Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

I Situ Påvisning av Ribonucleoprotein Complex Assembly i C. elegans Germline ved hjelp av nærhetligation analyse

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60982
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, University of Montana

Summary

Denne protokollen demonstrerer bruk av nærhetligation analyse for å sonde for protein-protein interaksjoner in situ i C. elegans germline.

Abstract

Å forstå når og hvor proteinproteininteraksjoner (PPIer) oppstår er avgjørende for å forstå proteinfunksjon i cellen og hvordan bredere prosesser som utvikling påvirkes. Caenorhabditis elegans germline er et flott modellsystem for å studere PPIer som er relatert til regulering av stamceller, meiose og utvikling. Det finnes en rekke velutviklede teknikker som gjør at proteiner av interesse kan merkes for anerkjennelse av standard antistoffer, noe som gjør dette systemet fordelaktig for nærhetligation analyse (PLA) reaksjoner. Som et resultat er PLA i stand til å vise hvor PPIer forekommer på en romlig og temporal måte i bakterier mer effektivt enn alternative tilnærminger. Beskrevet her er en protokoll for anvendelse og kvantifisering av denne teknologien for å sondere PPIer i C. elegans germline.

Introduction

Over 80% av proteiner er anslått å ha interaksjoner med andre molekyler1, noe som understreker hvor viktig PPI er for utførelsen av spesifikke biologiske funksjoner i celle2. Noen proteiner fungerer som huber som letter montering av større komplekser som er nødvendige for celleoverlevelse1. Disse hubene medierer flere PPI-er og bidrar til å organisere proteiner i et nettverk som letter bestemte funksjoner i en celle3. Dannelse av proteinkomplekser påvirkes også av biologisk kontekst, for eksempel tilstedeværelse eller fravær av spesifikke interagerende partnere4,cellesignalhendelser og utviklingsstadium av en celle.

C. elegans brukes ofte som modellorganisme for en rekke studier, inkludert utvikling. Den enkle anatomien til dette dyret består av flere organer, inkludert gonad, tarm og gjennomsiktig skjellaget, noe som letter analysen av ormutvikling. Germline bosatt i gonad er et flott verktøy for å studere hvordan germline stamceller modnes til gametes5 som utvikler seg til embryoer og til slutt neste generasjon av avkom. Den distale spissen i germline inneholder et utvalg av selvfornyende stamceller (Figur 1). Som stamceller forlate nisje, de utvikler seg inn i meiotic pachytene og til slutt utvikle seg til oocytes i den unge voksne scenen (Figur 1). Dette utviklingsprogrammet i germline er tett regulert gjennom ulike mekanismer, inkludert et post-transkripsjonsbasert regulatorisk nettverk tilrettelagt av RNA-bindende proteiner (RbPs)6. PPI er viktig for denne regulatoriske aktiviteten, da RBPs forbinder med andre faktorer for å utøve sine funksjoner.

Det er flere tilnærminger som kan brukes til å sonde for PPI er i ormen, men hver har unike begrensninger. In vivo immunoprecipitation (IP) kan brukes til å isolere protein-protein komplekser fra hele orm ekstrakter; Denne tilnærmingen angir imidlertid ikke hvor PPI forekommer i ormen. I tillegg kan proteinkomplekser som er forbigående og bare dannes under et bestemt utviklingsstadium eller i et begrenset antall celler, være vanskelig å gjenopprette ved ko-immunnedbør. Til slutt må IP-eksperimenter ta opp bekymringene til proteinkompleks resortiment etter lysis og ikke-spesifikk oppbevaring av proteiner på affinitetsmatrisen.

Alternative tilnærminger for in situ påvisning av PPI er co-immunostaining, Förster resonans energioverføring (FRET), og bimolekylær fluorescens komplementering (BiFC). Ko-immunostaining er avhengig av samtidig påvisning av to proteiner av interesse i fast ormvev og måling av omfanget av signalkolokalisering. Bruk av superoppløsningsmikroskopi, som gir større detaljer enn standard mikroskopi7,bidrar til å strengere teste proteinkolokalisering utover diffraksjonsbegrenset barriere på 200-300 nm8. Co-immunostaining ved hjelp av både konvensjonell og superoppløsningsmikroskopi fungerer imidlertid best for proteiner med veldefinerte lokaliseringsmønstre. Derimot blir det mye mindre informativt for diffust distribuerte samhandlende partnere. Måling for samlokalisering av signaler basert på overlapping gir ikke nøyaktig informasjon om proteinene er i kompleks med hverandre9,10.

Videre er co-immunnedbør og co-immunostaining av protein-protein komplekser ikke kvantitative, noe som gjør det utfordrende å avgjøre om slike interaksjoner er betydelige. FRET og BiFC er begge fluorescerende teknikker. FRET er avhengig av merking av proteiner av interesse med fluorescerende proteiner (FPs) som har spektral overlapping der energi fra en FP (donor) overføres til en annen FP (acceptor)11. Denne ikke-bestrålte overføringen av energi resulterer i fluorescens av acceptor FP som kan oppdages ved sin respektive bølgelengde av utslipp. BiFC er basert på rekonstituering av et fluorescerende protein in vivo. Det innebærer å dele GFP i to komplementære fragmenter, som helices 1-10 og helix 1112, som deretter smeltes sammen til to proteiner av interesse. Hvis disse to proteinene samhandler, blir de komplementære fragmentene av GFP nær nok i nærheten av å brette og montere, rekonstituere GFP-fluorofanen. Rekonstituert GFP observeres deretter direkte som fluorescens og indikerer hvor en PPI har oppstått.

Som sådan er både FRET og BiFC avhengige av store fluorescerende koder som kan forstyrre funksjonen til det kodede proteinet. I tillegg krever FRET og BiFC rikelig og sammenlignbart uttrykk for de kodede proteinene for å oppnå nøyaktige data. FRET er kanskje ikke egnet for eksperimenter der en partner er i overkant av den andre, noe som kan føre til høy bakgrunn13. Overuttrykk i BiFC eksperimenter bør også unngås, da dette kan indusere uspesifikk montering14 som resulterer i økt bakgrunn. Begge teknikkene krever optimalisering av uttrykk og bildebehandlingsforhold for de merkede proteinene, noe som kan forlenge tiden som kreves for å fullføre eksperimenter.

Nærhetsanalysen (PLA) er en alternativ tilnærming som kan adressere begrensningene i teknikkene nevnt ovenfor. PLA utnytter primære antistoffer som gjenkjenner proteiner av interesse (eller deres koder). Disse primære antistoffene er deretter bundet av sekundære antistoffer som inneholder oligonucleotide prober som kan hybridisere med hverandre når innenfor en 40 nm (eller kortere) avstand15. Det resulterende hybridiserte DNA forsterkes gjennom en PCR-reaksjon, som oppdages av sonder som utfyller DNA. Dette resulterer i foci som visualiseres av et mikroskop. Denne teknologien kan oppdage PPI-er in situ i komplekse vev (dvs. ormen gonad), som er organisert som en samlebånd som inneholder celler på ulike stadier av utvikling og differensiering. Med PLA kan PPI-er visualiseres direkte i en fast ormgonad, noe som er en fordel for å undersøke om PPI-er forekommer under et bestemt utviklingsstadium. PLA tilbyr større oppløsning av PPI-er i motsetning til co-lokalisering-baserte analyser, som er ideell for å gjøre nøyaktige målinger. Hvis den brukes, har mikroskopi med superoppløsning potensial til å gi finere detaljer om plasseringen av PLA-foci i en celle. En annen fordel er at foci som følge av PLA reaksjoner kan telles av en ImageJ-basert analyse arbeidsflyt, noe som gjør denne teknikken kvantitativ.

LC8-familien av dyneinlyskjeder ble først beskrevet som en underenhet av dyneinmotorkomplekset16 og hypotetisk for å fungere som en lastadapter. Siden den første oppdagelsen har LC8 blitt funnet i flere proteinkomplekser i tillegg til dyneinmotorkomplekset17,18,19,20. Skanning etter proteinsekvenser som inneholder LC8 interaksjonsmotivet19 antyder at LC8 kan ha mange interaksjoner med et bredt spekter av forskjellige proteiner17,,18,,19,,20,21,22. Som et resultat anses LC8-familieproteiner nå som knutepunkter som bidrar til å fremme montering av større proteinkomplekser19,22, for eksempel samlinger av iboende uordenproteiner21.

En C. elegans LC8-familie protein, dynein lyskjede-1 (DLC-1), er mye uttrykt over mange vev og ikke beriket i spesifikke subcellulære strukturer23,24. Følgelig er identifisering av biologisk relevante in vivo partnere av DLC-1 i C. elegans utfordrende av en rekke grunner: 1) co-immunoprecipitation indikerer ikke vevskilden der interaksjonen oppstår; 2) begrenset uttrykk for bestemte partnere eller forbigående interaksjoner kan hindre evnen til å oppdage en interaksjon ved co-immunnedbør; og 3) diffus fordeling av DLC-1 fører til ikke-spesifikk overlapping med potensielle partnerproteiner ved ko-immunfarging. Basert på disse utfordringene er PLA en ideell tilnærming for testing av vivo-interaksjoner med DLC-1.

Det har tidligere blitt rapportert at DLC-1 samhandler direkte med og fungerer som en kofaktor for RNA-bindende proteiner (RBPs) FBF-223 og GLD-125. Vårt arbeid støtter modellen av DLC-1 som fungerer som et hubprotein og antyder at DLC-1 letter et interaksjonsnettverk som strekker seg utover dynein19,22. Ved hjelp av en GST pulldown analyse, en ny DLC-1-samhandlende RBP kalt OMA-1 har blitt identifisert26. OMA-1 er viktig for oocyte vekst og meiotisk modning27 og funksjoner i forbindelse med en rekke translasjonelle undertrykkere og aktivatorer28. Mens FBF-2 og GLD-1 uttrykkes i stamceller og meiotiske pachytene-regioner, er OMA-1 diffust uttrykt i kimlinjen fra den meiotiske pachytene gjennom oocytes27 (Figur 1). Dette tyder på at DLC-1 danner komplekser med RBPs i forskjellige regioner av gonad. Det har også blitt funnet at den direkte interaksjonen mellom DLC-1 og OMA-1 observert in vitro ikke gjenopprettes av en in vivo IP. PLA har blitt brukt som en alternativ tilnærming til videre studier av denne interaksjonen i C. elegans germline, og resultatene tyder på at PLA kan brukes til å sondere mange andre PPIer i ormen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Denne protokollen bruker C. elegans stammer der potensielle samhandlende partnere er begge merket. Det anbefales sterkt at en negativ kontrollbelastning brukes, der ett merket protein ikke forventes å samhandle med en annen merket kandidatinteraksjonspartner. Her ble GFP alene brukt som en negativ kontroll for å vurdere bakgrunn, da DLC-1 ikke forventes å samhandle med GFP i ormen. GFP-merket OMA-1 ble brukt som eksperimentell belastning, da foreløpige data tyder på en interaksjon med DLC-1. Nematode stammer co-uttrykke kontroll og test proteiner med 3xFLAG-merket DLC-1 er referert til i denne teksten som 3xFLAG::DLC-1; GFP og 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (stammer tilgjengelig på forespørsel; mer informasjon i materialtabellen),henholdsvis. Her brukes 3xFLAG- og GFP-kodene; Andre koder kan imidlertid erstattes så lenge antistoffene deres er kompatible med PLA-settreagenserne.

1. Dyrepleie

  1. Hold ormer på nematodevekstmedium (NGM) plater som seedes med OP50-stammen av E. coli og vedlikehold ved 24 °C for optimal uttrykk for GFP.
  2. Passage voksen ormer hver 2-3 dager for å forplante ormer og holde dem godt matet.

2. Utarbeidelse av synkron kultur

  1. Synkroniser ormer ved å bleke en tallerken med velfødde, gravid hermafroditter. En bleking protokoll er beskrevet i Porta-de-la-Riva et al.29. La embryoene klekkes over natten i et sentrifugerør ved 24 °C mens de roterer ende over ende i 10 ml M9 minimalt mediet (M9) buffer. Dette vil produsere en kultur av arresterte L1 larver.
  2. Inkuber røret av arresterte L1 scenen larver på is i 10 min, deretter topp av røret med iskald 1x M9.
  3. Bruk en sentrifuge for å pellet larver på 600 x g i 5 min ved 4 °C. Aspirere forsiktig supernatanten slik at bare 1-2 ml supernatant gjenstår.
  4. Re-suspendere pellet av larver og bruke en mikropipette for å overføre 2 μL suspendert larver kultur til et glass lysbilde. Tell hvor mange larver som er tilstede for å bestemme tettheten av larverkulturen, noe som vil bidra til å veilede såing av ormene i trinn 2.5.
    MERK: En tetthet på 10-15 L1 larver / 1 μL fungerer bra for seeding.
  5. Bruk en mikropipette til å overføre volumet av larver kultur som trengs for å frø ca 100-120 L1 scenen larver på en 60 mm OP50 plate. For eksempel frø 10 μL av en larverkultur som har en tetthet på 10 L1 larver / 1 μL kultur.
    MERK: Ikke overskrid et volum på 40 μL for å så larver, eller overflødig væske vil forstyrre OP50-plenen. Hvis kulturvolumet overstiger 40 μL, gjentar du trinn 2,3-2,4 for ytterligere å redusere volumet og øke tettheten av larverkultur.
  6. Dyrk ormer ved 24 °C. Registrer tiden da L1s seedes på plate og med jevne mellomrom sjekke utviklingsstadiet for å identifisere den ideelle tiden for disseksjon.
    MERK: Ved 52 timer etter seeding av L1s er ormer dyrket ved 24 °C vanligvis i den unge voksenfasen, som er det ideelle stadiet for disseksjon for gonad-målrettet PLA. Imidlertid kan den faktiske tiden da de synkroniserte ormene når ung voksen stadium variere blant stammer og inkubasjonstemperatur.

3. Disseksjon/gonad ekstrudering

MERK: Disseksjon for å ekstrudere gonad er nødvendig for gonad-målrettet PLA å jobbe med hell. Denne tilnærmingen kan også frigjøre embryoer, som også fungerer ved hjelp av denne protokollen for PLA (se Diskusjon for mer informasjon). Etter disseksjon er både negativ kontroll og eksperimentelle prøver festet og behandlet for PLA sammen parallelt. Det foreslås også at et ekstra sett med prøver utarbeides med det formål å fluorescerende co-immunostaining23 for å demonstrere uttrykksmønstre av proteinpartnere av interesse.

  1. Plukk 30-40 unge voksne ormer i en klokkeglassfat som inneholder 500 μL av 1x M9 + levamisole (2,5 mM endelig konsentrasjon). Etter å ha samlet ormene, fjern og kast det meste av mediet forsiktig for å fjerne bakterier som overføres sammen med ormene.
  2. Tilsett friske 500 μL av 1x M9 + levamisole og bruk pipetten til å tegne forsiktig opp og dispensere mediet til å skylle ormene. Fjern og kast det meste av mediet forsiktig for å fjerne bakterier som overføres sammen med ormene.
    1. Gjenta dette trinnet 2x-3x til alle bakterier er fjernet. Etter at vasker er fullført, la ormer i ca 100 μL av media for å holde hydrert.
      MERK: Ikke la ormene sitte i media i mer enn 7 min, da dette vil svekke ekstruderingen av gonader under disseksjon. Utfør vask under hjelp av dissekering mikroskop for å overvåke fjerning av media slik at ormer ikke går tapt.
  3. Bruk en glass- eller polyetylenpipette til å overføre ormer til et mikroskoppå 25 mm x 75 mm mikroskop belagt med 0,001 % polyl-lysin (lysbilder som brukes i denne prosedyren, har en epoksybelagt omkrets, og etterlater tre arbeidsområder, 14 mm x 14 mm hver). Fjern overflødig ei slik at ca. 10-15 μL med i media forblir.
  4. Under hjelp av et dissekerende mikroskop og bruk av to 261/2 gauge nåler, plasser en nål over den andre slik at endene danner en saks. Ved hjelp av nåler orientert på denne måten, kutte ormer bak svelget for å frigjøre germlines. Dissekere alle ormer innen 5 minutter.
    MERK: Flere detaljer om hvordan du utfører disseksjoner finner du i en tidligere publikasjon av Gervaise og Arur30.
  5. Når alle ormer er dissekert, plasser forsiktig en 22 mm x 40 mm dekselslip over lysbildet slik at den er vinkelrett på lysbildet. Endene av dekkslip endene skal henge av lysbildet.
  6. Frys lysbildene på en forkjølt aluminiumsblokk som opprettholdes på tørris i minst 20 min. Plasser forsiktig en kjølt blyant på toppen av dekkslipen for å hindre at dekksdelen løsner på grunn av isutvidelse.

4. Fiksering/blokkering

  1. Når du er klar for fiksering, sveip av dekklepper med blyant eller annet sløvkantet verktøy og dypp umiddelbart lysbildet i en krukke som inneholder fersk, iskald metanol (kjølt til -20 °C) i 1 min.
  2. Tørk forsiktig av kantene på lysbildet som omgir prøven slik at neste reagens holdes av overflatespenning rundt prøven. Påfør 150 μL fikseringsmiddel (2% formaldehyd i 100 mM KH2PO4, pH = 7,2) i 5 min ved RT.
    MERK: Vi har også testet en metanol/acetonfikseringsprosedyre31,32 og funnet ut at den er kompatibel med PLA-reaksjonen.
  3. Trykk på lysbildet til et papirhåndkle i en vinkelrett 90°-vinkel for å la fikseringsmiddelet gå av lysbildet og absorbere inn i papirhåndkleet. Block lysbilder 2x for 15 min på RT i en Coplin krukke med 50 ml 1x PBS /1% Triton X-100/1% storfe serum albumin (PBT /BSA).
    MERK: Coplin krukker eller andre typer flekker krukker anbefales for dette blokkeringstrinnet og vasketrinnene nedenfor i avsnitt 6-9. Disse gir tilstrekkelige volumer for effektiv utveksling av blokkering eller vaskebuffer med prøven.
  4. Blokker lysbilder med en PBT/BSA-løsning som inneholder 10 % vanlig geiteserum. Tørk forsiktig av kantene som omgir lysbildet og påfør 100 μL av løsningen på lysbildet. Inkuber for 1 h ved RT i et fuktig kammer.
    MERK: Dette trinnet anbefales på det sterkeste for farging med αFLAG primære antistoff. Det fuktige kammeret er konstruert ved å feste glasspipetter med tape i skuffen for at lysbildene skal ligge på mens de ruger. Fuktet oppgaveservietter (Materialtabellen) er plassert i skuffen for å heve den interne fuktigheten i skuffen for å forhindre fordampning. Lokket og brettet er dekket av folie for å beskytte prøvene mot lys under de lysfølsomme trinnene.
  5. Plasser glidepå et papirhåndkle for å la PBT/BSA/10%NGS-løsningen renne av lysbildet og tørk forsiktig av kantene på lysbildet. Bruk blokkeringsreagensen (Materialtabell) til å blokkere lysbilder. Påfør en dråpe på 14 mm x 14 mm plass. Inkuber lysbilder i 1 time ved 37 °C i et fuktig kammer.

5. Primær antistoffinkubasjon

MERK: For å oppnå de beste PLA-resultatene og minimal bakgrunn, kan fortynningsfaktoren for de primære antistoffene kreve optimalisering (se Diskusjon for mer informasjon). I tillegg bør de primære antistoffene heves i forskjellige verter som samsvarer med spesifisiteten til de sekundære antistoffene som brukes for PLA.

  1. Plasser glidende på et papirhåndkle for å la blokkeringsreagen kjøre av lysbildet og tørk forsiktig av kantene. Bruk antistofffortynningsmiddelet (Materialtabellen) til å fortynne de primære antistoffene. Påfør 40 μL primær antistoffoppløsning per 14 mm x 14 mm plass.
  2. Inkuber lysbilder i et fuktig kammer over natten ved 4 °C.

6. PLA-sonde (sekundært antistoff) inkubasjon

MERK: For trinn 6-9, bruk vaskebuffere A og B ved RT. Hvis bufferne oppbevares ved 4 °C, la dem varme til RT før bruk.

  1. Vask sklier 2x i 5 min med 50 ml 1x vaskebuffer A (Materialbord) ved RT i en Coplin-krukke. Sett Coplin-krukken på en orbital shaker satt til 60 rpm.
  2. Plasser skyv på et papirhåndkle for å la vaskebufferen renne av lysbildet og tørk forsiktig av kantene. Forbered en oppløsning på 40 μL som inneholder PLUS- og MINUS-prober (fortynnet 1:5 med antistofffortynning). Påfør løsningen på hver 14 mm x 14 mm plass.
  3. Inkuber lysbilder i et fuktig kammer i 1 time ved 37 °C.

7. Ligation (andre er i verden)

  1. Vask sklier 2x i 5 min med 50 ml 1x vaskebuffer A ved RT i en Coplin-krukke. Sett Coplin-krukken på en orbital shaker satt til 60 rpm.
  2. Fortynn ligationbufferen (Materialbord) 1:5 med ultrarent vann. Bruk denne bufferen til å fortynne ligase (Table of Materials) 1:40 for å forberede en fungerende lager av ligation løsning.
    1. Plasser lysbildet på et papirhåndkle for å la vaskebufferen gå av skysog tørk forsiktig av kantene. Påfør 40 μL av ligation løsningen på hver 14 mm x 14 mm plass.
  3. Inkuber sklir i et fuktig kammer i 30 min ved 37 °C.

8. Forsterkning

MERK: Bruk av deteksjonsreagenser med røde fluoroforer (Materialtabell) resulterer i minst mulig bakgrunn i C. elegansvev.

  1. Vask sklier 2x i 5 min med 50 ml 1x vaskebuffer A ved RT i en Coplin-krukke. Sett Coplin-krukken på en orbital shaker satt til 60 rpm.
  2. Fortynn forsterkningen rød buffer (Materialbord) 1:5 med ultrarent vann. Bruk denne bufferen til å fortynne polymerase (Table of Materials) 1:80 for å forberede et fungerende lager av forsterkningløsning og beskytte mot lys.
    1. Plasser lysbildet på et papirhåndkle for å la vaskebufferen gå av skysog tørk forsiktig av kantene. Påfør 40 μL av forsterkningsløsningen på hver 14mm x 14 mm plass.
  3. Inkuber sklir i et fuktig kammer i 1 t og 40 min ved 37 °C. Pass på at det fuktige kammeret er dekket med folie for å beskytte prøvene mot lys.

9. Endelige vasker

  1. Vask sklier 2x i 10 min med 50 ml 1x vaskebuffer B (Materialbord) ved RT i en Coplin-krukke. Sett Coplin-krukken på en orbital shaker satt til 60 rpm.
  2. Vask sklier 1x i 1 min med 50 ml vaskebuffer B ved RT i en Coplin-krukke. Sett Coplin-krukken på en orbital shaker satt til 60 rpm. Denne bufferen fremstilles ved å fortynne vaskebuffer B med ultrarent vann.

10. Montering av dekselstrekk

  1. La overflødig vaskebuffer kjøre av lysbildet på et papirhåndkle og tørke av eventuelle gjenværende buffer som er igjen på den epoksybelagte omkretsen av lysbildet.
  2. Tilsett 10 μL monteringsmedium (Materialbord) for å prøve og legg forsiktig en dekkslip på toppen, slik at monteringsmediet kan spre seg ut.
  3. Mal rundt kanten av coverslip med neglelakk for å forsegle dekkslip og skyve. Vær forsiktig med påføring av neglelakk for å unngå å flytte dekkslip, noe som vil skade germlines. La neglelakken herdes i minst 20 minutter ved RT, mens lysbildene er beskyttet mot lys, før du ser den under et mikroskop.
  4. Lagre lysbilder i en mørk beholder eller glideholder, da PLA-merkede prøver er lysfølsomme. Produsenten foreslår at lysbilder kan lagres ved -20 °C for langtidslagring eller ved 4 °C for korttidslagring. Lysbilder som er klargjort ved hjelp av denne protokollen, varer minst 2 måneder når de lagres ved 20 °C.

11. Bildeoppkjøp

  1. For kvantifisering, bruk et konfokalmikroskop for å fange bilder av ekstruderte germlines som er i klar visning, uskadet og uhindret. Fang en z-stack av germline som strekker seg over hele germline i z-flyet og generere en maksimal projeksjon bilde som skal brukes for kvantitet.
    MERK: Konfokal mikroskopi er ideell for å skaffe og kvantifisere PLA-bilder med mindre bakgrunn sammenlignet med de som er oppnådd ved hjelp av et epifluorescerende mikroskop.
    1. Hvis germline ikke passer i ett synsfelt, kan du fange opp de overlappende synsfeltene etter behov for å bilde hele germline. Maksimal projeksjon av disse bildene kan sys sammen i FIJI.
  2. Sørg for å holde bildebehandlingsforholdene de samme mellom kontroll og eksperimentelle prøver for å sette en rettferdig og riktig terskel for identifisering av foci under bildeanalyse.
    MERK: Registrer minst 8-10 germlines fra hver prøve per replika for å lette statistisk analyse av PLA kvantifisering. Minst tre biologiske replikater anbefales for PLA for å oppnå pålitelige og konsekvente kvantitative resultater.

12. Bildeanalyse og kvantifisering ved hjelp av FIJI/ImageJ

MERK: Følgende arbeidsflyt er basert på bilder som er anskaffet ved hjelp av 40x-målet på et konfokalmikroskop, der bilder lagres i CZI-formatet. Disse .czi bildene og deres tilhørende metadata, inkludert dimensjoner, kan nås og åpnes i FIJI / ImageJ for videre analyse. Det bør kontrolleres om FIJI aksepterer formatet på konfokale filer fra konfokal tilgjengelig for den spesifikke brukeren. Hvis ikke, kan bilder i .tiff-formatet alternativt brukes til analyse, men brukeren må angi omfanget av bildet manuelt i FIJI /ImageJ (Analyser | Angi skala). Det anbefales at alle negative kontrollbilder analyseres sammen først for å etablere bakgrunnsnivået.

  1. Start analysearbeidsflyten ved å analysere alle negative kontrollbilder først, og gå deretter videre til de eksperimentelle prøvene. Åpne et maksimalt projeksjonsbilde i FIJI/ImageJ for å analysere (Figur 2A). Hvis du bruker en CZI-fil, blir det bedt om en liste over import alternativer for bioformater.
    1. Inkluder følgende alternativer for å åpne bildet: vis stabel med Data Browser; fargemodus = Fargesatt. Et vindu med bildet skal nå åpnes med en glidelinje for å veksle mellom ulike kanaler som er tatt med konfokal (f.eks. DAPI eller PLA).
    2. Hvis bilder må sys, oppretter du duplikater av hver kanal fra hvert bilde ved å høyreklikke bildet med musen og velge Dupliser for å åpne Vinduet Dupliser. Angi bare kanalnummeret (c) som tilsvarer PLA- eller DAPI-kanalen (f.eks. 2)og fjern merket i boksen for Duplikathyperstack.
    3. Med begge bildene som skal sys åpen, velg Plugins | Søm | Avskrevet | 2D-søm. Et syav 2D-bilder-vinduet åpnes. Velg hvilke bilder som skal brukes til søm, og bruk standardparameterne som er forhåndsinnstilte i vinduet, og velg deretter Ok. Det resulterende bildet vil være et montert gråtonebilde.
      MERK: Hvis underbildene ikke justeres perfekt, justere parametrene (dvs. øke antall topper som skal kontrolleres fra 5 til 500 eller endre fusjonsmetoden fra Lineær blanding til Maks. Intensitet)kan bidra til å få ønsket bilde. Mens andre sømverktøy er tilgjengelige, beholder denne tilnærmingen dimensjonaliteten til bildet, noe som er viktig for kvantifisering.
  2. Åpne roi (Region of Interest)-lederen ved å trykke T på tastaturet. Et nytt vindu kalt ROI Manager åpnes.
  3. Velg polygonverktøyet fra FIJI-verktøysettboksen. Slipp punkter rundt germline for å skissere den og generere en avkastning (figur 2B). Koble den siste prikken til den første for å generere en fullstendig avkastning.
    MERK: For mørkere bilder er det nyttig å justere kontrasten for å forbedre synligheten til germline (som er reversibel) slik at den kan skisseres mer nøyaktig.
    1. Umiddelbart etter at du har fullført avkastningen, går du til ROI-lederen og velger Legg til [t] for å lagre avkastningen. Det er viktig at eventuelle endringer i avkastningen, inkludert å legge til/fjerne punkter eller bevegelse av avkastningen og poeng oppdateres (velg Oppdater fra ROI-behandling) før du går videre til neste trinn, eller de vil gå tapt. Ytterligere detaljer om manipulering av ROIer og deres poeng finner du i brukerhåndboken for FIJI/ImageJ.
  4. Når avkastningen retning er satt, kan den lagres for senere referanse ved å velge avkastningsnavnet i avkastningen manager etterfulgt av Mer | Lagre | (navnefil og angi mål for hvor du vil lagre). Lagrede ROIer kan åpnes i ROI-lederen ved å velge Mer | Åpent | (velg filen).
  5. Mål området inne i avkastningen ved å velge avkastningsnavnet fra roilederen og deretter velge Mål-knappen på avkastningsansvarlig. Et resultatvindu åpnes med informasjon om avkastningen, inkludert området som det dekker i bildet (μM2) (innfelt av figur 2B). Registrer denne informasjonen i et regneark for etterfølgende beregninger.
    MERK: Kontroller at bildets skala er riktig angitt slik at de riktige dimensjonene på avkastningen samles inn. Hvilke typer målinger som Results rapporteres i Resultater-boksen, kan endres ved å gå til Analyser | Angi målinger...
  6. Åpne et duplisert bilde av bare PLA-kanalen ved å høyreklikke PLA-bildet og velge Dupliser (Figur 2C). Et duplisert vindu åpnes. Angi bare kanalnummeret (c) som tilsvarer PLA-kanalen (f.eks. 2) og fjern merket i boksen for Duplikathyperstack. Duplisering av dette bildet anbefales slik at det opprinnelige bildet ikke blir endret.
    MERK: Disse alternativene vises bare når du viser bildene som inneholder flere kanaler på FIJI/ImageJ. En alternativ tilnærming er å dele kanalene Image | Farge | Del kanaler, men dette vil endre den opprinnelige bildefilen.
  7. Med bare bildet av PLA-kanalen valgt, gå til Bilde | Juster | Terskel. Et terskelvindu for bildet åpnes. Velg Standard som terskelmetode, Rød som farge, og merk av for Mørk bakgrunn. Bruk det øvre sporet i vinduet til å skyve linjen mot høyre til alle PLA-foci er tydelig uthevet i bildet.
    1. Registrer verdien i boksen til høyre for det øvre sporet, og noter deg hvilken verdi som ble brukt til å angi terskelen. Velg Bruk i terskelvinduet for å fullføre terskelen, og bildet konverteres til en hvit bakgrunn med bare terskelfokuset som er synlig som svarte prikker (Figur 2D). Test terskelen på flere negative kontrollbilder for å sikre at den er egnet for å fange alle PLA-foci fra bilde til bilde før kvantitet.
      MERK: Hvis du vil vise terskelfokus som svarte prikker på hvit bakgrunn, går du til Prosess | Binære | Alternativer... og fjern merket for Svart bakgrunn. En terskelverdi mellom 30-40 er et godt utgangspunkt for å identifisere PLA i germline; Den ideelle verdien kan imidlertid variere avhengig av bakgrunn.
  8. Hvis du vil kvantifisere PLA-focien, bruker du avkastningen som genereres fra trinn 12.3-12.3.1 på terskelbildet ved å velge avkastningsnavnet fra vinduet for avkastningsbehandling. Omrisset av avkastningen skal vises på bildet på samme sted som det var fra kildebildet (Figur 2E).
    1. Gå til Analyser | Analyser partikler. Vinduet Analyser partikler åpnes og velger følgende parametere: størrelse (micron^2) = 0-Uendelighet, sirkularitet = 0,00-1,00, vis = Ingenting. Merk av for Sammendrag.
    2. Velg Ok, og en sammendragstabell vises med informasjon om avkastningen (dvs. det totale antallet PLA-foci, totalt areal okkupert av PLA-foci en del av avkastningen, gjennomsnittlig størrelse på PLA-foci, og prosentandel av området som er okkupert av PLA foci i forhold til størrelsen på avkastningen) (innfelt av figur 2E). Registrer disse målingene i et regneark.
  9. Gjenta trinn 12.1-12.8 for flere negative kontrollbilder ved hjelp av samme terskel.
    1. Når alle negative kontrollbilder er analysert, gjentar du trinn 12.1-12.8 for alle eksperimentelle prøver ved hjelp av samme terskel som ble bestemt av den negative kontrollen for å identifisere og kvantifisere PLA-foci.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ko-immunfarging av begge 3xFLAG::DLC-1; GFP og 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-germlines med FLAG- og GFP-antistoffer avslørte deres uttrykksmønstre i bakterielinjen (figur 3Aii-iii,3Bii-iii). Mens GFP ble uttrykt i hele kimet (Figur 3Aiii), oma-1::GFP uttrykk var begrenset til sen pachytene og oocytes (Figur 3Biii)27. FLAG immunfarging viser at 3xFLAG: :DLC-1 ble uttrykt gjennom hele kimlinjen i begge stammene (Figur 3Aii,3Bii). Ved co-immunostaining er overlappingen mellom 3xFLAG::DLC-1 og OMA-1::GFP umulig å skille fra det mellom 3xFLAG::DLC-1 og GFP (negativ kontroll).

Siden disse eksperimentene testet for interaksjoner mellom DLC-1 og OMA-1, regionen av interesse for PLA kvantifisering i germline omfattet sen pachytene gjennom oocytes i alle germlines undersøkt (Figur 2B), som dette er regionen av OMA-1 uttrykk (Figur 1, Figur 3Biii). 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-germlines syntes å ha en større mengde PLA foci i denne regionen sammenlignet med 3xFLAG::DLC-1; GFP-germlines (Figur 3Ciii-iv,3Diii-iv). Kvantifisering av PLA viste at antall PLA foci tilstede i 3xFLAG: :DLC-1; OMA-1::GFP-germlines var betydelig større enn 3xFLAG::DLC-1; GFP (Figur 3Ciii-iv,3Diii-iv; Tabell 1). Videre, selv med 10x høyere fortynning av GFP og FLAG antistoffer, forskjellen mellom kontroll og eksperimentell PLA var fortsatt betydelig forskjellig; Den totale tettheten og den gjennomsnittlige størrelsen på foci ble imidlertid redusert (tabell 1).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk av C. elegans germline. Den distale spissen regionen inneholder stamcellebassenget, som etterfølges av meiotisk pachytene, hvor cellene har byttet fra mitose til meiosis. Celler som går ut av den meiotiske pachytene utvikler seg til oocytter, med den mest modne oocyte på den proksimale enden. Regionen skyggelagt i grønt, som spenner fra den sene meiotiske pachytene gjennom alle oocytes, representerer OMA-1 uttrykksmønster. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative bilder av arbeidsflyt for germline PLA kvantifisering. Germline brukes i dette tallet er en representant 3xFLAG: :DLC-1; GFP-germline fra figur 3C. (A) Bilde av sammenslåtte PLA- og DAPI-kanaler åpnet i FIJI/ImageJ. (B) Polygonverktøyet i FIJI brukes til å skissere og definere regionen av interesse (ROI) i germline (gul linje med hvite bokser) som er kvantifisert, og området av AVKASTNINGEN (μM2) måles (innfelt av B). (C) Et enkelt bilde av PLA-kanalen oppnås ved å duplisere eller dele det opprinnelige bildet i (A,B). (D) Terskelen er nøye satt til å skille ut alle PLA-foci i PLA-bildet. Den samme terskelen må brukes på alle eksperimentelle og kontrollbilder som vil bli analysert sammen. (E) Med avkastningen valgt i terskelbildet, vil Analysepartikler-funksjonen returnere en tabell med resultater som inkluderer det totale antallet foci inkludert i avkastningen (innfelt av E). Bilder er øyeblikksbilder fra FIJI/Image J: Plugins | Verktøy | Ta bilde. Skala barer = 10 μM. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative bilder av germlines etter ko-immunfarging eller PLA. - Jeg har ikkenoe å si. Uttrykksmønstrene til kodede proteiner i 3xFLAG::DLC-1; GFP (Ai-iv) og 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (Bi-iv) ble evaluert i dissekert, fast og immunisert gonader. Anti-FLAG antistoff ble brukt på en 1:1000 fortynning, mens anti-GFP antistoff ble brukt på en 1:200 fortynning, som er optimal for immunofluorescens bilder. DNA ble farget av DAPI, og den enkelte kanal er vist i gråtoner for bedre kontrast (Aiv, Biv). I hvert bilde er stamcellene og meiotiske pachytene skissert med stiplede linjer, mens oocytes er skissert med stiplede linjer. Bilder ble kjøpt med et epifluorescerende mikroskop. Skala barer = 10 μM. (C,D) PLA i ekstrudert 3xFLAG: :DLC-1; GFP (C) og 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (D) gonads. Anti-FLAG antistoff ble brukt på en 1:1000 fortynning, mens anti-GFP antistoff ble brukt på en 1:4000 fortynning. DNA ble farget av DAPI, og både den enkelte DAPI (Cii, Dii) og PLA kanaler (Ciii, iv, Diii, iv) er vist i gråtoner for bedre kontrast. Den grønne, stiplede boksen (Ciii,Diii) betegner plasseringen av de zoomet inn PLA-bildene (Civ,Div). I hvert bilde er stamcellene og meiotiske pachytene skissert med stiplede linjer, mens oocytes er skissert med stiplede linjer. Bilder ble kjøpt med et konfokalmikroskop. Skalalinjer = 10 μM. (A,B,C,D) ble alle montert med bildebehandlingsprogramvare (se Materialtabellen). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Antistofffortynning Stamme testet Gjennomsnittlig PLA Tetthet (foci/μM2) X 10-2 T test Gjennomsnittlig størrelse på PLA Foci (μM2) T test
αFLAG (1:1000), αGFP (1:4000) 3xFLAG::DLC-1; GFP (andre kan foreksempel være 3,9 ± 1,4 P = 1,917E-05 0,52 ± 0,127 P = 0,057
3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP 9,1 ± 2,7 1,8 ± 2,08
αFLAG (1:10,000), αGFP (1:40,000) 3xFLAG::DLC-1; GFP (andre kan foreksempel være 3,2 ± 2,4 P = 3,395E-04 0,51 ± 0,1 P = 0,019
3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP 7,7 ± 3 0,7 ± 0,24

Tabell 1: Sammendrag av PLA-resultater. Tabell rapportering et sammendrag av PLA kvantifisering ved to fortynninger av primære antistoff. Forskjellene i gjennomsnittlig PLA-tetthet eller gjennomsnittlig størrelse på PLA foci for OMA-1::GFP mellom begge antistofftitregene var ikke signifikante (p-verdi ikke vist). Den samme sammenligningen ble også brukt på GFP, noe som heller ikke resulterte i signifikant forskjell (p-verdi ikke vist). P-verdiene ble bestemt ved hjelp av en to-tailed/equal varians t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved studier av PPI-er i C. elegans-germline, gir den høyere oppløsningen som tilbys av PLA sammenlignet med ko-immunfarging visualisering og kvantifisering av steder der interaksjoner forekommer i kimlinjen. Det ble tidligere rapportert at DLC-1 direkte samhandler med OMA-1 ved hjelp av en in vitro GST pulldown analyse26; Denne interaksjonen ble imidlertid ikke gjenopprettet av en in vivo pulldown. Fluorescerende ko-immunostaining av 3xFLAG: :DLC-1; OMA-1::GFP-germlines viser en overlapping i uttrykksmønstrene for DLC-1 og OMA-1; Det er imidlertid ingen indikasjon på hvor deres interaksjoner forekommer i germline, og overlappingen i seg selv er ikke større enn det mellom 3xFLAG::DLC-1 og GFP som ikke er smeltet til noe protein (negativ kontroll). Ved hjelp av in situ PLA ble det funnet at DLC-1 samhandler med OMA-1 i germline, noe som tyder på at PLA kan være mer følsom for påvisning av PPI sammenlignet med andre tilnærminger. Gjennom denne tilnærmingen fortsetter vi å utvide på den nye rollen som DLC-1 som en RBP-kofaktor. Dette arbeidet demonstrerer evnen til PLA for å oppdage PPIer i germline og etablerer en referanse for fremtidige brukere som utforsker samspillet mellom proteiner av egen interesse.

PLA gir brukerne muligheten til å teste for PPIer med sammenlignbar følsomhet uten ulempene forbundet med andre teknikker som FRET og BiFC. Biologisk relevante nivåer av proteinuttrykk kan ikke være optimale for FRET og BiFC. Funksjonen til potensielle samhandlingspartnere kan også påvirkes av de store taggene som brukes i begge tilnærmingene. Videre krever FRET-analyser et spesialisert mikroskopioppsett som kanskje ikke er lett tilgjengelig. PLA kan også være en kostnadseffektiv tilnærming til å studere PPIer sammenlignet med andre teknikker. Brukere trenger bare å få PLA reagenser og tilgang til et konfokalmikroskop for bildebehandling i tillegg til reagensene som trengs for immunfarging. Bildeanalyse utføres ved hjelp av åpen kildekode-programmet FIJI/ImageJ, som er tilgjengelig for alle brukere uten kostnad. Brukere som ikke har erfaring med FRET eller BiFC kan finne PLA å være et passende alternativ. Protokollen som presenteres her inneholder bare flere ekstra trinn utover en typisk immunfargingsprosedyre, noe som gjør denne teknikken praktisk talt tilgjengelig for alle brukere med immunfargingserfaring.

Ekstrudering av gonad ved disseksjon er viktig for PLA å arbeide vellykket. Vev som beholdes inne i ormskjellaget er ikke merket av PLA ved hjelp av denne protokollen. Det har blitt videre funnet at ekstruderte embryoer er effektivt merket av denne PLA-protokollen. Dette tyder på at andre vev som frigjøres under disseksjon, for eksempel tarmen, også sannsynligvis vil være kompatible med PLA. Det har blitt funnet at PLA produserer robuste signaler på gonad samt embryoprøver utarbeidet med to fikseringsprotokoller som ofte brukes til immunfarging. Dette tyder på at flere fikseringsprosedyrer som brukes i feltet, kan være kompatible med PLA, men må evalueres individuelt av brukeren.

Å bestemme optimal fortynning av primære antistoffer er avgjørende for vellykket PLA. Det er best å starte med fortynning som er optimalisert for immunofluorescens. Dette oppnås vanligvis ved å titrere det primære antistoffet i et immunofluorescenseksperiment for å finne optimal fortynning der det er lav bakgrunn og et høyt, spesifikt signal. Når de optimale fortynningene for immunfluorescens er etablert, kan de samme fortynningene testes i en PLA-analyse som sammenligner signalet produsert av et par potensielle interactors med signalet produsert av et kontrollpar av ikke-interagerende proteiner.

I tilfelle der rikelig signal observeres i kontrollprøven, er det nødvendig med ytterligere fortynning av primære antistoffer. Det har blitt funnet at de optimale primære antistofffortynninger for PLA er minst det samme eller enda mer fortynnet enn det som brukes til immunofluorescens. For eksempel er immunofluorescensbilder i figur 3A,B representative for en 1:1000 fortynning av anti-FLAG og en 1:200 fortynning av anti-GFP. Antistofffortynningene i PLA-bilder i figur 3C,D var imidlertid 1:1000 av anti-FLAG og 1:4000 av anti-GFP. Fortynning av anti-GFP antistoff som brukes i PLA er større enn det som ble brukt til immunofluorescens, noe som tyder på at PLA er mye mer følsom. Det ble funnet at fortynning av antistoffer 10 ganger ytterligere resulterte i en reduksjon av PLA tetthet samt størrelsen på DLC-1/OMA-1 foci (Tabell 1). Til tross for denne reduksjonen var forskjellen i PLA-tetthet mellom negativ kontroll og DLC-1/OMA-1 fortsatt betydelig forskjellig. Dette tyder på at PLA fortsatt er svært følsom med høyere fortynninger av primær antistoff; Utbredelsen av påvisbare interaksjoner vil imidlertid bli undervurdert.

Derimot kan for lavt antistofffortynning ha to typer skadelige konsekvenser. For det første kan det gi betydelig bakgrunnssignal i den negative kontrollen. For det andre kan PLA-foci produsert av de samhandlende partnerproteinene fusjonere og overlappe, noe som gjør dem vanskelige å løse i et maks projeksjonsbilde. Dette fører til en undervurdering av PLA foci nummer og tetthet under bildeanalyse. PLA-signal et tegn på å oppdage falsk nærhet mellom ikke-samhandlende partnere og oppdage alle forekomster av ekte PPIer som forekommer i prøven. Som et resultat er inkorporering av en negativ kontroll der to proteiner ikke samhandler, avgjørende for å bestemme bakgrunnsnivået i PLA-eksperimenter. Utelatelse av et primært antistoff i et PLA-eksperiment har blitt brukt som en negativ kontroll i andre rapporter9,10; Denne tilnærmingen kan imidlertid ikke ta hensyn til uspesifikke interaksjoner eller uspesifikk antistoffbinding som kan påvirke resultatet i den eksperimentelle PLA. GFP ble brukt her som en negativ kontroll, siden det ikke var forventet noen direkte interaksjon mellom DLC-1 og GFP. Det ble funnet at den negative kontrollen hadde noen bakgrunnssignal. Dette støtter ytterligere viktigheten av en negativ kontroll for en PLA-analyse når man evaluerer eksperimentelle data.

Når PLA-optimaliserte fortynninger er etablert, kan disse fortynningene brukes til å teste på tvers av en rekke forskjellige ormstammer som inneholder forskjellige par samhandlingspartnere merket med de samme affinitetskodene. Det er viktig å bruke samme par primære antistoffer for å sikre en rettferdig sammenligning av resulterende PLA-signaler, da variasjon i antistoffaffinitet kan påvirke utfallet av et PLA-eksperiment. En annen rapport om PLA foreslår optimalisering av fortynning av PLA sekundære antistoffer10; Dette anbefales imidlertid ikke. Høyere fortynninger av sekundære antistoffer kan redusere effekten av de andre nedstrøms PLA-trinnene som er avhengige av anerkjennelse av PLUS- og MINUS-prober som er konjugert til sekundære antistoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Noen nematode stammer som brukes i denne studien ble levert av Caenorhabditis Genetics Center finansiert av NIH (P40OD010440). Confocal mikroskopi ble utført i University of Montana BioSpectroscopy Core Research Laboratory operert med støtte fra NIH Awards P20GM103546 og S10OD021806. Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH-stipendet GM109053 til E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 til X.W., og Montana Academy of Sciences award til X.W. Funders var ikke involvert i studiedesign eller skriving av rapporten. Vi takker M. Ellenbecker for diskusjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% paraformaldehyde solution Electron Microscopy services 15710 used to make 4% working solution
1M KH2PO4 Sigma P0662 Prepare a 1M working stock
1x M9 various various prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol
1x PBS various various see wormbook.org for protocol
26.5 Gauge Needle Exel International 26402 Needles used for dissection
BSA Lampire 7500802
Centrifuge Tubes Thermo Scientific 05-529C 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization
Confocal Microscope Zeiss 880
Coplin Jar PolyLab 62101
Coverslip to Freeze Sample Globe Scientific 1411-10 22x40mm, No. 1
Coverslip to Seal Slide Globe Scientific 1404-15 22x22mm, No. 1.5
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence Vector H-1200
Ligase Sigma-Aldrich DUO82029 Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Amplification red buffer Sigma-Aldrich DUO82011 Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Ligation Buffer Sigma-Aldrich DUO82009 Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Antibody Diluent Sigma-Aldrich DUO82008 Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.
Blocking Solution Sigma-Aldrich DUO82007 Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002
Mounting Medium for PLA Sigma-Aldrich DUO82040 Duolink In Situ mounting medium with DAPI
MINUS Probe Sigma-Aldrich DUO92004 Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS
PLUS Probe Sigma-Aldrich DUO92002 Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS
Wash Buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink In Situ wash Buffer A
Wash Buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink In Situ wash Buffer B
Polymerase Sigma-Aldrich DUO82030 Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008
Epifluorescent Microscope Leica DFC300G camera, DM5500B microscope
Goat anti-mouse Alexa 594 JacksonImmuno 115-585-146 Use at 1:500
Goat anti-rabbit Alexa 488 JacksonImmuno 111-545-144 Use at 1:200
Image Processing Software Adobe Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Glass Pipette Corning 7095B-5X
Levamisole ACROS Organics 187870100 Prepare a 250mM working stock
Methanol Fisher Scientific A454
Mouse anti-FLAG Sigma F1804 Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended
Nailpolish L.A. colors CNP195
Nematode Growth Medium (NGM) various See wormbook.org for protocol
Normal Goat Serum JacksonImmuno 005-000-121
Polyethylene Pasteur Pipette Globe Scientific 135030
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P1524 Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides
Petri Dishes Tritech PD7060 60 mm diameter
Rabbit anti-GFP Thermo Fisher G10362 Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA
Slides Thermo Fisher 30-2066A-Brown Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab
Sodium Hypochlorite solution Fisher Scientific SS290-1
task wipes Kimtech 34120 4.4x8.4 inch task wipes
Trays (242x241x20mm) Thermo Fisher 240845 Used to make humid chamber
Triton X-100 ACROS Organics 327372500
Ultrapure water Milli-Q Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System
Watchglass Carolina Biological 742300
-20 °C freezer
-80 °C freezer
Aluminum Foil
OP50 strain E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematode strains used in this study (both available upon request)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] UMT 376 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III UMT 422 dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Nooren, I. M., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  3. Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. Hub promiscuity in protein-protein interaction networks. International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).
  4. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807 (2010).
  5. Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).
  6. Nousch, M., Eckmann, C. R. Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).
  7. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
  8. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  9. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  10. Wang, S., et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (95), 52139 (2015).
  11. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  12. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).
  14. Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45 (3), 185-191 (2008).
  15. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  16. Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains. Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).
  17. Erdős, G., et al. Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway. PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885 (2017).
  18. Navarro-Lérida, I., et al. Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8. Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).
  19. Rapali, P., et al. DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond. FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).
  20. Rapali, P., et al. Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS One. 6 (4), e18818 (2011).
  21. Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).
  22. Jespersen, N., et al. Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8. Life Science Alliance. 2 (4), (2019).
  23. Wang, X., et al. Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells. Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).
  24. Dorsett, M., Schedl, T. A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).
  25. Ellenbecker, M., et al. Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).
  26. Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation. FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).
  27. Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans. Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).
  28. Spike, C. A., et al. Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).
  29. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
  30. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  31. Duerr, J. S. Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking". Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  32. Crittenden, S., Kimble, J. Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).

Tags

Utviklingsbiologi Utgave 159 germline RNA-bindende protein LC8 PLA C. elegans nærhetligation analyse
I Situ Påvisning av Ribonucleoprotein Complex Assembly i <em>C. elegans</em> Germline ved hjelp av nærhetligation analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Day, N. J., Wang, X., Voronina, E.… More

Day, N. J., Wang, X., Voronina, E. In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (159), e60982, doi:10.3791/60982 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter