterila 1,5 mL centrifugrör.
   OBS: HA hydrogels har en fast tid till gelation. Justera volymen av gellösning alikvoter för användareffektivitet vid dispensering om för tidig gelation uppstår.
4. Justera pH-värdet för HA-SH-lösningen till 8.0 med 1 N NaOH omedelbart före användning. Utför en testgelation genom att blanda 40 μL HA-SH med 10 μL PEGDA och övervakningsgelation över tid. Gelation börjar normalt 5−8 min efter blandning ha-SH med PEGDA crosslinker.
5. Centrifugercellupphängning alikvoter i 2 min (200 x g, rumstemperatur) till pelletsceller. Ta försiktigt bort supernatant- och återanvändarcellerna i lämplig volym av HA-SH.
   OBS: Final hydrogel är en 4:1 HA-SH:PEGDA-lösning (volymprocent) så celler bör återsuspendgas i 40 μL HA-SH för en 50 μL slutvolym.
6. Tillsätt 10 μL AV PEGDA till en alikvot av celler i HA. Blanda väl och vänta 1−3 min (beroende på gelationstid från steg 4.4) innan du sår den mikrofluidiska plattan.
   OBS: Att tillåta gelation reaktion start innan sådd hjälper till att minimera cellen sedimentering.
7. Fäst en spets för dispensering av 1,5 μL-volymer till en enda kanal upprepande pipetter och last med celler i HA hydrogellösning. Kom ihåg att hålla hydrogel alikvoten välblandad för att säkerställa jämn cellfördelning.
8. För att så den mikrofluidiska plattan, rikta pipetterspets vinkelrätt mot plattan samtidigt som spetsen placeras försiktigt i mitten av gelinloppet (kolumnerna 1, 5, 9, 13, 17, 21) för att säkerställa kontakt men inget tryck vid dispensering av hydrogellösningen. Arbetar snabbt för att förhindra för tidig hydrogel stelning, dispensera 1,5 μL gellösning i varje gel inlopp.
9. Observera påfyllningsstatusen för de mikrofluidiska kanalerna genom att visa från plattans överkant, plattans botten, eller genom mikroskop, och bedöm lastningen, med hjälp av figur 3 som vägledning (framgångsrik lastning i figur 3A, pipet positioneringsvägledning i figur 3B, missad lastning i figur 3C, inte fylld till i figur 3D, överströmning i figur 3E). Identifiera eventuella nödvändiga justeringar i teknik som kan förbättra fyllningsframgången för nästa omgång chips (se diskussion för felsökningstips).
10. Upprepa steg 4.6−4.9 med återstående 3 alikvoter av celler i HA-lösning. Invertera plattan medan du förbereder nästa alikvot (~1 min).
    OBS: Plattans 1 min väntetid och invertering förbättrar cellernas 3D-fördelning genom att minska cellens sedimentering allt eftersom gelation sker.
11. Efter alla chips är fyllda, inkubera plattan vid 37 °C i en befuktad inkubator tills gelationen är klar (~ 45 min).
12. Med hjälp av den medföljande handboken, se till att perfusionsvklipparen är installerad i cellodlingsinkubatorn med rätt perfusionsinställningar (14° vinkel, 4 min intervall).
13. Tillsätt 50 μL PDX odlingsmedium till alla medeltunga inlopp (kolumnerna 2, 6, 10, 14, 18, 22) och kontrollera om kanalerna fylldes ordentligt genom att vända på plattan. Knacka försiktigt plattan mot en yta för att uppmuntra vätskan att fylla mikrofluidiska kanaler.
14. Tillsätt 50 μL dmem-F12 (10% FBS) för alla medelstora utlopp (kolumn 4, 8, 12, 16, 20, 24). Om några luftbubblor fastnar i perfusionskanalen, ta bort genom att försiktigt knacka plattan mot en yta.
15. Med hjälp av ett mikroskop och plattan layout form (Supplemental Figur 1), spela in chip fyllning framgång. Uteslut felaktigt fyllda marker från ytterligare experimentell användning.
16. Placera plattan på en lutande vippuppsättning till en lutning på 14° och en 4 min cykel för att påbörja perfusion. Byt ut PDX odlingsmedium var 2:e dag (först 50 μL i inlopp, därefter 50 μL i utlopp).

5. Cellfärgning, avbildning och bildkvantifiering

1. Bered en analyslösning för cellens viability som innehåller tre fluorescerande färgämnen (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]).
   1. Förbered stamlösningar av varje färgämne enligt följande: Hoechst 33342 vid 1,6 mM (1 mg/mL) i avjoniserat vatten; calcein AM vid 4 mM i vattenfri DMSO; ethidium homodimer-1 vid 2 mM i DMSO/H₂O (1:4, v/v).
      OBS: Beståndet calcein AM och ethidium homodimer-1 lösningar tillhandahålls i den noterade kit i Tabell över material.
   2. Bered en enda arbetslösning i HBSS eller fenolrött fritt medium, innehållande alla tre färgämnena. Optimera den slutliga arbetskoncentrationen för varje celltyp och matris, inom intervallen 1,6−8,0 μM för Hoechst 33342, 0,1−10 μM för kalcein AM, och 0,1−10 μM för ethidium homodimer-1.
2. Avlägsna odlingsmedium och applicera den arbetsdugliga livsduglighetsfärglösningen på önskade mikrofluidiska chips (75 μL i inlopp, 25 μL i utlopp) och lägg tillbaka på perfusionsvivaren i cellkulturinkubatorn i 1 h.
3. Avbilda de färgade kulturerna observationsfönster med hjälp av ett manuellt eller automatiserat konfokalmikroskop (Table of Materials) med fluorescerande filter (listade som excitations-/emissionsvåglängder, i nm) att observera alla kärnor (Hoechst 33342, 350/461), döda cellkärnor (ethidium homodimer-1, 528/617), och levande cell cytoplasman (calcein AM, 494/517).
4. Fånga 140 μm Z-stackar med en stegstorlek på ≤1 μm med hjälp av ett 20x luftmål. Tre synfält behövs för att avbilda hela mikrokanal med en liten mängd överlappning. För att undvika dubbel provtagning, bild bara två synfält per chip.
   OBS: Bildförhållanden bör optimeras för att säkerställa korrekt NyQuist-provtagning. I författarnas erfarenhet, en snabb bildbehandling system, som bygger antingen på deconvolution av en konventionell epi-fluorescens källa eller resonans scanning läge på en confocal, är nödvändigt att helt assay en komplett Z-stack, med tre laserfärger, över 96 marker på en platta inom en rimlig tid (ungefär 3,5 h med automatiserad bildbehandling, inklusive setup).
5. Med hjälp av bildanalysprogram, analys av Z-stack-bilderna för önskad kvantifierad data, till exempel morfologi, aggregeringstillstånd eller andra funktioner. För att kvantifiera cellens livskraft, räkna antalet döda celler (röda) och totala cellkärnor (blå).

Representative Results

En programmerbar perfusionsrocker framställdes i en vanlig vattenkapade cellkultur inkubator, och tvåfiliga mikrofluidiska plattor var beredda i en standard biosäkerhet skåp för lastning (Figur 1). En MDA-PCA-118b PDX tumör utökades in vivo, skördas när den hade nått en maximal storlek, och dissocieras som beskrivs i protokoll avsnitt 2 för att skapa en slurry suspension av celler, vid ungefär en encellig stat (Figur 2A). Den slurry var dispenseras i 6-väl vävnad kultur plattor, och placeras på en XY rotator som beskrivs, för 48 h. Mus stroma fästs på botten av vävnadskultur plattan, som tidigare har beskrivits, och de mänskliga PDX-celler förblev flytande i mediet, ihopsatta i kluster (Figur 2B). Omonterade enstaka celler var synliga i hela lösningen också.

En stegdensitetsgradient fastställdes i ett centrifugrör med metoderna i protokollavsnitt 3. Supernatant suspensionen av PDX celler var aspirerade försiktigt från multiwell plattan, lastas på steg gradient, och centrifuged som beskrivs. Efter centrifugeringen var ett disigt band, innehållande PDX-klustren, synligt nära gränssnittet mellan bråken 2 och 3, och enstaka celler identifierades vid gränssnittet mellan bråken 1 och 2 (Figur 2D). Fraktioner samlades in enligt beskrivningen, späddes ytterligare i HBSS och centrifugerades igen för att avlägsna densitetsgradientlösningen. Supernatanten var aspirerad, och de resulterande cell pellets var resuspended i PDX bearbetning medium. En liten alikvot av varje bearbetad fraktion bedömdes med mikroskop, för att bekräfta att den förväntade fraktionen innehöll PDX-kluster, och att den separata fraktionen innehöll i första hand enstaka celler.

HA hydrogel lösningar rekonstituerades som beskrivs i protokoll avsnitt 4, och PDX kluster var resuspended i hydrogel lösningen. PDX-lösningarna lastades i spån på den mikrofluidiska plattan och bedömdes för framgångsrik lastning (Figur 3). I de flesta fall,>90% av marker laddades framgångsrikt efter viss praxis med tekniken och justering av lastningsvolymer. Efter lastning önskat antal chips, och inkubering för gelation som beskrivs, PDX kultur medium lades till mikrofluidic plattan, och plattan var odlade med perfusion.

Med hjälp av fluorescerande färgämnen och metoderna i protokoll avsnitt 5, och konfokalmikroskopi, 3D mikrofluidic PDX kultur livskraft och morfologi utvärderades i både oseparerade och densitet gradient centrifugation separerade villkor (Figur 4A). Bilder av dessa plattor spelades in som Z-stackar på konfokalmikroskopet och bedömdes för cellens livskraft i bildanalysprogramvara. På dag 1 uppvisade de kulturer som genomgick separationsmetoden 10-faldig färre enstaka, döda celler (röda), jämfört med oseparerade kulturer (Figur 4B). Viktigt, bestod de separerade kluster främst av levande celler (grön). Ingen statistiskt signifikant skillnad identifierades för klustrets storleksfördelning (Figur 4C).

Kulturer upprätthölls ytterligare i den mikrofluidiska plattan i sju dagar (Figur 5A). Prover bedömdes periodiskt, med samma avbildnings- och kvantifieringsmetoder som ovan. Det totala antalet levande celler förblev konsekvent (Figur 5B) och kluster behöll ~ 80% livskraft (Figur 5C) under livet av kulturen. Celltätheten i det oseparerade tillståndet är ungefär en tredjedel av det separerade tillståndet eftersom enstaka celler lever under cellräkning, men dör snabbt inom hydrogelen. Det finns också mer variabilitet i klusterstorlek utan densitetsgradientseparationen.

Bild 1: Den 2-banors perfusable mikrofluidiska plattan. (A) Den 2-banor mikrofluidiska plattan är en standard 384-väl mikrotiterplatta med en modifierad botten bestående av mikrofluidiska kanaler inbäddade mellan glasplattor. Varje platta består av 96 vävnadschips för 3D-cellodling. (B) Enligt vyn från toppen av plattan, en enda 2-känslig mikrofluidic chip består av 4 brunnar i rad som är anslutna av gelen kanal (röd) och perfusion kanal (blå); gelinloppet, perfusionsinloppet, observationsfönstret och perfusionsutloppet. (C) Perfusion uppnås i den mikrofluidiska plattan med en programmerbar vipp som använder gravitationen för att driva media mellan perfusion inlopp och utlopp brunnar som är media reservoarer. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Bild 2: ISOLERING av PDX-kluster. (A) Dissekera primär PDX vävnad och dissociate till en enda cell suspension som innehåller både mänskliga PCa celler och mus tumör stroma. Antingen cryopreserve dissociated cell blandning eller (B) lägga till rotation kultur till recluster tumörceller och låta mus stromal celler att hålla sig till vävnadsodlingsplattan (48 h). (C) Använd densitetsgradientcentrifugeringen för att avlägsna kvarvarande döda enstaka celler, och (D) samla in livskraftiga PDX-kluster vid gränssnittet mellan densitetsgradientskikt 40 % och 55 % (röd streckad ruta). (E) Återvinna PDX-kluster, resuspend i Hydrogel prekursorlösning, och dispensera på plattan med en upprepande pipett. (F) Exempel beräkningar, motsvarande tabell 1, visar de nödvändiga inledande cellnummer som krävs för att nå en slutlig önskad cellkoncentration för alla spån över en platta. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Bild 3: Övervakning av mikrofluidisk plåtladdning. Laddar framgång och fel, kan bedömas med ögat (i topp och botten åsikter), med bekräftelse genom mikroskop. (A) Lyckad lastning identifieras genom en öppen (ljus) perfusion körfält i topp och botten vyer, och en något mörkare gel lane i botten vy. Visualisering genom mikroskop bekräftar att gelen körfält var fylld helt med celler och gel föregångare, utan att spilla över i den intilliggande körfält. (B) Tecknad film som demonstrerar korrekt pipet spets placering under gel dispensering, med korrekt placering är precis ovanför inloppsporten (vänster) och felaktig placering är off-centrerad (mitten) eller tillämpa kraft till inloppsporten (höger). (C) Ljusa körfält i alla vyer indikerar en missad lastning, vilket tyder på att pipet spetsen inte var korrekt placerad inom gel inloppet. (D) En delfyllning av gelen körfält (inte fylld till slut) identifieras av den röda pilen, som visar var den avancerande gellösning fronten avbröts, antingen av en instängd luftbubbla, eller en tidig paus i lastning. Den röda pilen i mikroskopvyn identifierar samma plats. (E) Innehållet i gelfilen svämmade över PhaseGuide, spilla in i perfusion körfält och slutligen blockera den. Detta överflöd syns i bottenvy av det mörka utseendet på både gel- och perfusionsbanor. Skala bar = 200 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 4: Cellfärgning och lönsamhetsbedömning i den mikrofluidiska plattan. (A) Med hjälp av fluorescerande fläckar bedömdes viabiliteten i oseparerade och separerade PCa-cellkluster som seeds i den mikrofluidiska plattan (alla kärnor: Hoechst 33342, blå; döda celler: ethidium homodimer-1, röd; och levande celler: calcein AM, grön). Skala bar = 50 μm. (B) Totalt döda celler kvanterades på dag 1 av kulturen och separerade MDA-PCa-118b PDX kulturer visat en betydande minskning av antalet döda celler. (C) Kvantifiering av klusterstorlek för PCa PDXs, i separerade och oseparerade kulturer, visade en liten ökning men ingen statistiskt signifikant skillnad. Staplar och felstaplar på panel B representerar medelvärdet och standardavvikelsen för 4 bilder per villkor (2 marker med 2 bild/chip). Asterisk (*) representerar statistiskt signifikanta skillnader (p < 0,05) jämfört med det oseparerade tillståndet med hjälp av en students t-test. För rutan och morrhårsyta på panel C anger kryssikonen medelvärdet, och den horisontella linjen representerar medianvärdet, av 4 bilder per villkor (2 marker med 2 bild/chip). Lådan innehåller 50 % av data medan morrhåren sträcker sig till minsta och högsta klusterdiameter för varje villkor. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 5: Karakterisering av separerad MDA-PCa-118b i den mikrofluidiska plattan. (A) Separerade (vänster) och oseparerade (höger) PCa cancer cell kluster var seedade i mikrofluidic plattan och perfused för upp till sju dagar. Kulturer var färgas med tre färgämnen specifika för alla kärnor (Hoechst 33342, blå), döda celler (ethidium homodimer-1, röd), och levande celler (calcein AM, grön). Skala bar = 50 μm. (B,C) Kvantifiering av antal celler och odlingskraft från bilder över en vecka av kultur vid en sådd densitet av 8.000 celler/ μL. Barer och fel barer representerar medelvärdet och standardavvikelse av fyra bilder per villkor. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Slutlig önskad celltäthet i enskilt chip (celler/μL)	Volym laddad per chip (μL)	Antal spånor på mikrofluidisk platta	Mutiplier för extra volym	Bild 2C: Antal separerade celler som krävs för en full mikrobrunnsplatta (steg 3.8)	Multiplikator för cellförluster (stromaborttagning, celldöd)	Bild 2B: Start # av dissocierade PDX-celler för protokoll (steg 2.8)
2,500	1.5	96	1.3	4.7E+05	3	1.4E+06
5,000	1.5	96	1.3	9.4E+05	3	2.8E+06
10,000	1.5	96	1.3	1.9E+06	3	5.7E+06
20,000	1.5	96	1.3	3.7E+06	3	1.1E+07

Tabell 1: Ungefärligt initialt och slutligt PDX-material som krävs för att lasta en enda 2-banors mikrofluidiska platta.

Kompletterande figur 1: Den 2-banor mikrofluidiska plattan layout. Efter seedning den mikrofluidiska plattan, spela in enskilda chip lastning framgång (framgångsrik, missade lastning, inte fyllt till, eller överflöd) med hjälp av 2-lane plattan layout. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Discussion

Här beskriver vi en metod för bearbetning och odling livskraftiga PDX-härledda tumörceller i en hög genomströmning, perfused 3D-kultur system. Medan detta protokoll utnyttjar PCa PDX vävnad, Det är lika effektivt för andra epitelial-härledda tumörer. Tumör egenskaper varierar mellan enskilda PDX linjer även inom samma vävnad av ursprung (prostata, bröst, etc.). Vissa PCa PDX linjer är mer fibrotisk och svårt att isolera livskraftiga celler från medan andra är mer cellulära. Tumören storlek noteras här kan varieras inom IACUC riktlinjer för att ge mer vävnad för särskilt låg avkastning tumörer. Dessutom kan tumörfragment samlas in efter steg 2.7, re-digested, och poolade med den inledande matsmältningen för att öka avkastningen. Detta är särskilt användbart för mer extracellulära matris-tunga tumörer. Ytterligare rundor av matsmältningen förbi två normalt resultera i låg lönsamhet och låg avkastning och rekommenderas inte.

Reningen av PDX-härledda populationer, för att avlägsna döda/döende celler eller förorenande värdceller, är fördelaktig för den utökade 3D-kulturen och kvantifieringen av de önskade cancercellerna. Det första steget i reningen som beskrivs här-suspension kultur i en relativt stor volym av media tillsammans med XY rotation vid måttliga hastigheter-främjar 1) den selektiva extraktionen av mycket vidhäftning-beroende celler, typiskt mus stromal fibroblaster, och 2) bildandet av cellaggregat att leverera pro-överlevnad cell-cell kontakt. Effektiviteten av att extrahera värd-härledda mus fibroblaster under 48 h XY rotationssteget är mycket hög, som beskrivs i Fong et al.⁵. Avsiktliga PCa-fibroblast co-kulturer är förvisso genomförbara, som vi har visat, men kräver en trimmad matris (för att stödja fibroblast vidhäftning till matris) och en större andel fibroblaster. Den enstaka PDX, vanligtvis de med mer mesenkymala egenskaper, kommer att följa lättare till vävnad kultur ytor under 48-timmars rotation kultur steg. PDX-linjer bör övervakas noggrant första gången detta protokoll utförs, och immunstained för HNA, för att identifiera andelen mänskliga celler i de vidhäftande och icke-anhängare populationerna. Icke-vävnadskultur behandlade plattor bör användas för klusterbildning med dessa PDXs. Mus stromaceller kommer fortfarande att följa så småningom till ytan, men separation kommer inte att vara lika effektiv.

Efter rotationskultur bearbetas den supernatant som innehåller icke-anhängarens population genom metoden med beskrivna densitetsgradientcentrifugation. Det protokoll som rapporteras här kan förenklas för att utesluta minst ett densitetssteg (t.ex. med endast lösningarna 20 %, 40 % och 55 % ), men alla fyra bör användas när denna metod fastställs med varje ny PDX. Multicellulära kluster är lätt separeras från enskilda celler med denna metod, och till stor del behålla sina klustrade fenotyp och andra egenskaper. Den kasserade encelliga populationen representerar antingen (a) celler som var döda/döende före rotationssteget på 48 h, och därmed aldrig integrerade i ett kluster, eller b) celler som förblev vid liv efter 48 h-rotationen, men ändå inte integrerades i kluster. Det är viktigt att notera att grupp (b) kan innefatta celler som vissa utredare finner önskvärda; t.ex. har vissa rapporter beskrivit primära cellkulturer som innehåller tidiga stamceller/stamceller, eller läkemedelsresistenta celler, som flyter inom supernatant som dåligt vidhäftande enstaka celler ovanför en annars vidhäftande population¹⁰. Relevant för cancerstudier, cirkulerande tumörceller (CTC), tumör initiera celler (TICs), eller andra liknande metastasering-främja celltyper skulle kunna vara en del av denna enda cell population. Därför bör utredare som använder vårt protokoll noggrant analysera den kasserade encelliga populationen för att säkerställa att eventuella celler av intresse inte har gått förlorade. I våra händer, de allra flesta av dessa enstaka celler är antingen en liten del av cancerceller som är döda / döende på grund av den ursprungliga vävnad dissociation protokoll, eller gnagare fibroblaster som redan går igenom anoikis.

Det rekommenderas starkt att öva tekniken för seedning av den mikrofluidiska plattan med mindre dyrbara celler för att säkerställa framgång när du arbetar med begränsat och värdefullt PDX-material. Var medveten om spetsplacering under dispensering, eftersom felaktig teknik sannolikt resulterar i 1) överflöd om tryck appliceras under lastning, eller 2) tomma eller delvis fyllda kanaler om spetsen inte är centrerad över inloppsporten. För tidig gelation kommer också att orsaka kanaler att inte fylla till slutet. Om detta inträffar, minska väntetiden mellan tillsats av PEGDA-korslänkaren och dispensering av gellösningen, eller arbeta med mindre alikvoter av gellösning åt gången. De dispenseringsvolymer som används i detta protokoll är väl optimerade för framgång med HA hydrogeler. Användning av mer viskösa lösningar som Matrigel i detta system kräver en ökning av dispenseringsvolymen till ~2 μL för korrekt fyllning av de mikrofluidiska kanalerna. Observera också att valet av 50 μL steg i steg 4.3, beredning av fyra cellpellets i samma steg, och de upprepade resuspensionerna i steg 4.10 är avsiktliga; även om de ger mer material än nödvändigt, ger de också överage för att redovisa förluster från den upprepande pipetten.

Det bör noteras att varje PDX sannolikt kommer att ha en unik morfologi och storleksfördelning inom denna 3D-odlingsmodell. I en mening förväntas detta, på grund av mångfalden av patientens sjukdom, vävnad historia, matrisparametrar, och många andra faktorer. En expansiv bedömning av flera prostatacancer linjer i Matrigel visat denna potentiella mångfald¹¹. Ändå kan utredarna bli förvånad över att hitta en stor variation i ovanstående parametrar. I ett manuskript som förberedelse presenterar vi en bred titt på flera PDX:er på denna kulturplattform; cellerna upprätthåller ett konsekvent svar inom varje PDX-typ, men kan variera väsentligt mellan exemplar, vilket resulterar i kluster som till exempel är stora med hög celltäthet per kluster, eller mindre, med lösare intercellulära anslutningar. Det specifika beteendet hos varje PDX bör bedömas av utredare över flera försök, för att bekräfta en förutsägbar och karakteristisk morfologi. Utredare kan förvänta sig exemplar att följa de allmänna beteenden som beskrivs i denna uppsats.

Sammanfattningsvis erbjuder det presenterade protokollet forskare en ny metod för att använda PDXs ex vivo i en plattform som möjliggör finjustering av kulturförhållanden och införlivande av relevanta 3D-miljösignaler såsom vävnadsspecifik extracellulärmatrix (ECM) och perfusionsflöde, vilket möjliggör förlängd cellöverlevnad under flera dagar eller veckor. Detaljerad karakterisering av dessa kulturer uppnåddes genom de färgning och morfologiska analyser som demonstreras här. Dessutom, om det behövs, kulturer kan lämnas till platta läsare-baserade analyser, immunofluorescerande märkning, eller användas för framställning av lysater möjliggör ytterligare molekylär karakterisering. Även om vi har publicerat tidigare några delar av PDX 3D kultur inom hydrogels, denna tillämpning av multistep rening är ny, lätt att anställa i ett standardlaboratorium, och framgångsrika i att behålla hög livskraftiga representativa kulturer. Den OrganoPlate plattform, i sin 2-lane och 3-lane sorter, erbjuder ytterligare komplexitet genom sin modell av vävnad perfusion, och en viktig möjlighet att använda ännu färre celler per experiment. Jämfört med våra tidigare modeller minskade den mikrofluidiska plattformen cellbehoven med en faktor på ~ 30, per experiment, vilket är en enorm fördel, med tanke på den knappa tillgängligheten av PDX tumörvävnad i de flesta laboratorier. Det mikrofluidiska systemet möjliggör utökad bildbehandling, immunfärgning och facile imaging, över en cellpopulation som är tillräckligt stor (n = ~ 2,000−4,000 celler per bildruta) för att möjliggöra kvantifiering av fenotyp inom kontexten för rumslig organisation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable