Summary
Этот протокол демонстрирует использование проверки перевязки близости для зондирования белково-белковых взаимодействий на месте в зародышевой линии C. elegans.
Abstract
Понимание того, когда и где происходят белково-белковые взаимодействия (PPI), имеет решающее значение для понимания функции белка в клетке и как затрагиваются более широкие процессы, такие как развитие. Зародышевой линии Caenorhabditis elegans является отличной модельной системой для изучения ИЦП, которые связаны с регулированием стволовых клеток, мейозом и развитием. Существуют различные хорошо разработанные методы, которые позволяют белки, представляющие интерес быть помечены для распознавания стандартными антителами, что делает эту систему выгодной для анализа перевязки близости (PLA) реакций. В результате НОАК может показать, где ИЦП происходят пространственным и временным образом в зародышевых чертах более эффективно, чем альтернативные подходы. Описано здесь протокол для применения и количественной оценки этой технологии для зондирования ИЦП в Зародыше C. elegans.
Introduction
Более 80% белков, по оценкам, имеют взаимодействия с другими молекулами1, что подчеркивает, насколько важны ИЦП для выполнения конкретных биологических функций в клетке2. Некоторые белки функционируют как концентраторы, облегчающие сборку более крупных комплексов, необходимых для выживания клеток1. Эти концентраторы посредничают в нескольких ИЦП и помогают организовать белки в сеть, которая облегчает конкретные функции в ячейке3. Формирование белковых комплексов также зависит от биологического контекста, такого как наличие или отсутствие конкретных взаимодействующих партнеров4,события клеточной сигнализации и стадия развития клетки.
C. elegans обычно используется в качестве образцового организма для различных исследований, включая развитие. Простая анатомия этого животного состоит из нескольких органов, в ключая гонад, кишечник и прозрачную кутикулу, которая облегчает анализ развития червя. Зародышевая линия, проживающая в гонаде, является отличным инструментом для изучения того, как зародышевые стволовые клетки созревают в гаметы5, которые превращаются в эмбрионы и, в конечном итоге, следующее поколение потомства. Дистальная область кончика зародышевой линии содержит пул самообновляющихся стволовых клеток(рисунок 1). Как стволовые клетки покидают нишу, они прогрессируют в мейотический пахитен и в конечном итоге превращаются в яйцеклетки в стадии молодых взрослых (Рисунок 1). Эта программа развития в зародышевой плотно регулируется с помощью различных механизмов, в том числе после транскрипционной регуляторной сети при содействии РНК-связывающих белков (RBPs)6. ИЦП имеют важное значение для этой регулятивной деятельности, поскольку ОРП связываются с другими кофакторами для осуществления своих функций.
Есть несколько подходов, которые могут быть использованы для зондирования Для ИЦП в червя, но каждый из них имеет уникальные ограничения. In vivo immunoprecipitation (IP) может быть использован для изоляции белково-белковых комплексов из экстрактов цельного червя; однако этот подход не указывает, где происходит ИЦП у червя. Кроме того, белковые комплексы, которые являются преходящими и только образуются на определенном этапе развития или в ограниченном количестве клеток может быть трудно восстановить путем совместного иммунопреципции. Наконец, IP-эксперименты должны решать проблемы белкового комплекса reassortment после лиза и неспецифического удержания белков на матрице сродства.
Альтернативными подходами к обнаружению ИЦП на месте являются совместное иммуносохранение, рецензирование фюрстерской резонансной передачи энергии (ФРЭТ) и бимолекулярная флуоресценция (BiFC). Совместное иммуностоирование опирается на одновременное обнаружение двух белков, представляющих интерес для фиксированной ткани червя, и измерение степени колокализации сигнала. Использование микроскопии сверхразрешения, которая предлагает более подробную информацию, чем стандартная микроскопия7,помогает более строго проверить колокализацию белка за пределами дифракционно-ограниченного барьера 200-300 нм8. Тем не менее, совместное иммуноскопии с использованием как обычных, так и супер-разрешение микроскопии лучше всего подходит для белков с четко определенными шаблонами локализации. В отличие от этого, он становится гораздо менее информативным для диффузно распределенных взаимодействующих партнеров. Измерение для совместной локализации сигналов на основе перекрытия не дает точной информации о том, являются ли белки в комплексе друг с другом9,,10.
Кроме того, совместное иммунопрецитификации и совместное иммуно-дентинирование белково-белковых комплексов не являются количественными, что затрудняет определение того, являются ли такие взаимодействия значительными. FRET и BiFC являются методами флуоресцентной основе. FRET опирается на пометки белков, представляющих интерес с флуоресцентными белками (FPs), которые имеют спектральное перекрытие, при котором энергия от одного FP (донор) передается другому FP (приемору)11. Эта нерадиационная передача энергии приводит к флуоресценции принимающего FP, которые могут быть обнаружены на соответствующей длине волны выбросов. BiFC основан на восстановлении флуоресцентного белка in vivo. Это влечет за собой разделение GFP на два дополнительных фрагмента, таких как сиксы 1-10 и сугнишие 1112, которые затем сливается с двумя белками, представляющими интерес. Если эти два белка взаимодействуют, дополнительные фрагменты GFP становятся достаточно близкими в непосредственной близости к разить и собрать, воскворуя фторфор GFP. Восстановленный GFP затем непосредственно наблюдается как флуоресценция и указывает, где иЦП произошло.
Таким образом, как FRET и BiFC зависит от больших флуоресцентных тегов, которые могут нарушить функцию помечены белка. Кроме того, FRET и BiFC требуют обильного и сопоставимого выражения помеченных белков для получения точных данных. FRET не может быть пригодным для экспериментов, где один партнер превышает другой, что может привести к высокому фону13. Следует также избегать переэкспрессии в экспериментах BiFC, так как это может вызвать неспецифическую сборку14, что приводит к увеличению фона. Оба метода требуют оптимизации экспрессии и условий визуализации помеченных белков, что может продлить время, необходимое для завершения экспериментов.
Перегоняемая близость анализа (PLA) является альтернативным подходом, который может решить ограничения методов, упомянутых выше. НОАК использует первичные антитела, которые распознают белки, представляющие интерес (или их теги). Эти первичные антитела затем связаны вторичными антителами, содержащими олигонуклеотидные зонды, которые могут гибридизироваться друг с другом, когда в пределах 40 нм (или короче) расстояние15. В результате гибридизированная ДНК усиливается через реакцию ПЦР, которая обнаруживается зондами, которые дополняют ДНК. Это приводит к foci, которые визуализированы микроскопом. Эта технология может обнаружить ИЦП на месте в сложных тканях (т.е. червь гонад), который организован как сборочная линия, содержащая клетки на различных стадиях развития и дифференциации. С PLA, ИЦП могут быть непосредственно визуализированы в фиксированной гонад червя, что выгодно для расследования ли ИЦП происходят на определенном этапе развития. НОАК предлагает более четкое разрешение ИЦП в отличие от анализов на основе совместной локализации, что идеально подходит для проведения точных измерений. При использовании микроскопия сверхразрешения может обеспечить более подробную информацию о местонахождении очагов PLA в клетке. Еще одним преимуществом является то, что фокусы, возникающие в результате реакций НОАК, могут быть подсчитаны по рабочему процессу на основе анализа ImageJ, что делает этот метод количественным.
Семейство световых цепей dynein было впервые описано как подразделение динейнского моторного комплекса16 и предположило, что служит грузовым адаптером. С момента своего первого открытия, LC8 был найден в нескольких белковых комплексов в дополнение к динейн моторный комплекс17,18,19,20. Сканирование для белковыхпоследовательностей,которые содержат мотив взаимодействия LC819 предполагает, что LC8 может иметь много взаимодействий с широким спектром различных белков17,18,19,20,21,22. В результате, LC8 семейные белки в настоящее время считаются концентраторами, которые помогают содействовать сборке больших белковых комплексов19,,22, таких как сборки внутренне неупорядоченных белков21.
Один C. elegans LC8-семейный белок, динеин световой цепи-1 (DLC-1), широко выражается во многих тканях и не обогащается в конкретных подклеточных структурах23,24. Следовательно, выявление биологически значимых партнеров in vivo DLC-1 в C. elegans является сложной задачей по ряду причин: 1) совместное иммунопрецитность не указывает источник ткани, где происходит взаимодействие; 2) ограниченное выражение конкретных партнеров или переходных взаимодействий может препятствовать способности обнаруживать взаимодействие путем совместного иммунопреципции; и 3) диффуза распределения DLC-1 приводит к неспецифическому совпадению с потенциальными белками партнера путем совместного иммуносохранения. Основываясь на этих проблемах, PLA является идеальным подходом для тестирования взаимодействия in vivo с DLC-1.
Ранее сообщалось, что DLC-1 напрямую взаимодействует и служит кофактором для РНК-связывающих белков (RBPs) FBF-223 и GLD-125. Наша работа поддерживает модель DLC-1, выступающей в качестве концентратора белка и предполагает, что DLC-1 облегчает взаимодействие сети, которая охватывает за dynein19,22. Используя GST выпадение ассс, новый DLC-1-взаимодействующих RBP имени OMA-1 был определен26. OMA-1 имеет важное значение для роста яйцеклеток и мейотического созревания27 и функционирует в сочетании с рядом переводческих репрессаторов и активаторов28. В то время как FBF-2 и GLD-1 выражены в стволовых клетках и мейотических областях пахитена, соответственно, OMA-1 диффузно выражается в зародыше из мейотического пахитена через яоциты27 (Рисунок 1). Это говорит о том, что DLC-1 формирует комплексы с ОДП в разных регионах гонада. Было также установлено, что прямое взаимодействие между DLC-1 и OMA-1 наблюдается in vitro не восстанавливается in vivo IP. НОАК была успешно использована в качестве альтернативного подхода для дальнейшего изучения этого взаимодействия в Зародышевой линии C. elegans, и результаты показывают, что НОАК может быть использован для зондирования многих других ИЦП у червя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует штаммы C. elegans, в которых помечены потенциальные взаимодействующие партнеры. Настоятельно рекомендуется использовать отрицательный контрольный штамм, в котором один помеченный белок не должен взаимодействовать с другим помеченным партнером по взаимодействию кандидата. Здесь, GFP только был использован в качестве отрицательного контроля для оценки фона, как DLC-1 не ожидается, взаимодействовать с GFP в червя. В качестве экспериментального штамма использовалась пометка ГФП OMA-1, поскольку предварительные данные свидетельствуют о взаимодействии с DLC-1. Штаммы Nematode, совместно выражающие контроль и тестовые белки с 3xFLAG-тегами DLC-1, упоминаются в этом тексте как 3xFLAG::DLC-1; GFP и 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (напряжения доступны по запросу; более подробная информацияв таблице материалов), соответственно. Здесь используются теги 3xFLAG и GFP; однако, другие метки могут быть заменены до тех пор, пока их антитела совместимы с реагентами комплекта НОАК.
1. Уход за животными
- Держите червей на пластинах роста нематод (NGM), которые посеяны с штаммом OP50 кишечной палочки и поддерживать на уровне 24 градусов по Цельсию для оптимального выражения GFP.
- Проход взрослых червей каждые 2-3 дня для распространения червей и держать их сытыми.
2. Подготовка синхронной культуры
- Синхронизируйте червей, отбеливая тарелку сытых, гравидных гермафродитов. Протокол отбеливания описан в Porta-de-la-Riva et al.29. Пусть эмбрионы люк на ночь в центрифуге трубки при 24 градусах По Цельсию при повороте конца над концом в 10 мл M9 минимального медиа (M9) буфера. Это создасти культуру арестованных личинок L1.
- Инкубировать трубку арестованных личинок l1 стадии на льду в течение 10 минут, а затем довершение трубки с холодным 1x M9.
- Используйте центрифугу, чтобы гранулы личинки на 600 х г в течение 5 мин при 4 c. Тщательно аспирируйте супернатант так, чтобы оставалось только 1-2 мл супернатанта.
- Повторно приостановить гранулы личинок и использовать микропайпет для передачи 2 Зл подвесной культуры личинок на стеклянную горку. Подсчитайте, сколько личинок присутствуют, чтобы определить плотность культуры личинок, которые помогут направлять посев червей в шаге 2.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность 10-15 l1 личинок /1 Л хорошо работает для посева. - Используйте микропипетт для передачи объема культуры личинок, необходимых для семени примерно 100-120 L1 этап личинок на 60 мм OP50 пластины. Например, семена 10 зл культуры личинок, плотность которого составляет 10 l1 личинок/1 л культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышать объем 40 qL для семени личинок, или избыток жидкости будет нарушать OP50 газон. Если объем культуры превышает 40 кл,5, повторите шаги 2.3-2.4 для дальнейшего уменьшения объема и увеличения плотности культуры личинок. - Выращивайте червей при 24 градусах Цельсия. Запишите время, когда L1s посеяны на тарелке и периодически проверяйте стадию разработки, чтобы определить идеальное время для вскрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: На 52 h после посева L1s, черви культивируется на 24 КС, как правило, в стадии молодых взрослых, что является идеальной стадией для вскрытия для гонад-целевых PLA. Однако фактическое время, когда синхронизированные черви достигают стадии молодых взрослых, может варьироваться между штаммами и температурой инкубации.
3. Рассечение/гонадная экструзия
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение, чтобы выдыхать гонад, необходимо для того, чтобы PLA, нацеленная на гонад, успешно работала. Этот подход может также выпустить эмбрионы, которые также работают с использованием этого протокола для НОАК (см. Обсуждение для получения дополнительной информации). После вскрытия, как отрицательный контроль и экспериментальные образцы фиксируются и обрабатываются для НОАК вместе параллельно. Предлагается также подготовить дополнительный набор образцов для флуоресцентного коиммунотирования23 для демонстрации моделей экспрессии белковых партнеров, представляющих интерес.
- Выберите 30-40 молодых взрослых червей в стеклянную тарелку, содержащую 500 зл 1x M9 и левамизол (2,5 мМ конечной концентрации). После сбора червей, тщательно удалить и отбросить большинство средств массовой информации, чтобы удалить бактерии, которые передаются вместе с червями.
- Добавить в свежие 500 л л 1x M9 и levamisole и использовать пипетку, чтобы аккуратно составить и обойтись средства массовой информации для промывки червей. Тщательно удалить и отбросить большинство средств массовой информации, чтобы очистить бактерии, которые передаются вместе с червями.
- Повторите этот шаг 2x-3x, пока все бактерии не будут удалены. После стирки завершены, оставьте червей примерно в 100 л носителей, чтобы держать гидратированных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте червям сидеть в средствах массовой информации дольше, чем 7 мин, так как это ухудшит экструзию гонад во время вскрытия. Выполните стих под помощью рассекающего микроскопа для мониторинга удаления носителей, чтобы черви не терялись.
- Повторите этот шаг 2x-3x, пока все бактерии не будут удалены. После стирки завершены, оставьте червей примерно в 100 л носителей, чтобы держать гидратированных.
- Используя стеклянный или полиэтиленовый пипетка, перенесите червей на микроскоп 25 мм x 75 мм, покрытый 0,001% поли-л-лизином (слайды, используемые в этой процедуре, имеют эпоксидно-покрытый периметр, оставляя три рабочих места, 14 мм х 14 мм каждый). Удалите избыток носителей так, чтобы оставалось примерно 10-15 л носителей.
- Под помощью рассекающего микроскопа и с помощью двух игл калибровочных 261 х 2, поместите одну иглу над другой так, чтобы концы образуют ножницы. Используя иглы ориентированных таким образом, вырезать червей за глотки, чтобы освободить зародыши. Вскрыть все черви в течение 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о том, как выполнять вскрытия можно найти в предыдущей публикации Gervaise и Arur30. - После того, как все черви расчленены, аккуратно поместите 22 мм х 40 мм крышкой над слайдом так, чтобы он перпендикулярно слайду. Концы крышки должны свисать с слайда.
- Заморозить слайды на предварительно охлажденной алюминиевой блок поддерживается на сухом льду, по крайней мере 20 мин. Аккуратно поместите охлажденный карандаш на верхней части крышки, чтобы предотвратить coverslip стать свободным из-за расширения льда.
4. Фиксация/блокировка
- Когда готовы к фиксации, откинуть крышки с карандашом или другим тупым краем инструмент и немедленно окунуть слайд в банку, содержащую свежий, ледяной метанол (охлажденный до -20 градусов по Цельсию) в течение 1 мин.
- Аккуратно протрите края слайда, которые окружают образец, так что следующий реагент удерживается поверхностным натяжением вокруг образца. Нанесите 150 кл фиксатора (2% формальдегида в 100 мМ KH2PO4, рН 7,2) в течение 5 мин на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы также протестировали процедуру фиксации метанола/ацетона31,32 и обнаружили, что она совместима с реакцией НОАК. - Прикоснитесь к слайду с бумажным полотенцем под перпендикулярным углом 90 градусов, чтобы фиксатор убежал с горки и впитывался в бумажное полотенце. Блок слайды 2x в течение 15 минут на RT в коплин банку с 50 мл 1x PBS/1% Тритон X-100/1% бычьей сыворотки альбумина (PBT/BSA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Коплин банки или другие виды окрашивания банки рекомендуются для этого блокирующего шага и стирки шаги ниже в разделах 6-9. Они обеспечивают достаточные объемы для эффективного обмена блокированием или мытьем буфера с образцом. - Блок слайды с раствором PBT/BSA, содержащим 10% нормальную козью сыворотку. Аккуратно протрите края, которые окружают слайд и применить 100 зл и раствора на слайде. Инкубировать 1 ч на RT во влажной камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг настоятельно рекомендуется для окрашивания с первичными антителами ЗФЛАГ. Влажная камера построена путем обеспечения стеклянных пипетки с лентой в лоток для слайдов, чтобы лежать на, как они инкубируют. Смоченные салфетки задачи(Таблица материалов) помещаются в лоток, чтобы поднять внутреннюю влажность лотка, чтобы предотвратить испарение. Крышка и лоток покрыты фольгой, чтобы защитить образцы от света во время светочувствительных шагов. - Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы PBT/BSA/10%NGS решение убежать слайд и аккуратно протрите края слайда. Используйте блокирующий реагент(Таблица материалов) для блокирования слайдов. Нанесите одну каплю на пространство 14 мм x 14 мм. Инкубировать слайды для 1 ч при 37 градусах по Цельсию во влажной камере.
5. Первичная инкубация антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения лучших результатов НОАК и минимального фона, фактор разбавления первичных антител может потребовать оптимизации (подробнее см. Обсуждение). Кроме того, первичные антитела должны быть подняты в различных хостах, которые соответствуют специфике вторичных антител, используемых для НОАК.
- Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы блокирующий реагент убежал с горки и аккуратно протрите края. Используйте разбавитель антител(Таблица материалов)для разбавления первичных антител. Нанесите 40 зл первичного раствора антитела на 14 мм х 14 мм пространства.
- Инкубировать слайды во влажной камере на ночь при 4 градусах Цельсия.
6. Зонд НОАК (вторичное антитело) инкубации
ПРИМЕЧАНИЕ: Для шагов 6-9 используйте буферы для мытья A и B на RT. Если буферы хранятся при 4 градусах Цельсия, то дайте им подогреть RT перед использованием.
- Вымойте слайды 2x в течение 5 минут с 50 мл 1x мыть буфера А (Таблица материалов) на RT в банку Коплин. Установите банку Коплин на орбитальный шейкер установлен до 60 об /мин.
- Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы мыть буфер бежать слайд и осторожно протрите края. Подготовьте раствор 40 л, содержащий зонды PLUS и MINUS (разбавленные 1:5 с разбавителем антител). Нанесите раствор на каждый 14 мм х 14 мм пространства.
- Инкубировать слайды во влажной камере на 1 ч при 37 градусах Цельсия.
7. Лигация
- Вымойте слайды 2x в течение 5 минут с 50 мл 1x мыть буфера а на RT в банку Коплин. Установите банку Коплин на орбитальный шейкер установлен до 60 об /мин.
- Разбавить буфер перевязки(Таблица материалов) 1:5 с ультрачистой водой. Используйте этот буфер, чтобы разбавить лигазу(Таблица материалов) 1:40 для подготовки рабочего запаса раствора перевязки.
- Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы буфер для мытья убежал от горки и аккуратно протрите края. Нанесите 40 л раствора перевязки на каждый 14 мм х 14 мм пространства.
- Инкубировать слайды во влажной камере в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
8. Усиление
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование обнаружения реагентов с красными фторофорами(Таблица материалов) приводит к наименьшему количеству фона в ткани C. elegans.
- Вымойте слайды 2x в течение 5 минут с 50 мл 1x мыть буфера а на RT в банку Коплин. Установите банку Коплин на орбитальный шейкер установлен до 60 об /мин.
- Разбавить усиление красного буфера(Таблица материалов) 1:5 с ультрачистой водой. Используйте этот буфер, чтобы разбавить полимеразу(Таблица материалов) 1:80, чтобы подготовить рабочий запас раствора усиления и защитить от света.
- Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы буфер для мытья убежал от горки и аккуратно протрите края. Нанесите 40 зл имулятельного раствора на каждый 14 мм х 14 мм пространства.
- Инкубировать слайды во влажной камере в течение 1 ч и 40 мин при 37 градусах Цельсия. Убедитесь, что влажная камера покрыта фольгой, чтобы защитить образцы от света.
9. Окончательные смывы
- Вымойте слайды 2x в течение 10 минут с 50 мл 1x мыть буфер B (Таблица материалов) на RT в банку Коплин. Установите банку Коплин на орбитальный шейкер установлен до 60 об /мин.
- Вымойте слайды 1x в течение 1 мин с 50 мл 0,01x мыть буфер B на RT в банку Коплин. Установите банку Коплин на орбитальный шейкер установлен до 60 об /мин. Этот буфер готовится путем разбавления буфера для мытья B ультрачистой водой.
10. Монтаж coverslip
- Пусть избыточный буфер мытьбежать слайд на бумажное полотенце и стереть любой остаточный буфер, оставшийся на эпоксидно-покрытом периметре слайда.
- Добавьте 10 злителк монтажной среды(Таблица материалов)в образец и аккуратно положите наверх крышку, что позволит для монтажной среды распространиться.
- Краска вокруг края крышки с лаком для ногтей, чтобы запечатать coverslip и слайд. Будьте нежны с применением лака для ногтей, чтобы избежать перемещения coverslip, который повредит зародыши. Пусть лак для ногтей затвердеть, по крайней мере 20 мин на RT, в то время как слайды защищены от света, перед просмотром его под микроскопом.
- Храните слайды в темном контейнере или держателе слайда, так как образцы с маркировкой PLA светочувствительны. Производитель предлагает, чтобы слайды можно хранить при -20 градусов для длительного хранения или при 4 градусах Цельсия для кратковременного хранения. Слайды, подготовленные с помощью этого протокола, продлятся не менее 2 месяцев при хранении при 20 градусах Цельсия.
11. Приобретение изображений
- Для количественной оценки используйте конфокальный микроскоп для захвата изображений экструдированных зародышевых существ, которые находятся на ясном виду, неповреждены и беспрепятственны. Захват z-стек зародышевой линии, которая охватывает всю зародышную линию в z-плоскости и создайте максимальное проекционное изображение для использования для количественной оценки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальная микроскопия идеально подходит для получения и количественной оценки изображений PLA с меньшим фоном по сравнению с теми, которые получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.- Если зародышевая линия не вписывается в одно поле зрения, захватывайте перекрывающиеся поля зрения по мере необходимости для изображения всей зародышевой линии. Максимальные проекции этих изображений могут быть сшиты вместе в FIJI.
- Убедитесь в том, чтобы условия изображения были одинаковыми между контрольными и экспериментальными образцами, чтобы установить справедливый и надлежащий порог для идентификации очагов во время анализа изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запись по крайней мере 8-10 зародышевых линий из каждого образца на реплику для облегчения статистического анализа количественной оценки НОАК. По крайней мере три биологические репликации рекомендуется для НОАК для получения надежных и последовательных количественных результатов.
12. Анализ изображений и количественная оценка с использованием FIJI/ImageJ
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий рабочий процесс основан на изображениях, полученных с помощью 40x цели на конфокальном микроскопе, в котором изображения сохраняются в формате .czi. Эти изображения .czi и сопровождающие их метаданные, включая размеры, могут быть доступны и открыты в FIJI/ImageJ для дальнейшего анализа. Следует проверить, принимает ли FIJI формат конфокальных файлов из конфокального файла, доступного конкретному пользователю. Если нет, то изображения в формате .tiff могут быть использованы в качестве альтернативы для анализа, но пользователю необходимо установить масштаб изображения вручную в FIJI/ImageJ (Анализ Установить масштаб). Рекомендуется сначала проанализировать все отрицательные контрольные изображения, чтобы установить уровень фона.
- Начните процесс анализа, сначала проанализировав все отрицательные контрольные изображения, а затем перейдите к экспериментальным образцам. Откройте максимальное проекционное изображение в FIJI/ImageJ для анализа(рисунок 2A). При использовании файла .czi будет предложено поле для опций импорта Bio-Formats.
- Включите следующие варианты, чтобы открыть изображение: просмотреть стек с data Browser; цветовой режим - Цветные. Окно с изображением теперь должно открываться с помощью панели слайдов для переключения между различными каналами, захваченными confocal (например, DAPI или PLA).
- Если изображения должны быть сшиты, создайте дубликаты каждого канала с каждого изображения, правильно выбрав изображение с помощью мыши и выбрав Duplicate, чтобы открыть дубликат окна. Укажите только номер канала (c), который соответствует каналу PLA или DAPI (например, 2)и отоверьте поле для Duplicate Hyperstack.
- С обоими изображениями, которые будут сшиты открытыми, выберите Плагины Сшивание Обеззараженный 2D сшивание. Откроется окно 2D-изображений. Выберите, какие изображения будут использоваться для сшивания, и используйте параметры по умолчанию, которые установлены в окне, а затем выберите Ok. Полученное изображение будет собрано серого изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если подизображения не идеально выравниваются, регулировка параметров (т.е. увеличение количества пиков, которые должны быть проверены с 5 до 500 или изменение метода синтеза от линейного смешивания до Макса. Интенсивность) может помочь получить желаемое изображение. В то время как другие инструменты сшивания доступны, этот подход сохраняет размерность изображения, что важно для количественной оценки.
- Откройте рентабельность инвестиций (регион интересов), нажав T на клавиатуре. Откроется новое окно под названием ROI Manager.
- Выберите инструмент полигона из коробки инструментов FIJI. Падение точек вокруг зародышевой линии, чтобы наметить его и генерировать рентабельность инвестиций(Рисунок 2B). Подключите последнюю точку к первой для создания полной рентабельности инвестиций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более темных изображений, полезно настроить контраст для улучшения видимости зародышевой линии (которая обратима), так что она может быть изложена более точно.- Сразу же после завершения рентабельности инвестиций, перейдите к менеджеру roI и выберите Добавить для хранения рентабельности инвестиций. Крайне важно, чтобы любые изменения в рентабельности инвестиций, включая добавление/удаление точек или движения рентабельности инвестиций и точек, обновлялись (выберите обновление от менеджера roI), прежде чем перейти к следующему шагу, иначе они будут потеряны. Более подробную информацию о манипуляциях с рентабельностью инвестиций и их точках можно найти в руководстве пользователя FIJI/ImageJ.
- После установки ориентации ROI она может быть сохранена для последующей ссылки, выбрав имя рентабельности инвестиций в менеджере ROI, за которым следует More Сохранить (англ.) (файл имени и указать пункт назначения, где сохранить). Сохраненные roIs могут быть открыты в roI менеджера, выбрав Подробнее Открыто (ru) (выберите файл).
- Измерьте область внутри рентабельности инвестиций, выбрав название roI от менеджера ROI, а затем выберите кнопку Измерения на менеджере ROI. Окно результатов откроется с информацией о рентабельности инвестиций, включая область, которую она охватывает на изображении (мМ2) (врез рисунка 2B). Запись этой информации в электронной таблице для последующих вычислений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что масштаб изображения был установлен должным образом, так что правильные размеры рентабельности инвестиций собираются. Типы измерений, зарегистрированных в поле Результатов, могут быть изменены, перейдя на анализ Набор измерений.... - Откройте дубликат изображения только канала PLA, правильно выбрав изображение PLA и выбрав Duplicate (рисунок 2C). Откроется двойное окно. Укажите только номер канала (c), который соответствует каналу PLA (например, 2) и отоверьте поле для duplicate Hyperstack. Дублирование этого изображения рекомендуется таким образом, чтобы исходное изображение не было изменено.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры будут отображаться только при просмотре изображений, содержащих несколько каналов на FIJI/ImageJ. Альтернативный подход заключается в разделении каналов Изображение Цветовая гамма Разделите каналы,но это изменит исходный файл изображения. - С только изображением канала PLA выбрано, перейдите к изображению Отрегулируйте (англ.) Пороговый . Откроется пороговое окно для изображения. Выберите по умолчанию в качестве порогового метода, красный цвет, и проверьте темный фон овый ящик. Используя верхний трек на окне, сдвиньте планку вправо до тех пор, пока все фокусы PLA не будут четко выделены на изображении.
- Запишите значение в поле справа от верхней дорожки и обратите внимание на то, какое значение было использовано для установки порога. Выберите Применить в окне порога для завершения порога, и изображение будет конвертироваться в белый фон только с пороговым фоком видны как черные точки(рисунок 2D). Проверьте порог на нескольких отрицательных контрольных изображениях, чтобы убедиться, что он подходит для захвата всех фокусов PLA от изображения к изображению до количественной оценки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для просмотра пороговых очагов в виде черных точек на белом фоне, перейдите к процессу Двоичные Варианты... и отменить черный фон окно. Пороговое значение между 30-40 является хорошей отправной точкой для выявления PLA в зародышевой линии; однако, идеальное значение может варьироваться в зависимости от фона.
- Запишите значение в поле справа от верхней дорожки и обратите внимание на то, какое значение было использовано для установки порога. Выберите Применить в окне порога для завершения порога, и изображение будет конвертироваться в белый фон только с пороговым фоком видны как черные точки(рисунок 2D). Проверьте порог на нескольких отрицательных контрольных изображениях, чтобы убедиться, что он подходит для захвата всех фокусов PLA от изображения к изображению до количественной оценки.
- Для количественной оценки foci PLA примените рентабельность инвестиций, генерируемую от шагов 12.3-12.3.1 к изображению порога, выбрав имя рентабельности инвестиций из окна менеджера ROI. Контур рентабельности инвестиций должен отображаться на изображении в том же месте, что и на исходном изображении(рисунок 2E).
- Перейти к анализу Анализ частиц. Окно Анализ частиц откроется и выберет следующие параметры: размер (микрон-2) - 0-Бесконечность, круговость 0,00-1,00, шоу . Проверьте окно Суммировать.
- Выберите Ok, и Резюме таблица появится с информацией о рентабельности инвестиций (т.е. общее количество foci PLA, общая площадь, занимаемая ПЛАКов внутри в рентабельности инвестиций, средний размер foci PLA, и процент площади, занимаемой ПЛААК foci относительно размера рентабельности инвестиций) (вставка рисунок 2E). Запись этих измерений в электронной таблице.
- Повторите шаги 12.1-12.8 для нескольких отрицательных контрольных изображений с использованием одного и того же порога.
- После анализа всех отрицательных контрольных изображений повторите шаги 12.1-12.8 для всех экспериментальных образцов с использованием того же порога, который был определен отрицательным контролем для выявления и количественной оценки foci PLA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Совместное иммуносирование обоих 3xFLAG::DLC-1; GFP и 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP зародышевые линии с антителами FLAG и GFP показали свои модели экспрессии в зародышевой линии(Рисунок 3Aii-iii,3Bii-iii). В то время как GFP был выражен по всей зародыше(Рисунок 3Aiii), OMA-1::GFP выражение было ограничено конце pachytene и яйцеклетки (Рисунок 3Biii)27. FLAG иммуностоинга показывает, что 3xFLAG::DLC-1 был выражен по всей зародышей в обоих штаммов (Рисунок 3Aii,3Bii). По совместному иммуносточингии, перекрытие между 3xFLAG::DLC-1 и OMA-1::GFP неотличимо от 3xFLAG::DLC-1 и GFP (отрицательный контроль).
Так как эти эксперименты, проверенные для взаимодействия между DLC-1 и OMA-1, область интереса для ноквы оценки в зародыше охватывает поздний pachytene через ооциты во всех зародышевых исследуемых (Рисунок 2B), так как это область выражения OMA-1 (Рисунок 1, Рисунок 3Biii). 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP зародышевые линии, как представляется, большее количество ПЛАА тихих в этом регионе по сравнению с 3xFLAG::DLC-1; GFP зародышевые(Рисунок 3Ciii-iv,3Diii-iv). Количественная оценка НОАК показала, что количество очагов НОАК, присутствующих в 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP зародышевые линии были значительно больше, чем 3xFLAG::DLC-1; GFP(рисунок 3Ciii-iv,3Diii-iv; Таблица 1). Кроме того, даже при 10-x более высоком разбавлении антител GFP и FLAG разница между контрольным и экспериментальным НОАК по-прежнему существенно отличалась; однако общая плотность и средний размер очагов были уменьшены(таблица 1).
Рисунок 1: Схема C. elegans зародышевой линии. Дистальная область наконечника содержит пул стволовых клеток, за которым следует мейотический пахитен, где клетки перешли от митоза к мейозу. Клетки, которые выходят из мейотического пахитена, превращаются в яйцеклетки, с наиболее зрелыми яйцеклетки на проксимальном конце. Область, затененные зеленым цветом, который простирается от позднего мейотического пахитена через все ооциты, представляет собой шаблон выражения OMA-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения рабочего процесса для количественной оценки зародышевой линии PLA. Зародышевая линия, используемая в этой цифре, является репрезентативной 3xFLAG::DLC-1; GFP зародышевой линии с рисунка 3C. (A) Изображение объединенных каналов PLA и DAPI открылось в FIJI/ImageJ. (B) Инструмент полигона в FIJI использован для того чтобы конспектировать и определить зону интереса (ROI) в зародышевой линии (желтой линии с белыми коробками) которая поддается количественной оценке, и зона ROI (м/м2) измерена (вставка b). (C) Одно изображение канала PLA получено путем дублирования или разделения исходного изображения в (A,B). (D) Порог тщательно устанавливается, чтобы четко выделить все фокусы PLA на изображении PLA. Один и тот же порог должен быть применен ко всем экспериментальным и контрольным изображениям, которые будут проанализированы вместе. (E) С рентабельностью, выбранной на пороговом изображении, функция Анализ частиц вернет таблицу результатов, которая включает общее количество фокусов, включенных в рентабельность инвестиций (всет E). Изображения — это снимки с фиджи/Изображения J: Плагины Коммунальные услуги Захват изображения. Шкала баров No 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения зародышей после совместного иммуносохранения или НОАК. (A, B) Модели выражения помеченных белков в 3xFLAG::DLC-1; GFP (Ай-ив) и 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (Bi-iv) оценивались в вскрытых, фиксированных и иммуноокрашенных гонадах. Анти-FLAG антитела были использованы на 1:1000 разбавления, в то время как анти-GFP антитела были использованы на 1:200 разбавления, который является оптимальным для иммунофлуоресценции изображений. ДНК была окрашена DAPI, и отдельный канал показан в сером масштабе для лучшего контраста(Aiv, Biv). На каждом изображении стволовые клетки и мейотический пахитен очерчены пунктирными линиями, в то время как ооцитнные ооцится пунктирными линиями. Изображения были получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Шкала баров No 10 мкм. (C,D) PLA в экструдированных 3xFLAG::DLC-1; GFP (C) и 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (D) гонады. Анти-FLAG антитела были использованы на 1:1000 разбавления, в то время как анти-GFP антитела были использованы на 1:4000 разбавления. ДНК была запятнана DAPI, и как отдельные DAPI (Cii, Dii) и НОАК каналов (Ciii, iv, Diii,iv) показаны в greyscale для лучшего контраста. Зеленый, пунктирной коробке (Ciii,Diii) обозначает расположение увеличенных в НОАК изображений (Civ, Div). На каждом изображении стволовые клетки и мейотический пахитен очерчены пунктирными линиями, в то время как ооцитнные ооцится пунктирными линиями. Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа. Шкала баров No 10 мкм. (A,B,C,D) все были собраны с программным обеспечением обработки изображений (см. Таблица материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Разбавление антител | Штамм Испытано | Средняя плотность PLA (foci/мкм2) X 10-2 | T-тест | Средний размер ПЛААЗа Foci (ММ2) | T-тест |
| ЗФЛАГ (1:1000), ГФП (1:4000) | 3xFLAG::DLC-1; Gfp | 3,9 и 1,4 | P 1.917E-05 | 0,52 х 0,127 | P 0,057 |
| 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP | 9,1 и 2,7 | 1,8 и 2,08 | |||
| ЗФЛАГ (1:10 000), ГФП (1:40 000) | 3xFLAG::DLC-1; Gfp | 3,2 и 2,4 | P 3.395E-04 | 0,51 и 0,1 | P 0,019 |
| 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP | 7,7 х 3 | 0,7 и 0,24 |
Таблица 1: Резюме результатов НОАК. Таблица отчетности резюме НОАК количественной оценки на два разбавления первичных антител. Различия в средней плотности НОАК или средний размер фоци НОАК для OMA-1::GFP между титрованиями обоих антител не были значительными (p-значение не показано). Такое же сравнение было применено и к GFP, что также не привело к существенной разнице (p-значение не показано). P-значения определялись с помощью двуххвостого/равного дисперсии t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При изучении ИЦП в зародышевой линии C. elegans более высокое разрешение, предлагаемое PLA, по сравнению с коиммуностоированием, позволяет визуализировать и количественно оценивать места, где взаимодействия происходят в зародышевой линии. Ранее сообщалось, что DLC-1 напрямую взаимодействует с OMA-1, используя анализ выпадения в пробирке GST26; однако, это взаимодействие не было восстановлено в in vivo вытягивании. флуоресцентное коиммуноирование 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP зародышевые линии показывают совпадение в шаблонах выражения для DLC-1 и OMA-1; однако, нет никаких указаний на то, где их взаимодействия происходят в зародышевой линии, и само перекрытие не больше, чем между 3xFLAG::DLC-1 и GFP, который не сливается с любым белком (отрицательный контроль). Используя in situ PLA, было установлено, что DLC-1 действительно взаимодействует с OMA-1 в зародышевой линии, что позволяет предположить, что НОАК может быть более чувствительной для обнаружения ИЦП по сравнению с другими подходами. Благодаря этому подходу мы продолжаем расширять сяочнную роль DLC-1 как кофактора RBP. Эта работа демонстрирует способность НОАК обнаруживать ИЦП в зародышевой линии и устанавливает ссылку для будущих пользователей, исследующих взаимодействие между белками, представляющими их собственный интерес.
PLA предлагает пользователям возможность тестирования на ИЦП с сопоставимой чувствительностью без недостатков, связанных с другими методами, такими как FRET и BiFC. Биологически соответствующие уровни экспрессии белка могут быть неоптимальными для FRET и BiFC. Кроме того, на функцию потенциальных партнеров по взаимодействию могут влиять большие метки, используемые в обоих подходах. Кроме того, анализы FRET требуют специализированной микроскопии настройки, которые могут быть недоступны. НОАК также может быть экономически эффективным подходом к изучению ИЦП по сравнению с другими методами. Пользователям только нужно получить РЕагенты PLA и доступ к конфокальный микроскоп для визуализации в дополнение к реагентам, необходимым для иммуносохранения. Анализ изображений проводится с помощью программы с открытым исходным кодом FIJI/ImageJ, которая доступна любому пользователю бесплатно. Пользователи, не имеюющие опыта работы с FRET или BiFC, могут найти PLA подходящей альтернативой. Представленный здесь протокол содержит лишь несколько дополнительных шагов, выходящих за рамки типичной процедуры иммуносохранения, что делает этот метод практически доступным для любого пользователя с иммунодефицитным опытом.
Экструзия гонада путем вскрытия имеет важное значение для PLA успешно работать. Ткани, которые сохраняются внутри кутикулы червя, не помечены PLA с помощью этого протокола. Кроме того, было установлено, что экструдированные эмбрионы фактически обозначены этим протоколом НОАК. Это говорит о том, что другие ткани, которые высвобождаются во время вскрытия, такие как кишечник, также могут быть совместимы с НОАК. Было установлено, что PLA производит надежные сигналы на гонад, а также эмбрионобразцов, подготовленных с двумя протоколами фиксации, которые часто используются для иммуно-стабилизируется. Это говорит о том, что дополнительные процедуры фиксации, используемые в полевых условиях, могут быть совместимы с НОАК, но должны быть индивидуально оценены пользователем.
Определение оптимального разбавления первичных антител имеет решающее значение для успешного НОАК. Лучше всего начать с разбавления, который был оптимизирован для иммунофлуоресценции. Это, как правило, достигается путем титрирование первичных антител в эксперименте иммунофлуоресценции, чтобы найти оптимальное разбавление, где есть низкий фон и высокий, конкретный сигнал. После того, как оптимальные разбавления для иммунофлуоресценции были установлены, эти же разбавления могут быть проверены в анализе PLA, который сравнивает сигнал, производимый парой потенциальных взаимодействующих с сигналом, производимым контрольной парой не взаимодействующих белков.
В случае, когда в контрольном образце наблюдается обильный сигнал, требуется дальнейшее разбавление первичных антител. Было установлено, что оптимальные первичные разбавления антител для PLA, по крайней мере же или даже более разбавленным, чем то, что используется для иммунофлуоресценции. Например, изображения иммунофлуоресценции на рисунке 3A,B являются репрезентативными для разбавления анти-FLAG 1:1000 и 1:200 разбавления анти-ГФП. Тем не менее, разбавления антител на изображениях НОАК на рисунке 3C,D были 1:1000 анти-FLAG и 1:4000 анти-GFP. Разбавление анти-GFP антитела, используемые в НОАК больше, чем то, что было использовано для иммунофлуоресценции, предполагая, что НОАК является гораздо более чувствительным. Было установлено, что разбавление антител в 10 раз в дальнейшем привело к снижению плотности НОАК, а также размер DLC-1/OMA-1 foci (Таблица 1). Несмотря на это сокращение, разница в плотности НОАК между отрицательным контролем и DLC-1/OMA-1 по-прежнему существенно отличалась. Это говорит о том, что НОАК по-прежнему очень чувствительна с более высоким разбавлениями первичных антител; однако распространенность обнаруживаемых взаимодействий будет недооценена.
В отличие от этого, слишком низкий разбавления антител может иметь два вида пагубных последствий. Во-первых, он может производить значительный фоновый сигнал в отрицательном контроле. Во-вторых, foci PLA, производимые белками взаимодействующих партнеров, могут сливаться и перекрываться, что затрудняет их разрешение на максимальном проекционном изображении. Это приводит к недооценке числа и плотности фокусов НОАК при анализе изображений. Сигнал НОАК представляет собой баланс обнаружения фиктивной близости между невзаимодействующими партнерами и обнаружения каждого экземпляра реальных ИЦП, которые встречаются в выборке. В результате, включение отрицательного контроля, где два белка не взаимодействуют имеет важное значение для определения уровня фона в экспериментах НОАК. Упущение первичного антитела в эксперименте НОАК было использовано в качестве отрицательного контроля в других докладах9,10; однако этот подход не может учитывать неспецифические взаимодействия или неспецифические связывания антител, которые могут повлиять на результат экспериментальной НОАК. GFP использовался здесь в качестве отрицательного контроля, поскольку прямого взаимодействия между DLC-1 и GFP не ожидалось. Выяснилось, что отрицательный контроль действительно имел некоторый фоновый сигнал. Это также подтверждает важность отрицательного контроля для анализа НОАК при оценке экспериментальных данных.
Как только PLA-оптимизированные разбавления установлены, эти разбавления можно использовать для того чтобы испытать через блок по-разному различных штаммов червя которые содержат по-разному пары соучастников взаимодействия маркированных с такими же тегами сродства. Важно использовать ту же пару первичных антител, чтобы обеспечить справедливое сравнение результирующих сигналов PLA, так как изменение сродства антител может повлиять на результат эксперимента PLA. Другой доклад о НОАК предлагает оптимизацию разбавления вторичных антител НОАК10; однако, это не рекомендуется. Более высокие разбавления вторичных антител могут снизить эффективность других шагов ВНИЗ по течению НОАК, которые зависят от распознавания зондов PLUS и MINUS, которые спрягаются к вторичным антителам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Некоторые штаммы нематод, используемые в этом исследовании, были предоставлены Центром генетики Канеорхаблита, финансируемым NIH (P40OD010440). Конфокальная микроскопия была проведена в Университете Монтаны BioSpectroscopy Core Research Laboratory работал при поддержке NIH Награды P20GM103546 и S10OD021806. Эта работа была частично поддержана грантом NIH GM109053 для E.V., Стипендией Американской ассоциации сердца 18PRE34070028 до X.W., и Монтана Академия наук награда XW. Спонсоры не участвовали в разработке исследования или написании доклада. Мы благодарим М. Элленбекера за обсуждение.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
| 1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
| 1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
| 1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
| 26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
| BSA | Lampire | 7500802 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
| Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
| Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
| Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
| Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
| DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
| Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
| Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
| Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
| MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
| PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
| Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
| Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
| Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
| Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
| Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
| Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
| Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
| Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
| Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
| Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
| Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
| Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
| Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
| Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
| Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
| Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
| task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4x8.4 inch task wipes |
| Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
| Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
| Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
| Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
| -20 °C freezer | |||
| -80 °C freezer | |||
| Aluminum Foil | |||
| OP50 strain E. coli | |||
| Orbital Shaker | |||
| Tape | |||
| Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
| mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
| mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Nooren, I. M., Thornton, J. M.
- Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H.
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807 (2010).
- Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).
- Nousch, M., Eckmann, C. R. Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Wang, S., et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (95), 52139 (2015).
- Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).
- Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45 (3), 185-191 (2008).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains. Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).
- Erdős, G., et al. Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway. PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885 (2017).
- Navarro-Lérida, I., et al. Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8. Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).
- Rapali, P., et al. DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond. FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).
- Rapali, P., et al. Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS One. 6 (4), e18818 (2011).
- Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).
- Jespersen, N., et al. Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8. Life Science Alliance. 2 (4), (2019).
- Wang, X., et al. Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells. Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).
- Dorsett, M., Schedl, T. A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).
- Ellenbecker, M., et al. Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).
- Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation. FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).
- Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans. Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).
- Spike, C. A., et al. Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Duerr, J. S. Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking". Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Crittenden, S., Kimble, J. Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).
