Summary
Presentato qui è un protocollo per valutare le proprietà contraili dei miofibrili muscolari striati con risoluzione nano-Newton. Il protocollo utilizza una configurazione con una sonda a forza ottica basata sull'interferometria. Questa configurazione genera dati con un elevato rapporto segnale-rumore e consente la valutazione della cinetica contrattinale delle miofibrils.
Abstract
Le cellule muscolari striate sono indispensabili per l'attività di esseri umani e animali. Le fibre muscolari singole sono costituite da miofibrils, che consistono in sarcomere collegati in serie, le più piccole unità contraili nel muscolo. La disfunzione sarcomerica contribuisce alla debolezza muscolare nei pazienti con mutazioni nei geni che codificano per le proteine sarcomeriche. Lo studio della meccanica miofibrile consente la valutazione delle interazioni actin-myosin senza potenziali effetti confusi di miofibrili danneggiati e adiacenti quando si misura la contrattilità delle singole fibre muscolari. I danni ultrastrutture e il disallineamento dei miofibrils potrebbero contribuire a una contrattura compromessa. Se nei miofibrils sono presenti danni strutturali, probabilmente si rompono durante la procedura di isolamento o durante l'esperimento. Inoltre, gli studi in miofibrils forniscono la valutazione delle interazioni actin-myosin in presenza dei vincoli geometrici dei sarcomere. Ad esempio, le misurazioni nei miofibrils possono chiarire se la disfunzione miofibrillare sia l'effetto primario di una mutazione in una proteina sarcomerica. Inoltre, la perfusione con soluzioni di calcio o composti è quasi istantanea a causa del piccolo diametro del miofibril. Questo rende myofibrils eminentemente adatto a misurare i tassi di attivazione e rilassamento durante la produzione di forza. Il protocollo descritto in questo documento utilizza una sonda di forza ottica basata sul principio di un interferometro Fabry-Pérot in grado di misurare le forze nella gamma nano-Newton, accoppiato a un motore di lunghezza piezo e un sistema di perfusione in fase rapida. Questa configurazione consente lo studio della meccanica miofibrile con misurazioni della forza ad alta risoluzione.
Introduction
Le cellule muscolari striate sono indispensabili per le attività quotidiane. Il movimento degli arti, la funzione respiratoria e il movimento di pompaggio del cuore si basano sulla forza generata dalle cellule muscolari. Il muscolo scheletrico è costituito da fascicle muscolari contenenti fasci di fibre muscolari singole (Figura 1A). Queste fibre muscolari sono costituite da miofibrils, che sono formate da sarcomere collegati in serie (Figura 1B,D). I sarcomere contengono filamenti sottili e spessi. Questi consistono principalmente in catene di molecole di actina e miosina, rispettivamente (Figura 1B). Le interazioni Actin-myosin sono responsabili della capacità di generazione della forza del muscolo. I pazienti con mutazioni nei geni che codificano per le proteine sarcomeriche, come la nebulina, l'actina e la troponina T, soffrono di debolezza muscolare dovuta alla disfunzione contrattile1.
La qualità della contrattilità muscolare può essere studiata a vari livelli di organizzazione, che vanno dai muscoli interi in vivo alle interazioni actin-myosin nei saggi di motilità in vitro. Nel corso degli ultimi decenni, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato configurazioni per determinare la contrattilità dei singoli myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10. Queste configurazioni si basano sul rilevamento dei cambiamenti nella deflessione laser da un cantilever (cioè, deflessione del fascio ottico) causati dalla contrazione del miofibril (per i dettagli, vedere Labuda et al.11). Anche se determinare la funzione contrattile delle miofibrils ha alcune limitazioni (ad esempio, le dinamiche dei processi di accoppiamento eccitazione-contrazione che sono a monte delle miofibrils sono carenti), ci sono molteplici vantaggi a questo approccio. Questi includono: 1) la capacità di valutare le interazioni actin-myosin in presenza dei vincoli geometrici dei sarcomere; 2) la capacità di valutare le interazioni actin-myosin senza potenziali effetti di confusione di miofibrili danneggiati e adiacenti (quando si misura la contrattilità delle singole fibre muscolari danno ultrastrutturale e disallineamento delle miofibrils potrebbe contribuire a contrarre alterata)(Figura 1D); 3) il piccolo diametro dei miofibrili (1 m, Figura 2A) e la mancanza di membrane consentono una diffusione quasi istantanea del calcio nei sarcomere. Inoltre, se nei miofibrils sono presenti danni strutturali, probabilmente si rompono durante il loro isolamento o durante l'esperimento. Quindi, valutare la contrattilità miofibrile è un metodo elegante per studiare i meccanismi di base della contrazione muscolare e per capire se le interazioni actin-myosin disturbate sono la causa principale della malattia muscolare causata da mutazioni nelle proteine sarcomeche.
Questo protocollo presenta una configurazione di recente sviluppo per determinare la contrattilità delle miofibrils che incorporano una sonda di forza a sbalzo con risoluzione nano-Newton (cioè Optiforce). Questa sonda di forza si basa sul principio dell'interferometria. L'interferometria consente l'uso di sbalzosi relativamente rigidi. Questo permette di misurare la forza con poca deflessione del cantilever, avvicinandosi alle contrazioni isometriche del miofibrile. La sonda consente la valutazione di forze basse passive e attive prodotte da un singolo miofibrile isolato da diverse biopsie muscolari, comprese quelle di soggetti umani, con un elevato rapporto segnale-rumore. La sonda ottica a sbalzo incorporata in questa configurazione si basa su un interferometro Fabry-Pérot12. L'interferometro rileva piccoli spostamenti tra una fibra ottica e un cantilever rivestito in oro montato su un ferrule(Figura 3). Il divario tra la fibra ottica e il cantilever è chiamato cavità Fabry-Pérot. I myofibrils sono montati tra la sonda e il motore piezo utilizzando due fibre di montaggio in vetro rivestite di colla. La forza prodotta dal miofibrile può essere derivata matematicamente dai dati dell'interferometro. L'interferometria si basa sulla sovrapposizione o sull'interferenza di due o più onde (in questa configurazione tre onde luminose). La luce laser con una lunghezza d'onda compresa tra 1.528,77–1.563,85 nm viene emessa dall'interferometro e viene inviata attraverso la fibra ottica. Nella sonda, la luce viene riflessa 1) all'interfaccia tra la fibra ottica e il mezzo (Figura 3A); 2) all'interfaccia del mezzo e del cantilever (Figura 3B); e 3) all'interfaccia tra il rivestimento in metallo e oro del cantilever (Figura 3C). La reflection all'interfaccia A e B dipende dall'indice di rifrazione (n) del mezzo in cui la sonda è sommersa. La luce, costituita dai tre riflessi sovrapposti, ritorna ad un fotodiode nell'interferometro. Il fotodiode misura l'intensità della luce, che è il risultato del modello di interferenza dei tre riflessi sovrapposti. Quando la forza contrattile viene generata attivando o allungando un miofibril, il miofibrile tira sul cantilever. Questo movimento cambia la dimensione della cavità (d) e, di conseguenza, il numero di lunghezze d'onda che si adattano alla cavità. La luce riflessa sul cantilever avrà una fase diversa, con conseguente un diverso modello di interferenza. Il fotodiode registra questo cambiamento di intensità del modello di interferenza come un cambiamento in Volts. Successivamente, la generazione di forza miofibrile viene calcolata da questo cambiamento, tenendo conto della rigidità a sbalzo. La sonda di forza è calibrata dal produttore spingendo la punta dell'ago di montaggio, attaccata all'estremità libera del cantilever, contro una bilancia di pesatura mantenendo la piegatura dello sbalzo pari a un multiplo della lunghezza d'onda del laser di lettura13. Pertanto, l'interferometria è un metodo altamente sensibile per rilevare piccoli cambiamenti di distanza, consentendo la misurazione delle forze con risoluzione nano-Newton. Questa risoluzione consente di valutazione della produzione di forza miofibrillare con un elevato rapporto segnale-rumore. Mentre l'interferometria tradizionale limita la gamma di misure alla parte lineare della curva di interferenza, l'utilizzo di un amplificatore lock-in e della modulazione della lunghezza d'onda lasersupera questa limitazione 14. Ciò è spiegato in modo più dettagliato nella sezione di discussione.
Per misurare la tensione attiva miofibrile, è stato incorporato un sistema di perfusione in fase rapida per esporre il miofibril alle soluzioni di calcio (Figura 4A). Il sistema di perfusione a passo rapido consente di apportare modifiche alla soluzione entro 10 ms. A causa del loro piccolo diametro, la diffusione del calcio nelle miofibrils è quasi istantanea. Pertanto, questo sistema è particolarmente adatto per misurare i tassi di legame actin-myosin durante l'attivazione e il rilascio durante il rilassamento. La velocità di attivazione (kACT) e il rilassamento (kREL) possono essere determinati dalle curve di attivazione-rilassamento. Inoltre, esponendo i miofibrili a soluzioni di calcio di crescente concentrazione, è possibile determinare il rapporto forza-calcio e la sensibilità al calcio.
Inoltre, un motore di lunghezza piezo consente di allungare e accorciare velocemente il miofibril. Ciò offre la possibilità di studiare le proprietà viscoelastiche (cioè la tensione passiva) del miofibril, oltre ad eseguire un rapido accorciamento e riposo del miofibril per determinare il tasso di riqualificazione della tensione (kTR). I parametri recuperati dagli esperimenti di tensione attiva e passiva possono essere alterati da mutazioni genetiche in una proteina sarcomerica.
Questa configurazione su misura è stata utilizzata per misurare le caratteristiche contrattuali attive e passive dei miofibrili isolati dal muscolo scheletrico umano, paziente e topo sano.
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Protocol
Il protocollo per ottenere biopsie umane è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale del VU University Medical Center (#2014/396) e il consenso scritto informato è stato ottenuto dai soggetti. Il protocollo per ottenere biopsie muscolari animali è stato approvato dal comitato etico animale locale presso l'Università VU (AVD114002016501)
1. Preparazione e isolamento miofibrile
NOTA: Utilizzare metodi descritti in precedenza per la glicecinazione delle biopsie, preparare le diverse soluzioni di concentrazione di calcio (pCa)7,16,17e isolare i miofibrils2,18.
- Scongelare le soluzioni rilassanti (pCa 9.0, Rx) e attivanti (pCa 4.5, Act) così come gli inibitori (1 M E64, 1 M DTT, 1 M leupeptin, 1 M PMSF), che sono conservati a -80 gradi centigradi.
- Prendere un pezzo glicerinato di biopsia muscolare striata di circa 1 mm3 e posizionarlo in un piccolo piatto Petri con soluzione 1:1 Rx/glicerolo (v/v) e posizionare il piatto Petri su una piastra fredda a 4 gradi centigradi.
- Dissezionare il pezzo di muscolo utilizzando microscopio di dissezione e forcepi, separando singole fibre muscolari senza isolarle dal pezzo di muscolo.
NOTA: Rimuovere il maggior tessuto grasso e connettivo possibile per prevenire la contaminazione della sospensione miofibrile. - Trasferire il pezzo di tessuto sezionato in un tubo da 5 mL con 1,5 mL di soluzione rilassante con inibitori (1 L/mL E-64, 1 leupeptina l/mL, 1 DTT 1 L/mL e 125 L/mL PMSF). Lasciare che il tessuto si temperi a circa 4 gradi centigradi per 1 h.
- Durante l'incubazione, avviare entrambi i PC, accendere i dispositivi e aprire il software associato (vedere Tabella dei materiali).
- Immergere la sonda di forza in acqua ultrapura in una piastra Petri e calibrare la sonda.
- Premere la 'Start Wizard' sull'interferometro e seguire le istruzioni visualizzate. Dopo aver premuto Calibra, toccare lo stage del microscopio.
NOTA: Toccando lo stadio del microscopio si farà deviare e passare attraverso le frange. Ciò consente la calibrazione della sonda. - Lasciare la sonda immersa nell'acqua ultrapure nella piastra Petri dopo la calibrazione.
- Premere la 'Start Wizard' sull'interferometro e seguire le istruzioni visualizzate. Dopo aver premuto Calibra, toccare lo stage del microscopio.
- Inizializzare la posizione del motore piezo. A tale scopo, seguire uno dei passaggi descritti di seguito.
- Quando il motore piezo verrà utilizzato per la tensione kTR, impostare la lunghezza su 0 m.
Le impostazioni del generatore di segnale sono disponibili nella Tabella 1, Figura 5A. - Quando il motore piezo sarà utilizzato per la tensione passiva, impostare la lunghezza su 50 m.
Le impostazioni del generatore di segnale sono disponibili nella Tabella 1.
NOTA: La differenza tra i passi è la posizione iniziale del motore di lunghezza piezo. Per allungare il miofibril, il motore piezo ha bisogno di tirare per aumentare la distanza tra entrambi gli aghi di montaggio e per allungare il miofibril. Per rallentare il miofibril, il motore piezo deve spingere per diminuire la distanza tra entrambi gli aghi di montaggio e per accorciare il miofibril.
- Quando il motore piezo verrà utilizzato per la tensione kTR, impostare la lunghezza su 0 m.
- Preparare un scivolo al microscopio. Pipetta 150 L di soluzione poliidrossethylmethacrylate (poli-HEMA) (5% poli-HEMA nel 95% di etanolo, w/v) su un condotto al microscopio e stenderlo attraverso lo scivolo in modo che sia tutto coperto.
NOTA: Se una sospensione miofibrile viene pipettata su un faro al microscopio non rivestito, i miofibrili che affondano sul fondo si attaccano al fondo e non sarà possibile incollarli. - Riempire le siringhe con soluzioni pCa (vedere la figura 4A)e prime il sistema di perfusione.
NOTA: In questi passaggi tutti i tubi sono precompilati con la soluzione appropriata per assicurarsi che tutte le bolle d'aria vengano rimosse dal tubo.- Riempire il tubo di afflusso del flusso di fondo della camera di flusso (Figura 3, 4A) afflusso con Rx.
- Quando viene utilizzato, lavare il collettore con acqua ultrapure per rimuovere l'aria. Per farlo, collegare la siringa con acqua ultrapura alla presa e lavare in essa nella direzione inversa. Bloccare le porte inutilizzate del collettore.
- Attivare ogni siringa pCa per riempire i rispettivi tubi con soluzione pCa. Quindi, collegarli al collettore e il Ɵ-vetro.
- Aprire le valvole 1 e 6 con il software del pannello di acquisizione dati (vedere Tabella dei materiali) controllando il pulsante '1 -6' (Figura 6A) per riempire il vetro Ɵ con le soluzioni rilassanti (pCa 9.0) e attivando (4.5) le valvole e le valvole di chiusura quando il vetro Ɵ è riempito (Figura 6B).
2. Montaggio di un miofibril
- Rivestire un vetro al microscopio con poli-HEMA per evitare che i miofibrili si attacchino al vetro.
- Preparare l'omogeneizzatore (vedere Tabella dei materiali) per l'omogeneizzazione dei tessuti. Pulire l'asta del rotore interno con carta vessurica pulita, assemblare l'omogeneizzatore e girare 1x per 15 s in alcool e tre volte per 15 s ciascuno in acqua ultrapura. Prerinsema l'omogeneizzatore nella soluzione rilassante 1 x per 15 s sul ghiaccio.
- Posizionare l'asta omogeneizzatore nel tubo contenente il tessuto muscolare come descritto al punto 1.4 e, mantenendo il tubo sul ghiaccio, far girare il rotore per 15 s alla velocità 5 per strappare il tessuto muscolare e ottenere una sospensione miofibrile.
- Pipette 50 L delle sospensioni miofibrili e 250 dollari della soluzione rilassante sul microscopio rivestito con poli-HEMA nel bagno dei tessuti. Questo formerà una goccia liquida. Coprire il bagno con un coperchio per proteggere dalla polvere e attendere 5-10 minuti per consentire ai miofibrili di affondare sul fondo.
NOTA: Il rapporto tra la sospensione e la soluzione rilassante dipende dalla qualità dell'isolamento, quindi, regolare di conseguenza. Ad esempio, se la resa miofibrile è bassa e nella sospensione sono presenti pochi myofibril adatti, aggiungere altre sospensioni miofibrili e diluire con una soluzione meno rilassante (ad esempio, 75 l di sospensione miofibrile e 225 gradi di soluzione rilassante). Cuore e tessuto muscolare scheletrico è facile da riconoscere a causa del suo modello di striazione. Utilizzando un obiettivo 10x o 40x, questo modello è visibile anche in un singolo miofibril. Nel caso in cui altri tessuti siano presenti nella sospensione, i miofibrili possono essere selezionati visivamente. Si può saltare l'attesa di 5-10 minuti. Tuttavia, questo aumenta la difficoltà di incollare un miofibril. - Cappotto aghi di montaggio con colla (shellac - etanolo; 120 mg shellac in 2 mL di 70% etanolo). Per fare ciò, scaldare la colla a 65 gradi centigradi per 30-60 s e la pipetta n. 6 su un nuovo vetro in vetro non rivestito. Immergere la punta di ogni ago di montaggio nella colla e ripetere fino a quando uno strato di colla è visibile. Spostare la sonda e il piezo verticalmente con i micromanipolatori per fare spazio per posizionare il bagno dei tessuti sullo stadio del microscopio. Rimuovere il vetrerà di vetro contenente la colla.
- Montaggio delle miofibrils
- Posizionare il bagno di tessuto con il giroscopio rivestito con poli-HEMA contenente la sospensione miofibrile sullo stadio del microscopio. Utilizzare il palco per trovare un miofibril adatto con l'obiettivo 40x. Se necessario, spostare e ruotare il bagno di tessuto per spostare il miofibril in una posizione montabile.
NOTA: Cercare i miofibrili con un motivo di striazione visibile che è lungo circa 30 m. Come descritto in dettaglio nei punti 3.1 e 3.2.1, è possibile controllare la lunghezza della lunghezza e del sarcomere prima di incollare il miofibrile. Non incollare myofibrils strappati, perché questi sono suscettibili di rompersi durante la contrazione. - Far scorrere la camera di flusso in posizione direttamente sopra la goccia liquida contenente le miofibrille nel bagno di tessuto (pipettato sul scivolo al punto 2.4) e abbassarlo. Fermati prima che colpisca la goccia di liquido.
- Abbassare l'ago di montaggio piezo e premerlo sulla punta inferiore del miofibrile. Sollevare leggermente per verificare se il miofibril è attaccato all'ago.
- Abbassare la camera di flusso abbastanza lontano per l'ago di montaggio della sonda per raggiungere il fondo senza che la sonda tocchi la camera di flusso.
- Premere l'ago di montaggio della sonda sulla punta superiore del miofibril. Sollevare leggermente per verificare se il miofibril è attaccato all'ago.
- Sollevare il miofibrile dal fondo del bagno il più lontano possibile senza perdere la capacità di messa a fuoco senza l'obiettivo toccare il fondo del vetro.
- Posizionare il bagno di tessuto con il giroscopio rivestito con poli-HEMA contenente la sospensione miofibrile sullo stadio del microscopio. Utilizzare il palco per trovare un miofibril adatto con l'obiettivo 40x. Se necessario, spostare e ruotare il bagno di tessuto per spostare il miofibril in una posizione montabile.
3. Inizializzazione dell'esperimento
- Utilizzare il software micromanulatori, fotocamera e controller di sistema (Figura 7A, vedere Tabella dei materiali) per misurare la lunghezza del sarcomere. Spostare la sonda piezo e/o forzata per impostare la lunghezza iniziale del sarcomere del miofibrile su 2,5 m.
NOTA: Una lunghezza del sarcomere di 2,5 m garantisce una sovrapposizione ottimale tra teste di miosina e actina. - Utilizzando la funzione vessel del software del controller di sistema misurare la lunghezza e la larghezza del miofibril (Figura 7B,C).
NOTA: quando si ruota la fotocamera, è possibile inclinarla orizzontalmente e/o verticalmente. Per controllare l'allineamento della fotocamera, è possibile utilizzare un livello di spirito per verificare che la fotocamera sia ruotata e non inclinata.- Posizionare il miofibril al centro dell'immagine video utilizzando lo stadio del microscopio.
- Disegnare un quadrato da un lato della miofibril all'altro. Per la lunghezza, assicurarsi di includere il bordo scuro delle goccioline di colla (Figura 2A) nel quadrato perché l'elaborazione dell'immagine è basata sul contrasto.
- Avviare la registrazione dei dati nel software del controller di sistema (vedere Tabella dei materiali) premendo 'Start' e dopo 5 s mettere in pausa la registrazione dei dati software del controller di sistema premendo il pulsante 'Pausa'. La lunghezza è ora registrata nei dati.
- Per la larghezza, ruotare prima la fotocamera di 90 gradi (vedere Tabella dei materiali)e quindi utilizzare il contrasto del bordo del miofibril stesso.
- Avviare la registrazione dei dati nel software del controller di sistema (vedere Tabella dei materiali) premendo 'Start' e dopo 5 s mettere in pausa la registrazione dei dati del software del controller di sistema premendo ilpulsante 'Pausa'. La larghezza è ora registrata nei dati.
- Se è necessario determinare la tensione attiva del miofibrile, è necessario utilizzare la configurazione della perfusione. In tal caso, continuare con il passaggio 3.4. Se viene determinata solo la tensione passiva, saltare i passaggi 3.4–4.1.3.7 e continuare al punto 4.2.
- Posizionare e inizializzare l'impostazione della perfusione.
NOTA: Questo è necessario solo per la generazione di forza attiva. Continuare al passaggio 4.2 quando si eseguono esperimenti di tensione passiva.- Impostare la posizione del motore a passo rapido a 4 V (Figura 5B).
- Far scorrere il supporto per la perfusione sul tavolo per allineare l'angolo inferiore sinistro del supporto con il nastro sul tavolo.
NOTA: Fare attenzione a non colpire la sonda di forza o il motore piezo. - Utilizzare il manipolatore per posizionare approssimativamente Ɵ vetro ad occhio.
- Guarda attraverso l'oculare e sposta attentamente Ɵ vetro verso il miofibrile usando il manipolatore.
- Allineare il canale superiore del Ɵ-vetro con il miofibril utilizzando il manipolatore e controllare la posizione eseguendo un passo veloce (le impostazioni del generatore di segnale sono disponibili nella Tabella 1) con il software del controller di sistema (Figura 2B–C, vedere La tabella dei materiali).
NOTA: assicurarsi che il canale inferiore sia allineato con il miofibril durante la fase di attivazione del passaggio rapido (Figura 2B–C).
- Attivare il flusso di sfondo di Rx (Figura 4A) per creare un flusso di sfondo laminare nella camera di flusso.
NOTA: Il flusso di fondo è necessario per evitare il flusso turbolento come risultato del flusso della soluzione pCa dal Ɵ-vetro.- Attivare l'afflusso della camera di flusso con una leva della valvola Luer.
- Inviare i seguenti parametri alla pompa di deflusso per avviare lo scarico della camera di flusso e prevenire l'overflow della camera di flusso (Figura 9): Valvola - Valvola di bagno (2); Modalità Microstep - Micro; Obiettivo di plunger : 48.000; Velocità di immersione : 38–40 (arbitraria).
NOTA: Assicurarsi che il livello del fluido sia sempre stabile. Il miofibril non deve funzionare a secco e nemmeno il cantilever. E 'meglio avere un po 'di overflow che troppo poco flusso.
- Inviare i seguenti parametri alla pompa di deflusso per avviare lo scarico della camera di flusso e prevenire l'overflow della camera di flusso (Figura 9): Valvola - Valvola di bagno (2); Modalità Microstep - Micro; Obiettivo di plunger : 48.000; Velocità di immersione : 38–40 (arbitraria).
- Attivare l'afflusso della camera di flusso con una leva della valvola Luer.
- Per impostare la temperatura sul valore desiderato con il controllore della temperatura termoelettrica (Figura 8, vedere Tabella dei materiali), immettere la temperatura desiderata e premere 'Start'. Attendere che la temperatura desiderata sia raggiunta controllando il grafico nel software termoelettrico del controller di temperatura e continuare.
NOTA: Quando si eseguono esperimenti a temperatura ambiente, non è necessario utilizzare il controllore termoelettrico della temperatura.
4. Protocolli sperimentali
- Decidere quali protocolli di forza attivi devono essere eseguiti.
NOTA: A seconda dei dati necessari per lo studio, è possibile eseguire più tipi di esperimenti di forza attiva: punto 4.1.1, misurazione della forza massima a saturazione [Ca2 anni]; punto 4.1.2, ottenere una curva Force-pCa per determinare la sensibilità del calcio oltre al punto 4.1.1; al punto 4.1.3, determinare il tasso di riqualificazione della tensione mediante un protocollo di riduzione-riposo oltre al punto 4.1.1 o 4.1.2.- Misurare la forza attiva massima.
- Avviare la registrazione dei dati nel software del controller di sistema (vedere Tabella deimateriali ) premendo 'Start'.
- Aprire le valvole 1 e 6 con il software di acquisizione dati (vedere Tabella deimateriali ) controllando il pulsante '1 -6' per avviare il flusso Ɵ vetro della soluzione rilassante e attivando la soluzione attraverso il vetro Ɵ (Figura 6A).
- Reimpostare l'intervallo dell'interferometro in modo che la forza di base sia 0 V selezionando e premendo 'Reimposta intervallo' sull'interferometro (vedere Tabella dei materiali).
- Quando la traccia di forza è stabile, eseguire Ɵ passo veloce in vetro (dimensione del passo : 100 m).
Le impostazioni del generatore di segnale sono disponibili nella tabella 1 (Figura 5C). Una traccia di attivazione-rilassamento simile alla figura 4D verrà registrata e visibile nel software del controller di sistema. - Sospendere la registrazione dei dati software del controller di sistema premendo il pulsante 'Sospendi'.
- Se non devono essere eseguite altre attivazioni, chiudere le valvole 1 e 6 per arrestare il flusso di Ɵ vetro deselezionando il pulsante '1 -6' (Figura 6B), arrestare la pompa di siringa (Figura 9, vedere Tabella dei materiali) premendo 'Termina' e interrompere il flusso di sfondo chiudendo la valvola Luer.
- Curva Force-pCa
NOTA: questo è simile al passaggio 4.1.1 per ottenere la forza attiva massima, ma con più attivazioni utilizzando diverse soluzioni pCa.- Avviare la registrazione dei dati nel software del controller di sistema premendo'Avvia'.
- Aprire le valvole 1 e 2 con il software del pannello di acquisizione dati per avviare il flusso della soluzione rilassante e pCa 6.2 attraverso Ɵ vetro.
- Reimpostare l'intervallo dell'interferometro in modo che la forza di base sia 0 V selezionando e premendo 'Reset Range' sull'interferometro.
- Quando la traccia di forza è stabile, eseguire Ɵ passo veloce in vetro (dimensione del passo : 100 m).
Le impostazioni del generatore di segnale sono disponibili nella Tabella 1. - Sospendere il software del controller di sistema premendo il pulsante 'Sospendi'.
- Ripetere i passaggi 4.1.2.1–4.1.2.4 per le valvole 1 e 3 (pCa 5.8), le valvole 1 e 4 (pCa 5.6), le valvole 1 e 5 (pCa 5.4) e le valvole 1 e 6 (pCa 4.5).
- Se non devono essere eseguite altre attivazioni, chiudere le valvole 1 e 6 per arrestare il flusso di Ɵ vetro deselezionando il pulsante '1 '6' (Figura 6A), arrestare la pompa di siringa (Figura 9) premendo 'Termina' e interrompere il flusso di fondo chiudendo la valvola Luer.
- Misurare il tasso di riqualificazione della tensione (kTR).
NOTA: Questo è simile al punto 4.1.1 per la massima forza attiva, ma con alcune modifiche e passaggi aggiunti.- Calcolare il movimento piezo necessario per rallentare il miofibril 15% e immettere questo valore nel generatore di segnale (Figura 5D, Tabella 1).
- Avviare la registrazione dei dati nel software del controller di sistema premendo 'Start'.
- Aprire le valvole 1 e 6 con il pannello di acquisizione dati (Figura 6A) per avviare il flusso della soluzione rilassante e pCa 4.5 attraverso il Ɵ-vetro.
- Reimpostare l'intervallo dell'interferometro in modo che la forza di base sia 0 V selezionando e premendo 'Reset Range' sull'interferometro.
- Quando la traccia di forza è stabile, eseguire Ɵ passo veloce in vetro (dimensione del passo : 100 m).
Le impostazioni del generatore di segnale sono disponibili nella Tabella 1. - Quando viene raggiunto l'altopiano di forza, eseguire l'accorciamento-restretch con il piezo.
Le impostazioni del generatore di segnali sono disponibilinella figura 5D, Tabella 1). Una traccia di attivazione-rilassamento simile a Figura 4E verrà registrata e visibile nel software del controller di sistema.
NOTA: È possibile creare un protocollo personalizzato per automatizzare i passaggi precedenti. - Sospendere il software del controller di sistema premendo il pulsante 'Sospendi'.
- Se non devono essere eseguite altre attivazioni, chiudere le valvole 1 e 6 per arrestare il flusso di Ɵ vetro deselezionando il pulsante '1 '6' (Figura 6B), arrestare la pompa di siringa (Figura 9) premendo 'Termina' e interrompere il flusso di fondo chiudendo la valvola Luer.
- Misurare la forza attiva massima.
- Eseguire misurazioni della forza passiva.
- Eseguire un tratto continuo.
- Calcolare il movimento piezo necessario per allungare il miofibril e immettere questo valore nel generatore di segnale (Tabella 1).
NOTA: queste sono impostazioni di esempio. Calcolare la quantità di allungamento e il tempo di stirazione rispetto alla lunghezza del sarcomere. Queste impostazioni sono necessarie per garantire che la velocità di stretching per sarcomere rimanga uguale attraverso myofibrils. - Avviare la registrazione dei dati nel software del controller di sistema premendo 'Start'.
- Reimpostare l'intervallo dell'interferometro in modo che la forza di base sia 0 V selezionando e premendo 'Reset Range' sull'interferometro.
- Eseguire l'allungamento continuo con il generatore di segnale nel software del controller di sistema per azionare il piezo. Le impostazioni del generatore di segnale di esempio sono disponibili nella Tabella 1.
- Abbreviare il miofibril a lunghezza di margine di flessibilità con il piezo al termine dell'allungamento (Tabella 1).
- Calcolare il movimento piezo necessario per allungare il miofibril e immettere questo valore nel generatore di segnale (Tabella 1).
- Eseguire un tratto graduale.
- Avviare la registrazione dei dati nel software del controller di sistema premendo 'Start'.
- Reimpostare l'intervallo dell'interferometro in modo che la forza di base sia 0 V selezionando e premendo 'Reset Range' sull'interferometro.
- Eseguire un tratto graduale con il generatore di segnale nel software del controller di sistema per far funzionare il piezo. Le impostazioni del generatore di segnale di esempio sono disponibili nella tabella 1 (Figura 5E).
- Abbreviare il miofibril a lunghezza slack con il piezo dopo che il tratto è finito. Le impostazioni del generatore di segnale di esempio sono disponibili nella Tabella 1.
- Eseguire un tratto continuo.
- Sospendere il software del controller di sistema premendo il pulsante 'Sospendi'.
- Interrompere la registrazione dei dati premendo il pulsante 'Stop' nel software del controller di sistema.
- Salvare i dati premendo 'File' e 'Salva dati' nel software del controller di sistema.
5. Pulizia
- Rimuovere il miofibril misurato e prepararsi per il prossimo miofibril.
- Per farlo, strappare con cura il miofibril mentre si guarda attraverso l'oculare con l'obiettivo 40x.
- Sposta la sonda di forza e piezo. Spostare il Ɵ vetro alto tutta la strada fino, a destra e sul retro. Poi spostarsi verso l'alto e far scorrere via la camera di flusso. Rimuovere il bagno di tessuto.
- Per pulire l'ago di montaggio, portarlo a fuoco utilizzando il 10x e l'oculare. Immergere il pennello in etanolo e spazzolare con cura e rimuovere la colla dall'ago.
NOTA: Tieni presente che potrebbe volerci un po' di tempo prima che la colla si srotoli. - Sciacquare la camera di flusso e il bagno di tessuto con acqua ultrapura.
- Posizionare la sonda in un piccolo piatto Petri riempito con acqua ultrapura. Assicurarsi che la sonda sia completamente insodribile.
- Al termine degli esperimenti, pulire la configurazione come sopra ed eseguire i seguenti passaggi aggiuntivi.
- Svuotare il tubo dal bagno di flusso. Inviare i parametri alla pompa di siringa in uscita (vedere La tabella deimateriali , Figura 9). Valvola - Valvola da bagno (2); Modalità Microstep - Normale; Obiettivo dello stantuffo : 0; Velocità di immersione 30.
NOTA: Terminare il comando quando il tubo è vuoto. - Inizializzare la pompa più volte (Figura 9B).
- Scolare le siringhe. Per farlo, chiudere tutte le valvole Luer, aprire tutte le valvole, rimuovere il tubo dall'ago della siringa, tenere il tubo di pCa specifico sotto l'ago e aprire la valvola Luer. Utilizzare i tappi di pressione per accelerare il processo.
- Riattaccare il tubo all'ago della siringa. Riempire le siringhe con 5 mL di acqua ultrapura. Mettere una tazza sotto Ɵ vetro. Aprire tutte le valvole e aprire la valvola di pressione per lavare il sistema.
- Arrestare il sistema. Spegnere il blocco di alimentazione del PC, dell'interferometro e del controller piezo.
- Svuotare il tubo dal bagno di flusso. Inviare i parametri alla pompa di siringa in uscita (vedere La tabella deimateriali , Figura 9). Valvola - Valvola da bagno (2); Modalità Microstep - Normale; Obiettivo dello stantuffo : 0; Velocità di immersione 30.
6. Analisi dei dati
- Esportare le tracce di dati dal software del controller di sistema (vedere Tabella dei materiali) in un programma software per fogli di calcolo o negli Appunti aprendo il file di dati e selezionando il segmento desiderato. Le tracce mostrate verranno esportate (ad esempio, forza grezza, lunghezza del sarcomere e posizione piezo).
- Eseguire l'analisi con il software di scelta (ad esempio, MATLAB).
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Representative Results
Le tracce dei dati sono state registrate e aperte con il software del controllore di sistema (vedere Tabella dei materiali). Le tracce complete o i segmenti selezionati sono stati esportati negli appunti o nel file di testo per un'ulteriore analisi con il software desiderato. Le valvole per controllare il flusso delle diverse soluzioni sono state commutate con software personalizzato o manualmente. Uno script MATLAB personalizzato è stato utilizzato per analizzare i tassi di attivazione, riqualificazione della tensione e rilassamento. La forza attiva massima e il picco e la forza dell'altopiano degli esperimenti di forza passiva sono stati presi direttamente dalla traccia della forza software del controllore di sistema. Dopo aver montato un miofibril (Figura 2), è stato selezionato il protocollo desiderato.
Massima forza attiva e calcio- sensibilità della forza neimiofibril isolati dalle biopsie muscolari scheletriche e umane
Nella Figura 4A l'impostazione sperimentale utilizzata per gli esperimenti di forza attiva è illustrata schematicamente. Vengono mostrate tracce di forza di un esperimento di forza attiva con un miofibril isolato dal muscolo quadricipite umano sano. Il miofibril è stato attivato 5 volte con soluzioni con pCa variabile (pCa 6.2, 5.8, 5.6, 5.4, 4.5; dati mostrati nella figura 4B). La forza massima media di tutti i miofibrils in questo esperimento è stata di 123 mN/mm2. Una curva force-pCa è stata costruita dalle forze dell'altopiano raggiunte durante ogni attivazione in ciascuna delle cinque soluzioni di calcio. I risultati sono illustrati nella figura 4C. Da questa curva è stato calcolato il pCa al 50% della produzione massima di forza (pCa50). In questo miofibril, il pCa50 era 5,75.
Inoltre, uno o più composti potrebbero essere aggiunti alla soluzione perfusa per misurare il suo effetto sulla forza prodotta dal miofibril. Nella Figura 4D, è illustrato l'effetto dell'inibitore N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS), un muscolo a contrazione veloce (tipo II) inibitore della catena pesante II (MHCII). 19 Un miofibril è stato attivato prima con una soluzione pCa 5.6, e successivamente con una soluzione pCa 5.6 - BTS. Durante la seconda attivazione fu prodotta meno forza, indicando che si trattava di un miofibrile che conteneva MHCII. Ci sono mutazioni nelle proteine che sono presenti esclusivamente in tipi muscolari specifici, e quindi influenzano solo i miofibrils da quel tipo di muscolo specifico. In tal caso, "digitare" le miofibrils è importante per discernere l'effetto mutazione sui vari tipi di muscoli. Inoltre, questo esempio illustra la possibilità di testare l'efficacia dei composti terapeutici nelle miofibrils.
Figura 4E mostra una traccia di forza attiva di un singolo myofibril isolato dal tessuto muscolare soleo scheletrico del topo. Il miofibril è stato montato nel setup e perfuso con soluzione rilassante (pCa 9.0), seguita da perfusione con soluzione di attivazione (pCa 4.5, 0.032 mM calcio). Contemporaneamente abbiamo registrato la forza e la lunghezza del sarcomere. Si trattava di una contrazione quasi isometrica, in quanto la deflessione del cantilever era di 0,5 m, che era circa l'1% della lunghezza di lassatura del miofibrile (50 m). Nella Figura 4E è stato eseguito un protocollo di rapida riduzione-riposo durante la contrazione attiva per valutare il tasso di riqualificazione della tensione (kTR, linea tratteggiata gialla). Il kTR è una misura di cinetica ciclistica cross-bridge. Inoltre, le curve di attivazione e di rilassamento sono state montate per determinare la velocità di attivazione (kACT, linea tratteggiata rossa) e relax (kREL, linea tratteggiata verde), rispettivamente. Nella Figura 4 viene illustrata una visualizzazione più dettagliata della fase di rilassamento evidenziata nella Figura 4F. Due fasi sono diventate evidenti: 1) una fase iniziale lenta di rilassamento (dominata dal distacco trasversale) e 2) una fase veloce di rilassamento (dominata dal distacco tra ponti e dalla dissociazione del calcio)20.
Forza passiva nelle miofibrils isolata da una biopsia muscolare scheletrica umana
Figura 10 mostra una traccia di un esperimento di forza passiva con un miofibrile isolato dal tessuto muscolare del diaframma umano sano. Il primo protocollo prevedeva uno o più tratti passivi per determinare le proprietà viscoelastiche dei sarcomere. La figura 10 mostra una traccia di forza di un tratto continuo di un miofibril (tratto dalla lunghezza del sarcomere 2,2–3,0 m). Durante il tratto, i miofibrili mostrarono caratteristiche sia viscose che elastiche. Ciò è evidente dalla curva illustrata nella figura 10A. Il picco acuto rappresenta entrambe le caratteristiche, mentre la forza dell'altopiano è una misura di elasticità. La viscosità resiste alla deformazione in modo lineare. Così, la forza è caduto dopo che il ceppo è stato rimosso. La figura 10B evidenzia l'allungamento stesso e illustra l'elevato rapporto segnale-rumore. Si noti che le tracce di forza non sono filtrate.
Figura 1: Rappresentazione schematica e microscopia elettronica di un muscolo scheletrico e della sua morfologia. (A) Mostra la struttura del muscolo scheletrico e (B) mostra la struttura del sarcomere, la più piccola unità contraile. Queste immagini schematiche sono adattate da Servier Medical Art. (C) Mostra l'immagine di una singola fibra muscolare e (D) mostra un'immagine di microscopia elettronica di una fibra muscolare che rivela danni miofibrillari e ultrastruttura miofibrillare conservata. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: immagini che mostrano un miofibril montato, Ɵ vetro trasparente e un ago di montaggio piezo. (A) Un miofibril montato a lunghezza lenta tra gli aghi in fibra di vetro rivestiti con shellac visto attraverso un obiettivo 40x. (B) Immagini della posizione del Ɵ vetro rispetto al miofibrile (evidenziato con gli ovali bianchi) come visto attraverso un obiettivo 10x. (In alto) Allineato al canale superiore (soluzione rilassante, pCa 9.0); (In basso) Allineato al canale inferiore (soluzione attivante, pCa 4.5) per perfuse il miofibril con calcio e indurre la contrazione. (C) Rappresentazioni schematiche della posizione del Ɵ vetro rispetto al miofibril. (In alto) Allineato con il canale superiore (soluzione rilassante, pCa 9.0); (In basso) Allineato con il canale inferiore (soluzione attivante, pCa 4.5) per esaminare il miofibrile con calcio e indurre la contrazione. (D) Ago di montaggio attaccato all'asta di carbonio del supporto piezo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentazione schematica della parte di installazione e di fine della camera di flusso del tessuto. In blu scuro la camera di flusso del tessuto in alluminio, e in bianco la cavità in cui la sonda di forza e Ɵ vetro sono mostrati in posizione; (Centro) Myofibril attaccato tra due aghi di montaggio in fibra di vetro attaccati alla sonda di forza e motore di lunghezza piezo. Il Ɵ vetro è allineato con il miofibril. Il Ɵ può muoversi su e giù per esporre il miofibrile alla soluzione di calcio. (A destra) Primo livello della sonda a sbalzo. Indicate sono le dimensioni della cavità (o cavità Fabry-Pérot, d); interfacce di riflessione A, B e C; e un esempio di onda di luce emessa dal laser (rosso). Il cantilever è montato sulla spalla del ferrule. La fibra che trasporta il laser dall'interferometro esce dal ferrule alla punta dello sbalzo. Una fibra di montaggio in vetro è fissata sul cantilever utilizzando la cera. (in alto a sinistra) L'interferometro analizza il segnale interferometro trasmesso al software del controller di sistema. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Configurazione sperimentale e dati da esperimenti di tensione attiva. (A) Rappresentazione schematica dell'impostazione e delle soluzioni di perfusione utilizzate. Si noti che il primo e l'ultimo tubo (azzurro) contengono una soluzione senza calcio (ad esempio, soluzione rilassante). (B) Esempio di tracce di forza di un esperimento di tensione attiva con un miofibrile isolato dal tessuto muscolare scheletrico umano che mostra cinque attivazioni da soluzione rilassante (pCa 9.0) a soluzioni di attivazione multipla (pCa 6.2 – 4.5). (C) Una curva forza-calcio; livelli di forza sugli altipiani nel pannello (B) sono stati normalizzati e tracciati contro i rispettivi livelli di calcio. (D) Traccia di forza di esempio di un miofibril di tipo II (contrazione rapida) isolato dal muscolo scheletrico umano attivato con soluzione pCa 5.6 (blu) e successivamente con pCa 5.6 - BTS (un inibitore del ponte trasversale specifico di tipo II, rosso). (E) Traccia di dati di esempio di un esperimento di tensione attiva con miofibrils isolati dal tessuto muscolare scheletrico del mouse soleo con un protocollo di accorciamento rapido-restretch durante l'attivazione per determinare il tasso di riqualificazione della tensione (kTR, linea tratteggiata gialla). Inoltre, la curva di attivazione e di rilassamento sono state montate per determinare la velocità di attivazione (kACT, linea tratteggiata rossa) e relax (kREL, linea tratteggiata verde), rispettivamente. (F) Uno zoom della fase di rilassamento (in alto a sinistra), evidenziato in (E). Il segnale motore a passo veloce (in basso a sinistra) indicava il punto di tempo in cui la soluzione è cambiata da una soluzione di attivazione (pCa 4.5) a una soluzione rilassante (pCa 9.0). La fase di rilassamento consisteva in una fase lineare e lenta (in alto a destra) e in una fase esponenziale e veloce (In basso a destra). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Impostazione di esempio per il generatore di segnale nel software di controllo del sistema. (vedere Tabella dei materiali). 1) Indica il pulsante per eseguire i comandi inseriti nel generatore di segnale. (A) Impostazione del motore di lunghezza piezo. (B) Impostazione del motore a passo veloce. (C) Esecuzione di un passaggio rapido per attivare un miofibril per una durata di 5 s. (D) Esecuzione di un rapido accorciamento-restretch di un miofibril per determinare il kTR. (E) Esecuzione di un tratto graduale di un miofibril per determinare le proprietà viscoelastiche. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Software del controller valve utilizzato sul PC. (A) Il pulsante utilizzato per aprire le valvole 1 (Rx) e 6 (Atto). (B) Lo stato dei pulsanti quando tutte le valvole sono chiuse. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Misurazione della lunghezza del sarcomere, della lunghezza del miofibrile e della larghezza del miofibrile con il software del controller di sistema. Un righello viene utilizzato come esempio. (A) Misurare la lunghezza del sarcomere: la scatola viola è posizionata intorno al miofibrile e la lunghezza del sarcomere è mostrata in (1). (B) Misurazione della lunghezza: la scatola ciano viene posizionata dall'inizio alla fine del miofibril. (C) Larghezza di misurazione: dopo aver ruotato la fotocamera di 90 gradi, la scatola ciano viene posizionata da un lato all'altro del miofibrile. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Software di controllo della temperatura termoelettrica. (A) Stabilire una connessione con il controllore termoelettrico della temperatura. (B) Espandere le impostazioni della temperatura. (C) Impostare la temperatura desiderata, in questo caso: 15 gradi centigradi (D) Accendere il controller termoelettrico e inviare la tensione al modulo di raffreddamento termoelettrico Peltier. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Impostazioni per la pompa di deflusso della siringa. (A) Aprire la connessione alla pompa premendo (1). (B) Avviare la pompa con le impostazioni predefinite premendo (2). (C) Avviare il pumping del deflusso impostando i 'Comandi Valvola' su 'Valvola' (2) e immettendo il ' CommandSet Parameters' come mostrato. Eseguire il comando premendo (3). I comandi possono essere terminati premendo (4). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Traccia di dati di esempio di un esperimento di tensione passiva con miofibrils isolati dal tessuto muscolare scheletrico umano. (A) Registrazione della forza (Superiore) e lunghezza sarcomere (inferiore) durante un protocollo di allungamento e rilascio. (B) Ingrandimento di (A) che mostra la forza (Superiore) e la lunghezza del sarcomere durante la fase di stiro del miofibril. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: Configurazione sperimentale e dati da esperimenti di preattivazione del calcio cardiomiocato. (A) Rappresentazione schematica dell'impostazione della perfusione. Si noti che l'ultimo tubo (azzurro) contiene una soluzione senza calcio (soluzione rilassante). (B) Curve sovrapposte di attivazione di un cardiomiocito senza (azzurro) e con preattivazione del calcio (blu scuro), con concentrazioni di calcio rispettivamente di 1 nM e 80 nM. (C) Confronto della preattivazione del calcio in tipo selvaggio (WT) e cardiomiociti RBM20 (HET) eterozigoti isolati dal ventricolo sinistro del ratto. Questa cifra è stata modificata da Najafi et al.21. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Passo | Dispositivo | Descrizione | Forma | Iniziale | ||||||||
| 1.7.1. | Piezo | Tensione passiva di inizializzazione | Fisso | 51,6 m | ||||||||
| 1.7.2. | Piezo | Inizializzazione della tensione attiva | Fisso | 0 m | ||||||||
| Passo | Dispositivo | Descrizione | Forma | Iniziale | Ritardo | Ripetizioni | Livello | Ritardo | Livello | Ritardo | ||
| 3.4.4. / 4.1.1.4. / 4.1.2.4. | Passo veloce | Test ɵ vetro di vetro / Attivazione di myofibril | Impulso | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 5 s | 4 V | 1 s | ||
| 4.1.3.4. | Passo veloce | Attivazione di myofibril (includere kTR) | Impulso | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 10s | 4 V | 1 s | ||
| Passo | Dispositivo | Descrizione | Forma | Iniziale | Ritardo | Ripetizioni | Livello rampa | Durata rampa | Ritardo | Livello rampa | Durata rampa | Ritardo |
| 4.1.3.1. / 4.1.3.6. | Piezo | Abbreviazione-Restretch per kTR | Trapezio | 0 m | 0,5 s | 1 x | 0 : 0,15 : L0 | 0,01 s | 0,01 s | 0 m | 0,01 s | 1 s |
| 4.2.1.1. / 4.2.1.4. | Piezo | Continua allungamento | Trapezio | 51,6 m | 2 s | 1 x | 51,6 - 0,30 - L0 | 2 s | 0 s | 51,6 - 0,30 - L0 | 0 s | 1 s |
| 4.2.1.4. | Piezo | Restituire myofibril alla lunghezza del margine di flessibilità | Trapezio | 1,6 m | 2 s | 1 x | 51,6 m | 5 s | 0 s | 51,6 m | 0 s | 1 s |
| 4.2.2.3. | Piezo | Allungamento graduale | Trapezio | 51,6 m | 2 s | 10 x | 51,6 - 5 m | 0,5 s | 10 s | 51,6 - 5 m | 0 s | 0 s |
| 4.2.3. | Piezo | Restituire myofibril alla lunghezza del margine di flessibilità | Trapezio | 1,6 m | 2 s | 1 x | 51,6 m | 5 s | 0 s | 51,6 m | 0 s | 0 s |
Tabella 1: Tabella che descrive le varie impostazioni del generatore di segnale utilizzate nel software del controller di sistema per azionare il motore a lunghezza piezo e il motore a passo veloce.
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Discussion
Descritto è un protocollo per valutare la funzione contrattile dei miofibrili isolati dai tessuti muscolari scheletrici umani o animali. La risoluzione della forza di questa configurazione è stata descritta in precedenza da Chavan et al.12. In breve, è determinato dalle fluttuazioni casuali della lunghezza della cavità Fabry-Pérot formata tra la fibra di rilevamento e il cantilever, che producono la parte dominante del rumore all'uscita del readout (espresso in V) che, moltiplicato per la sensibilità alla deflessione (espressa in m/V) e dalla costante di molla del cantilever (espresso in N/m), fornisce il rumore di forza. Per la nostra configurazione, il rumore quadrato medio radice (rms) nell'aria all'uscita della lettura, campionato a 1.000 punti dati/s (campione/i), è di circa 2 mV. Per una tipica misurazione miofibrile, viene utilizzata una sonda ferrule-top con una costante di molla di 0,7 N/m (sensibilità alla deflessione ∼300 nm/V). Questo valore rms corrisponde a una risoluzione di deflessione a sbalzo di 0,6 nm, che si traduce in una sensibilità di forza di 0,37 nN. La sonda di forza viene calibrata spingendo la punta dell'ago di montaggio contro una bilancia di pesatura mantenendo la piegatura dello sbalzo uguale a un multiplo della lunghezza d'onda del laser di lettura13. Questo metodo di calibrazione comporta sia la rigidità dello sbalzo e dell'ago di montaggio, nonché possibili variazioni nella coppia dello sbalzo e dell'ago di montaggio a causa della velocità e della grandezza della contrazione miofibrile. Attualmente, è disponibile un setup per la valutazione della contrattità miofibrile, che si basa sul rilevamento di un laser deviato dal cantilever, cioè, la deflessione ottica del fascio (1.700 A; risoluzione della forza nN n). Questo sistema è stato sviluppato da Labuda et al. utilizzando un periscopio ottico per guidare una luce laser verso e lontano dal cantilever nelle configurazioni di costrizione11. In questo sistema, un miofibril è montato tra il cantilever di forza atomica e un ago di vetro rigido. Un vantaggio del sistema qui descritto è la maggiore sensibilità della forza e il rapporto segnale-rumore. Inoltre, in questa configurazione, possono essere utilizzati sbalzosi relativamente rigidi, il che si traduce in una piccola deviazione a sbalzo quando viene applicata la forza miofibrillare. Questo è importante, in quanto consente misurazioni della forza a lunghezza quasi costante del sarcomere. Infine, rispetto al sistema descritto da Labuda et al., il sistema utilizza metodi simili o identici per controllare la temperatura, per indurre cambiamenti di lunghezza sul miofibril e per cambiare le soluzioni di perfusione utilizzando un motore Ɵ vetro e passo veloce. Il vantaggio del sistema descritto da Labuda et al. è che un cambiamento della composizione della soluzione (tra cantilever e periscopio ottico) non influisce sull'uscita del segnale. Nel sistema qui descritto, la composizione della soluzione tra cantilever e fibra ottica deve rimanere costante. La soluzione a questa limitazione è descritta in modo più dettagliato di seguito.
Ottimizzazione
La sonda di forza ottica in combinazione con il sistema di perfusione in fase rapida ha portato a complicazioni. La differenza nelle proprietà ottiche tra le soluzioni Ca2 a bassa e alta concentrazione interferisce con le misurazioni della forza. Per evitare il backflow della soluzione ad alto calcio, è stata progettata una camera di flusso personalizzata (Figura 3). Un flusso di fondo costante della soluzione senza calcio viene indotto da destra a sinistra per mantenere costante la soluzione tra la parte superiore della fibra ottica e il cantilever (Figura 3D).
Per controllare la temperatura, un elemento Peltier con raffreddamento liquido è montato sulla camera di flusso. Questa camera di flusso viene srotolata termicamente dal microscopio montandola su un adattatore di plastica. Con l'elemento Peltier, controllato da un sistema TEC, è possibile controllare la temperatura della soluzione nel tempo con una precisione di 0,1 gradi centigradi. La temperatura è monitorata da un sensore di temperatura montato sulla camera di flusso. La stabilità della temperatura è importante a causa della natura del trasduttore di forza. Il cantilever è costituito da una striscia di vetro rivestita in oro, rendendola efficacemente un termometro. Così, il cantilever si piega con variazioni di temperatura.
Il setup utilizza un sistema di perfusione a passo rapido (vedi Tabella dei Materiali) per controllare il movimento Ɵ-vetro. Questo sistema consente interruttori di perfusione entro 10 ms. La combinazione del metodo di controllo della temperatura e di commutazione della soluzione rende questo sistema particolarmente adatto a misurare la cinetica della contrattilità sarcomere (cioè, tassi di sviluppo della forza, riqualificazione della tensione e rilassamento) nelle miofibrils.
Inizialmente, lo svantaggio dell'uso dell'interferometria era la piccola gamma utilizzabile a causa della necessità di utilizzare la parte lineare della curva di interferenza (λ/8, con λ essendo la lunghezza d'onda del laser). Tuttavia, le recenti innovazioni hanno eliminato questa esociazione combinando la modulazione della lunghezza d'onda con un amplificatore lock-in. Pertanto, il sistema non è limitato a una singola parte lineare della curva di interferenza. Ciò consente la misurazione della deflessione infinita del cantilever14. Pertanto, la gamma di lettura della deflessione a sbalzo di questo sistema è notevolmente ampliata rispetto all'interferometria tradizionale. Inoltre, le sonde di forza descritte sono facili da sostituire e ci sono molti sbalzo disponibili, con rigidità che vanno da 0,5 N/m a >20 N/m. Pertanto, è possibile passare rapidamente da un sbalzo all'altro e selezionare la rigidità più adatta per l'esperimento condotto.
Sfide
Il sistema attuale è un prototipo basato su un sistema di misurazione cardiomiocato (vedi Tabella dei Materiali). Diversi componenti possono essere migliorati per fornire una migliore esperienza utente e dati di qualità superiore. In primo luogo, a causa di componenti aggiuntivi al sistema, vibrazione e risonanza può essere un problema che aggiungerà rumore al segnale. Inoltre, il Ɵ in vetro trasparente e il metodo di fissamento del motore a passo veloce potrebbero essere migliorati per renderlo meno soggetto a vibrazioni.
In secondo luogo, è auspicabile sostituire il motore a passo veloce con un attuatore di lunghezza piezo per aumentare la velocità di commutazione della soluzione e per ottenere un movimento più coerente.
In terzo luogo, le soluzioni di calcio che abbiamo usato in precedenza per attivare singole fibre muscolari striate includevano acido propionico, ma queste soluzioni assorbono la luce vicino all'infrarosso, interferendo con le misurazioni della forza. Il cloruro di calcio è stato utilizzato per eliminare la necessità di acido propionico, che ha notevolmente ridotto questo effetto. Questo problema è inerente a un sistema basato sull'interferometria e non è presente quando si utilizza la deflessione ottica del fascio.
In quarto luogo, un bagno di flusso personalizzato è stato progettato per creare un flusso laminare, per abbinare il flusso Ɵ-vetro. Questo previene il backflow a causa della turbolenza della soluzione ricca di calcio. Pertanto, la soluzione tra la punta della fibra ottica e il cantilever rimane costante. Il costofo con le miofibrili può muoversi liberamente sotto la camera di flusso e quindi, la selezione di miofibril adatti non è limitata alla piccola area della camera di flusso.
Riproducibilità e variabilità
Ci sono diversi elementi del sistema e del protocollo che sono importanti per il grado di riproducibilità e variabilità dei dati ottenuti.
In primo luogo, la qualità delle misurazioni dipende fortemente dalla qualità dell'isolamento miofibrile. Protocolli identici producono diverse qualità e quantità di miofibrils da diverse biopsie. In alcuni casi, le biopsie producono a malapena miofibrils utilizzabili o nessuna. Il consenso comune è che i miofibrils danneggiati si romperanno durante la contrazione e quindi non sono contabiliggiati nei risultati.
In secondo luogo, c'è incertezza nella determinazione dell'area trasversale del miofibril. A causa di vincoli tecnici, è possibile misurare la larghezza del miofibril in un solo piano. Pertanto, per calcolare l'area della sezione trasversale si presuppone che la larghezza e la profondità siano uguali. Quando la forza è normalizzata in un'area trasversale per calcolare la tensione attiva massima, si deve essere consapevoli di questa ipotesi.
Montaggio di myofibrils a causa dell'angolo di montaggio miofibrile, della posizione e dell'integrità della colla.
Anche se l'angolo di montaggio e la posizione possono essere in gran parte controllati visivamente, potrebbero essere presenti piccole variazioni tra miofibrili. L'integrità della colla non è stata ampiamente studiata. Tuttavia, l'integrità della colla può essere verificata monitorando la lunghezza del sarcomere nel miofibrile prima e dopo l'attivazione. Quando più sarcomere sono tra la colla dopo un protocollo, questo suggerisce che si è verificato lo slittamento del miofibrile nella colla. Di conseguenza, questo miofibril dovrebbe essere escluso dal set di dati.
Altre applicazioni del setup: Preattivazione del calcio nei cardiomiociti isolati dal ventricolo sinistro del ratto
Oltre a valutare la funzione contrattile delle miofibrils, il sistema può essere utilizzato anche per misurare la meccanica cardiomiocite. Ad esempio, la Figura 11 illustra l'uso di cardiomiociti singoli permeabili a membrana isolati dal ventricolo sinistro delratto 21. Contrariamente agli esperimenti sopra descritti, la soluzione rilassante è stata modificata e la soluzione di attivazione è stata mantenuta costante. Ogni cardiomiocito è stato sottoposto a cinque serie di attivazioni, esponendole a una soluzione di calcio libera di 2 M per 1 s. Il vincolo di tempo 1 s è scelto per imitare la natura limitata nel tempo delle contrazioni cardiache, dove l'esposizione a soluzioni a bassa concentrazione di calcio imita la fase diastolica e l'esposizione a soluzioni ad alta concentrazione di calcio imita la fase sistolica della contrazione del muscolo cardiaco (Figura 11A). Per ciascuno dei cinque set il calcio diastolico è stato variato (1, 80, 160, 250 e 400 nM calcio), mentre il calcio sistolico è rimasto costante (Figura 11A). Un set consisteva in due serie di tre cicli di attivazione-rilassamento a 1,8 m contro 2,0 m e 2,0 m contro 2,2 m per diversi gruppi sperimentali. La forza di picco è stata misurata a 1 s dall'interruttore della pipetta e media per l'insieme di tre cicli di attivazione-rilassamento. L'elevato rapporto segnale-rumore e l'elevata gamma dinamica di questo trasduttore di forza ci hanno permesso di misurare sia i piccoli cambiamenti nella forza diastolica che le forze sistoliche molto più grandi (Figura 11B). L'aumento del calcio diastolico ha portato ad una forza più elevata a 2 M calcio rispetto alla prima attivazione (Figura 11B). I cardiomiociti del ratto WT sono stati confrontati con cardiomiociti di ratto RMB20 eteroziga (HET). A causa dello splicing alternativo, i ratti HET hanno una proteina titina più conforme rispetto ai ratti WT. L'effetto è stato esagerato nei cardiomiociti HET a 80 e 160 di calcio di M(Figura 11C).
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Disclosures
Michiel Helmes è azionista e co-proprietario di IONOptix Inc.
Acknowledgments
Questo progetto è stato finanziato da AFM-Telethon e A Foundation Building Strength per le miopatie nemaline. Gli autori desiderano riconoscere il creatore dei prodotti menzionati in questo articolo, IONOptix Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
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References
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