Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bruke en kjemisk biopsi for graftkvalitetsvurdering

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/60946
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 3, 3, 2,4, 3, 1
1Department of Pharmacodynamics and Molecular Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Nicolaus Copernicus University in Torun, Collegium Medicum in Bydgoszcz, 2Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery, Toronto General Hospital, University Health Network, 3Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland, 4Department of Medicine, Toronto General Hospital
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Protokollen presenterer utnyttelse av den kjemiske biopsitilnærmingen etterfulgt av omfattende metabolomisk og lipidmisk analyse for kvalitetsvurdering av nyretransplantater tildelt transplantasjon.

Abstract

Nyretransplantasjon er en livreddende behandling for et stort antall personer med sluttstadium nyre dysfunksjon over hele verden. Prosedyren er forbundet med økt overlevelse og større kvalitet på pasientens liv sammenlignet med konvensjonell dialyse. Dessverre lider transplantasjonsteknologi av mangel på pålitelige metoder for organkvalitetsvurdering. Standard diagnostiske teknikker er begrenset til makroskopisk utseende inspeksjon eller invasiv vev biopsi, som ikke gir omfattende informasjon om graft. Den foreslåtte protokollen tar sikte på å innføre solid fase mikroektraksjon (SPME) som en ideell analytisk metode for omfattende metabolomikk og lipidomisk analyse av alle lavmolekylære forbindelser som finnes i nyrer tildelt transplantasjon. Den lille størrelsen på SPME-sonden muliggjør ytelse av en kjemisk biopsi, noe som muliggjør ekstraksjon av metabolitter direkte fra orgelet uten vevssamling. Den minste invasiviteten av metoden tillater gjennomføring av flere analyser over tid: rett etter organhøsting, under bevaring, og umiddelbart etter revaskularisering på mottakerens kropp. Det er hypotetisk at kombinasjonen av denne nye prøvetakingsmetoden med et høyoppløselig massespektrometer vil tillate diskriminering av et sett med karakteristiske forbindelser som kan tjene som biologiske markører for graftkvalitet og indikatorer for mulig utvikling av organdysfunksjon.

Introduction

Ifølge USAs organinnkjøp og transplantasjonsnettverk var det 94 756 pasienter som ventet på nyretransplantasjoner i USA i 2019; mens i Europa i 2018 var dette tallet 10.791. Hvert tiende minutt blir noen lagt til den nasjonale transplantasjonventelisten i USA, og det er anslått at 20 mennesker dør hver dag og venter påen transplantasjon 1,2. Nyretransplantasjon er en livreddende behandling for et stort antall mennesker som lider med terminal nyredysfunksjon over hele verden. Prosedyren er forbundet med økt overlevelse og større livskvalitet sammenlignet med konvensjonell dialyse.

Transplantasjon står imidlertid overfor mange alvorlige problemer, som organmangel eller mangel på effektive verktøy for organkvalitetsvurdering. Standardprotokollene er begrenset til makroskopisk utseende inspeksjon eller invasiv vev biopsi, som ikke gir omfattende informasjon om kvaliteten på transplantatet. Mens en visuell vurdering gjør det mulig å identifisere svulster synlig for øyet, anatomiske abnormiteter eller omfattende skade på grafts, er denne tilnærmingen svært subjektiv, varierende i effektiviteten i henhold til observatørenes erfaring. Biopsi, derimot, kan gi verdifull informasjon om eksisterende nyresykdommer, og anses dermed å være en metode for objektiv og dokumentert verdi i å bestemme graft utfall. Biopsiprosedyren er imidlertid ikke fri for feil; det er risiko for potensielle komplikasjoner som blødning og ytterligere 4-5 timer med prøveforberedelse er nødvendig, noe som forlenger den kalde iskemiske tiden betydelig. Derfor, spesielt i Europa, er bruken av direkte vevsanalyse begrenset til utvidede kriterier donorer (ECD) og givere etter sirkulasjonsdød (DCD)3,4.

Metabolomics og lipidomics har nylig blitt anerkjent som lovende tilnærminger til å oppnå en bedre forståelse av endringene i biokjemiske veier som oppstår under organbevaring. Metabolomisk og lipidmisk profilering muliggjør overvåking av umiddelbare responser av systemet til plutselige miljøendringer knyttet til organfjerning med påfølgende konsekvenser: iskemi, oksidativt stress ellerinflammatoriske responser 5,,6,,7,,8. Nyrene er et organ som i stor grad er forbundet med metabolske prosesser, og dermed kan målinger av metabolitter og lipiderkonsentrasjoner tillate identifisering av potensielle organkvalitet biomarkører og muliggjøre bedre spådommer om graft utfall.

Gitt de ovennevnte komplikasjonene og begrensningene forbundet med dagens organkvalitetsvurderingsmetoder, er det nødvendig med en mindre invasiv diagnostisk løsning for rask og kompleks organkvalitetsvurdering. Solid fase mikroektraksjon (SPME) overholder disse kravene som en minimal invasiv analytisk metode som muliggjør dekning av et bredt spekter av metabolitter og lipider. Teknikken er basert på innsetting av en tynn (~ 200 μm), biokompatibel, titan-nikkellegeringssonde dekket med en selektiv ekstraksjonsfase i det undersøkte organet i kort tid. Det bør understrekes at SPME forhindrer proteinekstraksjon, og dermed muliggjør metabolismehemming allerede på prøvetakingsstadiet, noe som er en betydelig fordel over alternative metoder. Videre gjør miniatyrisering av enheten mulighet for utførelse av repeterende og samtidige analyser av få strukturer iorgelet 9,10,11.

Protocol

Alle dyr fikk human omsorg i samsvar med ''Prinsipper for laboratoriedyrpleie'' formulert av National Society for Medical Research og ''Guide for care of Laboratory Animals'' utgitt av National Institute of Health, Ontario, Canada. Dyreomsorgskomiteen ved Toronto General Research Institute godkjente alle studier. Forskningen involvert menneskelige ble godkjent av bioetisk komité ved Collegium Medicum i Bydgoszcz Nicolaus Copernicus University i Torun.

MERK: Få godkjenning fra egnede etiske styrer. Husk å alltid bruke vernehansker. Ikke berør avsugsfasen til SPME-prober. Bruk av deaktiverte hetteglass med glass anbefales for lipidomanalyser.

1. Utarbeidelse av sonder

  1. Forbered titan-nikkellegeringsprober (40 mm lengde; 0,2 mm diameter) belagt med sorbent i 7 mm miksemodus. Antall prober avhenger av tidspunktene som er rettet mot under hele prosedyren, og antall repliker (3 anbefales per tidspunkt).
    MERK: Lengden og typen ekstraksjonsfase kan justeres basert på studiemåten, ombolittenes polaritet og prøvematrisen.
  2. Forbered en rengjøringsblanding bestående av 2:1 kloroform:metanol (v/v). Pipet 1,0 ml oppløsning til hvert 2,0 ml hetteglass og legg en sonde, tidligere gjennomboret gjennom hetten, i hvert hetteglass.
    MERK: Rengjør alle probene før bruk for å fjerne forurensende partikler.
  3. Sett hetteglassene på agitatoren og sett omrøringshastigheten ved 1200 o/min. Etter 45 min, stopp enheten og skyll belegget med LC-MS-grade vann.
  4. Som belegg må gjennomgå et betinget trinn for å aktivere dem, forberede en betinget blanding bestående av 1:1 metanol:vann (v /v). Pipet 1,0 ml oppløsning til hvert 2,0 ml hetteglass og legg en sonde, tidligere gjennomboret gjennom hetten, i hvert hetteglass.
  5. Sett hetteglassene på vortex agitatoren og sett omrøringshastigheten ved 1200 o/min.
  6. Etter 60 min, stopp agitatoren og skyll belegget med LC-MS-grade vann.
  7. Steriliser prober i henhold til standard steriliseringsprotokoll for kirurgisk utstyr.

2. Ekstraksjon

  1. Åpne den sterile pakken rett før prøvetaking for å sikre et sterilt miljø.
  2. Sett to sonder direkte inn i nyrecortex i 10 min på hvert tidspunkt. Hele lengden på belegget må dekkes av vevsmatrisen; ingen spesifikk vinkel er nødvendig, men ca. 90 grader brukes vanligvis.
    MERK: Hele den medisinske prosedyren følger standardprotokoller i gitt institusjon. Ingen endring vedrørende SPME-prøvetaking vurderes. Prosedyren omfatter de seks følgende utvalgstidspunktene:
    a) før nyre reseksjon, in vivo fra donor;
    b)-e) etter 1 t, 3 timer, 5 timer, 7 timer nyreperfusjon, ex vivo i organkammer;
    f) etter reperfusjon, in vivo fra mottakeren.
  3. Trekk sondene tilbake ved å trekke den ut av vevet og skyll deretter belegg med LC-MS-graders vann for å fjerne gjenværende blod fra beleggets overflate. Skyll vekk fra operasjonsstedet, og umiddelbart etter fjerning av sondene.

3. Transport og lagring

  1. Plasser probene i separate hetteglass og lukk dem.
  2. Legg hetteglass i en Styrofoam boks fylt med tørris eller i flytende nitrogen for transport.
  3. Oppbevar prøvene i en fryser (-80 °C), eller start umiddelbart avsorpsjonstrinnet.

4. Fornedrelse

  1. Forbered desorpsjonsløsninger bestående av 80:20 acetonitril:vann (v/v) for metabolomisk analyse, og 1:1 isopropanol:metanol (v/v) for lipidomisk analyse.
  2. Pipet 100 μL av oppløsningen til innsatser plassert i 2,0 ml merkede hetteglass og plasser en sonde, tidligere gjennomboret gjennom hetten, i hvert hetteglass.
  3. Sett hetteglassene på vortex agitatoren og sett agitasjonshastigheten ved 1200 o/min i 120 min.
  4. Fjern probene fra hetteglassene. Oppnådde ekstrakter er nå klare for instrumentell analyse.

5. LC-MS-analyse

  1. Plasser hetteglass som inneholder ekstrakter i autosampleren til LC-MS-systemet.
    MERK: Flytende kromatografi (RP, HILIC) kombinert med høyoppløselig massespektrometri og en orbitrap masseanalysator ble brukt til denne studien. For metabolomiske analyseparametere, gå til trinn 5.2. For lipidomanalyseparametere, gå til trinn 5.6.
  2. Bruk en pentafluorophenyl (PFP) kolonne (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) for omvendt faseseparasjon.
    1. Sett strømningshastigheten til henholdsvis 300 μL/min, og autosampler- og kolonnetemperaturer til henholdsvis 4 °C og 25 °C.
    2. Forbered mobile faser i henhold til følgende proporsjoner: mobil fase A: vann:maursyre (99.9:0.1, v/v) og mobil fase B: acetonitril:maursyre (99.9:0.1, v/v). Still inn mobilfaseflyten i henhold til følgende parametere: start mobil faseflyt (0-3 min): 100% A etterfulgt av en lineær gradient til 10% A (3-25 min), og endte med isokratisk strømning på 10% A til 34 min, etterfulgt av 6 min kolonne re-likevektstid.
  3. For HILIC-separasjon, bruk en HILIC-kolonne (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200A). Sett strømningshastigheten til 400 μL/min.
    1. Forbered mobile faser i henhold til følgende proporsjoner: mobil fase A: acetonitrile:ammoniumacetatbuffer (9:1, v/v, effektiv saltkonsentrasjon 20 mM), mobil fase B: acetonitril:ammoniumacetatbuffer (1:1, v/v, effektiv saltkonsentrasjon 20 mM).
    2. Sett mobilfaseflyten i henhold til følgende parametere: start mobil faseflyt (0-3 min) ved 100% A, hold i 3,0 min og deretter rampe til 100% B innen 5 min. Hold med 100% B til 12 min, etterfulgt av 8 min kolonne re-likevekt tid.
  4. Sett skanneområdet til 85-1000 m/z. Sett HESI ionkildeparametere i positiv iioniseringsmodus til: sprøytespenning 1500 V, kapillærtemperatur 300 °C, skjedegass 40 a.u., aux gassstrømningshastighet 15 a.u., probevarmetemperatur 300 °C, S-Lens RF-nivå 55 %.
  5. Kjør QC-prøver bestående av 10 μL av hver analyserte prøve (regelmessig hver 10-12 prøve) for å overvåke instrumentytelsen.
  6. For omvendt faseseparasjon, bruk en C18-kolonne (2,1 mm x 75 mm, 3,5 μm).
    1. Sett strømningshastigheten til 200 μL/min, og autosampler- og kolonnetemperaturer til henholdsvis 4 °C og 55 °C. Forbered mobile faser i henhold til følgende proporsjoner: mobil fase A: H2O:MeOH (60:40, v / v), 10 mM ammoniumacetat og 1 mM eddiksyre; mobil fase B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM ammoniumacetat og 1 mM eddiksyre.
    2. Sett mobilfaseflyten i henhold til følgende parametere: 0-1 min (20 % B), 1-1,5 min (20-50 % B), 1,5-7,5 min (50-70 % B), 7,5 -13 min (70-95% B), 13-17 min (95% B), 17-17,1 min (95-20% B), 17,1-23 min (20%).
  7. For HILIC-separasjon, bruk en HILIC-kolonne (100 x 2,1 mm, 3 μm).
    1. Sett strømningshastigheten til henholdsvis 400 μL/min, og autosampler- og kolonnetemperaturer til henholdsvis 4 °C og 40 °C.
    2. Klargjør mobile faser i henhold til følgende proporsjoner: mobil fase A: ACN; mobil fase B: 5 mM ammoniumacetat i vann. Sett mobilfaseflyten i henhold til følgende parametere: 0-2 min (96% B), 2-15 min (96-80% B), 15-15,1 min (80-96% B), 15,1-21 min (96% B).
  8. Still inn HESI-ionkildeparametere i positiv iioniseringsmodus for å sprøyte spenning 3500 V, kapillærtemperatur 275 °C, skjedegass 20 a.u., aux gassstrømningshastighet 10 a.u., probevarmetemperatur 300 °C, S-Lens RF-nivå 55 %.
  9. Kjør QC-prøver bestående av 10 μL av hver analyserte prøve (hver 10-12 prøve) for å overvåke instrumentytelsen.
  10. Utfør datainnsamling i programvare som er kompatibel med instrumentet.

6. Dataanalyse

  1. Utfør databehandling, antatt identifikasjon og statistisk analyse ved bruk av programvare dedikert til umålrettede metabolomikk og lipidomikkanalyse.
    MERK: Hovedkomponentanalyse (PCA) og boks-whisker-plott kan fås for å visualisere datastruktur.

Representative Results

Prøvesamlingen ble utført i henhold til SPME-metoden beskrevet ovenfor, ved hjelp av prober belagt med en 7 mm ekstraksjonsfase i blandet modus. Prøvetaking ble utført direkte fra transplantatvevet (in vivo før transplantasjon), ex vivo i nyrekammeret etter 1 t, 3 h, 5 h og 7 timer perfusjon, og in vivo etter avsky i mottakeren. Umålrettede metabolomiske og lipidomiske analyser ble utført ved bruk av flytende kromatografi (RP, HILIC) kombinert med høy oppløsning massespektrometri, med masseanalysatoren satt i positiv ioniseringsmodus. For å vurdere datakvalitet og oppnå generell innsikt om resultatene, ble data utsatt for hovedkomponentanalyse (PCA). Som vist i figur 1dannet QC-prøver en stram klynge som bekrefter kvaliteten på analysene. De studerte gruppene viser relativt god separasjon, noe som åpner for visualisering av forskjeller i metabolske og lipidomiske profiler før og etter transplantasjon, så vel som under organperfusjon (figur 2). SPME prøvetaking tillater metabolsk profilering av orgelet over tid. Box-whisker plott av utvalgte metabolitter tjener til å eksemplifisere endringer i metabolittnivåer gjennom hele eksperimentet (figur 3). Det brede spekteret av ekstraherte funksjoner atskilt på både RP- og HILIC-kolonner er vist i figur 4.

Figure 1
Figur 1: Hovedkomponentanalyse som viser klynger av kvalitetskontrollprøver for metabolom reverserte fase (A), HILIC (B) og lipidom reverserte fase (C), HILIC (D) analyser. Kvalitetskontroll er nødvendig i umålrettet analyse for å overvåke eventuelle endringer forårsaket av instrumental ustabilitet. Tett klynge av QC-prøver sikrer at alle endringer som observeres er av biologisk opprinnelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Hovedkomponentanalyse som viser metabolomiske (A) og lipidomiske (B) forskjeller mellom bestemte utvalgspunkter. Umålrettet profilering av nyre med SPME-LC-HRMS gjør det mulig å observere biokjemiske forskjeller i organer ved påfølgende trinn av deres bevaring. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Box-whisker tomter av utvalgte forbindelser som viser endringer i metabolitter (A, B) og lipider (C, D) i løpet av peritransplantperioden. Etter valg og identifisering av diskriminerende forbindelser boks-whisker tomter gjør det mulig å overvåke endringer i nivåer av disse forbindelsene ved påfølgende trinn av protokollen og sammenligne metabolitter nivåer i organer utsatt for ulike bevaring protokoller eller høstet fra ulike givere f.eks hjerte bankende donorer eller donorer etter hjertedød. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Ion kart (m / z versus oppbevaringstid) av funksjoner oppnådd ved LC-MS analyse med (A) reversert fase og (B) HILIC separasjon. Plottet gjør det mulig å estimere det totale antall funksjoner oppnådd med den foreslåtte protokollen (fra utvinning til deteksjon) og vurdere analytisk dekning basert på polariteten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Evaluering av organkvalitet er fortsatt en stor utfordring for leger, som må ta raske informerte beslutninger om hvorvidt et gitt organ er levedyktig for transplantasjon eller om det må kastes. Flere faktorer, som donoralder, iskemi varighet og infeksjoner og inflammatoriske prosesser, kan påvirke det langsiktige graft-resultatet. Mens ulike metoder er utviklet til dags dato for å diagnostisere nyre allograft funksjon, histopatologisk inspeksjon forblir gullstandarden i densaks skyld 3,4,12. Selv om biopsiprosedyren kan gi betydelig informasjon om eksisterende donorsykdom og vaskulære endringer, er den ikke fri for feil. Prøvetakingsfeil knyttet til interobservervariabilitet og utvalg av utilstrekkelige glomeruli for omfattende informasjon om organfunksjon er fortsatt typiske bekymringer i denne forbindelse. Videre gir prøveforberedelse noen problemer som en ufullstendig vurdering av transplantatet i tilfelle frosne seksjoner, og forlengelse av prosedyretid for parafinseksjon. Imidlertid er den økte risikoen for blødning, som kan virke akutt som mikroskopisk eller grov hematuri, den store livstruende komplikasjonen forbundet med biopsiprosedyren. Av denne grunn er antall tillatte biopsier strengt begrenset i transplantasjonsprosedyrer, en faktor som hindrer fangst av dynamiske endringer og tidsserieanalyser via denne metoden12,,13,,14. Fordelene med en histologisk analyse må veies mot risikoen forbundet med metodikken. Verdien av histologiske funn er ubestridelig, men de forklarer ikke de molekylære mekanismene i avvikene.

Metabolomics og lipidomics er de yngste domenene i "-omics" vitenskapelig familie. Det komplette settet med lavmolekylære (<1200 Da) menneskelige metabolitter og lipider som er koblet til i et metabolsk nettverk, er definert som en human metabolom. Genomet forblir relativt konstant gjennom hele levetiden, med små modifikasjoner forårsaket av mutasjoner som forekommer sjelden. Metabolomen er et produkt av genuttrykk, som er svært følsom for endringer i alle biologiske prosesser samt miljøfaktorer. Den dynamiske naturen til metabolitter og lipider gjør dem perfekte indikatorer på dagens organtilstand7,8,15,16. SPME-metoden som foreslås i ovennevnte protokoll, muliggjør påvisning av endringer som skjer i orgelet under bevaringen, fra organfjerning fra donorens kropp til revaskularisering hos mottakeren. Sondens lille diameter (~200 μm) gir minimal invasivitet og gir mulighet for flere prøvetakinger fra samme organ uten å forårsake skade på vevet. Gjennomføre studier ved hjelp av nyre, som den hyppigst transplanterte organ, gir en bedre forståelse og videre karakterisering av metabolske veier ansvarlig for å redusere kvaliteten og funksjonen av grafts. Muligheten for overvåking modifikasjoner over tid absolutt er en viktig fordel med teknikken i forhold til konvensjonelle invasive metoder som biopsi. Den presenterte analysen identifiserte endrede konsentrasjoner av ulike grupper av lipider og metabolitter, spesielt av essensielle aminosyrer, puriner, purinkjerner og glyserofosfolipider. Disse resultatene er i samsvar med tidligere vev analyserapporter 5,6,17,18,19,20. Til dags dato har de fleste vitenskapelige rapporter som bruker metabolomikk eller lipidomikk for å forklare prosessersom induserer komplikasjoneretter transplantasjon eller iskemi / reperfusjonsskade (IRI) fenomener vært begrenset til analyse av biofluider 21,22,23.

Hver klinisk applikasjon krever optimalisering av prøvetakingsprotokollen for å sikre at ytelsen til den analytiske metoden oppfyller forventede kriterier. I denne forbindelse er fordelen med å utnytte SPME muligheten for å justere forholdene for ulike eksperimentelle design. Utvalget av tilgjengelige ekstraksjonsfaser gir et bredt spekter av ekstraherte metabolitter med diversifiserte polariteter. Samtidig kan dette betraktes som en begrensning av metoden på grunn av det faktum at hver sorbent gir selektivitet mot bestemte funksjoner og ikke trekker ut alle forbindelser som finnes i prøvematrisen. Det bør bemerkes at SPME belegg ekstrakt bare via frie molekyler, og rett og slett ikke samhandle med en bundet brøkdel av analyten. Biokompatibiliteten til belegget introduserer ikke toksisitet for vevet mens du begrenser utvinningen av store molekyler som proteiner; Som en konsekvens hemmes de enzymatiske prosessene allerede på prøvetakingsstadiet, og tilstedeværelsen av gjenstander minimeres, noe som er en stor fordel over alternative prøvetakingsmetoder. Lengden på belegget påvirker effektiviteten av ekstraksjon (det vil vil vil at lengden på belegget angir overflatearealet og ekstraksjonsfasevolumet); dermed gir lengre belegg høyere gjenopprettinger. På den annen side gir kortere belegg høyere romlig oppløsning. For pålitelige resultater er det avgjørende å senke sonden til nøyaktig samme dybde av nyrecortex. Innsetting for dyp forårsaker risikoen for å komme inn i nyre medulla. Tidspunktet for utvinningen er også proporsjonal med utvinningseffektiviteten. Derfor er valg av optimal ekstraksjonstid et av de mest kritiske trinnene i SPME-metodeutvikling. Nøyaktigheten av tidsmåling gir høyest repeterbarhet. I biologiske anvendelser som den som diskuteres, er det alltid et kompromiss mellom følsomheten og repeterbarheten til den analytiske protokollen og restriksjonene i den medisinske prosedyren. Mens likevekt ekstraksjon gir den høyeste følsomheten, av sikkerhetsmessige grunner, pre-likevekt forhold brukes ofte i slike applikasjoner, som utvinning tid bør ikke påvirke den totale varigheten av operasjonen. Effektiviteten av avsorpsjon bestemmes av tidspunktet for prosessen og sammensetningen av avsorpsjonsløsemiddelet, som skal være kompatibel med den mobile fasen som brukes til kromatografisk separasjon9,,10,,11.

Et av de viktigste kravene til diagnostisk instrumentering som brukes til intrakirurgiske vurderinger er analysetid. Nåværende forsøk blir gjort for å utvikle et raskt verktøy for in vivo SPME ekstraksjon koblet direkte til et massespektrometer via mikrofluidisk åpent grensesnitt (MOI)24 eller belagt bladspray (CBS)25. Slike tilnærminger ville tillate offentliggjøring av analytiske resultater i reell eller nær sanntid. Bruken av slike metoder for pre-intervensjon analyser av metabolske og lipidomiske profiler kan forbedre beslutningsprosessen under transplantasjonprosedyrer, slik at best mulig personlig tilnærming og rask respons i tilfelle organsvikt.

Som et sammendrag er det hypotetisk at den foreslåtte protokollen vil muliggjøre oppnåelse av fulle metabolske og lipidomiske profiler av nyretransplantater, som igjen vil gi en omfattende vurdering av organkvalitet og karakterisering av prosessene som er ansvarlige for iskemi-reperfusjonsskade. Nyheten om prosjektet inkluderer utnyttelse av solid-fase mikrokstraksjon (SPME), som tilbyr lav invasiv prøvetaking av levende systemer, i kombinasjon med en av de mest innovative teknologiene som er tilgjengelige for metabolomics og lipidomics analyse (f.eks Orbitrap høy oppløsning massespektrometer). SPME kombinerer prøveinnsamling, ekstraksjon og slukking av metabolitter i ett trinn, noe som gjør det til et perfekt verktøy for rask analyse. Det forventes at denne protokollen vil bidra til å svare på spørsmål knyttet til hvilke pre-transplantasjon forhold i nyrene er ansvarlig for forsinket organfunksjon eller dets dysfunksjoner etter transplantasjon, samt hvordan graft bevaring protokollen påvirker biokjemi av orgelet. Slik kunnskap ville ikke bare ha betydelig innvirkning på forebygging av mulige komplikasjoner knyttet til transplantasjon, men kan bidra til å forbedre dagens pode bevaring protokoller, minimere tap av levedyktig transplantasjon vev samt tap av liv. Den foreslåtte løsningen vil åpne døren for videre undersøkelser på dette feltet, inkludert validering av spesifikke potensielle biomarkører og forbedring av terapeutiske utfall i transplantasjon.

Disclosures

Forfatterne ønsker å anerkjenne MilliporeSigma (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) for å gi SPME-enheter og Thermo Fisher Scientific for tilgang til Q-Exactive Focus Orbitrap massespektrometer.

Acknowledgments

Studien ble støttet av stipend Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 fra National Science Centre. Forfatterne ønsker å anerkjenne MilliporeSigma, en bedrift av Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland for å gi SPME-enheter. Life Science-virksomheten til Merck opererer som MilliporeSigma i USA og Canada. Også forfatterne ønsker å takke Thermo Fisher Scientific for tilgangen til Q-Exactive Focus orbitrap massespektrometer. Forfatterne vil gjerne takke Dr. Aleksandra Woderska-Jasińska og personellet ved Institutt for transplantologi og generell kirurgi i Bydgoszcz for deres vennlige hjelp i prosjektet. BB vil takke prof. Janusz Pawliszyn for muligheten for prøvesamling på Toronto General Hospital under sitt opphold ved University of Waterloo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Merck 5330010050 Mobile phase additive
Acetonitrile Alchem 696-34967-4X2.5L HPLC solvent
Ammonium acetate Merck 5330040050 Mobile phase additive
BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER Benchmark Scientific BV1010 Vortex mixer
Caps Perlan Technologies 5183-2076 Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK
Chloroform Merck 1024441000
Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm Merck 567570-U HPLC guard column
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm Merck 567502-U HPLC column
Formic acid Alchem 497-94318-50ML Mobile phase additive
Glass vials Perlan Technologies 5182-0714
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-00D-4449-B0 HPLC column
HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm Shim-Pol PHX-AJ0-8328 HPLC guard column
Isopropanol Alchem 231-AL03262500 HPLC solvent
Methanol Alchem 696-34966-4X2.5L HPLC solvent
Nano-pure water Merck 1037281002 HPLC solvent
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS Thermo Scientific Q Exactive Focus Mass Spectrometer
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm Merck 1506570001 HPLC column
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm Merck 1504360001 HPLC guard column
SPME LC fiber probes, mixed mode Supelco prototype fibers
UltiMate 3000 HPLC systems Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC system
Vial inserts (deactivated) Perlan Technologies 5181-8872
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm Waters 186005644 HPLC column
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm Waters 186007811 HPLC guard column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. U.S. Department of Health & Human Services. Organ Procurement and Transplantation Network. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov (2019).
  2. Branger, P., Undine, S. Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation. , Eurotransplant Foundation. Leiden. (2018).
  3. Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers. Transplantation. 97, 797-807 (2014).
  4. Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation. Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).
  5. Xu, J., et al. Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction. Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
  6. Rao, S., et al. Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).
  7. Wishart, D. S. Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation. American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).
  8. Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. Understanding metabolomics in biomedical research. Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).
  9. Bojko, B., et al. Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols. Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).
  10. Filipiak, W., Bojko, B. SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research - How far are we from daily practice. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).
  11. Bojko, B., et al. Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery. Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).
  12. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).
  13. Plattner, B. W., et al. Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques. Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).
  14. Tapia-Canelas, C., et al. Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients. Nefrologia. 34, 115-119 (2014).
  15. Afshinnia, F., et al. Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease. Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).
  16. Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. Lipidomics: New insight into kidney disease. Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).
  17. Kaminski, J., et al. Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation. Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).
  18. Wijermars, L. G. M., et al. Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function. Kidney International. 90, 181-191 (2016).
  19. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).
  20. Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury. PLoS One. 13, 1-24 (2018).
  21. Wishart, D. S. Metabolomics in monitoring kidney transplants. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).
  22. Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases. Metabolites. 9, (2019).
  23. Zhang, Z. H., et al. Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis. Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).
  24. Looby, N. T., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
  25. Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS. Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).

Tags

Medisin utgave 160 transplantasjon nyre kjemisk biopsi metabolomisk lipidomisk solid fase mikrokstraksjon (SPME) flytende kromatografi kombinert med massespektrometri (LC-MS)

Erratum

Formal Correction: Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment
Posted by JoVE Editors on 08/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. One of the affiliations was updated.

The third affiliation was updated from:

Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun"

to:

Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

Bruke en kjemisk biopsi for graftkvalitetsvurdering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stryjak, I., Warmuzińska, N.,… More

Stryjak, I., Warmuzińska, N., Łuczykowski, K., Hamar, M., Urbanellis, P., Wojtal, E., Masztalerz, M., Selzner, M., Włodarczyk, Z., Bojko, B. Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment. J. Vis. Exp. (160), e60946, doi:10.3791/60946 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter