Summary
このプロトコルは、C.エレガンス生殖細胞リンにおけるその場でのタンパク質相互作用をプローブするための近接ライゲーションアッセイの使用を実証する。
Abstract
タンパク質相互作用(PPI)がいつどこで起こっているのかを理解することは、細胞内のタンパク質機能を理解し、開発などのより広範なプロセスがどのように影響を受けるかを理解するために重要です。カエノハブディティス・エレガンス生殖細胞系列は、幹細胞の調節、髄膜炎、および発達に関連するPPIを研究するための素晴らしいモデルシステムです。標準的な抗体による認識のために目的のタンパク質をタグ付けすることを可能にする様々な開発された技術があり、このシステムは近接ライゲーションアッセイ(PLA)反応に有利です。その結果、PLAは、PPIが代替アプローチよりも効果的に生殖系列で空間的および時間的に起こる場所を示すことができる。ここで説明するC. エレガンス生殖細胞系列の PPI をプローブするこの技術の適用および定量化のためのプロトコルです。
Introduction
タンパク質の80%以上が他の分子1との相互作用を有すると推定されており、細胞2における特定の生物学的機能の実行においてPPIがいかに重要であるかを強調している。一部のタンパク質は、細胞生存に必要なより大きな複合体の組立を促進するハブとして機能する1.これらのハブは複数の PPI を仲介し、細胞3の特定の機能を容易にするネットワークにタンパク質を整理するのに役立ちます。タンパク質複合体の形成は、特異的相互作用パートナー4の有無、細胞シグナル伝達事象、および細胞の発達段階などの生物学的文脈によっても影響される。
C.エレガンスは、開発を含む様々な研究のためのモデル生物として一般的に使用されています。この動物の単純な解剖学は、生殖腺、腸、透明キューティクルを含むいくつかの器官で構成されており、ワームの発達の分析を容易にする。生殖腺に存在する生殖細胞は、生殖細胞幹細胞が胚に成長し、最終的には次世代の子孫に成長するジテ5に成熟する方法を研究するのに最適なツールです。生殖細胞系列の遠位先端領域には、自己更新幹細胞のプールが含まれています(図1)。幹細胞がニッチを離れると、それらは大乳頭蓋に進行し、最終的には若年成人期に卵母細胞に発展する(図1)。生殖細胞系列におけるこの開発プログラムは、RNA結合タンパク質(RRP)6によって促進される転写後調節ネットワークを含む異なるメカニズムを介して厳しく調節される。6PPPは、RPPが他の補因子と関連付けて機能を発揮するので、この規制活動にとって重要です。
ワームの PPI をプローブするために使用できる方法はいくつかありますが、それぞれに固有の制限があります。インビボ免疫沈降(IP)は、ワーム抽出物全体からタンパク質-タンパク質複合体を分離するために使用することができます。ただし、このアプローチは、ワーム内で PPI が発生する場所を示すものではありません。さらに、開発の特定の段階または限られた数の細胞の中で一過性で唯一形成されるタンパク質複合体は、共免疫沈降法によって回収することが困難であり得る。最後に、IP実験では、アフィニティーマトリックス上のタンパク質のリシスおよび非特異的保持後のタンパク質複合体再分類の懸念に対処する必要があります。
PPIのインシチュ検出における代替アプローチは、共免疫染色、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)、および二分子蛍光相補(BiFC)である。コ免疫染色は、固定ワーム組織での目的とする2つのタンパク質の同時検出と、シグナルの共局在化の程度の測定に依存します。標準的な顕微鏡検査7よりも詳細な超解像顕微鏡の使用は、200-300nm8の回折限界障壁を越えてタンパク質の共局在化をより厳格にテストするのに役立ちます。しかし、従来の顕微鏡と超解像顕微鏡の両方を使用した共同免疫染色は、明確に定義されたローカリゼーションパターンを持つタンパク質に最適です。対照的に、拡散分散型の相互作用パートナーにとってはあまり有益ではありません。重複に基づいてシグナルの共局在化を測定しても、タンパク質が互いに複雑であるかどうかについては正確な情報を提供しません9,,10.
さらに、タンパク質複合体の共免疫沈降と共免疫染色は定量的ではなく、そのような相互作用が有意であるかどうかを判断することは困難です。FRETとBiFCは、いずれも蛍光ベースの技術です。FRETは、あるFP(ドナー)からのエネルギーが別のFP(アクセプタ)11に伝達されるスペクトル重複を有する蛍光タンパク質(FP)と関心のあるタンパク質をタグ付けすることに依存する。このエネルギーの非放射移動は、それぞれの発光波長で検出することができるアクセクサFPの蛍光をもたらす。BiFCは、インビボの蛍光タンパク質の再構成に基づいています。これは、ヘリックス1-10とヘリックス1112などの2つの相補的な断片にGFPを分割し、その後、対象となる2つのタンパク質に融合することを必要とします。これら2つのタンパク質が相互作用する場合、GFPの相補的な断片は、折り畳み式と組み立てに十分近く、GFPフルオロフォアを再構成するほど近くなります。再構成されたGFPは、蛍光として直接観察され、PPIが発生した場所を示す。
そのため、FRETとBiFCの両方が、タグ付きタンパク質の機能を破壊する可能性のある大きな蛍光タグに依存しています。さらに、FRETとBiFCは、正確なデータを得るためにタグ付きタンパク質の豊富で同等の発現を必要とします。FRETは、一方のパートナーが他方を超えている実験には適しておらず、高い背景13につながる可能性がある。BiFC実験における過剰発現は、背景の増加をもたらす非特異的アセンブリ14を誘発する可能性もあるので、避けるべきである。どちらの手法でも、タグ付きタンパク質の発現条件と画像化条件の最適化が必要であり、実験の完了に必要な時間が長くなる可能性があります。
近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、上述の技術の限界に対処できる代替アプローチである。PLAは、目的のタンパク質(またはそのタグ)を認識する一次抗体を利用します。これらの一次抗体は、40nm(または短い)距離15内で互いにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含む二次抗体によって結合される。得られたハイブリダイズされたDNAはPCR反応を通じて増幅され、DNAを補うプローブによって検出される。これは顕微鏡によって視覚化される病巣で起因する。この技術は、複雑な組織(すなわち、ワーム生殖腺)においてPPIを検出することができ、これは、開発および分化の様々な段階で細胞を含む組立ラインとして組織される。PLAを使用すると、PPIは固定ワーム生殖腺で直接視覚化することができ、開発の特定の段階でPPIが発生するかどうかを調査する上で有利です。PLAは、正確な測定に最適な共ローカリゼーションベースのアッセイとは対照的に、PPIの解像度を高めます。使用する場合、超解像顕微鏡は、細胞内のPLA病巣の位置についてのより細かい詳細を提供する可能性を有する。もう1つの利点は、PLA反応に起因する病巣をImageJベースの解析ワークフローで数えることができることであり、この技術を定量化する。
ダイニン軽鎖のLC8ファミリーは、最初にダイニンモーター複合体16のサブユニットとして記述され、貨物アダプタとして機能すると仮定した。,最初の発見以来、LC8はダイニンモーター複合体17、18、19、20,18,19に加えて複数のタンパク質複合体で発見された。20LC8相互作用モチーフ19を含むタンパク質配列のスキャンは、LC8,が,17、18、19、20、21、22の異なるタンパク質の広い配列との多くの相互作用17,18,1921を22有し得る可能性があることを示唆している。20その結果、LC8ファミリータンパク質は現在、より大きなタンパク質複合体19,22,22の組立を促進するのに役立つハブと考えられている。
1つのC.エレガンスLC8ファミリータンパク質は、ダイニン軽鎖-1(DLC-1)が、多くの組織にわたって広く発現しており、特異的な細胞下構造23,24,24では濃縮されていない。その結果、C.エレガンスにおけるDLC-1の生体内パートナーの生物学的に関連する同定は、いくつかの理由で困難である:1)共免疫沈降は、相互作用が起こる組織源を示さない。2)特定のパートナーの限定的な発現または一時的相互作用は、共免疫沈降による相互作用を検出する能力を妨げる可能性がある;3) DLC-1の拡散分布は、共免疫染色により、潜在的なパートナータンパク質と非特異的な重複を招く。これらの課題に基づいて、PLAは、DLC-1とのインビボ相互作用をテストするための理想的なアプローチです。
DLC-1はRNA結合タンパク質(RRP)FBF-223およびGLD-125と直接相互作用し、補間因子として機能することが以前に報告25されている。我々の研究は、ハブタンパク質として機能するDLC-1のモデルをサポートし、DLC-1がdynein19,22,22を超えた相互作用ネットワークを促進することを示唆している。GST プルダウンアッセイを使用して、OMA-1 という名前の新しい DLC-1 相互作用 RBP が26と特定されました。OMA-1は、卵母細胞の成長および大動脈成熟27および多数の翻訳リプレッサーおよび活性化剤28と共に機能する重要である。FBF-2およびGLD-1は幹細胞領域および重症パキテーン領域でそれぞれ発現しているが、OMA−1は、大母細胞27を通る大動脈パキテーンから生殖細胞で拡散的に発現される(図1)。これは、DLC-1が生殖腺の異なる領域にRMPを有する複合体を形成することを示唆している。また、インビトロで観察されたDLC-1とOMA-1の間の直接相互作用は、in vivo IPによって回収されないことも判明した。PLAは、C.エレガンス生殖細胞系列におけるこの相互作用をさらに研究するための代替アプローチとしてうまく使用されており、その結果、PLAを使用してワーム内の他の多くのPPIを探査できることを示唆している。
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Protocol
注: このプロトコルは、潜在的な相互作用パートナーの両方がタグ付けされているC.elegans株を使用します。1つのタグ付きタンパク質が別のタグ付き候補相互作用パートナーと相互作用することが期待されない陰性対照株を使用することを強くお勧めします。ここで、GFP単独は、DLC-1がワーム内のGFPと相互作用するとは考えられていないので、バックグラウンドを評価するための陰性制御として使用された。GFPタグ付きOMA-1は、実験株として使用され、予備データがDLC-1との相互作用を示唆している。3xFLAG タグ付き DLC-1 を持つ対照タンパク質とテストタンパク質を共発現する線虫株は、このテキストでは 3xFLAG::DLC-1 と呼ばれます。GFP と 3xFLAG::DLC-1;OMA-1:::GFP(要求に応じて利用可能な株、材料表の詳細)それぞれ。ここでは、3xFLAG タグと GFP タグが使用されます。しかし、他のタグは、それらの抗体がPLAキット試薬と互換性がある限り置換され得る。
1. 動物のケア
- 大腸菌のOP50株を播種した線虫増殖培地(NGM)プレートにワームを保管し、GFPの最適な発現のために24°Cで維持します。
- 2〜3日ごとに成虫のワームを通過させ、ワームを伝播し、十分に餌を与え続ける。
2. 同期文化の準備
- よく供給された、グラビッド雌雄同体のプレートを漂白することによってワームを同期させます。漂白プロトコルはポルタ・ド・ラ・リヴァら29に記載されています。M9最小培地(M9)バッファーの10 mLで終わりを回転させながら、胚を24°Cの遠心分離管で一晩孵化させます。これは逮捕されたL1幼虫の文化を生み出すでしょう。
- 逮捕されたL1ステージの幼虫のチューブを氷の上に10分間インキュベートし、氷冷1x M9でチューブを上に置きます。
- 遠心分離機を使用して幼虫を600xgで4°Cで5分間ペレットします。 g上清の1-2 mLのみが残るように上清を慎重に吸引する。
- 幼虫のペレットを再懸濁し、マイクロピペットを使用して2μLの懸濁幼虫培養液をガラススライドに移します。ステップ2.5でワームの播種を導くのに役立つ幼虫培養の密度を決定するために、いくつの幼虫が存在するかを数えます。
注:10-15 L1幼虫/1μLの密度は、播種に適しています。 - マイクロピペットを使用して、約100-120 L1ステージの幼虫を60mmOP50プレートに播種するのに必要な幼虫培養量を移送します。例えば、10 L1幼虫/1μLの培養密度を有する幼虫培養の種子10μL。
注:幼虫を播種するために40 μLのボリュームを超えないようにしてください、または余分な液体はOP50芝生を破壊します。培養量が40μLを超える場合は、ステップ2.3~2.4を繰り返して、さらに体積を減らし、幼虫培養の密度を高めます。 - 24°Cでワームを育てる。L1sがプレートに播種された時刻を記録し、定期的に開発段階をチェックして解剖の理想的な時期を特定します。
注:L1sの播種後52時間で、24°Cで培養されたワームは、通常、生殖腺標的PLAの解剖に理想的な段階である若年成人期である。しかし、同期されたワームが成人期に達する実際の時間は、株や潜伏温度によって異なる場合があります。
3. 解剖/生殖腺押出
注:生殖腺を標的とするPLAが正常に動作するためには、生殖腺を押し出すために解剖が必要です。このアプローチは、PLAのためにこのプロトコルを使用して動作する胚を解放することもできます(詳細については、議論を参照してください)。解剖後、陰性対照および実験サンプルの両方を固定し、同時にPLAのために処理される。また、目的とするタンパク質パートナーの発現パターンを実証するために、蛍光共免疫染色23の目的のために追加のサンプルセットを調製することも示唆される。
- 1x M9 + レバミソール(2.5 mM最終濃度)の500 μLを含む時計ガラス皿に30〜40の若い成虫を選びます。ワームを収集した後、慎重に除去し、ワームと一緒に転送される細菌を除去するためにメディアのほとんどを破棄します。
- 1x M9 + レバミソールの新鮮な500 μLを加え、ピペットを使用して穏やかに描画し、メディアを分配してワームをすすきます。慎重に除去し、ワームと一緒に転送される細菌をクリアするために、メディアのほとんどを破棄します。
- すべての細菌が除去されるまで、このステップ2x-3xを繰り返します。水和を保つために、約100μLの培地にワームを残します。
注:これは解剖中に生殖腺の押し出しを損なうため、ワームが7分以上メディアに座らせないでください。顕微鏡を解剖して、虫が失われないようにメディアの除去を監視する方法で、打ち上げを行います。
- すべての細菌が除去されるまで、このステップ2x-3xを繰り返します。水和を保つために、約100μLの培地にワームを残します。
- ガラスまたはポリエチレンピペットを使用して、0.001%ポリL-リジンでコーティングされた25 mm x 75 mm顕微鏡スライドにワームを移す(この手順で使用されるスライドはエポキシコーティングされた周長を有し、3つのワークスペース、それぞれ14 mm x 14 mmを残す)。余分なメディアを取り除き、約10~15μLのメディアが残るようにします。
- 解剖顕微鏡の助けを借りて、2つの261/2ゲージ針を使用して、端がハサミを形成するように片方の針をもう一方の針の上に置きます。この方法で向いた針を使用して、細菌を解放するために咽頭の後ろにワームをカットします。5分以内にすべてのワームを解剖します。
注: 解剖の実行方法の詳細については、Gervaise と Arur30の前の文書で見つけることができます。 - すべてのワームを解剖した後、スライドに対して垂直になるように、スライドの上に22 mm x 40 mmのカバースリップをそっと置きます。カバースリップの端部がスライドから垂れ下がるはずです。
- ドライアイスに保持されている冷やされたアルミニウムブロックのスライドを少なくとも20分間凍らせます。
4. 固定/ブロック
- 固定の準備ができたら、鉛筆や他の鈍い刃のツールでカバースリップをフリックし、すぐに新鮮な氷冷メタノール(-20°Cに冷やして)を含む瓶にスライドを1分間浸します。
- サンプルを取り囲むスライドの端を静かに拭き取り、次の試薬がサンプルの周りの表面張力によって保持されるようにします。150 μL の固定液(2% ホルムアルデヒド 100 mM KH2PO4、pH = 7.2)を RT で 5 分間塗布します。
注:メタノール/アセトン固定手順31、32をテストし、PLA32反応と互換性があることを発見しました。 - 固定剤がスライドから飛び出してペーパータオルに吸収できるように、スライドをペーパータオルに90°垂直にタッチします。1x PBS/1% トリトンX-100/1%ウシ血清アルブミン(PBT / BSA)の50 mLを持つコプリン瓶のRTで15分間2倍のスライドをスライドさせます。
注:このブロッキングステップとセクション6-9の洗浄手順には、コプリン瓶やその他のタイプの染色瓶をお勧めします。これらはサンプルとのブロッキングまたは洗浄バッファーの効率的な交換のための十分な量を提供する。 - 10%の正常なヤギの血清を含むPBT/BSA溶液とのブロックスライド。スライドを囲むエッジを静かに拭き取り、100 μLのソリューションをスライドに適用します。湿度の高いチャンバーでRTで1時間インキュベートする。
注:このステップは、αFLAG一次抗体で染色する場合に強くお勧めします。湿気の多い部屋は、それらがインキュベートとして置くためにスライドのためのテープでガラスピペットを固定することによって構築されます。減衰したタスクワイプ(材料表)は、蒸発を防ぐためにトレイの内部湿度を上げるためにトレイに置かれます。蓋とトレイは、光に敏感なステップの間に光からサンプルを保護するためにホイルで覆われています。 - ペーパータオルの上にスライドを置き、PBT /BSA/10%NGS溶液をスライドから外し、スライドの端を静かに拭きます。スライドをブロックするには、ブロッキング試薬(材料表)を使用します。14 mm x 14 mm のスペースに 1 滴を塗布します。湿気の多いチャンバーで37°Cで1時間の間のインキュベートスライド。
5. 一次抗体インキュベーション
注:最良のPLA結果と最小限の背景を得るためには、一次抗体の希釈因子は最適化を必要とするかもしれません(詳細については、議論を参照)。さらに、PLAに使用される二次抗体の特異性に一致する異なる宿主において、一次抗体を育てるべきです。
- ペーパータオルの上にスライドを置き、ブロッキング試薬をスライドから外し、端を静かに拭きます。抗体希釈剤(材料表)を使用して、一次抗体を希釈します。14 mm x 14 mm スペースあたり 40 μL の一次抗体溶液を塗布します。
- 4°Cで一晩湿気の多いチャンバーに滑り込み。.
6. PLAプローブ(二次抗体)インキュベーション
メモ:手順6~9では、RTで洗浄バッファAとBを使用してください。バッファーが4°Cで保存されている場合は、使用する前にRTに温めてみましょう。
- コップリン瓶のRTで50 mLの1x洗浄バッファーA(材料表)で5分間スライド2倍を洗浄します。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。
- ペーパータオルの上にスライドを置き、洗浄バッファーをスライドから流し、端を静かに拭きます。PLUSおよびMINUSプローブを含む40μL溶液を調製(抗体希釈剤で1:5希釈)。14mm x 14 mmの各スペースに溶液を塗布します。
- 37°Cで1時間湿度の高いチャンバーに滑り込みスライドをインキュベートする。
7. ライゲーション
- コップリン瓶のRTで50 mLの1x洗浄バッファAで5分間スライド2倍を洗います。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。
- ライゲーションバッファー (材料表) を超純水で 1:5 希釈します。このバッファーを使用してリガーゼ(材料表)1:40 を希釈し、ライゲーション溶液の作業ストックを調製します。
- ペーパータオルの上にスライドを置き、洗濯バッファーをスライドから流し、端を静かに拭きます。各14 mm x 14 mm のスペースに、40 μL のライゲーション溶液を塗布します。
- 37°Cで30分間、湿気の多いチャンバーに滑り込みスライドをインキュベートします。
8. 増幅
注:赤い蛍光体(材料表)を含む検出試薬を使用すると、C.エレガンス組織の背景の量が最も少ないです。
- コップリン瓶のRTで50 mLの1x洗浄バッファAで5分間スライド2倍を洗います。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。
- 増幅赤バッファー(材料表)を超純水で1:5希釈します。このバッファーを使用してポリメラーゼ(材料表)1:80 を希釈し、増幅液の作業ストックを調製し、光から保護します。
- ペーパータオルの上にスライドを置き、洗濯バッファーをスライドから流し、端を静かに拭きます。各14mm x 14mmのスペースに40μLの増幅液を塗布します。
- 37°Cで1時間40分間、湿気の多いチャンバーに滑り込み。.湿気の多いチャンバーが光からサンプルを保護するためにホイルで覆われていることを確認してください。
9. 最終の打ち上がり
- コップリン瓶のRTで1x洗浄バッファーB(材料表)の50 mLで10分間スライド2倍を洗浄します。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。
- コップリン瓶のRTで0.01x洗浄バッファBの50 mLで1分間スライド1倍を洗います。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。この緩衝液は、洗浄緩衝液Bを超純水で希釈して調製する。
10. カバースリップマウント
- 余分な洗浄バッファーをペーパータオルにスライドから流し、スライドのエポキシコーティングされた周囲に残っている残りのバッファーを拭き取ります。
- 10 μLの取り付け媒体(材料表)を加えてサンプルを取り、カバースリップを上にそっと置き、取り付け媒体を広げます。
- カバースリップとスライドを密封するためにマニキュアでカバースリップの端の周りにペイントします。生殖細胞系を損傷するカバースリップを動かさないようにマニキュアの塗布に優しくしてください。マニキュアはRTで少なくとも20分間硬化させ、スライドは光から保護してから顕微鏡で見ます。
- PLA ラベルのサンプルは光に敏感なので、暗い容器またはスライドホルダにスライドを保管します。メーカーは、スライドが長期保存のために-20 °Cで、短期保存のために4°Cで保存することができることを示唆しています。このプロトコルを使用して作成したスライドは、20°Cで保存すると少なくとも2ヶ月間持続します。
11. 画像の取得
- 定量化を目的として、共焦点顕微鏡を使用して、明確な視界、損傷のない、遮るもののない突出性生殖細胞の画像をキャプチャします。Z平面の生殖細胞系列全体に及ぶ生殖細胞系列のZスタックをキャプチャし、定量に使用する最大投影画像を生成します。
注意:共焦点顕微鏡は、蛍光顕微鏡を用いて得られるものに比べ、背景の少ないPLA画像を取得し、定量するのに理想的です。- 生殖細胞系列が1つの視野に収まらない場合は、必要に応じて重なり合う視野を捉えて、生殖細胞系列全体を画像化する。これらの画像の最大投影は、フィジーで一緒にステッチすることができます。
- 画像解析中の病巣の識別に適した適切な閾値を設定するために、コントロールと実験サンプルの間で画像処理条件を同じに保つようにしてください。
注: PLA定量の統計分析を容易にするために、各サンプルから反復ごとに少なくとも8-10の生殖細胞を記録してください。PLAが信頼性の高い一貫した定量的結果を得るためには、少なくとも3つの生物学的複製が推奨されます。
12. フィジー/イメージJを用いた画像分析と定量
注: 次のワークフローは、イメージが .czi 形式で保存される共焦点顕微鏡上の 40x 目的を使用して取得した画像に基づいています。これらの .czi イメージとそれに付随するメタデータ (寸法を含む) は、フィジー/ImageJ でアクセスして開いて、さらに分析することができます。フィジーが特定のユーザが利用できる共焦点からコンフォーカルファイルのフォーマットを受け入れるかどうかをチェックする必要があります。そうでなければ、.tiff形式の画像を分析に使用することもできますが、ユーザーは、フィジー/ImageJで手動で画像のスケールを設定する必要があります (分析 |スケールを設定します。すべての陰性コントロール イメージを最初にまとめて分析し、背景のレベルを設定することをお勧めします。
- まず、すべての負のコントロール画像を分析して解析ワークフローを開始し、次に実験サンプルに進みます。分析するフィジー/ImageJで最大投影画像を開きます (図 2A)。czi ファイルを使用している場合は、バイオフォーマットインポートオプションボックスが表示されます。
- イメージを開くには、次のオプションを含めます。カラーモード =カラー化.イメージが表示されたウィンドウがスライド バー付きに開き、共焦点 (DAPI や PLA など) によってキャプチャされた異なるチャネルを切り替えるようになりました。
- 画像をステッチする必要がある場合は、マウスで画像を右選択し、[Duplicate](複製)ウィンドウを開く場合は[Duplicate](複製)を選択して、各画像から各チャンネルの複製を作成します。PLA または DAPI チャネルに対応するチャネル番号 (c) のみを指定し (例えば、2)、ハイパースタックの複製のチェックボックスをオフにします。
- 両方の画像を開いてステッチして、プラグインを選択 |ステッチング |非推奨 |2Dステッチ.[2D 画像のステッチ]ウィンドウが開きます。ステッチに使用する画像を選択し、ウィンドウでプリセットされているデフォルトのパラメータを使用して、[OK]を選択します。結果の画像は、組み立てられたグレースケールイメージになります。
注: サブイメージが完全に整列しない場合は、パラメータを調整します(つまり、チェックするピーク数を5から500に増やすか、融合方法をリニア ブレンドから Max に変更します)。強度)は、所望の画像を得るのに役立つかもしれません。他のステッチツールは利用できますが、この方法では画像の次元が保持されるため、定量化に重要です。
- キーボードのTキーを押して ROI (対象地域) マネージャーを開きます。ROI マネージャという名前の新しいウィンドウが開きます。
- フィジーツールセットボックスからポリゴンツールを選択します。生殖細胞系列の周囲をドロップして、それをアウトライン化して ROI を生成します (図 2B)。最後のドットを最初のドットに接続して、完全な ROI を生成します。
注意:画像が暗い場合は、より正確に輪郭を描くことができるように、(可逆的な)生殖細胞系列の可視性を向上させるためにコントラストを調整すると便利です。- ROI が完了したらすぐに ROI マネージャに移動し、[追加][t]を選択して ROI を保存します。ROI のポイントの追加/削除、ROI およびポイントの移動など、ROI に対する変更は、次の手順に進む前に更新 ([ROI マネージャから更新] を選択) することが不可欠です。ROIとそのポイントの操作に関する詳細は、FIJI/ImageJユーザーガイドを参照してください。
- ROI の向きを設定したら、ROI マネージャで ROI 名を選択し、[詳細] をクリックして後で参照できるように保存できます。保存 |(ファイル名を指定し、保存先を指定します)。保存された ROI を ROI マネージャで開くには、[その他] を選択します。開く |(ファイルを選択する)
- ROI マネージャから ROI 名を選択し、ROI マネージャの[測定]ボタンを選択して、ROI 内の領域を測定します。結果ウィンドウが開き、画像(μM2)(図2Bのインセット)でカバーする領域を含むROIに関する情報が表示されます。この情報をスプレッドシートに記録して、後続の計算を行います。
注: ROI の正しいサイズが収集されるように、イメージのスケールが正しく設定されていることを確認してください。[結果] ボックスに報告された測定の種類は、[分析] |測定を設定します。 - PLA チャンネルのみの複製イメージを開くには、PLA イメージを右クリックし、[複製] を選択します (図 2C)。複製ウィンドウが開きます。PLA チャネルに対応するチャネル番号 (c) のみを指定し (例えば、2)、ハイパースタックの複製のチェックボックスをオフにします。元のイメージが変更されないように、このイメージの複製を使用することをお勧めします。
注:これらのオプションは、FIJI /ImageJで複数のチャンネルを含む画像を表示する場合にのみ表示されます。別のアプローチは、チャンネルを分割する画像 |色 |[チャネルを分割] をクリックしますが、元のイメージ ファイルが変更されます。 - 選択したPLAチャンネルの画像のみで、画像|調整 |しきい値:イメージのしきい値ウィンドウが開きます。しきい値の方法として[既定値]を選択し、色として[赤] を選択し、[背景の濃い] ボックスをオンにします。ウィンドウの上部のトラックを使用して、すべてのPLAの病巣が画像で明確にハイライトされるまで、右に向かってバーをスライドさせます。
- 上部トラックの右側にあるボックスに値を記録し、しきい値の設定に使用された値をメモします。しきい値ウィンドウで[適用]を選択してしきい値を確定すると、画像は黒い点として表示されるしきい値フォシのみを含む白い背景に変換されます(図2D)。複数の陰性制御イメージでしきい値をテストし、定量前に画像から画像まですべてのPLA病巣をキャプチャするのに適していることを確認します。
注: 白い背景に黒い点としてしきい値の病巣を表示するには、プロセス |バイナリ |オプション.をクリックし、[黒の背景] ボックスをオフにします。30~40のしきい値は、生殖細胞系列のPLAを識別するための良い出発点です。ただし、理想的な値は背景によって異なる場合があります。
- 上部トラックの右側にあるボックスに値を記録し、しきい値の設定に使用された値をメモします。しきい値ウィンドウで[適用]を選択してしきい値を確定すると、画像は黒い点として表示されるしきい値フォシのみを含む白い背景に変換されます(図2D)。複数の陰性制御イメージでしきい値をテストし、定量前に画像から画像まですべてのPLA病巣をキャプチャするのに適していることを確認します。
- PLA の病位を定量化するには、ROI マネージャ ウィンドウから ROI 名を選択して、ステップ 12.3~ 12.3.1 から生成された ROI をしきい値イメージに適用します。ROI のアウトラインは、ソース イメージと同じ場所にイメージに表示されます (図2E)。
- 分析に移動|パーティクルの解析:[パーティクルの解析] ウィンドウが開き、次のパラメータが選択されます。 0-Infinity 0.00-1.00 Nothing[集計] ボックスをオンにします。
- [OK]を選択すると、ROI に関する情報 (つまり、PLA 病巣の合計数、ROI 内の PLA 病巣の内部占有領域、PLA 病巣の平均サイズ、および PLA 病巣が占める領域の割合をROIのサイズに対して占める割合) に関する情報が表示されます (図 2Eの設定値)。これらの測定値をスプレッドシートに記録します。
- 同じしきい値を使用して、複数の負のコントロール イメージについて手順 12.1 ~ 12.8 を繰り返します。
- すべての陰性対照画像を解析したら、負のコントロールによって決定されたのと同じ閾値を使用して、すべての実験サンプルについてステップ 12.1~12.8 を繰り返し、PLA病巣を特定して定量します。
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Representative Results
両方の 3xFLAG::DLC-1 の共同免疫染色;GFP と 3xFLAG::DLC-1;OMA-1::FLAG抗体とGFP抗体を用いたGFP生殖細胞は、生殖細胞系列における発現パターンを明らかにした(図3Aii-iii,3Bii-iii)。GFPは生殖細胞系列全体に発現した(図3Aiii),OMA-1::GFP発現は後期パキテネ及び卵母細胞に限定された(図3AiiiBiii)27。27FLAG免疫染色は、3xFLAG::DLC-1が両方の株で生殖細胞系列全体に発現したことを示す(図3Aii,3Bii)。共免疫染色によって、3xFLAG::DLC-1とOMA-1:::GFPの間の重複は、3xFLAG::DLC-1とGFP(陰性対照)の間の重複と区別がつかない。
これらの実験はDLC-1とOMA-1の相互作用について試験したので、生殖細胞におけるPLA定量の対象領域は、検査したすべての生殖細胞を通して後期パキテインを包含した(図2B)、これがOMA−1発現の領域であるように(図1、図3Biii)。3xFLAG::DLC-1;OMA-1::GFP生殖細胞は、3xFLAG::DLC-1と比較して、この領域内でより多くのPLA病巣を有するように見えた。GFP生殖細胞系列(図3Ciii-iv,3Diii-iv)。PLAの定量化は、3xFLAG::DLC-1に存在するPLA病巣の数を明らかにした。OMA-1::GFP生殖細胞は3xFLAG::DLC-1より有意に大きかった。GFP (図 3Ciii-iv,3Diii-iv;表 1)。さらに、GFPおよびFLAG抗体の10倍高い希釈量を有しても、対照と実験PLAの差は依然として有意に異なっていた。しかしながら、全体的な密度と病巣の平均サイズは減少した(表1)。
図1:C.エレガンス生殖細胞系列の概略図。遠位先端領域には幹細胞プールが含まれており、その後に細胞が有糸分裂から重症に切り替わったマイオティックパチテンが続く。大尾パチテンを出る細胞は卵母細胞に発達し、最も成熟した卵母細胞は近位端に現る。緑色の色で囲まれた領域は、後期の大母細胞からすべての卵母細胞を通る範囲で、OMA-1パターンの発現を表す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:生殖細胞系列PLA定量化のワークフローの代表的な画像。この図で使用される生殖細胞系列は、代表的な 3xFLAG::DLC-1 です。図3CからのGFP生殖細胞系列.(A) フィジー/イメージJで開かれたマージされたPLAおよびDAPIチャネルのイメージ。(B) フィジーのポリゴンツールは、定量化された生殖線(白いボックスを持つ黄色い線)の関心領域(ROI)を概説して定義するために使用され、ROI(μM2)の面積が測定されます(Bのインセット)。(C) PLA チャンネルの単一イメージは、元の画像を (A,B) に複製または分割することによって取得されます。(D) しきい値は、PLA イメージ内のすべての PLA 病巣を明確に強調表示するように慎重に設定されます。同じしきい値を、一緒に分析するすべての実験画像と制御画像に適用する必要があります。(E) しきい値イメージで ROI を選択すると、パーティクルの解析機能は ROI 内に含まれる病巣の合計数 (E の差し込み値) を含む結果のテーブルを返します。画像はフィジー/イメージJからのスナップショットです:プラグイン |ユーティリティ |イメージのキャプチャ:スケールバー= 10 μM.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:共免疫染色またはPLAに続く生殖細胞の代表的な画像。(A,B)3xFLAG::DLC-1 におけるタグ付きタンパク質の発現パターンGFP (Ai-iv) および 3xFLAG::DLC-1;OMA-1:::GFP(Bi-iv)は、解剖、固定、および免疫染色された生殖腺で評価した。抗FLAG抗体は1:1000希釈で使用され、抗GFP抗体は1:200希釈で使用され、免疫蛍光画像に最適です。DNAはDAPIによって染色され、個々のチャネルはより良いコントラストのためにグレースケールで示されている(Aiv,Biv)。各画像では、幹細胞と大動脈パキテーンは破線で輪郭を描かれ、卵母細胞は点線で輪郭を描いています。画像は、蛍光顕微鏡で取得した。スケールバー = 10 μM. (C,D) 立ち上げ中の PLA 3xFLAG::DLC-1;GFP (C) および 3xFLAG::DLC-1;OMA-1::GFP(D)生殖腺。抗FLAG抗体は1:1000希釈で使用され、抗GFP抗体は1:4000希釈時に使用されました。DNAはDAPIによって染色され、個々のDAPI(Cii,Dii)およびPLAチャネル(Ciii,iv,Diii,iv)の両方が、より良いコントラストのためにグレースケールで示されている。緑色の破線ボックス(Ciii,Diii)は、ズームイン PLA 画像(Civ,Div)の位置を示します。各画像では、幹細胞と大動脈パキテーンは破線で輪郭を描かれ、卵母細胞は点線で輪郭を描いています。画像は共焦点顕微鏡で取得した。スケールバー = 10 μM(A,B,C,D)はすべて画像処理ソフトウェアで組み立てられました(材料表を参照)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 抗体希釈液 | ひずみ試験済み | 平均PLA密度(病巣/μM2)X10-2 | Tテスト | PLAフォチの平均サイズ(μM2) | Tテスト |
| αFLAG (1:1000), αGFP (1:4000) | 3xFLAG::DLC-1;Gfp | 3.9 ± 1.4 | P = 1.917E-05 | 0.52 ± 0.127 | P = 0.057 |
| 3xFLAG::DLC-1;オマ-1::GFP | 9.1 ± 2.7 | 1.8 ± 2.08 | |||
| αFLAG (1:10,000), αGFP (1:40,000) | 3xFLAG::DLC-1;Gfp | 3.2 ± 2.4 | P = 3.395E-04 | 0.51 ± 0.1 | P = 0.019 |
| 3xFLAG::DLC-1;オマ-1::GFP | 7.7 ± 3 | 0.7 ± 0.24 |
表1:PLA結果の概要一次抗体の2つの希釈におけるPLA定量の概要を報告する表。OMA-1のPLA病巣の平均PLA密度または平均サイズの違いは有意ではなかった(p値は示されていない)。GFPにも同じ比較が適用され、有意差は生じなかった(p値は示されていない)。p値は、両側/等分散t-testを用いて決定した。
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Discussion
C.エレガンス生殖細胞系列でPPIを研究する際、PLAが提供する高解像度は、共免疫染色と比較して、生殖細胞系列で相互作用が起こる場所の視覚化と定量化を可能にする。DLC-1は、IN VITRO GSTプルダウンアッセイ26を使用してOMA-1と直接相互作用することが報告されました。しかし、この相互作用は in vivo プルダウンでは回復されませんでした。3xFLAG::DLC-1の蛍光共免疫染色;OMA-1::GFP生殖細胞系は、DLC-1とOMA-1の発現パターンに重複を示す。しかし、生殖細胞系列でどこで相互作用が起こるかの兆候はなく、重複自体は3xFLAG::DLC-1とGFPの間のタンパク質(陰性対照)との間のそれより大きくはない。Situ PLAを用いて、DLC-1が生殖細胞系列のOMA-1と相互作用することが判明し、PLAは他のアプローチと比較してPPIの検出に対してより敏感である可能性があることを示唆した。このアプローチを通じて、RBPの補因子としてのDLC-1の新たな役割を拡大し続けています。この研究は、生殖細胞系列中のPPIを検出するPLAの能力を実証し、将来のユーザーが自分の興味を持つタンパク質間の相互作用を探求するための参照を確立する。
PLAは、FRETやBiFCなどの他の技術に関連する欠点なしに、同等の感度でPPIをテストする機能を提供します。生物学的に関連するレベルのタンパク質発現は、FRETおよびBiFCに最適でない場合があります。また、潜在的な相互作用パートナーの機能は、両方のアプローチで使用される大きなタグの影響を受ける可能性があります。さらに、FRETアッセイは、容易に入手できない可能性のある特殊な顕微鏡のセットアップを必要とします。PLAはまた、他の技術と比較してPPIを研究するための費用対効果の高いアプローチである可能性があります。ユーザーは、PLA試薬を取得し、免疫染色に必要な試薬に加えて、画像化のための共焦点顕微鏡にアクセスするだけで済みます。画像解析はオープンソースプログラムFIJI/ImageJを使用して実行され、任意のユーザーが無償で利用できます。FRETまたはBiFCの経験がないユーザーは、PLAが適切な代替手段であると感じるかもしれません。ここで示すプロトコルには、一般的な免疫染色手順を超えたいくつかの追加ステップのみが含まれているため、この技術は免疫染色経験を持つすべてのユーザーが事実上アクセスできます。
解剖による生殖腺の押し出しは、PLAが正常に動作するために重要です。ワームキューティクルの内部に保持されている組織は、このプロトコルを使用してPLAによってラベル付けされません。押し出された胚は、このPLAプロトコルによって効果的に標識されていることがさらに分かった。これは、腸管などの解剖中に放出される他の組織もPLAと互換性がある可能性が高いことを示唆している。PLAは、生殖腺に強いシグナルを生成するだけでなく、免疫染色によく使用される2つの固定プロトコルで調製された胚サンプルを生成することが判明しました。これは、現場で使用される追加の固定手順はPLAと互換性があるかもしれないが、ユーザーが個別に評価する必要があることを示唆している。
PLAを成功させるためには、一次抗体の最適希釈を決定することが重要です。免疫蛍光に最適化された希釈から始めるのが最適です。これは通常、免疫蛍光実験で一次抗体を測定し、バックグラウンドが低く、特定のシグナルが高い最適希釈を見つけることによって達成されます。免疫蛍光に最適な希釈が確立されると、これらの同じ希釈は、潜在的なインターアクターのペアによって生成されたシグナルを非相互作用タンパク質の対照ペアによって生成されたシグナルと比較するPLAアッセイでテストすることができます。
対照試料に豊富なシグナルが認められる場合には、一次抗体のさらなる希釈が必要である。PLAに最適な一次抗体希釈は、免疫蛍光に用いられるものと少なくとも同じか、あるいはより希薄であることがわかった。例えば、図3A,Bの免疫蛍光画像は、1:1000の抗FLAG希釈および1:200希釈の抗GFPを表す。しかしながら、図3C,DのPLA画像における抗体希釈は、抗FLAGの1:1000および抗GFPの1:4000であった。PLAで使用される抗GFP抗体の希釈は、免疫蛍光に使用されたものよりも大きく、PLAがはるかに敏感であることを示唆している。抗体を10倍希釈すると、さらにPLA密度の減少、ならびにDLC-1/OMA-1病巣のサイズが低下することが分かった(表1)。この減少にもかかわらず、陰性対照とDLC-1/OMA-1の間のPLA密度の差は依然として有意に異なっていた。これは、PLAが一次抗体のより高い希釈で依然として非常に敏感であることを示唆している。しかし、検出可能な相互作用の有病率は過小評価されます。
対照的に、抗体希釈の低すぎると、2種類の有害な結果が生じる可能性があります。第1に、陰性制御において有意なバックグラウンド信号を生じ得る。第二に、相互作用するパートナータンパク質によって産生されるPLA病巣が結合して重なり合い、最大投影画像で解決することが困難になる可能性がある。これは、画像解析中のPLA病巣数と密度の過小評価につながります。PLAシグナルは、相互作用していないパートナー間のスプリアス近接を検出し、サンプルで発生する実際のPPIのすべてのインスタンスを検出するバランスです。その結果、2つのタンパク質が相互作用しない陰性制御の組み込みは、PLA実験における背景レベルを決定するために不可欠である。PLA実験における一次抗体の省略は、他の報告書99,1010において陰性対照として用いられている。しかし、このアプローチは、非特異的相互作用や非特異的抗体結合を考慮できず、実験PLAの結果に影響を与える可能性があります。DLC-1とGFPの間の直接的な相互作用は期待されなかったため、GFPはネガティブコントロールとしてここで使用されました。負のコントロールにはバックグラウンドシグナルがあることがわかりました。この機能は、実験データを評価する際のPLAアッセイに対する陰性制御の重要性をさらに支持する。
PLA 最適化希釈が確立されると、これらの希釈を使用して、同じアフィニティ タグでタグ付けされた異なるペアの相互作用パートナーを含むさまざまなワーム株の配列でテストできます。抗体アフィニティーの変動がPLA実験の結果に影響を与える可能性があるため、同じ一次抗体ペアを使用して、得られるPLAシグナルの公正な比較を確実にすることが重要です。PLAに関する別の報告は、PLA二次抗体10の希釈を最適化することを示唆している。ただし、これはお勧めできません。二次抗体のより高い希釈は、二次抗体に結合されるPLUSおよびMINUSプローブの認識に依存する他の下流PLAステップの有効性を低下させる可能性がある。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究で使用されるいくつかの線虫株は、NIH(P40OD010440)が資金を提供するカエノールハブディティス遺伝学センターによって提供された。共焦点顕微鏡は、NIHアワードP20GM103546およびS10OD021806の支援を受けて運営されているモンタナ大学バイオスペクトロスコピーコア研究所で行われました。この研究の一部は、NIHがE.V.にGM109053を付与し、アメリカ心臓協会フェローシップ18PRE34070028をX.W.に、モンタナ科学アカデミー賞X.W.に支援しました。資金提供者は研究デザインや報告書の執筆に関与していなかった。M・エレンベッカーの話し合いに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
| 1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
| 1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
| 1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
| 26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
| BSA | Lampire | 7500802 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
| Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
| Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
| Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
| Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
| DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
| Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
| Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
| Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
| MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
| PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
| Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
| Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
| Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
| Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
| Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
| Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
| Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
| Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
| Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
| Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
| Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
| Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
| Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
| Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
| Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
| Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
| task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4x8.4 inch task wipes |
| Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
| Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
| Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
| Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
| -20 °C freezer | |||
| -80 °C freezer | |||
| Aluminum Foil | |||
| OP50 strain E. coli | |||
| Orbital Shaker | |||
| Tape | |||
| Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
| mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
| mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |
References
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