Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Brug af en kemisk biopsi til graft kvalitetsvurdering

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/60946
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 3, 3, 2,4, 3, 1
1Department of Pharmacodynamics and Molecular Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Nicolaus Copernicus University in Torun, Collegium Medicum in Bydgoszcz, 2Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery, Toronto General Hospital, University Health Network, 3Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland, 4Department of Medicine, Toronto General Hospital
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Protokollen præsenterer udnyttelse af den kemiske biopsi tilgang efterfulgt af omfattende metabolomic og lipidomic analyse for kvalitetsvurdering af nyretransplantater afsat til transplantation.

Abstract

Nyretransplantation er en livreddende behandling for et stort antal mennesker med nyredysfunktion i slutstadiet på verdensplan. Proceduren er forbundet med en øget overlevelsesrate og større kvalitet af patientens liv i forhold til konventionel dialyse. Desværre lider transplantationen af mangel på pålidelige metoder til vurdering af organkvaliteten. Standarddiagnosticeringsteknikker er begrænset til makroskopisk udseendeinspektion eller invasiv vævsbiopsi, som ikke giver omfattende oplysninger om transplantatet. Den foreslåede protokol har til formål at indføre mikroeksistenstræk i fast fase (SPME) som en ideel analysemetode til omfattende metabolomik og lipidomic analyse af alle lavkylære forbindelser, der findes i nyrer, der er afsat til transplantation. SPME-sondens lille størrelse muliggør en kemisk biopsis ydeevne, som muliggør udvinding af metabolitter direkte fra organet uden vævsindsamling. Metodens mindste invasive virkning gør det muligt at udføre flere analyser over tid: direkte efter organhøst, under dens konservering og umiddelbart efter revaskularisering på modtagerens krop. Det er en hypotese, at kombinationen af denne nye prøveudtagningsmetode med et massespektrometer med høj opløsning vil give mulighed for forskelsbehandling af et sæt karakteristiske forbindelser, der kan tjene som biologiske markører for graftkvalitet og indikatorer for mulig udvikling af organdysfunktion.

Introduction

Ifølge USA's organindkøbs- og transplantationsnetværk var der 94.756 patienter, der ventede på nyretransplantationer i USA i 2019. i Europa i 2018 var det tal 10.791. Hvert tiende minut, er nogen føjet til den nationale transplantation venteliste i USA, og det anslås, at 20 mennesker dør hver dag venter på en transplantation1,2. Nyretransplantation er en livreddende behandling for et stort antal mennesker, der lider med slutstadiet nyredysfunktion på verdensplan. Proceduren er forbundet med øget overlevelsesrate og større livskvalitet sammenlignet med konventionel dialyse.

Transplantation står imidlertid over for mange alvorlige problemer, såsom organmangel eller mangel på effektive værktøjer til vurdering af organkvaliteten. Standardprotokollerne er begrænset til makroskopisk udseende inspektion eller invasiv vævbiopsi, som ikke giver omfattende oplysninger om kvaliteten af transplantatet. Mens en visuel vurdering giver mulighed for identifikation af tumorer synlige for øjet, anatomiske abnormiteter, eller omfattende skader på transplantater, denne fremgangsmåde er meget subjektiv, varierende i sin effektivitet i henhold til erfaringerne fra observatørerne. Biopsi, på den anden side, kan give værdifulde oplysninger om allerede eksisterende nyresygdomme, og anses derfor for at være en metode til objektiv og dokumenteret værdi i fastsættelsen af graft resultater. Men, biopsi procedure er ikke fri for fejl; der er risiko for potentielle komplikationer såsom blødning og yderligere 4-5 timers prøvepræparat er påkrævet, hvilket i væsentlig grad forlænger den kolde iskæmiske tid. Derfor er brugen af direkte vævsanalyse i Europa begrænset til udvidede kriterier donorer (ECD) og donorer efter kredsløbsdød (DCD)3,4.

Metabolomik og lipidomics er for nylig blevet anerkendt som lovende tilgange til at opnå en bedre forståelse af de ændringer i biokemiske veje, der opstår under organopholdelse. Metabolomic og lipidomic profilering gør det muligt at overvåge systemets umiddelbare reaktioner på pludselige miljømæssige ændringer i forbindelse med fjernelse af organer med efterfølgende konsekvenser: iskæmi, oxidativt stressellerinflammatoriske reaktioner5,6,7,8. Nyrerne er et organ, der i vid udstrækning er forbundet med metaboliske processer, således målinger af metabolitter og lipider koncentrationer kan gøre det muligt at identificere potentielle organkvalitet biomarkører og muliggøre bedre forudsigelser af graft resultat.

I betragtning af ovennævnte komplikationer og begrænsninger i forbindelse med de nuværende organkvalitetsvurderingsmetoder er der behov for en mindre invasiv diagnostisk løsning til hurtig og kompleks vurdering af organkvaliteten. Mikroudtræk i fast fase (SPME) opfylder disse krav som en minimalt invasiv analysemetode, der muliggør dækning af et bredt spektrum af metabolitter og lipider. Teknikken er baseret på indsættelse af en tynd (~200 μm), biokompiselig, titanium-nikkellegeringssonde dækket med en selektiv ekstraktionsfase i det undersøgte organ i en kort periode. Det skal understreges, at SPME forhindrer proteinekstraktion og dermed muliggør metabolismehæmning allerede på indsamlingsstadiet, hvilket er en betydelig fordel i forhold til alternative metoder. Desuden giver miniaturiseringen af anordningen mulighed for udførelse af gentagne og samtidige analyser af få strukturer iorganet 9,10,11.

Protocol

Alle dyr modtog human pleje i overensstemmelse med ''Principles of Laboratory Animal Care'' formuleret af National Society for Medical Research og ''Guide for the Care of Laboratory Animals'' udgivet af National Institute of Health, Ontario, Canada. Animal Care Committee af Toronto General Research Institute godkendt alle undersøgelser. Forskningen involverede mennesker blev godkendt af Bioethical Committee på Collegium Medicum i Bydgoszcz Nicolaus Copernicus University i Torun.

BEMÆRK: Få godkendelse fra relevante etiske bestyrelser. Husk altid at bære sikkerhedshandsker. Rør ikke ved ekstraktionsfasen af SPME-sonder. Det anbefales at anvende deaktiverede glashætteglas til lipidomic-analyser.

1. Udarbejdelse af sonder

  1. Forbered titanium-nikkel legering sonder (40 mm længde; 0,2 mm diameter) belagt med 7 mm mix-mode sorbent. Antallet af sonder afhænger af de tidspunkter, der er målrettet under hele proceduren, og antallet af replikater (3 anbefales pr. tidspunkt).
    BEMÆRK: Længden og typen af ekstraktionsfase kan justeres på grundlag af studiemåden, metabolitters polaritet og prøvematrixen.
  2. Der tilberedes en rengøringsblanding bestående af 2:1 chloroform:methanol (v/v). Rør 1,0 ml af opløsningen på hvert 2,0 ml glasglas og en sonde, der tidligere er gennemboret gennem hætten, i hvert hætteglas.
    BEMÆRK: Før brug rengøres alle sonder for at fjerne forurenende partikler.
  3. Sæt hætteglassene på omrøreren og sæt omrøringshastigheden til 1.200 omdrejninger i minuttet. Efter 45 min, stop enheden og skyl belægningerne med LC-MS grade vand.
  4. Da belægninger skal gennemgå et forkonditioneringstrin for at aktivere dem, skal der forberedes en forkonditioneringsblanding bestående af 1:1 methanol:vand (v/v). Rør 1,0 ml af opløsningen på hvert 2,0 ml glasglas og en sonde, der tidligere er gennemboret gennem hætten, i hvert hætteglas.
  5. Sæt hætteglassene på vortex-omrøreren, og indstil omrøringshastigheden til 1.200 omdrejninger i minuttet.
  6. Efter 60 min, stop omrøreren og skyl belægningerne med LC-MS grade vand.
  7. Steriliser sonder i henhold til standard steriliseringsprotokollen for kirurgisk udstyr.

2. Udvinding

  1. Åbn den sterile emballage lige før prøveudtagning for at sikre et sterilt miljø.
  2. Indsæt to sonder direkte ind i nyre cortex i 10 min på hvert tidspunkt punkt. Hele belægningens længde skal være dækket af vævsmatrixen. ingen specifik vinkel er påkrævet, men ca. 90 grader anvendes normalt.
    BEMÆRK: Hele den medicinske procedure følger standardprotokoller i en given institution. Der tages ingen hensyn til ændringer vedrørende GRANSP-prøvetagning. Proceduren omfatter følgende seks prøvetagningstidspunkter:
    a) før nyreresektion, in vivo fra donor;
    b)-e) efter 1 time, 3 timer, 5 timer, 7 timers nyreperfusion, ex vivo i orgelkammeret;
    f) efter reperfusion, in vivo fra modtageren.
  3. Træk sonderne tilbage ved at trække det ud af vævet og skyl derefter belægninger med vand af LC-MS-kvalitet for at fjerne eventuelt resterende blod fra belægningsoverfladen. Skyl væk fra operationsstedet, og umiddelbart efter fjernelse af sonderne.

3. Transport og opbevaring

  1. Sonderne sættes i separate hætteglas, og luk dem.
  2. Hætteglassene i en Styrofoam-kasse fyldt med tøris eller flydende nitrogen til transport.
  3. Prøverne opbevares i en fryser (-80 °C), eller desorptionstrinnet påbegyndes straks.

4.

  1. Forbered desorptionsopløsninger, der består af 80:20 acetonitril:vand (v/v) til metabolomisk analyse, og 1:1 isopropanol:methanol (v/v) til lipidomic analyse.
  2. Rør 100 μL af opløsningen til indsatser, der er anbragt i 2,0 ml mærkede hætteglas, og der anbringes en sonde, der tidligere er gennemboret gennem hætten, i hvert hætteglas.
  3. Sæt hætteglassene på vortex-omrøreren, og indstil omrøringshastigheden til 1.200 omdrejninger i minuttet i 120 min.
  4. Fjern sonder fra hætteglassene. Opnåede ekstrakter er nu klar til instrumental analyse.

5. LC-MS-analyse

  1. Anlæder hætteglas med ekstrakter i autosampleren i LC-MS-systemet.
    BEMÆRK: Flydende kromatografi (RP, HILIC) kombineret med massespektrometri med høj opløsning og en orbitrap masseanalysator blev anvendt til denne undersøgelse. For metabolomic analyse parametre, gå til trin 5,2. For lipidomic analyseparametre skal du gå til trin 5.6.
  2. Brug en pentafluorophenylkolonne (PFP) (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) til omvendt faseadskillelse.
    1. Strømningshastigheden indstilles til 300 μL/min. og autosampler- og kolonnetemperaturerne til henholdsvis 4 °C og 25 °C.
    2. Forbered mobile faser i henhold til følgende proportioner: mobil fase A: vand:myresyre (99.9:0.1, v/v) og mobil fase B: acetonitril:myresyre (99.9:0.1, v/v). Indstil det mobile faseflow i henhold til følgende parametre: start af mobilfaseflow (0-3 min): 100% A efterfulgt af en lineær gradient til 10% A (3-25 min), der slutter med en isokratisk strøm på 10% A indtil 34 min, efterfulgt af 6 min kolonnereligelige balancetid.
  3. Til HILIC-separation skal der anvendes en HILIC-kolonne (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200A). Indstil strømningshastigheden til 400 μL/min.
    1. Der forberedes mobile faser i henhold til følgende proportioner: mobil fase A: acetonitrile:ammoniumacetatbuffer (9:1, v/v, effektiv saltkoncentration 20 mM), mobil fase B: acetonitrile:ammoniumacetatbuffer (1:1, v/v, effektiv saltkoncentration 20 mM).
    2. Indstil det mobile faseflow i henhold til følgende parametre: start af mobilfaseflow (0-3 min) ved 100% A, hold i 3,0 min og rampe derefter til 100% B inden for 5 min. Hold med 100% B indtil 12 min, efterfulgt af 8 min kolonne re-ligevægt tid.
  4. Indstil scanningsområdet til 85-1000 m/z. Indstil HESI ionkildeparametre i positiv ioniseringstilstand til: sprøjtespænding 1.500 V, kapillær temperatur 300 °C, kappegas 40 a.u., aux gasflowhastighed 15 a.u., sondevarmerens temperatur 300 °C, S-Lens RF-niveau 55%.
  5. Der køres QC-prøver, der består af 10 μL af hver analyseret prøve (regelmæssigt, hver 10-12 prøver) for at overvåge instrumentets ydeevne.
  6. Ved omvendt faseseparation skal du bruge en C18-kolonne (2,1 mm x 75 mm, 3,5 μm).
    1. Strømningshastigheden indstilles til 200 μL/min. og autosampler- og kolonnetemperaturerne til henholdsvis 4 °C og 55 °C. Forbered mobile faser i henhold til følgende proportioner: mobil fase A: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM ammoniumacetat og 1 mM eddikesyre; mobil fase B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM ammoniumacetat og 1 mM eddikesyre.
    2. Indstil det mobile faseflow efter følgende parametre: 0-1 min (20% B), 1-1,5 min (20-50% B), 1,5-7,5 min (50-70% B), 7,5 -13 min (70-95% B), 13-17 min (95% B), 17-17,1 min (95-20% B), 17,1-23 min (20%).
  7. Ved HILIC-separation skal du bruge en HILIC-kolonne (100 x 2,1 mm, 3 μm).
    1. Strømningshastigheden indstilles til 400 μL/min. og autosampler- og kolonnetemperaturerne til henholdsvis 4 °C og 40 °C.
    2. Forbered mobile faser i henhold til følgende proportioner: mobil fase A: ACN; mobil fase B: 5 mM ammoniumacetat i vand. Indstil det mobile faseflow i henhold til følgende parametre: 0-2 min (96% B), 2-15 min (96-80% B), 15-15,1 min (80-96% B), 15,1-21 min (96% B).
  8. Indstil HESI ionkildeparametre i positiv ioniseringstilstand til sprøjtespænding 3.500 V, kapillær temperatur 275 °C, kappegas 20 a.u., aux gasflowhastighed 10 a.u., sondevarmerens temperatur 300 °C, S-Lens RF-niveau 55%.
  9. Der køres QC-prøver, der består af 10 μL af hver analyseret prøve (hver 10-12 prøver) for at overvåge instrumentets ydeevne.
  10. Udfør dataindsamling i software, der er kompatibel med instrumentet.

6. Dataanalyse

  1. Udfør databehandling, formodede identifikation, og statistisk analyse med brug af software dedikeret til ikke-målrettede metabolomics og lipidomics analyse.
    BEMÆRK: Hovedkomponenter analyse (PCA) og box-whisker plots kan fås til at visualisere datastruktur.

Representative Results

Prøvetagningen blev udført efter den ovenfor beskrevne SPME-metode ved hjælp af sonder belagt med en 7 mm blandet ekstraktionsfase. Prøveudtagningen blev foretaget direkte fra transplantatet væv (in vivo før transplantation), ex vivo i nyrekammer efter 1 h, 3 h, 5 h, og 7 h perfusion, og in vivo efter revaskularisering i modtageren. Umålrettede metabolomiske og lipidomiske analyser blev udført med brug af flydende kromatografi (RP, HILIC) kombineret med massespektrometri med høj opløsning, med masseanalysatoren sat i positiv ioniseringstilstand. For at vurdere datakvaliteten og opnå generel indsigt i resultaterne blev data underkastet hovedkomponentanalyse. Som vist i figur 1dannede QC-prøver en stram klynge, der bekræftede kvaliteten af analyserne. De undersøgte grupper udviser en forholdsvis god adskillelse, hvilket giver mulighed for visualisering af forskelle i metaboliske og lipidomic profiler før og efter transplantation, samt under organperfusion (Figur 2). SPME-prøvetagning tillader metabolisk profilering af organet over tid. Box-whisker-plots af udvalgte metabolitter tjener til at eksemplificere ændringer i metabolitniveauer under hele forsøget (figur 3). Det brede spektrum af udtrukne træk adskilt på både RP- og HILIC-kolonner er vist i figur 4.

Figure 1
Figur 1: Analyse af hovedkomponenter, der viser klyngedannelse af kvalitetskontrolprøver for metabolomic omvendt fase (A), HILIC (B) og lipidomic reversed-fase (C), HILIC (D) analyser. Kvalitetskontrol er nødvendig i ikke-målrettede analyse for at overvåge eventuelle ændringer forårsaget af instrumental ustabilitet. Tæt klynge af QC prøver sikrer, at alle observerede ændringer er af biologisk oprindelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Analyse af hovedkomponenter, der viser metabolomic (A) og lipidomic (B) forskelle mellem bestemte prøvetagningssteder. Ikke-målrettede profilering af nyre med SPME-LC-HRMS gør det muligt at observere biokemiske forskelle i organer ved efterfølgende trin af deres konservering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Kasse-whisker-parceller af udvalgte forbindelser, der viser ændringer i metabolitter (A, B) og lipider (C, D) i peritransplantperioden. Efter udvælgelse og identifikation af diskriminerende forbindelser box-whisker plots gør det muligt at overvåge ændringer i niveauet af disse forbindelser på efterfølgende trin i protokollen og sammenligne metabolitter niveauer i organer, der udsættes for forskellige konserveringsprotokoller eller høstet fra forskellige donorer f.eks hjerte bankende donorer eller donorer efter hjertedød. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Ionkort (m/z versus retentionstid) af funktioner opnået ved LC-MS-analyse med (A) omvendt fase og (B) HILIC-adskillelse. Observationsområdet gør det muligt at anslå det samlede antal funktioner, der er opnået med den foreslåede protokol (fra ekstraktion til detektion), og vurdere analysanddækningen baseret på polariteten. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Evaluering af organkvalitet er fortsat en stor udfordring for læger, som skal træffe hurtige informerede beslutninger om, hvorvidt et givet organ er levedygtigt til transplantation, eller om det skal kasseres. Flere faktorer, såsom donor alder, varigheden af iskæmi, og infektioner og inflammatoriske processer, kan påvirke den langsigtede graft resultat. Mens forskellige metoder er blevet udviklet til dato for at diagnosticere nyre allograft funktion, histopatologisk inspektion forbliver guldstandarden i dennesag 3,4,12. Selv om biopsi procedure kan give betydelige oplysninger om allerede eksisterende donorsygdom og vaskulære ændringer, det er ikke fri for fejl. Stikprøvefejl i forbindelse med interobservervariation og prøveudtagning af utilstrækkelig glomeruli til omfattende oplysninger om organfunktionen er fortsat typiske problemer i denne henseende. Desuden giver præparatet visse spørgsmål såsom en ufuldstændig vurdering af transplantatet i tilfælde af frosne sektioner og forlængelse af proceduretiden for parafling. Men den øgede risiko for blødning, som kan forekomme akut som mikroskopisk eller grov hæmatia, er den største livstruende komplikation forbundet med biopsi procedure. Derfor er antallet af tilladte biopsier strengt begrænset i transplantationsprocedurer, en faktor, der hæmmer erobringen af dynamiske ændringer og tidsserieanalyser via dennemetode 12,13,14. Fordelene ved en histologisk analyse skal afvejes mod de risici, der er forbundet med metoden. Værdien af histologiske fund er ubestridelig, men de forklarer ikke de molekylære mekanismer i afvigelser.

Metabolomics og lipidomics er de yngste domæner af "-omics" videnskabelige familie. Det komplette sæt af lav molekylære (<1.200 Da) humane metabolitter og lipider forbundet inden for et metabolisk netværk er defineret som en human metabolom. Genomet forbliver relativt konstant i hele dets levetid, med mindre ændringer forårsaget af mutationer forekommer sjældent. Metabolomet er et produkt af genekspression, som er meget følsom over for ændringer i alle biologiske processer samt miljømæssige faktorer. Den dynamiske karakter af metabolitter og lipider gør dem perfekte indikatorer for den nuværende organtilstand7,8,15,16. Den SPME-metode, der foreslås i ovennævnte protokol, gør det muligt at opdage ændringer, der forekommer i organet under dets bevarelse, begyndende fra organfjernelse fra donorkroppen indtil revaskularisering hos modtageren. Sondens lille diameter (~200 μm) giver minimal invasiv og giver mulighed for flere prøver fra samme organ uden at forårsage skade på vævet. Gennemførelse af undersøgelser ved hjælp af nyre, som den hyppigst transplanterede organ, giver mulighed for en bedre forståelse og yderligere karakterisering af de metaboliske veje ansvarlig for at afslå kvaliteten og funktionen af transplantater. Muligheden for at overvåge ændringer over tid helt sikkert er en vigtig fordel ved teknikken i forhold til konventionelle invasive metoder såsom biopsi. Den aktuelt fremlagte analyse identificeret ændrede koncentrationer af forskellige grupper af lipider og metabolitter, især af essentielle aminosyrer, puriner, purin nukleosider, og glycerophospholipids. Disse resultater stemmer overens med tidligere vævsanalyserapporter5,6,17,18,19,20. Til dato har de fleste videnskabelige rapporter, der anvender metabolomik eller lipidomics til at forklare processer, der fremkalder komplikationer efter transplantation eller iskæmi/reperfusionsskade (IRI) fænomener, været begrænset til analyse af biofluider21,22,23.

Hver klinisk anvendelse kræver optimering af prøvetagningsprotokollen for at sikre, at analysemetodens ydeevne opfylder de forventede kriterier. I denne forbindelse er fordelen ved at anvende SPME muligheden for at justere betingelserne for forskellige forsøgsdesign. De mange forskellige tilgængelige ekstraktionsfaser giver et bredt spektrum af udtrukne metabolitter med diversificerede polariteter. Samtidig kan dette betragtes som en begrænsning af metoden, da hver sorbent giver selektivitet over for specifikke egenskaber og ikke udvinder alle forbindelser, der findes i prøvematrixen. Det skal bemærkes, at SPME belægninger ekstrakt kun via frie molekyler, og simpelthen ikke interagere med en bundet brøkdel af analysanden. Belægningernes biokompatibilitet medfører ikke toksicitet for vævet, mens ekstraktionen af store molekyler såsom proteiner begrænses; Som følge heraf hæmmes de enzymatiske processer allerede på indsamlingsstadiet, og tilstedeværelsen af artefakter minimeres, hvilket er en stor fordel i forhold til alternative prøveudtagningsmetoder. Belægningens længde påvirker ekstraktionens effektivitet (dvs. belægningens længde angiver overfladearealet og ekstraktionsfasevolumen). således giver længere belægninger højere genindvindinger. På den anden side muliggør kortere belægninger højere rumlig opløsning. For pålidelige resultater, Er det afgørende at nedsænke sonden til nøjagtig samme dybde af nyre cortex. Indsættelse for dybt forårsager risikoen for at komme ind i nyre medulla. Ekstraktionens tid er også proportional med udvindingseffektiviteten. Derfor er udvælgelse af optimal udvindingstid et af de mest kritiske trin i udviklingen af SPME-metoden. Tidsmålingens nøjagtighed giver den højeste repeterbarhed. I biologiske anvendelser som den diskuterede er der altid et kompromis mellem den analytiske protokols følsomhed og repeterbarhed og begrænsningerne i den medicinske procedure. Mens ligevægtsekstraktion giver den højeste følsomhed, anvendes præligereligvildighedsforholdene af sikkerhedsmæssige årsager ofte i sådanne anvendelser, da ekstraktionstiden ikke bør påvirke operationens samlede varighed. Desorptionens effektivitet bestemmes af tidspunktet for processen og sammensætningen af desorptionsopløsningsmidlet, som skal være forenelig med den mobile fase, der anvendes til kromatografisk adskillelse9,10,11.

Et af de vigtigste krav til diagnostisk instrumentering, der anvendes til intrakirurgiske vurderinger, er analysetid. Der gøres aktuelle forsøg på at udvikle et hurtigt værktøj til in vivo SPME-ekstraktion, der er koblet direkte til et massespektrometer via microfluidic open interface (MOI)24 eller coated blade spray (CBS)25. Sådanne tilgange vil gøre det muligt at offentliggøre analytiske resultater i realtid eller tæt på realtid. Anvendelsen af sådanne metoder til analyse af metaboliske og lipidomic-profiler før indgrebet kan forbedre beslutningsprocessen under transplantationsprocedurerne, så den bedst mulige personlige tilgang og hurtig reaktion i tilfælde af organsvigt kan styrkes.

Sammenfattende er det en hypotese, at den foreslåede protokol vil gøre det muligt at opnå fuld metaboliske og lipidomic profiler af nyretransplantater, hvilket igen vil give en omfattende vurdering af organkvalitet og karakterisering af de processer, der er ansvarlige for iskæmi-reperfusion skade. Projektets nyhed omfatter udnyttelse af mikroeksplinter i fast fase (SPME), der tilbyder lav invasiv prøveudtagning af levende systemer i kombination med en af de mest innovative teknologier til metabolomik- og lipidomics-analyse (f.eks. massspektrometeret orbitrap med høj opløsning). SPME kombinerer prøveindsamling, ekstraktion og dæmpning af metabolitter i ét trin, hvilket gør det til et perfekt værktøj til hurtig analyse. Det forventes, at denne protokol vil bidrage til at besvare spørgsmål vedrørende, hvad præ-transplantation betingelser i nyrerne er ansvarlige for forsinket organfunktion eller dens dysfunktioner efter transplantation, samt hvordan graft bevarelse protokol påvirker biokemi af orglet. En sådan viden vil ikke kun have betydelig indvirkning på forebyggelsen af mulige komplikationer i forbindelse med transplantation, men kan bidrage til at forbedre de nuværende graft konserveringsprotokoller, minimere tab af levedygtige transplantationsvæv samt tab af menneskeliv. Den foreslåede løsning vil åbne døren for yderligere undersøgelser på dette område, herunder validering af specifikke potentielle biomarkører og forbedring af terapeutiske resultater i transplantationologien.

Disclosures

Forfatterne vil gerne anerkende MilliporeSigma (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) for at levere SPME-enheder og Thermo Fisher Scientific for adgang til Q-Exactive Focus Orbitrap massespektrometer.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev støttet af tilskud Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 fra National Science Centre. Forfatterne vil gerne anerkende MilliporeSigma, en virksomhed af Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland for at levere SPME-enheder. Mercks life science-virksomhed fungerer som MilliporeSigma i USA og Canada. Også forfatterne ønsker at takke Thermo Fisher Scientific for adgang til Q-Exactive Focus orbitrap massespektrometer. Forfatterne vil gerne takke Dr. Aleksandra Woderska-Jasińska og personalet i Institut for Transplantologi og Generel Kirurgi i Bydgoszcz for deres venlige bistand i projektet. BB vil gerne takke prof. Janusz Pawliszyn for muligheden for prøve indsamling på Toronto General Hospital under hendes ophold på University of Waterloo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 5330010050 Mobile phase additive
Acetonitrile Alchem 696-34967-4X2.5L HPLC solvent
Ammonium acetate Merck 5330040050 Mobile phase additive
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER Benchmark Scientific BV1010 Vortex mixer
Caps Perlan Technologies 5183-2076 Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK
Chloroform Merck 1024441000
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm Merck 567570-U HPLC guard column
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm Merck 567502-U HPLC column
Formic acid Alchem 497-94318-50ML Mobile phase additive
Glass vials Perlan Technologies 5182-0714
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-00D-4449-B0 HPLC column
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-AJ0-8328 HPLC guard column
Isopropanol Alchem 231-AL03262500 HPLC solvent
Methanol Alchem 696-34966-4X2.5L HPLC solvent
Nano-pure water Merck 1037281002 HPLC solvent
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS Thermo Scientific Q Exactive Focus Mass Spectrometer
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm Merck 1506570001 HPLC column
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm Merck 1504360001 HPLC guard column
SPME LC fiber probes, mixed mode Supelco prototype fibers
UltiMate 3000 HPLC systems Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC system
Vial inserts (deactivated) Perlan Technologies 5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm Waters 186005644 HPLC column
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm Waters 186007811 HPLC guard column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. U.S. Department of Health & Human Services. Organ Procurement and Transplantation Network. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov (2019).
  2. Branger, P., Undine, S. Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation. , Eurotransplant Foundation. Leiden. (2018).
  3. Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers. Transplantation. 97, 797-807 (2014).
  4. Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation. Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).
  5. Xu, J., et al. Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction. Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  6. Rao, S., et al. Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).
  7. Wishart, D. S. Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation. American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).
  8. Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. Understanding metabolomics in biomedical research. Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).
  9. Bojko, B., et al. Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols. Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).
  10. Filipiak, W., Bojko, B. SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research - How far are we from daily practice. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).
  11. Bojko, B., et al. Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery. Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).
  12. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).
  13. Plattner, B. W., et al. Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques. Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).
  14. Tapia-Canelas, C., et al. Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients. Nefrologia. 34, 115-119 (2014).
  15. Afshinnia, F., et al. Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease. Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).
  16. Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. Lipidomics: New insight into kidney disease. Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).
  17. Kaminski, J., et al. Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation. Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).
  18. Wijermars, L. G. M., et al. Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function. Kidney International. 90, 181-191 (2016).
  19. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).
  20. Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury. PLoS One. 13, 1-24 (2018).
  21. Wishart, D. S. Metabolomics in monitoring kidney transplants. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).
  22. Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases. Metabolites. 9, (2019).
  23. Zhang, Z. H., et al. Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis. Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).
  24. Looby, N. T., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
  25. Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS. Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).

Tags

Medicin transplantation nyre kemisk biopsi metabolomic lipidomic fast fase mikroudtræk (SPME) flydende kromatografi kombineret med massespektrometri (LC-MS)

Erratum

Formal Correction: Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment
Posted by JoVE Editors on 08/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. One of the affiliations was updated.

The third affiliation was updated from:

Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun"

to:

Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

Brug af en kemisk biopsi til graft kvalitetsvurdering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stryjak, I., Warmuzińska, N.,… More

Stryjak, I., Warmuzińska, N., Łuczykowski, K., Hamar, M., Urbanellis, P., Wojtal, E., Masztalerz, M., Selzner, M., Włodarczyk, Z., Bojko, B. Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. J. Vis. Exp. (160), e60946, doi:10.3791/60946 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter