Summary
Apresentado aqui é um protocolo para estudar o comportamento anedônico e depressão em ratos. Combina dois métodos comportamentais bem estabelecidos, a preferência por sacarose e testes de hipofagia induzidos por novidades, com um sistema automatizado de monitoramento de consumo alimentar e líquido, para investigar indiretamente o comportamento dos roedores usando parâmetros substitutos.
Abstract
A prevalência e incidência de transtornos depressivos estão aumentando em todo o mundo, afetando cerca de 322 milhões de indivíduos, ressaltando a necessidade de estudos comportamentais em modelos animais. Neste protocolo, para estudar o comportamento anedônico e anedônico semelhante à depressão em ratos, a preferência estabelecida por sacarose e os testes de hipofagia induzidos por novidades são combinados com um sistema automatizado de monitoramento de consumo alimentar e líquido. Antes dos testes, no paradigma de preferência da sacarose, os ratos machos são treinados por pelo menos 2 dias para consumir uma solução de sacarose, além da água da torneira. Durante o teste, os ratos são novamente expostos à solução de água e sacarose. O consumo é registrado a cada segundo pelo sistema automatizado. A razão entre sacarose e a ingestão total de água (razão de preferência de sacarose) é um parâmetro substituto para a anedonia. No teste de hipofagia induzida pela novidade, os ratos machos passam por um período de treinamento no qual são expostos a um lanche palatável. Durante o treinamento, os roedores mostram uma ingestão estável de lanches na linha de base. No dia do teste, os animais são transferidos de gaiolas domésticas para uma gaiola fresca e vazia representando um novo ambiente desconhecido com acesso ao conhecido lanche palatável. O sistema automatizado registra a ingestão total e sua microestrutura subjacente (por exemplo, latência à aproximação do lanche), fornecendo insights sobre comportamentos anedônicos e ansiosos. A combinação desses paradigmas com um sistema de medição automatizado fornece informações mais detalhadas, juntamente com maior precisão, reduzindo erros de medição. No entanto, os testes utilizam parâmetros substitutos e apenas retratam depressão e anedonia de forma indireta.
Introduction
Em média, 4,4% da população mundial é afetada pela depressão. Estes representam 322 milhões de pessoas em todo o mundo, um aumento de 18% em relação a dez anos atrás1. Segundo estimativas da Organização Mundial da Saúde, a depressão será a segunda no ranking de Anos de Vida Ajustado por Incapacidade em 20202. Para enfrentar a crescente prevalência de transtornos afetivos e estabelecer novas estratégias intervencionistas, é necessário estudar melhor esse comportamento. Antes e além do exame em humanos, são necessários estudos em animais.
Vários modelos foram estabelecidos para estudar componentes do comportamento depressivo (ou seja, teste de natação forçado, teste de suspensão de cauda, teste de preferência de sacarose e hipofagia induzida por novidades)3,4. O teste de preferência de sacarose (SPT) e a hipofagia induzida por novidades (NIH) podem detectar comportamento semelhante à depressão em animais. Esses testes em si não induzem um estado de depressão em roedores, mas retratam mudanças agudas de comportamento. Tanto o SPT quanto o NIH avaliam um traço característico da depressão conhecido como anedonia, que é a perda de interesse nas seguintes atividades: atividades gratificantes, atividades que antes eram desfrutadas pelo indivíduo5, e um aspecto do complexo fenômeno de processamento e resposta à recompensa6. Ambos os testes estudam a resposta a um estímulo gratificante na forma de alimentos palatáveis. A extensão do consumo serve como parâmetro substituto para a anedonia7,8,9.
O valor dos testes que investigam a anedonia depende fortemente da determinação precisa do consumo resultante da medição precisa do peso da substância. Convencionalmente, esta medição é realizada manualmente uma vez antes e uma vez após o teste. No entanto, isso é propenso a medições errôneas por várias razões. Primeiro, os roedores tendem a acumular alimentos, o que significa que eles removem alimentos sem consumi-lo imediatamente e depois escondem-no em um lugar seguro. Assim, essa perda de alimentos pode ser incluída no cálculo do consumo total. Em segundo lugar, os ratos derramam alimentos e água, resultando em perda de peso sem o respectivo consumo. Em terceiro lugar, a perda não intencional de líquido ocorre devido ao manuseio das garrafas, inserindo-as e removendo-as das gaiolas.
Em uma abordagem para reduzir essas fontes de erro, combinamos os dois testes comuns avaliando a anedonia (SPT3,4 e NIH9) com a medição da ingestão de alimentos e água utilizando um sistema automatizado de monitoramento de consumo alimentar e líquido. Este procedimento permite uma investigação precisa do consumo de substâncias palatáveis, bem como fornece informações sobre a experiência do prazer em ratos como uma característica de comportamento semelhante à depressão. Os erros acima mencionados associados à medição manual são reduzidos usando diferentes abordagens, que são ilustradas posteriormente com mais detalhes.
Para fornecer informações sobre microestrutura, o sistema automatizado de monitoramento de admissão utilizado neste protocolo10 pesa os alimentos (±0,01 g) a cada segundo. Assim, um peso estável é documentado como "não comer", e um peso instável como "comer". Um "bout" é definido como mudança no peso estável antes e depois de um evento. Uma refeição consiste em um ou mais bouts e seu tamanho mínimo em ratos foi definido como 0,01 g. Uma refeição é separada de outra refeição em ratos por 15 min (valor padronizado). Assim, a ingestão alimentar é considerada uma refeição quando as crises ocorreram dentro de 15 minutos e a mudança de peso é igual ou superior a 0,01 g. Os parâmetros da refeição avaliados neste protocolo incluem duração da refeição, tempo gasto em refeições, tamanho do ataque, duração do ataque, tempo gasto em lutas, latência para primeiro ataque, e número de ataques.
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Protocol
O cuidado com os animais e os procedimentos experimentais seguiram as diretrizes específicas de ética institucional e foram aprovados pela autoridade estadual para pesquisa animal.
1. Funcionamento do sistema de monitoramento automatizado
NOTA: Ao operar o sistema de monitoramento automatizado, é crucial documentar todas as ações na caixa de comentários incluídas no software imediatamente antes da ação. A descrição deve ser digitado na caixa de comentários e, pressionando Save,ela é salva com um ponto de tempo específico. Os prazos são significativos na análise dos dados, uma vez que o sistema registra continuamente, e o período de interesse deve ser indicado para análise.
- Instalação, utilização e manutenção do sistema de monitoramento automatizado
NOTA: Este protocolo usa ratos adultos machos Sprague Dawley pesando 250-300 g (~10 semanas de idade). Recomenda-se abrigar ratos em grupos durante o período de aclimatação. As condições ambientais devem ser controladas com os seguintes parâmetros: ciclo escuro/claro de 12 h/12h com luzes acesas às 6:00 A.M., umidade de 45%-65%, e temperatura de 21-23 °C, e acesso a ad libitum à água e dieta de roedores padrão. O manuseio diário permite que os animais se acostumem com os investigadores.- Separe os ratos para que cada animal tenha uma gaiola individual. Certifique-se de que cada rato permaneça separado durante o protocolo.
- Encha as gaiolas de alojamento com roupa de cama regular com uma camada de 1 a 2 cm de espessura. Essa quantidade (reduzida) diminui a possibilidade de contaminação de microbalancens e funis com derramamento, reduzindo assim os erros de medição. Adicione tubos plásticos (por exemplo, um pedaço de 20 cm de comprimento de um cano de drenagem plástico com diâmetro de 8 cm) e roendo a madeira como enriquecimento, ao mesmo tempo em que omitia tecidos de papel para reduzir os erros de medição.
- Prepare as gaiolas para a medição automatizada de consumo de alimentos sólidos e líquidos, anexando duas montagens de gaiola fechadas com microequilíquilos a orifícios feitos sob medida na parte frontal das gaiolas. Coloque dois funis vazios nas montarias da gaiola, um para a comida e outro para a garrafa.
NOTA: Os microbalances são conectados via cabos a um sistema de gravação conectado a um computador e o respectivo software é instalado no computador. - Para começar a gravar, abra "Monitor" epressione" Iniciar ", em seguida, escolha um lugar para salvar os dados.
- Utilizando a função de calibração (pressione "Calibrar") do sistema automatizado de monitoramento de admissão, calibrar cada equilíbrio removendo os funis e colocando dois pesos medidos diferentes nas montagens da gaiola com saldos. Faça isso em intervalos de tempo regulares (semanalmente é recomendado).
- Encha um funil completamente com chow (~100 g) e remova pedaços de comida e crumbles que são muito pequenos em tamanho. Encha a água na garrafa (~100 mL) e coloque-a no outro funil.
- Documente a posição de alimentos e água (por exemplo, equilíbrio 1: alimento animal 1, equilíbrio 2: animal de água 1).
- Coloque o rato na gaiola e abra todos os portões das montarias da gaiola para que ele possa comer e beber ad libitum.
NOTA: Para uma medição precisa, é necessário manter os equilíbrios e os funis diariamente, limpando suavemente com uma escova de derramamento e removendo pequenas migalhas de alimentos do recipiente de alimentos. Isso reduzirá muito a medição errônea. Feche todos os portões durante a manutenção diária.
- Acessando dados após os experimentos
- Pesquise na caixa de comentários os pontos de tempo de início e fim de um período (por exemplo, treinamento, teste) que precisa ser analisado.
- Clique em "Exibir dados" no software para abrir o Data Viewer.
- Insira os pontos de tempo nas caixas abaixo "Begin time" e "End time". Pressione a praça no canto superior esquerdo indicando o saldo que registrou a informação.
- Clique em "PSC Totals" para acessar os dados de microestrutura. Pressione o botão "Export PSC Table" para exportar os dados.
NOTA: Para comparar a microestrutura de animais individuais (por exemplo, não estressados versus estressados) utilizando monitoramento automatizado, animais individuais podem ser selecionados no"Visualizador de Dados" pressionando o quadrado apropriado no canto superior esquerdo. O PSC Totals mostra apenas a microestrutura para o animal selecionado. A análise estatística não pode ser realizada com o sistema. Os dados precisam ser extraídos em um programa de planilha/software de análise.
2. Implementação do teste de preferência de sacarose
- Conduzindo o período de treinamento
NOTA: Antes do teste, os animais devem estar acostumados com a disponibilidade de duas garrafas para líquidos em funis através dos portões, enquanto os alimentos devem ser fornecidos a partir dos topos das gaiolas (a configuração é mostrada na Figura 1). Esse período de treinamento deve durar pelo menos 2 dias. É realizado nas gaiolas de casa na sala onde os animais são mantidos.- Feche todos os portões. Remova a garrafa de água e o recipiente de alimentos dos microbalanceamentos.
- Coloque alimentos pré-pesados (~50 g) no topo da gaiola e documente seu peso diariamente usando um equilíbrio regular para avaliar o consumo diário de alimentos. Refil, se necessário.
- Limpe uma garrafa com água limpa e reabaste nas encha com cerca de 100 mL de água. Coloque de volta no funil.
- Encha uma segunda garrafa limpa com 100 mL de solução de sacarose recém-feita 1%. Coloque no funil.
NOTA: Marque as garrafas com cuidado e documente suas localizações (por exemplo, equilíbrio 1: animal de água 1, equilíbrio 2: solução de sacarose animal 1). - Abra todos os portões. Documente o início do treinamento no sistema de monitoramento. Deixe os portões abertos por 24 horas, resultando no acesso ad libitum a ambas as garrafas. Depois das 24h, feche os portões e documente o fim do treinamento. Os dados do intervalo de 24 horas podem ser avaliados usando o sistema de monitoramento automatizado inserindo o "tempo de início" e " tempofinal". Os procedimentos são os mesmos quando um intervalo de teste de 1 h é avaliado.
- Limpe e rechee as garrafas a cada 24 horas. Prepare a solução fresca de 1% de sacarose diariamente. Troque a posição da garrafa de solução de água e sacarose diariamente para evitar efeitos de habitação.
NOTA: Realize o treinamento em todos os animais pelo menos 48h até que as razões de preferência atinjam ~1. A razão de preferência de sacarose é avaliada logo após o treinamento usando o "data viewer". É calculado como a razão da ingestão de sacarose para a ingestão global (água mais entrada de sacarose). - 24 h antes do teste, remova a garrafa com a solução de sacarose para que o rato tenha acesso apenas à comida e água padrão.
- Prepare uma garrafa fresca cheia de água da torneira e uma cheia com uma solução de sacarose de 1%, ambas com ~100 mL.
- Antes dos testes, feche todos os portões.
- Retire a garrafa cheia de água da torneira do funil e coloque as duas garrafas frescas, uma cheia de água da torneira e outra cheia com uma solução de sacarose de 1%, no funil.
- Abra todos os portões, documente o início do teste no sistema de monitoramento. Deixe os portões abertos por 60 minutos. Feche os portões após 60 min e documente o fim do teste.
- Avalie os dados (por exemplo, a razão de entrada de fluidos/sacarose/total).
NOTA: O teste pode ser repetido várias vezes com intervalos de treinamento (pelo menos 2 dias) no meio.
3. Implementação do teste de hipofagia induzida pela novidade
- Conduzindo o período de treinamento
NOTA: Antes do teste, recomenda-se um período diário de treinamento de 30 minutos de 5 dias (a configuração é mostrada na Figura 2). O objetivo é alcançar uma linha de base estável de ingestão de lanche palatável antes do experimento. É realizado nas gaiolas de casa na sala onde os animais são mantidos.- Feche todos os portões e remova o funil com comida padrão.
- Encha um funil fresco com o lanche palatável (~50 g). Insira os biscoitos cuidadosamente no funil para evitar desmoronar. Coloque o funil no suporte da gaiola em cima do microequilípmo.
- Abra os portões por 30 minutos para que o rato tenha acesso a ad libitum ao lanche e água. Documente o início do treinamento no sistema de monitoramento.
NOTA: O rato não deve ter acesso à comida padrão durante o período de treinamento. - Feche os portões após 30 min e documente o fim do treinamento no sistema de monitoramento. Substitua o lanche por comida padrão.
- Repita isso diariamente até que uma ingestão de lanche palatável de linha de base estável seja alcançada (por exemplo, 1,5-2,0 g/30 min) e 2) a ingestão não difere estatisticamente entre os dias de treinamento.
- Realizando o teste de hipofagia induzida pela novidade
- Prepare uma gaiola vazia e recém-limpa sem roupa de cama ou enriquecimento ligado ao sistema automatizado de monitoramento da ingestão de alimentos. Coloque um funil com uma garrafa de água da torneira e funil com um lanche palatável nas montagens da gaiola.
NOTA: A gaiola nova deve ser colocada na mesma sala onde os ratos são mantidos e o treinamento realizado. Mantenha os portões fechados. - Retire o rato da gaiola e coloque na gaiola da novela.
- Abra todos os portões por 30 minutos. Documente o início dos testes no sistema de monitoramento.
NOTA: Durante os 30 minutos de acesso ao lanche, o tamanho da ingestão de lanches e os parâmetros de microestrutura subjacente (por exemplo, latência à primeira refeição) são registrados utilizando o sistema automatizado de monitoramento da ingestão alimentar. - Feche os portões após 30 minutos e documente o fim dos testes. Coloque o rato de volta na jaula.
NOTA: O teste pode ser repetido várias vezes com intervalos de treinamento (pelo menos 5 dias) no meio.
- Prepare uma gaiola vazia e recém-limpa sem roupa de cama ou enriquecimento ligado ao sistema automatizado de monitoramento da ingestão de alimentos. Coloque um funil com uma garrafa de água da torneira e funil com um lanche palatável nas montagens da gaiola.
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Representative Results
Para testar a distribuição de dados, foi utilizado o teste Kolmogorov-Smirnov. Os testes T foram utilizados quando os dados foram normalmente distribuídos e o teste Mann-Whitney-U foi utilizado, se não. Anova unidirecional seguida de teste pós-hoc tukey foi usado para comparação de vários grupos normalmente distribuída. ANOVA unidirecional, seguida do teste de comparação múltipla de Dunn, foi utilizado em casos de distribuição não normal. As diferenças entre os grupos foram consideradas significativas quando p < 0,05.
O SPT foi realizado em ratos ingênuos neste estudo. O consumo de solução de sacarose aumentou e a ingestão de água diminuiu durante o período de treinamento (Figura 3). No primeiro dia de treinamento, os ratos beberam 24,40 mL ± 3,48 mL de solução de sacarose(Figura 3A) e 4,83 mL ± 0,89 mL de água regular(Figura 3B),gerando uma razão de preferência de sacarose de 0,80 ± 0,06 (Figura 3C). No segundo dia de treinamento, os ratos aumentaram o consumo de solução de sacarose até 33,77mL ± 4,49 mL (não significativo, p = 0,17 vs. dia 1) e diminuição da ingestão de água para 0,42 mL ± 0,13 mL (p < 0,001 vs. dia 1), resultando em uma razão de 0,99 ± 0,004 (p < 0,05 vs. dia 1; Figura 3C). Oito ratos foram estudados aqui; assim, cada ponto de dados é derivado de oito animais. A ingestão de fluidos, incluindo sua microestrutura, foi registrada automaticamente. Os dados foram extraídos do PSC Totals utilizando o visualizador de dados.
Durante os testes de 60 min, os animais consumiram entre 0-6,18 mL de solução de sacarose com valor médio de 2,91 mL ± 0,66 (n =8) sem consumir água, resultando em uma razão de preferência de sacarose de 0,99 ± 0,00. Os animais que não consumiram nenhum líquido durante o teste foram excluídos da análise. Oito ratos foram estudados. A ingestão de fluidos foi registrada automaticamente.
O sistema automatizado de monitoramento de admissão forneceu dados sobre microestrutura de admissão de sacarose avaliadas automaticamente durante o teste, que foram extraídos do PSC Totals utilizando o visualizador de dados. Estes parâmetros foram o tamanho da refeição(Figura 4A),a duração da refeição(Figura 4B),o tempo gasto nas refeições em segundos(Figura 4C) e as porcentagens (Figura 4D), frequência da refeição (Figura 4E), latência à primeira refeição(Figura 4F)e percentuais(Figura 4D),frequência da refeição(Figura 4E), latênciaà primeira refeição (Figura 4F ), intervalo inter-refeição(Figura 4G),taxa de consumo(Figura 4H),duração do ataque(Figura 4I),tamanho do bout(Figura 4J),e tempo gasto em lutas em segundos(Figura 4K) e percentuais(Figura 4L).
Para estudar melhor as vantagens do sistema automatizado de monitoramento de admissão, os dados ilustrados acima foram comparados aos dados obtidos utilizando avaliações manuais convencionais (pesando garrafas manualmente antes e depois do período de treinamento/teste, Tabela 1). No primeiro dia de treinamento, a sacarose (p < 0,01) e a ingestão de água(p < 0,01) foram significativamente maiores quando avaliadas manualmente em comparação com automaticamente. No segundo dia de treinamento, a ingestão de água (p < 0,001) e a razão de preferência de sacarose(p < 0,01) diferiram entre os dois grupos e durante o teste. Todos os parâmetros, ou seja, a ingestão de sacarose (p < 0,001), a ingestão de água (p < 0,001) e a razão de preferência de sacarose(p < 0,001) foram diferentes entre os grupos, possivelmente devido à medição ou derramamento erroneamente elevado quando avaliado manualmente.
A ingestão geral do lanche palatável durante o treinamento aumentou constantemente: 0,48 g ± 0,14 g (dia 1), 1,05 g ± 0,32 g (dia 2), 1,48 g ± 0.56 g (dia 3), 1,1 g ± 0,39 g (dia 4) e 1,91 g ± 0,68 g (dia 5), indicando uma adaptação durante os primeiros 2-3 dias. Da mesma forma, o tamanho da refeição tende a aumentar entre os dias de treinamento(Figura 5A, p = 0,12), enquanto a duração da refeição(Figura 5B) não (p > 0,05). Da mesma forma, outros parâmetros microestruturais, como o tempo gasto nas refeições(Figura 5C),latência ao primeiro ataque(Figura 5D),tamanho do bout(Figura 5E),duração do ataque(Figura 5F),tempo gasto em lutas(Figura 5G),e número de lutas(Figura 5H) não foram significativamente diferentes entre esses dias(p > 0,05). Oito ratos foram estudados; assim, cada ponto de dados é derivado de oito animais. A ingestão de lanches, incluindo a microestrutura, foi registrada automaticamente. Os dados foram extraídos do PSC Totals utilizando o visualizador de dados.
No dia do teste, ratos ingênuos expostos ao lanche em um ambiente novo mostraram uma ingestão do lanche palatável de 0,98 g ± 0,34 g (Figura 6A). Parâmetros da microestrutura de consumo alimentar no dia do teste, incluindo duração da refeição(Figura 6B),tempo gasto nas refeições(Figura 6C), latênciapara primeiro ataque(Figura 6D),tamanho do ataque(Figura 6E),duração do ataque(Figura 6F),tempo gasto em lutas(Figura 6G),e número de ataques(Figura 6H),foram avaliados automaticamente e extraídos dos Totais de PSC utilizando o visualizador de dados.
Para estudar a especificidade do teste de hipofagia induzida pela novidade, os dados descritos acima de ratos ingênuos e não estressados foram comparados aos que receberam uma injeção intracerebroventricular de fator de liberação de corticotropina, que estimula o eixo de estresse hipotálamo-pituitário-adrenal e induz o estresse e a ansiedade11. Os dados individuais de cada animal foram obtidos usando o "Data viewer" e "PSC Totals", conforme descrito na seção de protocolo. Os dados individuais foram então reunidos segundo grupos em um programa de planilha e analisados para diferenças estatísticas. Foi detectada uma diferença significativa no tamanho da refeição(p < 0,01) e no tamanho do bout(p < 0,01) entre ambos os grupos(Tabela 2). A diferença no tamanho do ataque não teria sido detectável usando avaliação manual.
Figura 1: Configuração do teste de preferência de sacarose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração do teste de hipofagia induzida por novidades. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Período de treinamento para o teste de preferência de sacarose. O consumo de solução de sacarose (A) e água (B) foi avaliado ao longo de 24h durante 2 dias. A razão de preferência de sacarose (C)foi calculada em conformidade. Os dados são apresentados como ± SEM de oito ratos (*p < 0,05, ***p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Teste de preferência de sacarose. No dia do teste, a microestrutura de admissão líquida (aqui, mostrado para a ingestão de sacarose) foi analisado mais de 1h para tamanho de refeição englobada (LA),duração da refeição(B),tempo gasto em refeições em s (C),tempo gasto em refeições em % (D),número de refeições(E),latência para primeira refeição(F),intervalo inter-refeição(G),taxa de consumo(H),duração do bout(I),tamanho do bouts(J),tempo gasto em lutas em s (K), e tempo gasto em lutas em Os dados são apresentados como média ± SEM, n = 8 ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Período de treinamento para o teste de hipofagia induzido pela novidade. Tamanho da refeição (A),duração da refeição(B),tempo gasto nas refeições em s (C),latência para primeiro bout(D),tamanho do bout(E),duração do bout(F),tempo gasto em lutas(G), e número de lutas (H) foram avaliados durante um período de 5 dias. Os dados são apresentados como média ± SEM, n = 8 ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Teste de hipofagia induzida por novidades. No dia do teste, a microestrutura de consumo alimentar foi analisada ao longo de 1h para tamanho de refeição englobada (A), duração da refeição (B), tempo gasto nas refeições (C), latência para primeiro ataque (D), tamanho do ataque (E), duração do ataque (F), tempo gasto em lutas (G) e número de bouts (H). Os dados são apresentados como média ± SEM, n = 8 ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetro | Avaliação manual | Monitoramento automatizado de admissão |
| Período de treinamento (dia 1) | ||
| Ingestão de sacarose (ml) | 63.46 ± 10.2 | 24,4 ± 3,48** |
| Inakte de água (ml) | 12,07 ± 1,62 | 4,83 ± 0,89** |
| Razão de preferência de sacarose | 0,83 ± 0,03 | 0,8 ± 0,06 |
| Período de treinamento (dia 2) | ||
| Ingestão de sacarose (ml) | 45,49 ± 5,75 | 33.77 ± 4.49 |
| Inakte de água (ml) | 4.92 ± 0,80 | 0,42 ± 0,13*** |
| Razão de preferência de sacarose | 0,89 ± 0,02 | 0,99 ± 0,004** |
| Teste de preferência de sacarose | ||
| Ingestão de sacarose (ml) | 10.15 ± 0.53 | 2.91 ± 0,66*** |
| Inakte de água (ml) | 6.65 ± 0,68 | 0 *** |
| Razão de preferência de sacarose | 0,61 ± 0,04 | 0,99 ± 0,001*** |
Tabela 1: Teste de preferência de sacarose em ratos ingênuos usando avaliação manual versus sistema automatizado de monitoramento de admissão. A distribuição dos dados foi determinada usando o teste kolmogorov-smirnov. Os dados são expressos como ± SEM médios e as diferenças foram analisadas utilizando-se t-tests ou o teste Mann-Whitney U, dependendo da distribuição dos dados (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. avaliação manual).
| Parâmetro | Átono | Estressado |
| (n=8) | (n=11) | |
| Tamanho da refeição (g/300g bw) | 0,98 ± 0,29 | 0,35 ± 0,07** |
| Duração da refeição (seg) | 998,29 ± 163,87 | 1209.11 ± 114,67 |
| Tempo gasto em refeições (seg) | 998,29 ± 163,87 | 989,27 ± 174,73 |
| Tempo gasto em refeições (%) | 55.46± 9.10 | 54.96 ± 9.71 |
| Latência para primeiro combate (seg) | 241,25 ± 45,96 | 185,50 ± 57,52 |
| Tamanho do ataque (g) | 0.21 ± 0.03 | 0,08 ± 0,01** |
| Duração do ataque (seg) | 70.70 ± 14.12 | 45.59 ± 4.20 |
| Tempo gasto em lutas (seg) | 439,75 ± 125,94 | 208,73 ± 45,01 |
| Tempo gasto em lutas (%) | 24.43 ± 7.00 | 11.6 ± 2,50 |
| Bouts (número) | 5.63 ± 0,67 | 4.64 ± 0,80 |
Tabela 2: Teste de hipofagia induzida por novidades em ratos ingênuos não estressados e estressados (INJETADOS POR CRF). No grupo de estresse, os ratos canulados de gelo foram injetados com 0,6 μg/5 μL CRF e submetidos à hipofagia induzida por novidades posteriormente. A distribuição dos dados foi determinada usando o teste kolmogorov-smirnov. As diferenças foram analisadas utilizando-se os t-tests ou o teste U Mann-Whitney, dependendo da distribuição dos dados. Para melhor comparabilidade, todos os dados são expressos como ± SEM (**p < 0,01 vs. não-restrito).
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Discussion
A preferência por sacarose e os testes de hipofagia induzidos por novidades são duas técnicas estabelecidas para avaliar a anedonia em ratos. Sua combinação com o sistema automatizado de monitoramento da ingestão de alimentos permite uma análise mais detalhada em ratos não perturbados e reduz a medição errônea.
A incidência de erros é reduzida por diferentes abordagens. Primeiro, para resolver o erro ocorrido devido ao derramamento, a lacuna entre o funil de alimentos e o portão permite que migalhas geradas durante a roer caiam sobre a bandeja integrada. Ao coletar esse derramamento nas montagens da gaiola, eles estão incluídos na medição (uma vez que o derramamento ainda está na balança, não afeta a medição). Em segundo lugar, para evitar acumulação, a abertura da gaiola de ratos é grande o suficiente para permitir que o animal coma do funil de alimentos com a cabeça dentro da abertura, mas pequeno o suficiente para limitar a capacidade do animal de usar as mãos enquanto come. Isso limita sua capacidade de remover alimentos e trazê-lo para a gaiola.
Em terceiro lugar, o sistema reduz a perda não intencional de líquido porque a garrafa líquida, após a escorva, não vaza, e a evaporação ocorre apenas lentamente (aproximadamente <10 mg/h) na interface de tubo de bola de aço inoxidável de precisão/sipper. Além disso, como o sistema pesa as garrafas automaticamente, o manuseio das garrafas durante a gravação não é necessário, o que é uma causa comum de erros. Suspeita-se que as diferenças observadas na comparação entre as medidas manuais e automatizadas(Tabela 1) sejam decorrentes de perda não intencional durante o manuseio manual das garrafas.
O uso do sistema automatizado de monitoramento da ingestão de alimentos proporciona diversas vantagens, como análise detalhada da ingestão de alimentos sólidos e líquidos e avaliação da microestrutura de consumo alimentarsubjacente 10. O termo "microestrutura" descreve o padrão de ingestão de alimentos ou fluidos com mais detalhes. Em estudos sem um sistema automatizado de monitoramento da ingestão, a ingestão é medida pela pesagem de alimentos/fluidos no início e no fim de um ponto de tempo de interesse. A única informação obtida por essa abordagem é o consumo total ao longo de um determinado período de tempo.
Em contrapartida, o sistema de monitoramento automatizado fornece mais informações sobre o consumo durante esse período, pois registra mudanças no peso dos microbalanceamentos a cada segundo. As gravações podem detalhar quando o roedor começa a comer, quantas vezes ele come, quanto tempo ele come, quanto come, quanto tempo as pausas entre comer são, etc. Para obter dados semelhantes ao sistema automatizado usando medição manual, os usuários teriam que medir o conteúdo com frequência durante os testes/treinamento e, assim, perturbar significativamente os animais. Com o sistema automatizado, os roedores permanecem imperturbáveis durante as sessões de treinamento e testes.
Considerando o grande número de sistemas de admissão automatizados disponíveis para roedores, é importante notar que nenhum modelo especificado é necessário para o protocolo descrito aqui. No entanto, este sistema é muito sensível. Para evitar erros devido ao ruído ambiental (vibração de baixo nível ou agitação da massa na escala), o algoritmo do sistema avalia os valores coletados em uma base segundo a segundo, e só aceita aqueles que estão abaixo de um ponto de partida para "ruído" a fim de média de 10 valores. Se o sistema exceder esse limiar de ruído, os valores não são utilizados para calcular pesos estáveis, que são usados para calcular os ataques de alimentação.
No que diz respeito à execução dos testes, vários pontos críticos devem ser mantidos em mente. Todos os testes comportamentais devem ser realizados na mesma hora do dia, pois alterações circadianas podem afetar o comportamento dos animais12,13. A maioria dos estudos realiza testes comportamentais durante a fase de luz, enquanto aqui, todos os testes foram realizados durante a fase escura. Os roedores são animais noturnos e, portanto, ativos na fase escura, enquanto estão dormindo ou menos ativos12 com menor atividade exploratória13 durante a fase de luz. Assim, o teste comportamental é mais fisiologicamente apetitoso durante o período de foto escura.
É importante notar que para o teste de preferência de sacarose, foram utilizadas diferentes concentrações da solução de sacarose, variando de 0,5%a 10%4,7,14. Eles são escolhidos principalmente dependendo de espécies, cepas, sexo e idade, mas especialmente com base no comportamento observado de beber durante o treinamento (todos os animais devem beber aproximadamente a mesma quantidade antes do tratamento/intervenção). No entanto, altas concentrações (por exemplo, 10 %) pode substituir a anedonia, uma vez que mesmo animais com comportamento depressivo ainda bebem líquidos muito doces4.
Além disso, o alto teor calórico devido às altas concentrações pode afetar mais proeminentemente a preferência por solução de sacarose. Por isso, foi escolhida uma solução de 1% de sacarose para este protocolo. Alguns estudos recomendam o uso de sacarina em vez de sacarose15 para evitar qualquer influência calórica. No entanto, o teor calórico médio da quantidade consumida de solução de sucrose %(2 g de solução de sacarose de 1% contém 0,08 kcal) é consideravelmente menor do que o da mesma quantidade de chow padrão (2 g contém 7,8 kcal). Assim, este ponto parece secundário.
Também é importante notar que a razão de preferência de sacarose de linha de base avaliada aqui utilizando o sistema automatizado de monitoramento da ingestão alimentar é maior (0,99) em comparação com estudos anteriores que empregam uma avaliação manual (com 0,7 em camundongos8, 0,8 em ratos adultos jovens, 0,6 em ratos de Sprague Dawley16). Isso pode ser devido ao manuseio das garrafas, uma vez que a pesagem convencional provavelmente causa perda de fluido durante a inserção e remoção das gaiolas. Isso é ainda mais comprovado pelos resultados apresentados na Tabela 1. Portanto, o uso do sistema de monitoramento automatizado pode ser mais adequado para detectar anedonia, enquanto um maior estímulo aos aspectos hedônicos da ingestão alimentar pode ser perdido devido aos efeitos do teto.
No que diz respeito ao teste de hipofagia induzida pela novidade, é crucial permitir que os ratos desenvolvam uma linha de base estável para a ingestão do lanche palatável antes de realizar o teste. Somente quando uma linha de base estável é alcançada dentro e entre os ratos caso o teste real seja realizado. Caso contrário, os efeitos da intervenção (ou seja, droga, estresse, etc.) podem ser perdidos, ou flutuações da linha de base podem ser mal interpretadas. Também é importante garantir que a gaiola da novela induz um estresse de novidade resultando em hipofagia. Embora vários protocolos sugiram que o uso de uma nova gaiola é suficiente por si só, observamos que gaiolas não usadas antes, mas contendo roupa de cama e enriquecimento podem não induzir o estresse, uma vez que os ratos são frequentemente usados para limpeza/mudança semanal da gaiola. Portanto, uma gaiola nova e vazia deve ser usada. Uma vez que a ingestão de alimentos pré-teste também pode afetar os resultados, a ingestão de alimentos deve ser monitorada antes do teste. Isso pode ser facilmente feito de forma automatizada.
Na literatura, vários testes alternativos são utilizados para avaliar diferentes aspectos do comportamento depressivo (muitas vezes o desespero em vez de anedonia); no entanto, os métodos ilustrados dentro deste manuscrito têm várias vantagens. Um método alternativo comumente usado para avaliar o desespero comportamental como parte do comportamento semelhante à depressão é o teste de natação forçado4. Por meio deste, não é avaliado o consumo de alimentos; portanto, não há risco de medição da imprecisão.
Este protocolo tem várias outras desvantagens. Uma revisão recente concluiu que o teste de natação forçado é um teste que realmente mede estratégias de enfrentamento do estresse e não comportamento semelhante à depressão17. Além disso, se um projeto de crossover é preferido para reduzir o número de animais de acordo com os "três R's" do bem-estar animal, o teste de natação forçado não pode ser aplicado, uma vez que pode exercer um efeito duradouro (traumatizante) sobre o comportamento dos animais testados18.
Em contraste, o SPT e o NIH não têm aspectos traumatizantes e podem ser repetidos. Além disso, note-se, a fase de treinamento perante o SPT e o NIH estabelecem uma habitação ao consumo; portanto, repetir o protocolo é possível. Após o teste, o alimento palatável (solução de sacarose ou lanche) é removido, e o treinamento é reintroduzido aproximadamente 24 horas após o teste; assim, os roedores têm uma ruptura sem acesso ao estímulo palatável. Supõe-se que após o intervalo, um novo período de treinamento com adaptação deve ocorrer para garantir uma razão de preferência em torno de 1 ou que uma ingestão estável de lanche de linha de base seja alcançada antes de repetir os testes.
Um teste semelhante ao teste de natação forçado é o teste de suspensão da cauda, um período de estresse de curto prazo e inescapável no qual os animais são suspensos pela cauda e desenvolvem uma postura imóvel interpretada como um sinal de comportamento semelhante à depressão19. Este teste só pode ser usado em camundongos, uma vez que os ratos não devem ser suspensos por suas caudas devido a um peso médio maior20,enquanto o SPT e o NIH podem ser usados tanto em camundongos quanto em ratos.
Outras vantagens dos testes apresentados neste manuscrito são que o teste de hipofagia induzida pela novidade apresenta boa validade de construção; portanto, mede até suas reivindicações bem21,22. Consequentemente, a quantidade da substância palatável consumida correlaciona-se com a intensidade da anedonia, corroborada pela conformidade dos resultados do SPT e do NIH com outros testes comportamentais12. Além disso, tanto o teste de preferência de sacarose quanto o teste de hipofagia induzido por novidades têm boa validade facial. São subjetivamente vistas como medindo o que se pretende (aqui, anedonia avaliada como redução da ingestão de substâncias palatáveis)21,22.
As principais limitações do sistema automatizado de monitoramento de admissão são os requisitos para o treinamento adequado e a manutenção/limpeza diária do sistema, o que o torna trabalhoso do que protocolos manuais. Em experimentos anteriores10, observou-se que, embora os ratos jovens se adaptem ao sistema automatizado, ratos mais velhos às vezes não. Esses animais devem obviamente ser excluídos do experimento.
Quanto às limitações do teste comportamental, deve-se mencionar que o treinamento também é demorado, especialmente o NIH. Além disso, os protocolos são de curto prazo, e a aplicação a longo prazo pode levar à desnutrição. Até agora, a literatura não relata o uso desses testes em estados de fome (por exemplo, um modelo para anorexia nervosa, um transtorno alimentar comumente associado a sintomas de depressão), portanto não há recomendação de seu uso para estados de fome.
Com este protocolo, só é possível detectar se há anedonia (ingestão reduzida de líquido/lanche). No entanto, não é capaz de quantificar especificamente o grau de anedonia. No futuro, a introdução de várias garrafas com diferentes concentrações de sacarose pode ser uma possível adição para quantificar ainda mais a anedonia. No geral, o uso do monitoramento automatizado da ingestão pode ser útil em qualquer experimento onde uma detecção precisa da ingestão seja necessária, como o monitoramento da ingestão oral de medicamentos dissolvidos na água potável para estudos farmacêuticos.
Em resumo, o teste de preferência de sacarose e o teste de hipofagia induzido por novidades são protocolos bem estabelecidos para avaliar a anedonia como parte do comportamento semelhante à depressão em roedores. Quando combinado com o sistema automatizado de monitoramento da ingestão de alimentos, mesmo diferenças sutis podem ser detectadas de forma confiável e repetível.
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Disclosures
A.S. é consultora da A & R Berlin, Boehringer-Ingelheim, Takeda e Schwabe. Não existem conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Fundação Alemã de Pesquisa (STE 1765/3-2) e do Financiamento Universitário charité (UFF 89/441-176, A.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCMPRF01 | |
| Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCMUPRF01 | |
| cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCR02 | single housing |
| Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BLT003 | |
| enrichment (plastic tubes, gnawing wood) | distributed by the animal facility | ||
| HoneyMaid Graham Cracker Crumbs | Nabisco, East Hanover, NJ, USA | ASIN: B01COWTA98 | palatable snack for NIH test |
| low vibration polymer rack | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BRACKR | |
| male Sprague Dawley rats | Envigo | Order Code: 002 | |
| Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCC32_03 | |
| Peripheral sensor Controller - includes cable | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BPSC01 | |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | statistical analysis | |
| Stainless steel blocker | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BBLKR | |
| standard rodent diet with 10 kcal% fat | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | D12450B | |
| sucrose powder | Roth | 4621.1 | for SPT |
References
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