Summary
Hier gepresenteerd is een protocol om depressie-achtig en anhedonisch gedrag bij ratten te bestuderen. Het combineert twee gevestigde gedragsmethoden, de sacharose voorkeur en nieuwheid-geïnduceerde hypofagie tests, met een geautomatiseerd voedsel en vloeibare inname monitoring systeem, om indirect te onderzoeken knaagdier gedrag met behulp van surrogaat parameters.
Abstract
De prevalentie en incidentie van depressieve stoornissen nemen wereldwijd toe, die ongeveer 322 miljoen individuen treffen, wat de noodzaak van gedragsstudies in diermodellen onderstreept. In dit protocol, om depressie-achtig en anhedonic gedrag bij ratten te bestuderen, worden de gevestigde sacharosevoorkeur en nieuwheid-geïnduceerde hypofagietests gecombineerd met een geautomatiseerd systeem van de voedsel en vloeibare opnamecontrole. Voorafgaand aan het testen, in de sacharose voorkeur paradigma, mannelijke ratten zijn opgeleid voor ten minste 2 dagen om een sacharose oplossing te consumeren in aanvulling op leidingwater. Tijdens de test worden ratten opnieuw blootgesteld aan water en sacharoseoplossing. Het verbruik wordt elke seconde geregistreerd door het geautomatiseerde systeem. De verhouding van sacharose tot totale waterinname (sucrose preferentuurverhouding) is een surrogaatparameter voor anhedonia. In de nieuwigheid-geïnduceerde hypofagie test, mannelijke ratten ondergaan een trainingsperiode waarin ze worden blootgesteld aan een smakelijke snack. Tijdens de training vertonen knaagdieren een stabiele baseline snackinname. Op de testdag worden de dieren van huiskooien overgebracht naar een verse, lege kooi die een nieuwe onbekende omgeving vertegenwoordigt met toegang tot de bekende smakelijke snack. Het geautomatiseerde systeem registreert de totale inname en de onderliggende microstructuur (bijvoorbeeld latentie bij het benaderen van de snack), waardoor inzicht wordt verhelderd in anhedonic en angstig gedrag. De combinatie van deze paradigma's met een geautomatiseerd meetsysteem biedt meer gedetailleerde informatie, samen met een hogere nauwkeurigheid door het verminderen van meetfouten. Echter, de tests gebruiken surrogaat parameters en alleen verbeelden depressie en anhedonia op een indirecte manier.
Introduction
Gemiddeld wordt 4,4% van de wereldbevolking getroffen door depressie. Deze zijn goed voor 322 miljoen mensen wereldwijd, een stijging van 18% ten opzichte van tien jaar geleden1. Volgens schattingen van de Wereldgezondheidsorganisatie, depressie zal de tweede in de rangschikking van handicap aangepaste levensjaren in 20202. Om de toenemende prevalentie van affectieve stoornissen aan te pakken en nieuwe interventionele strategieën vast te stellen, is het noodzakelijk om dit gedrag verder te bestuderen. Voorafgaand en naast onderzoek bij mensen zijn dierproeven noodzakelijk.
Verschillende modellen zijn vastgesteld om componenten van depressief gedrag te bestuderen (d.w.z. gedwongen zwemtest, staartsuspensietest, sacharosevoorkeurstest en nieuwheids-geïnduceerde hypofagie)3,4. De sucrose voorkeurstest (SPT) en nieuwheid-geïnduceerde hypofagie (NIH) kunnen depressie-achtig gedrag bij dieren detecteren. Deze tests zelf veroorzaken geen staat van depressie bij knaagdieren, maar verbeelden acute veranderingen in gedrag. Zowel het SPT als het NIH beoordelen een karakteristieke eigenschap van depressie die bekend staat als anhedonia, wat het verlies van interesse in het volgende is: lonende activiteiten, activiteiten die ooit werden genoten door de individuele5, en een aspect van het complexe fenomeen van verwerking en reageren op beloning6. Beide tests bestuderen de reactie op een lonende prikkel in de vorm van smakelijk voedsel. De omvang van het verbruik dient als surrogaatparameter voor anhedonia7,8,9.
De waarde van de proeven die anhedonnie onderzoeken, is sterk afhankelijk van de nauwkeurige bepaling van het verbruik als gevolg van een nauwkeurige meting van het gewicht van de stof. Conventioneel wordt deze meting één keer voor en eenmaal na de test handmatig uitgevoerd. Dit is echter gevoelig voor onjuiste metingen om verschillende redenen. Ten eerste hebben knaagdieren de neiging om voedsel te hamsteren, wat betekent dat ze voedsel verwijderen zonder het onmiddellijk te consumeren en het dan op een veilige plaats te verbergen. Dit verlies aan voedsel kan dus worden meegenomen in de berekening van de totale consumptie. Ten tweede, ratten morsen voedsel en water, wat resulteert in gewichtsverlies zonder respectieve consumptie. Ten derde treedt onbedoeld vloeistofverlies op als gevolg van het hanteren van de flessen door ze in te voegen en uit kooien te verwijderen.
In een aanpak om deze bronnen van fouten te verminderen, combineerden we de twee gemeenschappelijke tests die anhedonia (SPT3,4 en NIH9)beoordeelden met het meten van voedsel- en waterinname met behulp van een geautomatiseerd voedsel- en vloeistofinnamebewakingssysteem. Deze procedure maakt nauwkeurig onderzoek van de consumptie van smakelijke stoffen mogelijk en geeft informatie over de ervaring van plezier bij ratten als een kenmerk van depressie-achtig gedrag. De bovengenoemde fouten in verband met handmatige meting worden verminderd door het gebruik van verschillende benaderingen, die later worden geïllustreerd in meer detail.
Om informatie te verstrekken over microstructuur weegt het geautomatiseerde inlaatbewakingssysteem dat in dit protocol wordt gebruikt10 het voedsel (±0,01 g) elke seconde. Zo is een stabiel gewicht gedocumenteerd als "niet eten", en een onstabiel gewicht als "eten". Een "bout" wordt gedefinieerd als verandering in stabiel gewicht voor en na een evenement. Een maaltijd bestaat uit een of meer aanvallen en de minimale grootte bij ratten werd gedefinieerd als 0,01 g. Een maaltijd wordt gescheiden van een andere maaltijd bij ratten door 15 min (gestandaardiseerde waarde). Zo wordt voedselinname beschouwd als een maaltijd wanneer de aanvallen zich binnen 15 minuten voordeden en de gewichtsverandering gelijk is aan of groter is dan 0,01 g. Maaltijd parameters beoordeeld in dit protocol omvatten maaltijdduur, tijd doorgebracht in maaltijden, bout grootte, bout duur, tijd doorgebracht in periodes, latentie om eerste bout, en het aantal periodes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierlijke zorg en de experimentele procedures volgden de specifieke institutionele ethiekrichtlijnen en werden goedgekeurd door de staatsinstantie voor dierlijk onderzoek.
1. Werking van het geautomatiseerde bewakingssysteem
OPMERKING: Bij het gebruik van het geautomatiseerde bewakingssysteem is het van cruciaal belang om elke actie in het opmerkingenvak dat in de software is opgenomen, vlak voor de actie te documenteren. De beschrijving moet worden getypt in het opmerkingenvak en door op Opslaante drukken, wordt deze opgeslagen met een specifiek tijdpunt. De tijdpunten zijn aanzienlijk bij het analyseren van de gegevens, omdat het systeem continu wordt registreert en de periode van belang moet worden aangegeven voor analyse.
- Installeren, gebruiken en onderhouden van het geautomatiseerde monitoringsysteem
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van volwassen mannelijke Sprague Dawley ratten met een gewicht van 250-300 g (~ 10 weken oud). Het wordt aanbevolen om ratten in groepen te huisvesten tijdens de acclimatisatieperiode. De omgevingsomstandigheden moeten worden gecontroleerd met de volgende parameters: 12 uur/12 uur donkere/lichtcyclus met lichten aan om 6:00 A.M., vochtigheid van 45%-65%, en temperatuur van 21-23 °C, en ad libitum toegang tot water en standaard knaagdierdieet. Dagelijkse behandeling stelt de dieren in staat om te wennen aan de onderzoekers.- Scheid de ratten zodat elk dier een individuele kooi heeft. Zorg ervoor dat elke rat gescheiden blijft tijdens het protocol.
- Vul de kooien met regulier beddengoed met een 1-2 cm dikke laag. Deze (verminderde) hoeveelheid vermindert de kans op verontreiniging van microbalansen en hoppers met morsen, waardoor meetfouten worden verminderd. Voeg plastic buizen (bijvoorbeeld een 20 cm lang stuk van een plastic afvoerpijp met diameter van 8 cm) en knagen hout als verrijking, terwijl het weglaten van papieren weefsels om meetfouten te verminderen.
- Bereid de kooien voor op de geautomatiseerde vaste en vloeibare voedselinnamemeting door twee gesloten kooisteunen met microbalansen aan op maat gemaakte gaten in de voorkant van de kooien te bevestigen. Plaats twee lege hoppers op de kooi mounts, een voor de chow en een voor de fles.
OPMERKING: De microbalansen zijn via kabels verbonden met een opnamesysteem dat op een computer is aangesloten en de desbetreffende software is op de computer geïnstalleerd. - Als u wilt beginnen met opnemen, opent u "Monitor" en drukt u opStarten kiest u een plaats om de gegevens op te slaan.
- Met behulp van de kalibratie (druk op "Kalibreren") functie van de geautomatiseerde inlaat monitoring systeem, kalibreren elke balans door het verwijderen van de hoppers en het plaatsen van twee verschillende gemeten gewichten op de kooi mounts met saldi. Doe dit op regelmatige tijdstippen (wekelijks wordt aanbevolen).
- Vul een hopper volledig met chow (~ 100 g) en verwijder chow stukken en crumbles die te klein zijn in grootte. Vul water in de fles (~ 100 mL) en plaats het in de andere hopper.
- Documenteer de positie van voedsel en water (bijvoorbeeld balans 1: voedseldier 1, balans 2: waterdier 1).
- Plaats de rat in de kooi en open alle poorten van de kooi mounts, zodat het kan eten en drinken ad libitum.
OPMERKING: Voor een nauwkeurige meting is het noodzakelijk om de saldi en hoppers dagelijks te behouden door voorzichtig met een borstel te reinigen van morsen en kleine voedselkruimels uit de voedselcontainer te verwijderen. Dit zal de foutieve meting sterk verminderen. Sluit alle poorten tijdens het dagelijkse onderhoud.
- Toegang tot gegevens na de experimenten
- Zoek in het opmerkingenvak naar de begin- en eindeindepunten van een periode (bijvoorbeeld training, test) die moet worden geanalyseerd.
- Klik op 'Gegevens weergeven'op de software om de Data Viewer te openen.
- Voeg de tijdpunten in de vakken onder "Begintijd" en "Eindtijd". Druk op het vierkant in de linkerbovenhoek met vermelding van het saldo dat de informatie heeft opgenomen.
- Klik op "PSC Totalen" om toegang te krijgen tot de microstructuurgegevens. Druk op de knop "Psc-tabel exporteren" om de gegevens te exporteren.
OPMERKING: Om de microstructuur van individuele dieren (bijvoorbeeld niet-gestresste versus gestrest) te vergelijken met behulp van geautomatiseerde monitoring, kunnen individuele dieren worden geselecteerd in de"Data viewer" door op het juiste vierkant in de linkerbovenhoek te drukken. De PSC Totalen toont alleen de microstructuur voor het geselecteerde dier. Statistische analyse kan niet worden uitgevoerd met het systeem. De gegevens moeten worden geëxtraheerd in een spreadsheetprogramma/analysesoftware.
2. Uitvoering van de preferentietest voor sacharose
- Het uitvoeren van de opleidingsperiode
OPMERKING: Voorafgaand aan de proef moeten de dieren gewend zijn aan de beschikbaarheid van twee flessen voor vloeistoffen op hoppers door de poorten, terwijl voedsel moet worden geleverd vanaf de toppen van kooien (opstelling is opgenomen in figuur 1). Deze trainingsperiode moet ten minste 2 dagen duren. Het wordt uitgevoerd in de kooien in de kamer waar dieren worden gehouden.- Sluit alle poorten. Haal de waterfles en de voedselcontainer uit de microbalansen.
- Plaats voorge weighed voedsel (~ 50 g) op de bovenkant van de kooi en documenteer het gewicht dagelijks met behulp van een regelmatige balans om de dagelijkse voedselconsumptie te beoordelen. Indien nodig bijvullen.
- Maak een fles schoon met helder water en vul met ongeveer 100 mL water. Plaats het terug op de hopper.
- Vul een tweede schone fles met 100 mL vers gemaakte 1% sacharoseoplossing. Leg het op de hopper.
OPMERKING: Markeer de flessen zorgvuldig en documenteer hun locaties (bijvoorbeeld balans 1: waterdier 1, balans 2: sacharoseoplossing dier 1). - Open alle poorten. Documenteer de start van de training in het monitoringsysteem. Laat de poorten open voor 24 uur, wat resulteert in ad libitum toegang tot beide flessen. Sluit na 24 uur de poorten en documenteer het einde van de training. Gegevens van het interval van 24 uur kunnen worden beoordeeld met behulp van het geautomatiseerde bewakingssysteem door de "begintijd" en "eindtijd" in te voegen. De procedures zijn hetzelfde wanneer een testinterval van 1 uur wordt beoordeeld.
- Maak de flessen elke 24 uur schoon en vul ze bij. Bereid dagelijks verse 1% sacharoseoplossing voor. Schakel de positie van het water en sacharose oplossing fles dagelijks om gewenning effecten te voorkomen.
OPMERKING: Voer de training bij alle dieren ten minste 48 uur uit totdat de preferentieratio's ~1 bereiken. De sucrose voorkeursverhouding wordt direct na de training beoordeeld met behulp van de "Data viewer". Het wordt berekend als de verhouding van de sacharose inname tot de totale inname (water plus sacharose inname). - 24 uur voor de test, verwijder de fles met de sacharose oplossing, zodat de rat toegang heeft tot standaard chow en water alleen.
- Bereid een verse fles gevuld met kraanwater en een gevuld met een 1% sacharose oplossing, beide met ~ 100 mL.
- Voor het testen, sluit alle poorten.
- Haal de fles gevuld met kraanwater uit de hopper en leg de twee verse flessen, een gevuld met kraanwater en een gevuld met een 1% sacharoseoplossing, op de hopper.
- Open alle poorten, documenteer het begin van de test in het bewakingssysteem. Laat de poorten 60 minuten open. Sluit de poorten na 60 minuten en documenteer het einde van de test.
- Beoordeel de gegevens (bijvoorbeeld de sucrose/total fluid intake ratio).
LET OP: De test kan meerdere keren worden herhaald met tussenpozen van training (ten minste 2 dagen) ertussen.
3. Uitvoering van de nieuwheidsgeïnduceerde hypofagietest
- Het uitvoeren van de opleidingsperiode
LET OP: Voorafgaand aan het testen wordt een dagelijkse trainingsperiode van 30 minuten van 5 dagen aanbevolen (de opstelling wordt weergegeven in figuur 2). Het doel is om voor het experiment een stabiele basislijn van smakelijke snackinname te bereiken. Het wordt uitgevoerd in de kooien in de kamer waar dieren worden gehouden.- Sluit alle poorten en verwijder de hopper met standaard chow.
- Vul een verse hopper met de smakelijke snack (~ 50 g). Steek de crackers voorzichtig in de hopper om afbrokkeling te voorkomen. Plaats de hopper op de kooi mount op de top van de microbalans.
- Open de poorten voor 30 minuten, zodat de rat ad libitum toegang tot de snack en water heeft. Documenteer het begin van de training in het bewakingssysteem.
LET OP: De rat mag tijdens de trainingsperiode geen toegang hebben tot standaard chow. - Sluit de poorten na 30 minuten en documenteer het einde van de training in het bewakingssysteem. Vervang de snack door standaard chow.
- Herhaal dit dagelijks tot een 1) stabiele baseline smakelijke snackinname wordt bereikt (bijvoorbeeld 1,5-2,0 g/30 min) en 2) de inname verschilt statistisch niet tussen trainingsdagen.
- Het uitvoeren van de nieuwheid-geïnduceerde hypofagie test
- Bereid een lege, vers gereinigde kooi zonder beddengoed of verrijking aan het geautomatiseerde voedselinnamebewakingssysteem. Plaats een hopper met een fles kraanwater en hopper met een smakelijke snack op de kooi mounts.
OPMERKING: De nieuwe kooi moet in dezelfde ruimte worden geplaatst waar de ratten worden gehouden en training worden uitgevoerd. Hou de poorten dicht. - Haal de rat uit de kooi en plaats in de nieuwe kooi.
- Open alle poorten voor 30 minuten. Documenteer het begin van het testen in het bewakingssysteem.
OPMERKING: Tijdens de 30 minuten toegang tot de snack worden de grootte van de snackinname en de onderliggende microstructuurparameters (bijvoorbeeld latentie tot eerste maaltijd) geregistreerd met behulp van het geautomatiseerde monitoringsysteem voor voedselinname. - Sluit de poorten na 30 minuten en documenteer het einde van het testen. Plaats de rat terug in de kooi.
LET OP: De test kan meerdere keren worden herhaald met tussenpozen van training (ten minste 5 dagen) ertussen.
- Bereid een lege, vers gereinigde kooi zonder beddengoed of verrijking aan het geautomatiseerde voedselinnamebewakingssysteem. Plaats een hopper met een fles kraanwater en hopper met een smakelijke snack op de kooi mounts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de gegevensdistributie te testen, werd de Kolmogorov-Smirnov-test gebruikt. T-tests werden gebruikt toen gegevens normaal werden verspreid en Mann-Whitney-U test werd gebruikt, zo niet. One-way ANOVA gevolgd door Tukey post-hoc test werd gebruikt voor normaal verdeeld meerdere groep vergelijking. One-way ANOVA gevolgd door Dunn's meervoudige vergelijkingstest werd gebruikt in gevallen van niet-normale distributie. Verschillen tussen groepen werden als significant beschouwd wanneer p < 0,05.
De SPT werd uitgevoerd op naïeve ratten in deze studie. Het verbruik van sacharoseoplossing nam toe en de inname van water daalde tijdens de opleidingsperiode (figuur 3). Op de eerste trainingsdag dronken ratten 24,40 mL ± 3,48 mL sacharoseoplossing(figuur 3A) en 4,83 mL ± 0,89 mL regulier water (figuur 3B), wat een sucrose voorkeursverhouding van 0,80 ± 0,06(3C)oplevert . Op de tweede trainingsdag verhoogden ratten het verbruik van sacharoseoplossing tot 33,77 mL ± 4,49 mL (niet significant, p = 0,17 vs.dag 1) en verminderde waterinname tot 0,42 mL ± 0,13 mL (p < 0,001 vs. dag 1), wat resulteert in een verhouding van 0,99 ± 0,004 (p < 0,05 vs. dag 1; Figuur 3C). Acht ratten werden hier bestudeerd; Elk gegevenspunt is dus afgeleid van acht dieren. De vochtinname inclusief de microstructuur werd automatisch geregistreerd. De gegevens zijn geëxtraheerd uit PSC Totalen met behulp van de viewer Data.
Tijdens de tests van 60 min verbruikten de dieren tussen 0-6,18 mL sacharoseoplossing met een gemiddelde waarde van 2,91 mL ± 0,66 (n =8) zonder water te verbruiken, wat resulteert in een sucrosevoorkeursverhouding van 0,99 ± 0,00. De dieren die tijdens de test geen vloeistof hebben verbruikt, werden van de analyse uitgesloten. Acht ratten werden bestudeerd. De vochtinname werd automatisch geregistreerd.
Het geautomatiseerde intake monitoring systeem leverde gegevens over sacharose inname microstructuur automatisch beoordeeld tijdens het testen, die werden gewonnen uit PSC Totalen met behulp van de Data viewer. Deze parameters waren maaltijdgrootte (figuur 4A), maaltijdduur (figuur 4B), tijd doorgebracht in maaltijden in seconden (figuur 4C) en percentages (figuur 4D), maaltijdfrequentie (figuur 4E), latentie naar eerste maaltijd (figuur 4F), inter-maaltijd interval (Figuur 4G), drinkpercentage (Figuur 4H), bout duur (Figuur 4I), bout grootte (Figuur 4J), en de tijd doorgebracht in periodes in seconden (Figuur 4K) en percentages (Figuur 4L).
Om de voordelen van het geautomatiseerde inlaatbewakingssysteem verder te bestuderen, werden de hierboven beschreven gegevens vergeleken met gegevens die zijn verkregen met behulp van conventionele handmatige beoordelingen (flessen handmatig wegen voor en na de opleiding/testperiode, tabel 1). Op de eerste trainingsdag waren de sacharose (p < 0,01) en de waterinname(p < 0,01) aanzienlijk hoger wanneer deze handmatig werden beoordeeld in vergelijking met automatisch. Op de tweede trainingsdag verschilden de waterinname(p < 0,001) en de sucrose preferentieverhouding(p < 0,01) tussen de twee groepen en tijdens het testen. Alle parameters, namelijk de sacharoseinname(p < 0,001), de waterinname(p < 0,001) en de sucrosepreferentieverhouding(p < 0,001) verschilden tussen groepen, mogelijk als gevolg van verkeerd hoge meting of morsen wanneer deze handmatig wordt beoordeeld.
De totale inname van de smakelijke snack tijdens de training nam gestaag toe: 0,48 g ± 0,14 g (dag 1), 1,05 g ± 0,32 g (dag 2), 1,48 g ± 0,0 56 g (dag 3), 1,1 g ± 0,39 g (dag 4) en 1,91 g ± 0,68 g (dag 5), wat wijst op een aanpassing gedurende de eerste 2-3 dagen. Evenzo is de maaltijdgrootte geterineerd in de richting van een toename tussen de opleidingsdagen (figuur 5A, p = 0,12), terwijl de maaltijdduur (figuur 5B) niet (p > 0,05) deed. Ook andere microstructurele parameters, zoals tijd doorgebracht in maaltijden (Figuur 5C), latentie naar de eerste bout (Figuur 5D), bout grootte (Figuur 5E), bout duur (Figuur 5F), tijd doorgebracht in periodes (Figuur 5G), en het aantal periodes (Figuur 5H) waren niet significant verschillend tussen deze dagen(p > 0,05). Acht ratten werden bestudeerd; Elk gegevenspunt is dus afgeleid van acht dieren. Snackinname inclusief de microstructuur werd automatisch geregistreerd. De gegevens zijn geëxtraheerd uit PSC Totalen met behulp van de viewer Data.
Op de testdag toonden naïeve ratten die in een nieuwe omgeving aan de snack werden blootgesteld een inname van de smakelijke snack van 0,98 g ± 0,34 g (Figuur 6A). Parameters van de voedselinname microstructuur op de testdag, met inbegrip van maaltijdduur (Figuur 6B), tijd doorgebracht in maaltijden (Figuur 6C), latentie naar eerste bout (Figuur 6D), bout grootte (Figuur 6E), bout duur (Figuur 6F), tijd doorgebracht in periodes (Figuur 6G), en het aantal periodes (Figuur 6H), werden automatisch beoordeeld en geëxtraheerd uit PSC Totalen met behulp van de Data viewer.
Om de specificiteit van de nieuwheids-geïnduceerde hypofagietest te bestuderen, werden de hierboven beschreven gegevens van naïeve en onbeklemtoonde ratten vergeleken met die welke een intracerebroventriculaire injectie van corticotropin-vrijgevende factor ontvingen, die de hypothalamus-hypofyse-bijniernanierstressas stimuleert en stress en angst veroorzaakt11. De individuele gegevens voor elk dier werden verkregen met behulp van de "Data viewer" en "PSC Totalen", zoals beschreven in de protocol sectie. De individuele gegevens werden vervolgens verzameld volgens groepen in een spreadsheetprogramma en geanalyseerd op statistische verschillen. Tussen beide groepen(p < 0,01) en boutgrootte (p < 0,01) werd een significant verschil in maaltijdgrootte (p < 0,01) en boutgrootte(p < 0,01) vastgesteld.Table 2 Het verschil in bout grootte zou niet zijn detecteerbaar met behulp van handmatige beoordeling.
Figuur 1: Opstelling van sacharosevoorkeurstest. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Opstelling van nieuwheidsgeïnduceerde hypofagietest. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Opleidingsperiode voor de sucrose preferentietest. Het verbruik van sacharoseoplossing(A) en water (B) werd gedurende 2 dagen over 24 uur beoordeeld. De sucrose preferentieratio(C)werd dienovereenkomstig berekend. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van acht ratten (*p < 0,05, ***p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Sucrose voorkeurstest. Op de testdag is de vloeibare innamemicrostructuur (hier, getoond voor sacharose inname) werd geanalyseerd meer dan 1 uur voor ommekt maaltijdgrootte (A), maaltijdduur (B), tijd doorgebracht in maaltijden in s (C), tijd doorgebracht in maaltijden in % (D), aantal maaltijden (E), latentie naar eerste maaltijd (F), inter-maaltijd interval (G), drinkpercentage (H), bout duur (I), bout grootte (J), tijd doorgebracht in periodes in s (K), en tijd doorgebracht in periodes in % (L). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM, n = 8 ratten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Opleidingsperiode voor de nieuwheidsgeïnduceerde hypofagietest. Maaltijdgrootte (A), maaltijdduur (B), tijd doorgebracht in maaltijden in s (C), latentie naar eerste bout (D), bout grootte (E), bout duur (F), tijd doorgebracht in periodes(G),en het aantal periodes (H) werden beoordeeld over een periode van 5 dagen. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM, n = 8 ratten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Nieuwheidsgeïnduceerde hypofagietest. Op testdag, de voedselinname microstructuur werd geanalyseerd meer dan 1 uur voor omlijnde maaltijdgrootte (A), maaltijdduur (B), tijd doorgebracht in maaltijden (C), latentie aan eerste bout (D), bout grootte (E), bout duur (F), tijd doorgebracht in periodes (G) en het aantal periodes (H). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM, n = 8 ratten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Parameter | Handmatige beoordeling | Geautomatiseerde intakebewaking |
| Trainingsperiode (dag 1) | ||
| Sucrose-inname (ml) | 63,46 ± 10,2 | 24,4 ± 3,48** |
| Waterinakte (ml) | 12,07 ± 1,62 | 4,83 ± 0,89** |
| Sucrose voorkeursverhouding | 0,83 ± 0,03 | 0,8 ± 0,06 |
| Trainingsperiode (dag 2) | ||
| Sucrose-inname (ml) | 45,49 ± 5,75 | 33,77 ± 4,49 |
| Waterinakte (ml) | 4,92 ± 0,80 | 0,42 ± 0,13*** |
| Sucrose voorkeursverhouding | 0,89 ± 0,02 | 0,99 ± 0,004** |
| Sucrose voorkeurstest | ||
| Sucrose-inname (ml) | 10.15 ± 0,53 | 2,91 ± 0,66**** |
| Waterinakte (ml) | 6,65 ± 0,68 | 0 *** |
| Sucrose voorkeursverhouding | 0,61 ± 0,04 | 0,99 ± 0,001*** |
Tabel 1: Sucrose voorkeurstest bij naïeve ratten met behulp van handmatige beoordeling versus geautomatiseerd intake monitoring systeem. De verspreiding van de gegevens werd bepaald aan de hand van de Kolmogorov-Smirnov-test. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM en verschillen werden geanalyseerd met behulp van t-tests of de Mann-Whitney U-test, afhankelijk van de verdeling van de gegevens (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs.handmatige beoordeling).
| Parameter | ongesttress | Benadrukt |
| (n=8) | (n=11) | |
| Maaltijdgrootte (g/300g bw) | 0,98 ± 0,29 | 0,35 ± 0,07** |
| Maaltijdduur (sec) | 998,29 ± 163,87 | 1209,11 ± 114,67 |
| Tijd doorgebracht in maaltijden (sec) | 998,29 ± 163,87 | 989,27 ± 174,73 |
| Tijd besteed aan maaltijden (%) | 55.46± 9.10 | 54,96 ± 9,71 |
| Latentie naar eerste bout (sec) | 241,25 ± 45,96 | 185,50 ± 57,52 |
| Bout grootte (g) | 0,21 ± 0,03 | 0,08 ± 0,01** |
| Bout duur (sec) | 70,70 ± 14,12 | 45,59 ± 4,20 |
| Tijd doorgebracht in periodes (sec) | 439,75 ± 125,94 | 208,73 ± 45,01 |
| Tijd doorgebracht in periodes (%) | 24.43 ± 7,00 | 11,6 ± 2,50 |
| Bouts (nummer) | 5,63 ± 0,67 | 4,64 ± 0,80 |
Tabel 2: Nieuwheid-geïnduceerde hypofagie test bij naïeve niet-gesttresste en gestreste (CRF-geïnjecteerde) ratten. In de stressgroep werden icv-cannulated ratten geïnjecteerd met 0,6 μg/5 μL CRF en daarna onderworpen aan nieuwheid-geïnduceerde hypofagie. De verspreiding van de gegevens werd bepaald aan de hand van de Kolmogorov-Smirnov-test. Verschillen werden geanalyseerd met behulp van t-tests of de Mann-Whitney U-test, afhankelijk van de verdeling van de gegevens. Voor een betere vergelijkbaarheid worden alle gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± SEM (**p < 0,01 vs.niet benadrukt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De sacharose voorkeur en nieuwheid-geïnduceerde hypofagie tests zijn twee gevestigde technieken voor de evaluatie van anhedonia bij ratten. Hun combinatie met het geautomatiseerde voedselinname monitoring systeem zorgt voor een meer gedetailleerde analyse bij ongestoorde ratten en vermindert foutieve meting.
De incidentie van fouten wordt verminderd door verschillende benaderingen. Ten eerste, om de fout die optreedt als gevolg van morsen aan te pakken, de kloof tussen de voedselhopper en de poort maakt het mogelijk kruimels gegenereerd tijdens het knagen te vallen op de geïntegreerde lade. Door het verzamelen van dit morsen op kooisteunen, worden ze opgenomen in de meting (omdat morsen is nog steeds op de balans, heeft het geen invloed op de meting). Ten tweede, om hamsteren te voorkomen, de rat kooi mount opening is groot genoeg om het dier te eten van het voedsel hopper met zijn hoofd in de opening, maar klein genoeg om het vermogen van het dier om zijn handen te gebruiken tijdens het eten te beperken. Dit beperkt hun vermogen om voedsel te verwijderen en in de kooi te brengen.
Ten derde vermindert het systeem onbedoeld verlies van vloeistof omdat de vloeibare fles na priming niet lekt en verdamping slechts langzaam optreedt (ongeveer <10 mg/h) bij de precisiestainless steel ball/sipper tube interface. Bovendien, omdat het systeem de flessen automatisch weegt, is het hanteren van de flessen tijdens de opname niet nodig, wat een veel voorkomende oorzaak van fouten is. De verschillen in de vergelijking tussen handmatige en geautomatiseerde metingen(tabel 1) zijn vermoedelijk te wijten aan onbedoeld verlies tijdens het handmatig hanteren van de flessen.
Het gebruik van het geautomatiseerde voedselinnamebewakingssysteem biedt verschillende voordelen, zoals een gedetailleerde analyse van de inname van vaste en vloeibare voedsel en de beoordeling van de onderliggende microstructuur van de voedselinname10. De term "microstructuur" beschrijft het patroon van voedsel of vochtinname in meer detail. In studies zonder een geautomatiseerd innamebewakingssysteem wordt de inname gemeten door voedsel/vloeistof te wegen aan het begin en einde van een tijdstip van belang. De enige informatie die door deze aanpak wordt verkregen, is het totale verbruik over een bepaalde periode.
Het geautomatiseerde bewakingssysteem biedt daarentegen meer informatie over het verbruik tijdens deze periode, omdat het elke seconde veranderingen in het gewicht van de microbalansen registreert. De opnames kunnen detail wanneer het knaagdier begint te eten, hoe vaak het eet, hoe lang het eet voor, hoeveel het eet, hoe lang de pauzes tussen het eten zijn, enz. Om gegevens te verkrijgen die vergelijkbaar zijn met het geautomatiseerde systeem met behulp van handmatige metingen, zouden gebruikers de inhoud vaak moeten meten tijdens het testen/trainen en daardoor de dieren aanzienlijk moeten verstoren. Met het geautomatiseerde systeem blijven knaagdieren ongestoord tijdens de trainingen en testen.
Gezien het grote aantal geautomatiseerde inlaatsystemen dat beschikbaar is voor knaagdieren, is het belangrijk op te merken dat er geen gespecificeerd model vereist is voor het hier beschreven protocol. Dit systeem is echter zeer gevoelig. Om fouten als gevolg van omgevingslawaai (lage trilling of schudden van de massa op de schaal) te voorkomen, evalueert het algoritme van het systeem de waarden die op tweede basis worden verzameld, en accepteert het alleen de waarden die onder een ingestelde plaats voor "ruis" liggen om gemiddeld 10 waarden te bereiken. Als het systeem deze ruisdrempel overschrijdt, worden de waarden niet gebruikt om stabiele gewichten te berekenen, die worden gebruikt om vlagen van voeding te berekenen.
Met betrekking tot de uitvoering van de tests moet rekening worden gehouden met een aantal kritische punten. Alle gedragstests moeten op hetzelfde tijdstip van de dag worden uitgevoerd, omdat circadiane veranderingen het gedrag van de dieren12,13kunnen beïnvloeden. De meeste studies voeren gedragstesten uit tijdens de lichtfase, terwijl hier alle tests werden uitgevoerd tijdens de donkere fase. Knaagdieren zijn nachtdieren en dus actief in de donkere fase, terwijl ze slapen of minder actief12 met lagere verkennende activiteit13 tijdens de lichtfase. Zo is gedragstesten fysiologischer appriopriate tijdens de donkere fotoperiode.
Het is belangrijk op te merken dat voor de sacharosepreferentietest verschillende concentraties van de sacharoseoplossing zijn gebruikt, variërend van 0,5%-10%4,7,14. Ze worden voornamelijk gekozen afhankelijk van soorten, stam, geslacht en leeftijd, maar vooral op basis van waargenomen drinkgedrag tijdens de training (alle dieren moeten ongeveer dezelfde hoeveelheid drinken vóór de behandeling / interventie). Hoge concentraties (bijv. kan anhedonia overschrijven, omdat zelfs dieren met depressie-achtig gedrag nog steeds zeer zoete vloeistoffen drinken4.
Bovendien kan een hoog caloriegehalte als gevolg van hoge concentraties de voorkeur voor sacharoseoplossing prominenter beïnvloeden. Daarom werd gekozen voor een sucroseoplossing van 1%. Sommige studies raden het gebruik van saccharine in plaats van sacharose15 om elke calorische invloed te voorkomen. Het gemiddelde caloriegehalte van de verbruikte hoeveelheid % sacharoseoplossing (2 g sacharoseoplossing bevat 0,08 kcal) is echter aanzienlijk lager dan dat van dezelfde hoeveelheid standaardkucrose (2 g bevat 7,8 kcal). Dus, dit punt lijkt secundair.
Het is ook belangrijk op te merken dat de hier met behulp van het geautomatiseerde systeem voor de controle van de voedselinname een hogere voorkeursratio is (0,99) in vergelijking met eerdere studies met behulp van een handmatige beoordeling (met 0,7 bij muizen8, 0,8 bij jonge volwassen ratten, 0,6 bij oudere mannelijke Sprague Dawley ratten16). Dit kan te wijten zijn aan het hanteren van de flessen, omdat conventionele weging waarschijnlijk leidt tot verlies van vloeistof tijdens het inbrengen en verwijderen uit de kooien. Dit wordt verder gestaafd door de resultaten in tabel 1. Daarom kan het gebruik van het geautomatiseerde bewakingssysteem meer geschikt zijn voor het detecteren van anhedonia, terwijl verdere stimulatie van hedonische aspecten van voedselinname kan worden gemist als gevolg van plafondeffecten.
Met betrekking tot de nieuwheid-geïnduceerde hypofagie test, is het van cruciaal belang om ratten in staat te stellen een stabiele basislijn voor de inname van de smakelijke snack te ontwikkelen voordat de test. Alleen wanneer een stabiele basislijn binnen en tussen de ratten wordt bereikt, moet de eigenlijke test worden uitgevoerd. Anders kunnen effecten van de interventie (d.w.z. drugs, stress, enz.) worden gemist of kunnen schommelingen van de uitgangswaarde verkeerd worden geïnterpreteerd. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de nieuwe kooi een nieuwheidsspanning veroorzaakt die in hypophagia resulteert. Hoewel verschillende protocollen suggereren dat het gebruik van een nieuwe kooi op zichzelf voldoende is, hebben we geconstateerd dat kooien die niet eerder zijn gebruikt, maar beddengoed en verrijking bevatten, geen stress kunnen veroorzaken, omdat ratten vaak worden gebruikt voor wekelijkse kooireiniging/-verandering. Daarom moet een lege, nieuwe kooi worden gebruikt. Aangezien de voedselinname voor het testen van voedsel ook van invloed kan zijn op de resultaten, moet de voedselinname vóór de test worden gecontroleerd. Dit kan eenvoudig op een geautomatiseerde manier.
In de literatuur worden verschillende alternatieve tests gebruikt om verschillende aspecten van depressie-achtig gedrag te beoordelen (vaak wanhoop in plaats van anhedonia); de methoden die in dit manuscript worden geïllustreerd, hebben echter verschillende voordelen. Een alternatieve veelgebruikte methode om gedragswanhoop te beoordelen als onderdeel van depressie-achtig gedrag is de gedwongen zwemtest4. Hierbij wordt geen voedselconsumptie geëvalueerd; Er is dus geen risico op het meten van onnauwkeurigheid.
Dit protocol draagt verschillende andere nadelen. Een recente review geconcludeerd dat de gedwongen zwemtest is een test die daadwerkelijk meet stress coping strategieën en niet depressie-achtig gedrag17. Bovendien, als een crossover ontwerp de voorkeur heeft om het aantal dieren te verminderen volgens de "drie R's" van dierenwelzijn, kan de gedwongen zwemtest niet worden toegepast, omdat het een langdurig (traumatiserend) effect kan uitoefenen op het gedrag van geteste dieren18.
De SPT en het NIH daarentegen hebben geen traumatiserende aspecten en kunnen worden herhaald. Ook, van belang, de opleiding fase voor de SPT en NIH vast te stellen een gewenning aan het verbruik; daarom is het herhalen van het protocol mogelijk. Na de test wordt het smakelijke voedsel (sacharoseoplossing of snack) verwijderd en wordt de training ongeveer 24 uur na het testen opnieuw ingevoerd; zo hebben de knaagdieren een pauze zonder toegang tot de smakelijke prikkel. Aangenomen wordt dat na de pauze een nieuwe trainingsperiode met aanpassing moet plaatsvinden om een voorkeursverhouding van ongeveer 1 te garanderen of dat een stabiele snackinname met basislijn wordt bereikt voordat de tests worden herhaald.
Een test vergelijkbaar met de gedwongen zwemtest is de staart suspensie test, een korte termijn en onontkoombare stress periode waarin dieren worden opgehangen door hun staart en het ontwikkelen van een immobiele houding geïnterpreteerd als een teken van depressie-achtig gedrag19. Deze test kan alleen worden gebruikt bij muizen, omdat ratten niet mogen worden opgehangen door hun staarten als gevolg van een hoger gemiddeld gewicht20,terwijl de SPT en NIH kunnen worden gebruikt in zowel muizen als ratten.
Verdere voordelen van de tests die in dit manuscript worden voorgesteld zijn dat de nieuwheid-geïnduceerde hypofagietest goede bouwgeldigheid toont; daarom meet zij tot aan haar vorderingen goed21,22. Bijgevolg correleert de hoeveelheid geconsumeerde smakelijke stof met de intensiteit van anhedonia, bevestigd door overeenstemming van SPT- en NIH-resultaten met andere gedragstests12. Bovendien, zowel de sacharose voorkeurstest en nieuwheid-geïnduceerde hypofagie test hebben een goede gezichtsgeldigheid. Ze worden subjectief gezien als het meten van wat bedoeld is (hier wordt anhedonia beoordeeld als verminderde inname van smakelijke stoffen)21,22.
Belangrijke beperkingen van het geautomatiseerde intake monitoring systeem zijn de vereisten voor een goede training en dagelijks onderhoud / reiniging van het systeem, waardoor het arbeidsintensief is dan handmatige protocollen. In eerdere experimenten10, is geconstateerd dat hoewel jonge ratten zich aanpassen aan het geautomatiseerde systeem, oudere ratten soms niet. Deze dieren moeten uiteraard van het experiment worden uitgesloten.
Met betrekking tot beperkingen van de gedragstest, moet worden vermeld dat training ook tijdrovend is, vooral de NIH. Bovendien, de protocollen zijn zowel op korte termijn, en op lange termijn toepassing kan leiden tot ondervoeding. Tot nu toe rapporteert de literatuur niet het gebruik van deze tests in staten van honger (bijvoorbeeld een model voor anorexia nervosa, een eetstoornis die vaak geassocieerd wordt met symptomen van depressie), dus er is geen aanbeveling voor het gebruik ervan voor staten van honger.
Met dit protocol is het alleen mogelijk om te detecteren of er anhedonia is (verminderde inname van vocht/snack). Het is echter niet in staat om specifiek de mate van anhedonia te kwantificeren. In de toekomst zou de introductie van verschillende flessen met verschillende sacharoseconcentraties een mogelijke aanvulling kunnen zijn om anhedonia verder te kwantificeren. Over het algemeen kan het gebruik van de geautomatiseerde innamemonitoring nuttig zijn in elk experiment waarbij een nauwkeurige detectie van inname noodzakelijk is, zoals door het monitoren van de orale inname van medicatie die is opgelost in het drinkwater voor farmaceutische studies.
Samengevat, de sacharose voorkeurstest en nieuwheid-geïnduceerde hypofagie test zijn gevestigde protocollen om anhedonia te beoordelen als onderdeel van depressie-achtig gedrag bij knaagdieren. In combinatie met het geautomatiseerde voedselinname monitoring systeem, kunnen zelfs subtiele verschillen op een betrouwbare en herhaalbare manier worden gedetecteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.S. is consultant voor a & r Berlin, Boehringer-Ingelheim, Takeda en Schwabe. Er zijn geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van de German Research Foundation (STE 1765/3-2) en Charité University Funding (UFF 89/441-176, A.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCMPRF01 | |
| Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCMUPRF01 | |
| cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCR02 | single housing |
| Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BLT003 | |
| enrichment (plastic tubes, gnawing wood) | distributed by the animal facility | ||
| HoneyMaid Graham Cracker Crumbs | Nabisco, East Hanover, NJ, USA | ASIN: B01COWTA98 | palatable snack for NIH test |
| low vibration polymer rack | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BRACKR | |
| male Sprague Dawley rats | Envigo | Order Code: 002 | |
| Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCC32_03 | |
| Peripheral sensor Controller - includes cable | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BPSC01 | |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | statistical analysis | |
| Stainless steel blocker | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BBLKR | |
| standard rodent diet with 10 kcal% fat | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | D12450B | |
| sucrose powder | Roth | 4621.1 | for SPT |
References
- World Health Organization. Depression. , Available from: https://www.who.int/health-topics/depression (2018).
- Reddy, M. S.
- Cryan, J. F., Mombereau, C. In search of a depressed mouse: utility of models for studying depression-related behavior in genetically modified mice. Molecular Psychiatry. 9 (4), 326-357 (2004).
- Overstreet, D. H.
- Moreau, J. -L. Simulating the anhedonia symptom of depression in animals. Dialogues in Clinical Neuroscience. 4 (4), 351-360 (2002).
- Scheggi, S., De Montis, M. G., Gambarana, C. Making Sense of Rodent Models of Anhedonia. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 21 (11), 1049-1065 (2018).
- Liu, M. Y., et al. Sucrose preference test for measurement of stress-induced anhedonia in mice. Nature Protocol. 13 (7), 1686-1698 (2018).
- Serchov, T., van Calker, D., Biber, K. Sucrose Preference Test to Measure Anhedonic Behaviour in Mice. Bio-Protocol. 6 (19), 1958 (2016).
- Dulawa, S. C., Hen, R. Recent advances in animal models of chronic antidepressant effects: the novelty-induced hypophagia test. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 771-783 (2005).
- Teuffel, P., et al. Treatment with the ghrelin-O-acyltransferase (GOAT) inhibitor GO-CoA-Tat reduces food intake by reducing meal frequency in rats. Journal of Physiology and Pharmacology. 66 (4), 493-503 (2015).
- Binder, E. B., Nemeroff, C. B. The CRF system, stress, depression and anxiety-insights from human genetic studies. Molecular Psychiatry. 15 (6), 574-588 (2010).
- Marques, M. D., Waterhouse, J. M. Masking and the evolution of circadian rhythmicity. Chronobiology International. 11 (3), 146-155 (1994).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Locomotor response to an open field during C57BL/6J active and inactive phases: differences dependent on conditions of illumination. Physiology and Behavior. 69 (3), 269-275 (2000).
- Madiha, S., Haider, S. Curcumin restores rotenone induced depressive-like symptoms in animal model of neurotoxicity: assessment by social interaction test and sucrose preference test. Metabolic Brain Disorder. 34 (1), 297-308 (2019).
- Strouthes, A.
- Inui-Yamamoto, C., et al. Taste preference changes throughout different life stages in male rats. PloS One. 12 (7), 0181650 (2017).
- Commons, K. G., Cholanians, A. B., Babb, J. A., Ehlinger, D. G. The Rodent Forced Swim Test Measures Stress-Coping Strategy, Not Depression-like Behavior. ACS Chemical Neuroscience. 8 (5), 955-960 (2017).
- Slattery, D. A., Cryan, J. F. Using the rat forced swim test to assess antidepressant-like activity in rodents. Nature Protocols. 7 (6), 1009-1014 (2012).
- Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Review. 29 (4-5), 571-625 (2005).
- Can, A., et al.
- Chadman, K. K., Yang, M., Crawley, J. N. Criteria for validating mouse models of psychiatric diseases. American Journal of Medical Genetics B Neuropsychiatric Genetics. 150 (1), 1-11 (2009).
- Powell, T. R., Fernandes, C., Schalkwyk, L. C.
