Summary
该协议演示了使用接近连接测定来探测在C. elegans生殖系中原位的蛋白质-蛋白质相互作用。
Abstract
了解蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 的何时何地发生对于了解细胞中的蛋白质功能以及开发等更广泛的过程受到的影响至关重要。Caenorhabditis elegans生殖系是研究与干细胞、梅氏病和发育调控相关的PPI的一种很好的模型系统。有多种开发良好的技术，允许感兴趣的蛋白质被标出标准抗体来识别，使该系统有利于接近结扎测定（PLA）反应。因此，PLA 能够比替代方法更有效地以空间和时间方式显示 PPI 在生殖系中的位置。此处描述的是一种用于应用和定量该技术以在C. elegans生殖系中探测 PPI 的协议。
Introduction
据估计，超过80%的蛋白质与其他分子有相互作用1，这强调PPI对于在细胞2中执行特定生物功能的重要性。一些蛋白质作为中心，促进组装更大的复合物，这是细胞生存所必需的1。这些中心调解多个PPI，并帮助组织蛋白质进入一个网络，促进细胞3中的特定功能。蛋白质复合物的形成也受到生物背景的影响，如存在或缺乏特定的相互作用伙伴4、细胞信号事件和细胞的发育阶段。
C. elegans通常用作各种研究（包括发育）的模型有机体。这种动物的简单解剖由几个器官组成，包括果子、肠和透明角质，这有利于蠕虫发育的分析。居住在哥纳的生殖系是研究生殖系干细胞如何成熟成配体5，发育成胚胎，并最终成为下一代后代的一个很好的工具。生殖系的远端区域包含一池自我更新的干细胞（图1）。当干细胞离开这个利基时，它们进入微离子pachytene，并最终在年轻的成人阶段发展成卵母细胞（图1）。该生殖系的发育方案通过不同的机制受到严格监管，包括由RNA结合蛋白（RBPs）6促进的转录后监管网络。6PPI 对于这一监管活动非常重要，因为限制性商业惯例与其他辅助因素相关联以发挥其职能。
有几种方法可用于探测蠕虫中的 PPI，但每种方法都有独特的限制。体内免疫沉淀（IP）可用于从整个蠕虫提取物中分离蛋白质-蛋白质复合物;但是，此方法并不指示 PPI 在蠕虫中的位置。此外，在特定的发育阶段或有限数量的细胞中，暂时性且仅形成的蛋白质复合物很难通过共同免疫沉淀来恢复。最后，IP实验需要解决在压解后蛋白质复杂重新分类以及蛋白质在亲和力基质上的非特异性保留后的问题。
PPI原位检测的替代方法是联合免疫染色、Fürster共振能量转移（FRET）和双分子荧光补充（BiFC）。联合免疫染色依赖于同时检测固定蠕虫组织中感兴趣的两种蛋白质，以及信号共定位程度的测量。使用超分辨率显微镜，它提供了比标准显微镜7更多的细节，有助于更严格地测试蛋白质共定位超过衍射限制屏障200-300 nm8。然而，使用常规和超高分辨率显微镜的共免疫染色最适合具有明确定位模式的蛋白质。相比之下，对于漫射分布的交互伙伴来说，它的信息量要少得多。测量基于重叠的信号的共定位并不能提供有关蛋白质是否彼此复杂99、1010的准确信息。
此外，蛋白质-蛋白质复合物的共免疫沉淀和共同免疫染色不是定量的，因此很难确定这种相互作用是否显著。FRET 和 BiFC 都是基于荧光的技术。FRET依赖于标记感兴趣的蛋白质与荧光蛋白（FP），具有光谱重叠，其中能量从一个FP（捐赠者）转移到另一FP（接受者）11。这种能量的非辐射转移导致接受方FP的荧光，可以在其各自的发射波长下检测到。BiFC是基于在体内重组荧光蛋白。它需要将GFP分成两个互补片段，如螺旋1-10和螺旋1112，然后融合到两个感兴趣的蛋白质。如果这两种蛋白质相互作用，GFP的互补片段就变得足够接近折叠和组装，重建GFP荧光。重组后的 GFP 被直接观察为荧光，并指示 PPI 发生的位置。
因此，FRET 和 BiFC 都依赖于大型荧光标签，这些荧光标签会破坏标记蛋白的功能。此外，FRET 和 BiFC 需要大量且可比较地表达标记的蛋白质才能获得准确的数据。FRET 可能不适合一个伙伴超过另一个伙伴的实验，这可能导致高背景13。还应避免在 BiFC 实验中过度表达，因为这可能导致非特异性装配14导致背景增加。这两种技术都需要优化标记蛋白的表达和成像条件，这可能会延长完成实验所需的时间。
接近连接测定 （PLA） 是一种替代方法，可以解决上述技术的限制。PLA利用识别感兴趣的蛋白质（或其标签）的主要抗体。这些主要抗体然后由含有寡核苷酸探针的二次抗体结合，当在40纳米（或较短）距离15内时，这些抗体可以相互杂交。由此产生的杂交DNA通过PCR反应被放大，由补充DNA的探测器检测到。这将导致由显微镜可视化的 foci。该技术可以在复杂组织（即蠕虫腺体）中现场检测PPI，该组织为在发育和分化的不同阶段包含细胞的装配线。使用 PLA，PPI 可以直接可视化到固定蠕虫子，这有利于调查 PPI 是否在特定开发阶段发生。PLA 提供更高的 PPI 分辨率，而不是基于联合本地化的检测，这是进行精确测量的理想选择。如果使用，超高分辨率显微镜有可能提供有关PLA foci在细胞内位置的更精细的细节。另一个优点是，PLA反应产生的方法可以通过基于ImageJ的分析工作流进行计数，使这种技术具有定量性。
LC8系列的代宁光链最初被描述为Dynein电机复合体16的子单元，并假设作为货物适配器。自首次发现以来，LC8除了Dynein马达,复合体17、18、19、20,18,19外，还发现多种蛋白质复合物。20扫描含有LC8相互作用图案的蛋白质序列19表明LC8可能与各种不同的蛋白质有许多相互作用17，18，19，20，21，22。17,18,19,20,21,22因此，LC8家族蛋白现在被认为是中心，帮助促进组装较大的蛋白质复合物19，22，如内部紊乱蛋白质的组装21。19,
一种C.elegansLC8系列蛋白质，代宁光链-1（DLC-1），广泛表达在许多组织中，不丰富在特定亚细胞结构23，24。,24因此，由于多种原因，在C.elegans中确定DLC-1体内的体内伙伴是具有挑战性的：1） 共同免疫沉淀并不指示发生相互作用的组织源;2） 特定伴侣的有限表达或瞬态相互作用可能妨碍通过共同免疫沉淀检测相互作用的能力;和 3） DLC-1 的漫反射通过共同免疫染色导致与潜在伙伴蛋白的非特异性重叠。基于这些挑战，PLA 是测试与 DLC-1在体内交互的理想方法。
此前有报道称，DLC-1与RNA结合蛋白（BPS）FBF-223和GLD-125直接相互作用，并作为共同因子。23 25我们的工作支持作为中心蛋白的DLC-1模型，并建议DLC-1促进一个超越Dynein19，22,22的交互网络。使用 GST 下拉测定，已识别一个新的 DLC-1 交互 RBP 名为 OMA-126。OMA-1对卵母细胞生长和成熟很重要27，并与一些转化抑制剂和活化剂28一起功能。虽然FBF-2和GLD-1分别表达在干细胞和环太平洋区域，OMA-1在从卵母细胞27的生殖系中漫射（图1）。这表明DLC-1在哥纳德的不同区域与限制性商业惯例形成复合体。还发现，在体外观察到的DLC-1和OMA-1之间的直接相互作用并没有通过体内IP恢复。人民解放军已经成功地作为另一种方法，进一步研究这种相互作用在C.elegans生殖系，结果表明，PLA可用于探索许多其他PPI在蠕虫。
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Protocol
注：此协议使用C. elegans菌株，其中潜在的交互伙伴都标记。强烈建议使用负控制菌株，其中一种标记的蛋白质不应与另一个标记的候选相互作用伙伴相互作用。在这里，仅 GFP 就用作评估背景的负控件，因为 DLC-1 预计不会在蠕虫中与 GFP 交互。GFP标记的OMA-1被用作实验菌株，因为初步数据表明与DLC-1相互作用。Nematode 菌株与 3xFLAG 标记的 DLC-1 共同表达控制和测试蛋白质在本文本中称为 3xFLAG：:DLC-1;GFP 和 3xFLAG：:DLC-1;OMA-1：GFP（应要求提供菌株;材料表中的更多信息）。在这里，使用 3xFLAG 和 GFP 标记;但是，只要其他标签的抗体与 PLA 试剂兼容，即可更换其他标签。
1. 动物护理
- 将蠕虫放在用OP50大肠杆菌菌株播种的线虫生长介质（NGM）板上，并保持在24°C，以最佳表达GFP。
- 每2-3天通过成年蠕虫传播蠕虫，并保存它们良好的喂养。
2. 同步文化的准备
- 通过漂白一盘喂食良好、肉汁的黄斑石来同步蠕虫。在波塔-德拉里瓦等人29日中描述了漂白协议。让胚胎在24°C的离心管中孵化过夜，同时在M9最小介质（M9）缓冲液的10 mL缓冲液中旋转末端。这将产生一种被捕的L1幼虫文化。
- 在冰上孵育被逮捕的L1级幼虫的管10分钟，然后用冰冷1x M9从管子上拔下。
- 使用离心机在4°C下以600 x g的颗粒粒度为5分钟。小心地吸气上清液，使仅保留1-2 mL的上清液。
- 重新悬浮幼虫颗粒，并使用微移液器将2μL的悬浮幼虫培养转移到玻璃滑梯上。计算有多少幼虫存在，以确定幼虫培养的密度，这将有助于指导在步骤2.5中播种蠕虫。
注：密度为10-15 L1幼虫/1 μL，非常适合播种。 - 使用微移液器在 60 mm OP50 板上移植大约 100-120 L1 级幼虫所需的幼虫培养量。例如，密度为10 L1幼虫/1 μL的幼虫培养的种子10μL。
注：不要超过40μL的体积来播种幼虫，否则多余的液体会破坏OP50草坪。如果培养量超过 40 μL，重复步骤 2.3-2.4 以进一步减小体积并增加幼虫培养的密度。 - 在24°C下生长蠕虫。记录 L1 在板上播种的时间，并定期检查开发阶段，以确定解剖的理想时间。
注：在L1播种后52小时，在24°C下培养的蠕虫通常处于年轻的成人阶段，这是对高纳德靶向PLA进行解剖的理想阶段。然而，同步蠕虫达到年轻成人阶段的实际时间可能因菌株和孵育温度而异。
3. 解剖/高纳德挤出
注：要成功工作，必须解剖以挤压戈纳德。这种方法还可以释放胚胎，这些胚胎也可以使用该协议为PLA工作（有关详细信息，请参阅讨论）。解剖后，对负对照和实验样品进行固定处理，并同时为PLA进行处理。还建议为荧光共免疫染色23目的再制备一组样品，以展示感兴趣的蛋白质伴侣的表达模式。
- 将 30-40 只年轻的成年蠕虫放入手表玻璃盘中，该盘含有 500 μL 的 1x M9 = levamisole（2.5 mM 最终浓度）。收集蠕虫后，小心地去除并丢弃大部分介质，以去除与蠕虫一起转移的细菌。
- 加入新鲜 500 μL 的 1x M9 + levamisole，并使用移液器轻轻绘制和分配介质以冲洗蠕虫。小心地去除并丢弃大多数介质，以清除与蠕虫一起转移的细菌。
- 重复此步骤 2x-3x，直到清除所有细菌。完成补时后，将蠕虫留在约100 μL的介质中，以保持水分。
注：不要让蠕虫在介质中停留超过 7 分钟，因为这将在解剖过程中损害多面体的挤出。在解剖显微镜的帮助下进行消毒，以监测介质的去除，以便蠕虫不会丢失。
- 重复此步骤 2x-3x，直到清除所有细菌。完成补时后，将蠕虫留在约100 μL的介质中，以保持水分。
- 使用玻璃或聚乙烯移液器，将蠕虫转移到涂有 0.001% 聚-L-莱辛的 25 mm x 75 mm 显微镜幻灯片中（本步骤中使用的幻灯片具有环氧涂层周长，留下三个工作空间，每个 14 mm x 14 mm）。去除多余的介质，使大约 10-15 μL 的介质保持。
- 在解剖显微镜的帮助下，使用两根261⁄2仪表针，将一根针放在另一根针上，使末端形成一把剪刀。使用这种方式的针头，在咽部后面切开蠕虫以释放生殖系。在 5 分钟内分解所有蠕虫。
注：有关如何执行解剖的更多细节，请参阅 Gervaise 和 Arur30以前的出版物。 - 解剖所有蠕虫后，在幻灯片上轻轻放置一个 22 mm x 40 mm 的盖玻片，使其垂直于幻灯片。盖玻片的末端应悬挂在滑轨上。
- 将滑板冻结在干冰上预冷却的铝块上至少 20 分钟。轻轻将一支冰冷的铅笔放在盖玻片上，以防止盖玻片因结冰膨胀而松动。
4. 固定/阻塞
- 准备好固定时，用铅笔或其他钝刃工具轻拂盖玻片，立即将滑道浸入装有新鲜冰冷甲醇（冷却至-20°C）的罐子中 1 分钟。
- 轻轻擦拭样品周围的幻灯片边缘，以便下一个试剂由样品周围的表面张力保持。在 RT 时，将 150 μL 的固定剂（100 mM KH2PO 中的 2% 甲醛、pH = 7.2）应用 5 分钟。
注：我们还测试了甲醇/丙酮固定程序31，32，发现它与解放军的反应兼容。31, - 以垂直 90° 角触摸滑块到纸巾，让固定式从滑道上跑出并吸收到纸巾中。在 Coplin 罐子中，在 RT 中，块滑 2x 15 分钟，50 mL 的 1x PBS/1% Triton X-100/1% 牛血清白蛋白 （PBT/BSA）。
注：建议为此阻塞步骤和以下第 6-9 节中的洗涤步骤使用 Coplin 罐或其他类型的染色罐。这些提供了足够的体积，以便有效地交换阻塞或洗涤缓冲器与样品。 - 块状幻灯片，含有10%正常山羊血清的PBT/BSA溶液。轻轻擦拭幻灯片周围的边缘，并将 100 μL 的解决方案应用于幻灯片。在潮湿的室内在 RT 孵育 1 小时。
注：此步骤强烈建议使用 #FLAG 原抗体染色。湿式造型室通过用胶带固定玻璃移液器在托盘中，使滑轨在孵化时放在纸盒上。浸湿的任务湿巾（材料表） 被放置在托盘中，以提高托盘的内部湿度，以防止蒸发。盖子和托盘用箔覆盖，以保护样品在光线敏感步骤期间免受光照。 - 将幻灯片放在纸巾上，让 PBT/BSA/10%NGS 解决方案从幻灯片上运行，轻轻擦拭幻灯片边缘。使用阻塞试剂 （材料表） 阻止幻灯片。将一滴涂抹到 14 mm x 14 mm 空间上。在潮湿的腔室中，在37°C下孵育1小时。
5. 原抗体孵育
注：为了获得最佳的PLA结果和最小的背景，主要抗体的稀释系数可能需要优化（有关详细信息，请参阅讨论）。此外，应在与用于PLA的二次抗体的特异性相匹配的不同宿主中引发主要抗体。
- 将滑块放在纸巾上，让阻塞试剂从滑道上运行，轻轻擦拭边缘。使用抗体稀释剂 （材料表） 稀释主要抗体.每 14 mm x 14 mm 空间应用 40 μL 原抗体溶液。
- 在4°C下在潮湿的室内孵育滑梯过夜。
6. PLA 探针（二次抗体）孵育
注：对于步骤 6-9，在 RT 时使用洗涤缓冲器 A 和 B。如果缓冲器储存在 4 °C，则在使用前请它们加热到 RT。
- 在 Coplin 罐子中的 RT 处用 50 mL 的 1x 洗涤缓冲液 A （材料表） 清洗幻灯片 2x 5 分钟。将Coplin振动器上的Coplin罐设置为60rpm。
- 将滑块放在纸巾上，让洗涤缓冲器从滑道上运行，轻轻擦拭边缘。准备含有 PLUS 和 MINUS 探头的 40 μL 溶液（用抗体稀释剂稀释 1：5）。将解决方案应用于每个 14 mm x 14 mm 空间。
- 在 37 °C 下在潮湿室中孵育 1 小时。
7. 结扎
- 在 Coplin 罐子中的 RT 处用 50 mL 的 1x 洗涤缓冲液 A 清洗幻灯片 2x 5 分钟。将Coplin振动器上的Coplin罐设置为60rpm。
- 用超纯水稀释连接缓冲液 （材料表） 1：5.使用此缓冲液稀释连接（材料表）1：40，以准备成套溶液的工作库存。
- 将滑块放在纸巾上，让洗涤缓冲器从滑道上运行，轻轻擦拭边缘。将 40 μL 的配扎溶液应用于每个 14 mm x 14 mm 空间。
- 在37°C下在潮湿的室内孵育30分钟。
8. 放大
注：使用带有红色荧光球的检测试剂（材料表）可使C.elegans组织的背景量最少。
- 在 Coplin 罐子中的 RT 处用 50 mL 的 1x 洗涤缓冲液 A 清洗幻灯片 2x 5 分钟。将Coplin振动器上的Coplin罐设置为60rpm。
- 用超纯水稀释放大红缓冲液（材料表）1：5。使用此缓冲液稀释聚合酶（材料表）1：80，制备放大溶液的工作库存并防止光照。
- 将滑块放在纸巾上，让洗涤缓冲器从滑道上运行，轻轻擦拭边缘。将 40 μL 的放大溶液应用于每个 14mm x 14 mm 空间。
- 在37°C下，在潮湿的室内孵育1小时40分钟。确保湿室被铝箔覆盖，以保护样品免受光照。
9. 最终用时
- 在 Coplin 罐子中的 RT 处用 50 mL 的 1x 洗涤缓冲液 B （材料表） 清洗幻灯片 2x 10 分钟。将Coplin振动器上的Coplin罐设置为60rpm。
- 在 Coplin 罐中的 RT 时，用 50 mL 0.01x 的洗涤缓冲液 B 清洗 1x 1 分钟。将Coplin振动器上的Coplin罐设置为60rpm。此缓冲液通过稀释洗涤缓冲液 B 与超纯水制备。
10. 盖玻片安装
- 让多余的洗涤缓冲器从滑道上运行到纸巾上，擦去幻灯片环氧涂层周长上残留的缓冲液。
- 加入10 μL的安装介质（材料表）进行取样，轻轻在上面放置盖玻片，使安装介质散开。
- 用指甲油在盖玻片边缘涂上油漆，以密封盖玻片和滑动。使用指甲油时要温柔，以免移动盖玻片，以免损坏生殖线。让指甲油在RT下硬化至少20分钟，而幻灯片则不受光的影响，然后再在显微镜下查看。
- 将幻灯片存放在深色容器或幻灯片支架中，因为 PLA 标记的样品具有淡敏感。制造商建议，幻灯片可以储存在-20°C，用于长期存储，也可以储存在4°C，用于短期存储。使用此协议准备的幻灯片在 20°C 下存储时至少会持续 2 个月。
11. 图像采集
- 为了量化，使用共聚焦显微镜捕获在清晰视野、无损坏和畅通无阻的挤出生殖系的图像。捕获线系的 z 堆栈，该堆栈跨越 z 平面中的整个生殖系，并生成用于定量的最大投影图像。
注：与使用荧光显微镜获得的图像相比，共聚焦显微镜是获取和量化背景较少的PLA图像的理想选择。- 如果生殖系不适合一个视场，则根据需要捕获重叠的视场，以成像整个生殖系。这些图像的最大投影可以在 FIJI 中拼接在一起。
- 一定要在对照样品和实验样品之间保持相同的成像条件，为图像分析期间识别foci设定一个公平、适当的阈值。
注：每次复制从每个样品中记录至少8-10个生殖系，以便对PLA定量进行统计分析。建议解放军至少进行三次生物复制，以获得可靠和一致的定量结果。
12. 使用 FIJI/ImageJ 进行图像分析和定量
注： 以下工作流基于在共聚焦显微镜上使用 40x 目标获取的图像，其中图像以 .czi 格式保存。这些 .czi 图像及其附带的元数据（包括尺寸）可以在 FIJI/ImageJ 中访问和打开，以便进一步分析。应检查 FIJI 是否接受来自特定用户可用的共聚焦文件的格式。否则，可以交替使用 .tiff 格式的图像进行分析，但用户需要在 FIJI/ImageJ 中手动设置图像的比例（分析 |设置比例。建议首先将所有负控制图像分析在一起，以确定背景级别。
- 首先分析所有负控制图像，然后转到实验样本，从而启动分析工作流。打开 FIJI/ImageJ 中的最大投影图像进行分析（图 2A）。如果使用 .czi 文件，将提示使用生物格式导入选项框。
- 包括以下选项来打开映像：使用数据浏览器查看堆栈;颜色模式 =着色。现在，具有图像的窗口应打开一个滑动条，在共聚焦捕获的不同通道（例如 DAPI 或 PLA）之间切换。
- 如果需要拼接图像，请通过用鼠标右选择图像并选择"重复"窗口来从每个图像创建每个通道的重复项。仅指定对应于 PLA 或 DAPI 通道（例如2）的通道号 （c），并取消选中"重复超堆栈"复选框。
- 打开两个图像后，选择插件 |缝合 |已弃用 |2D缝合。将打开2D 图像的拼接窗口。选择将用于拼接的图像，并使用窗口中预设的默认参数，然后选择"确定"。生成的图像将是一个组装的灰度图像。
注： 如果子图像不完全对齐，则调整参数（即，将要检查的峰值数从5增加到500，或将融合方法从线性混合更改为Max。强度）可能有助于获得所需的图像。虽然其他拼接工具可用，但这种方法保留了图像的尺寸，这对定量非常重要。
- 按键盘上的T打开 ROI（感兴趣区域）管理器。将打开一个名为ROI 管理器的新窗口。
- 从 FIJI 工具集框中选择多边形工具。在生殖系周围放置点以勾勒出它并生成 ROI（图 2B）。将最后一个点连接到第一个点，以生成完整的 ROI。
注： 对于较暗的图像，调整对比度以提高生殖系（可逆）的可见性是很有帮助的，以便更准确地勾勒出它。- 完成 ROI 后，立即转到 ROI 经理，然后选择"添加 [t]以存储 ROI。在继续下一步之前，必须更新 ROI 的任何更改，包括添加/删除点或移动 ROI 和点（从 ROI 经理中选择"更新"），否则这些更改将丢失。有关操纵 RO 及其点的进一步详细信息，请参阅 FIJI/ImageJ 用户指南。
- 设置 ROI 方向后，可以通过在 ROI 管理器中选择 ROI 名称后，然后选择更多 ， 将其保存以供以后参考保存 |（命名文件并指定要保存的位置的目标）。通过选择更多 |打开 |（选择该文件）.
- 通过从 ROI 经理中选择 ROI 名称，然后选择 ROI 经理上的"度量"按钮，衡量 ROI 内部的区域。将打开"结果"窗口，其中将包含有关 ROI 的信息，包括它覆盖在图像中的区域 （μM2）（图 2B的页）。在电子表格中记录此信息以供后续计算。
注： 确保图像的比例已正确设置，以便收集 ROI 的正确维度。"结果"框中报告的测量类型可以通过"分析" 进行修改|设置测量... - 通过右选择 PLA 图像并选择"重复"（图 2C），打开仅解放军通道的重复图像。将打开"重复"窗口。仅指定与 PLA 通道对应的通道号 （c）（例如，2），并取消选中"重复超堆栈"复选框。建议复制此图像，以便不修改原始图像。
注：这些选项仅在查看 FIJI/ImageJ 上包含多个通道的图像时才会显示。另一种方法是拆分通道图像|颜色 |拆分通道，但这将修改原始图像文件。 - 只选择 PLA 通道的图像，转到图像|调整 |阈值。将打开图像的阈值窗口。选择"默认"作为阈值方法，红色作为颜色，然后选中"深色背景"框。使用窗口上的上轨，将条向右侧滑动，直到图像中明显突出显示所有 PLA foci。
- 将值记录在上轨右侧的框中，并记下用于设置阈值的值。在"阈值"窗口中选择"应用"以最终确定阈值，图像将转换为白色背景，只有阈值作为黑点可见（图2D）。测试多个负控制图像的阈值，以确保在量化之前捕获从图像到图像的所有 PLA 信息。
注： 要将阈值 foci 视为白色背景上的黑点，请访问"进程" |二进制 |选项...并取消选中"黑色"背景框。30-40 之间的阈值是识别生殖系中的 PLA 的良好起点;但是，理想值可能因背景而异。
- 将值记录在上轨右侧的框中，并记下用于设置阈值的值。在"阈值"窗口中选择"应用"以最终确定阈值，图像将转换为白色背景，只有阈值作为黑点可见（图2D）。测试多个负控制图像的阈值，以确保在量化之前捕获从图像到图像的所有 PLA 信息。
- 要量化 PLA 信息，请从 ROI 管理器窗口中选择 ROI 名称，将步骤 12.3-12.3.1 生成的 ROI 应用于阈值映像。ROI 的轮廓应与源映像位于同一位置的映像显示（图 2E）。
- 转到分析 |分析粒子。"分析粒子"窗口将打开并选择以下参数：大小（微米+2）=0-无穷大，圆度 = 0.00-1.00，显示 =无。选中"汇总"框。
- 选择"确定"，将显示一个摘要表，其中将显示有关投资回报率的信息（即，解放军在投资回报率中所占用的总面积、解放军官皮的平均大小以及 PLA foci 相对于 ROI 大小的面积百分比）（图 2E中）。在电子表格中记录这些测量值。
- 对使用相同阈值的多个负控制图像重复步骤 12.1-12.8。
- 分析所有负控制图像后，对所有实验样本重复步骤12.1-12.8，使用负控制确定的相同阈值来识别和量化PLA foci。
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Representative Results
3xFLAG：:DLC-1的共免疫染色;GFP 和 3xFLAG：:DLC-1;OMA-1：具有FLAG和GFP抗体的GFP生殖系揭示了它们在生殖系中的表达模式（图3Aii-iii，3Bii-iii）。虽然GFP在整个生殖系中表达（图3Aiii），但OMA-1：GFP表达仅限于晚期的pachytene和卵母细胞（图3Biii）27。27FLAG免疫染色显示，3xFLAG：:DLC-1在两种菌株的生殖系中表达（图3Aii，3Bii）。通过共同免疫染色，3xFLAG：:DLC-1 和 OMA-1：GFP 之间的重叠与 3xFLAG：:DLC-1 和 GFP（负控制）之间的重叠是无可区分的。
由于这些实验测试了DLC-1和OMA-1之间的相互作用，因此，在生殖系中，PLA定量感兴趣的区域包括所有所检查的生殖系中的卵母细胞（图2B），因为这是OMA-1表达式的区域（图1，图3Biii）。3xFLAG：:DLC-1;OMA-1：GFP生殖系似乎在该地区有更多的PLA病菌数量，而3倍：:DLC-1;GFP生殖系（图3Ciii-iv，3Diii-iv）。解放军的量化表明，解放军的人数为3倍：:DLC-1;OMA-1：GFP生殖系明显大于3倍：:DLC-1;GFP（图3Ciii-iv，3Diii-iv;表 1。此外，即使GFP和FLAG抗体的稀释度提高了10倍，控制与实验PLA之间的差异仍然显著不同;然而，整体密度和平均大小减少了（表1）。
图1：C.埃勒根菌系的原理图。远端区域包含干细胞池，随后是体粒体，细胞从线虫病切换到梅氏症。退出甲流的细胞发育成卵母细胞，在近端有最成熟的卵母细胞。绿色区域，从晚期的环太平洋，穿过所有卵母细胞，表示 OMA-1 表达模式。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：生殖系PLA定量工作流程的代表性图像。此图中使用的生殖系是具有代表性的 3xFLAG：:DLC-1;图3C的GFP生殖系。（A） 在 FIJI/ImageJ 中打开的合并 PLA 和 DAPI 通道的图像。（B） FIJI 中的多边形工具用于勾勒和定义量化的生殖系（黄线加白框）中感兴趣的区域 （ROI），并测量 ROI （μM2） 的区域（B 的内部）。（C） 通过复制或分割原始图像（A、B）获得 PLA 通道的单一图像。（D） 门槛被仔细设定，以突出解放军形象中的所有解放军。相同的阈值必须应用于所有将一起分析的实验和控制图像。（E） 在阈值图像中选择 ROI 后，"分析粒子"函数将返回一个结果表，其中包括 ROI 中包括的 foci 总数（E 的内部）。图像是来自 FIJI/图像 J 的快照：插件 |公用事业 |捕获图像。比例尺 = 10 μM。请点击这里查看此图形的较大版本。
图3：共免疫染色或PLA后生殖系的代表性图像。（A， B）3xFLAG：:DLC-1中标记蛋白质的表达模式;GFP（Ai-iv）和3xFLAG：:DLC-1;OMA-1：GFP（Bi-iv）在解剖、固定和免疫染色的gonads中进行了评估。抗FLAG抗体在1：1000稀释时使用，而抗GFP抗体在1：200稀释时使用，这是免疫荧光图像的最佳选择。DNA被DAPI染色，单个通道以灰度显示，以更好的对比度（Aiv， Biv）。在每张图片中，干细胞和卵端用虚线勾勒出轮廓，而卵母细胞则用虚线勾勒出。图像是通过荧光显微镜获得的。刻度杆 = 10 μM. （C，D） 挤出 3xFLAG：:DLC-1;GFP （C） 和 3xFLAG：:DLC-1;OMA-1：GFP （D） gonads。抗FLAG抗体在1：1000稀释时使用，而抗GFP抗体在1：4000稀释时使用。DNA被DAPI染色，并且单个DAPI（Cii，Dii）和PLA通道（Ciii，iv，Diii，iv）都以灰度显示，以更好的对比度。绿色虚线框 （Ciii， Diii） 表示放大的 PLA 图像的位置 （Civ， Div）。在每张图片中，干细胞和卵端用虚线勾勒出轮廓，而卵母细胞则用虚线勾勒出。图像是通过共聚焦显微镜获得的。比例尺 = 10 μM.（A、B、C、D）均使用图像处理软件组装（参见材料表）。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 抗体稀释 | 应变测试 | 平均 PLA 密度 （foci/μM2） X 10-2 | T 测试 | 解放军福慈的平均大小 （μM2） | T 测试 |
| *FLAG （1：1000）， *GFP （1：4000） | 3xFLAG：:DLC-1;Gfp | 3.9 × 1.4 | P = 1.917E-05 | 0.52 × 0.127 | P = 0.057 |
| 3xFLAG：:DLC-1;OMA-1：GFP | 9.1 × 2.7 | 1.8 × 2.08 | |||
| *FLAG （1：10，000）， *GFP （1：40，000） | 3xFLAG：:DLC-1;Gfp | 3.2 × 2.4 | P = 3.395E-04 | 0.51 ± 0.1 | P = 0.019 |
| 3xFLAG：:DLC-1;OMA-1：GFP | 7.7 × 3 | 0.7 × 0.24 |
表1：解放军成果摘要。表报告在两次稀释原抗体时对PLA定量的摘要。OMA-1：GFP 两种抗体点之间的PLA平均密度或平均大小差异并不显著（未显示 p 值）。同样的比较也适用于GFP，这也没有造成显著差异（未显示p值）。p 值是使用双尾/相等方差t-检验确定的。
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Discussion
在研究C.elegans生殖系中的PPI时，PLA提供的与共同免疫染色相比提供的更高分辨率，可以对生殖系中发生相互作用的位置进行可视化和定量。此前有报道称，DLC-1使用体外GST下拉测定26直接与OMA-1相互作用;然而，这种相互作用并没有通过体内下拉恢复。3xFLAG的荧光共免疫染色：:DLC-1;OMA-1：GFP生殖系显示DLC-1和OMA-1的表达模式重叠;然而，没有迹象表明它们的相互作用发生在生殖系中，并且重叠本身不大于3xFLAG：:DLC-1和GFP之间没有融合到任何蛋白质（负控制）之间的重叠。使用原地PLA，发现DLC-1确实与发芽线上的OMA-1相互作用，这表明PLA在检测PPI方面可能比其他方法更敏感。通过这种方法，我们继续扩展 DLC-1 作为 RBP 协理器的新兴作用。这项工作展示了PLA在生殖系中检测PPI的能力，并为未来用户探索自己感兴趣的蛋白质之间的相互作用提供了参考。
PLA 为用户提供了测试具有类似灵敏度的 PPI 的能力，而不需要与其他技术（如 FRET 和 BiFC）相关的缺点。与生物学相关的蛋白质表达水平可能不是FRET和BiFC的最佳水平。此外，潜在交互伙伴的功能可能受两种方法中使用的大标记的影响。此外，FRET测定需要一个专门的显微镜设置，可能不容易获得。与其他技术相比，PLA 也可以是一种经济高效的方法来研究 PPI。除了免疫染色所需的试剂外，用户只需获得 PLA 试剂并进入共聚焦显微镜进行成像。图像分析使用开源程序 FIJI/ImageJ 执行，任何用户均可免费提供该程序。没有使用 FRET 或 BiFC 经验的用户可能会发现 PLA 是一个合适的替代方案。此处介绍的协议仅包含除典型免疫染色程序之外的几个附加步骤，使具有免疫染色经验的任何用户几乎可以访问此技术。
通过解剖来挤压果子，对解放军的成功工作具有重要意义。保留在蠕虫角质内组织不会由 PLA 使用此协议标记。进一步发现，挤出的胚胎被这个PLA协议有效地标记。这表明，在解剖过程中释放的其他组织，如肠道，也可能与PLA兼容。结果发现，PLA在果子上产生强健的信号，以及用两种固定协议制备的胚胎样本，这些培养方案通常用于免疫染色。这表明，现场使用的其他固定程序可能与 PLA 兼容，但需要由用户单独评估。
确定原抗体的最佳稀释对于成功实现PLA至关重要。最好从针对免疫荧光优化的稀释开始。这通常是通过在免疫荧光实验中对主要抗体进行定位，以在背景低和信号高的情况下找到最佳稀释。一旦建立了免疫荧光的最佳稀释，这些相同的稀释液可以在PLA测定中进行测试，该测定将一对潜在相互作用者产生的信号与控制对非相互作用蛋白质产生的信号进行比较。
在对照样品中观察到大量信号的情况下，需要进一步稀释原抗体。研究发现，PLA的最佳原抗体稀释至少与用于免疫荧光的抗体稀释度相同甚至更稀。例如，图 3A、B中的免疫荧光图像代表 1：1000 反 FLAG 稀释和 1：200 稀释抗 GFP。然而，图3C、D中的PLA图像中的抗体稀释物是抗FLAG的1：1000和1：4000的反GFP。PLA中使用的抗GFP抗体的稀释程度大于用于免疫荧光的抗体，这表明PLA更为敏感。结果发现，稀释抗体10倍，进一步降低PLA密度，以及DLC-1/OMA-1 foci的大小（表1）。尽管减少了，但负控制与DLC-1/OMA-1之间的PLA密度差异仍然明显不同。这表明，PLA仍然非常敏感，主要抗体的稀释度较高;然而，可探测相互作用的普遍性将被低估。
相比之下，抗体稀释过低可能产生两种有害后果。首先，在负控制中可能产生显著的背景信号。其次，相互作用的伙伴蛋白产生的PLA蛋白可能会合并和重叠，使其难以在最大投影图像中解析。这导致在图像分析过程中低估了PLA的体积数和密度。PLA 信号是检测非交互伙伴之间的虚假接近和检测样本中发生的每个实际 PPI 实例的平衡。因此，在两种蛋白质不相互作用的情况下加入负对照对于确定PLA实验中的背景水平至关重要。在PLA实验中，一种主要抗体的遗漏在其它报告中被用作,负控制;然而，这种方法不能考虑非特异性相互作用或非特异性抗体结合，可能会影响实验PLA的结果。此处使用 GFP 作为负控制，因为 DLC-1 和 GFP 之间不会直接交互。结果发现，负控制确实有一些背景信号。这进一步支持了在评估实验数据时对 PLA 测定进行负控制的重要性。
一旦建立了PLA优化的稀释，这些稀释可用于测试一系列不同的蠕虫菌株，这些蠕虫菌株包含带有相同关联标记的不同交互伙伴对。使用同一对原抗体以确保对产生的PLA信号进行公平比较非常重要，因为抗体亲和力的变化会影响PLA实验的结果。另一份关于解放军的报告建议优化稀释解放军二次抗体10;但是，不建议这样做。二次抗体的稀释率较高，可能会降低其他下游PLA步骤的功效，这些步骤依赖于对与二次抗体结合的 PLUS 和 MINUS 探针的识别。
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Disclosures
提交人没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究中使用的一些线虫菌株是由国家卫生研究院资助的卡诺哈卜炎遗传学中心提供的（P40OD010440）。在国立卫生研究院奖 P20GM103546 和 S10OD021806 的支持下，蒙大拿大学生物光谱核心研究实验室进行了共聚焦显微镜。这项工作得到了NIH向E.V.授予GM109053的部分支持，美国心脏协会奖学金18PRE34070028资助了X.W.，蒙大拿州科学院授予了X.W.资助者没有参与研究设计或撰写报告。我们感谢埃伦贝克先生的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
| 1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
| 1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
| 1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
| 26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
| BSA | Lampire | 7500802 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
| Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
| Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
| Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
| Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
| DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
| Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
| Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
| Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
| MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
| PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
| Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
| Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
| Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
| Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
| Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
| Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
| Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
| Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
| Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
| Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
| Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
| Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
| Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
| Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
| Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
| Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
| task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4x8.4 inch task wipes |
| Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
| Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
| Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
| Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
| -20 °C freezer | |||
| -80 °C freezer | |||
| Aluminum Foil | |||
| OP50 strain E. coli | |||
| Orbital Shaker | |||
| Tape | |||
| Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
| mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
| mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |
References
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