Summary
Presentert her er en protokoll for å vurdere kontraktile egenskapene til striated muskel myofibriller med nano-Newton oppløsning. Protokollen bruker et oppsett med en interferometribasert, optisk kraftsonde. Dette oppsettet genererer data med et høyt signal-til-støy-forhold og muliggjør vurdering av de kontraktile kinetikkene til myofibriller.
Abstract
Striated muskelceller er uunnværlig for aktiviteten til mennesker og dyr. Enkelt muskelfibre består av myofibriller, som består av serierelaterte sarkomer, de minste kontraktile enhetene i muskel. Sarcomeric dysfunksjon bidrar til muskelsvakhet hos pasienter med mutasjoner i gener koding for sarcomeric proteiner. Studien av myofibril mekanikk gjør det mulig å vurdering av actin-myosin interaksjoner uten potensielle forvirrende effekter av skadede, tilstøtende myofibriller når du måler kontraktiliteten til enkeltmuskelfibre. Ultrastrukturelle skader og feiljustering av myofibriller kan bidra til nedsatt kontraktilitet. Hvis strukturell skade er tilstede i myofibrillene, bryter de sannsynligvis under isolasjonsprosedyren eller under eksperimentet. Videre gir studier i myofibriller vurderingen av actin-myosin interaksjoner i nærvær av de geometriske begrensningene til sarkomene. For eksempel kan målinger i myofibriller belyse om myofibrillar dysfunksjon er den primære effekten av en mutasjon i et sarkomerisk protein. I tillegg er perfusjon med kalsiumløsninger eller forbindelser nesten øyeblikkelig på grunn av den lille diameteren til myofibril. Dette gjør myofibriller eminent egnet til å måle aktiveringshastigheten og avslapningen under kraftproduksjon. Protokollen som er beskrevet i dette papiret, bruker en optisk kraftsonde basert på prinsippet om et Fabry-Pérot interferometer som er i stand til å måle krefter i nano-Newton-serien, kombinert med en piezo lengde motor og et raskt perfusjonssystem. Dette oppsettet gjør det mulig å studere myofibril mekanikk med høyoppløselige kraftmålinger.
Introduction
Striated muskelceller er uunnværlig for daglige aktiviteter. Lembevegelse, åndedrettsfunksjon og hjertets pumpebevegelse er avhengig av kraften som genereres av muskelceller. Skjelettmuskulatur består av muskel fascicles som inneholder bunter av enkelt muskelfibre (Figur 1A). Disse muskelfibrene består av myofibriller, som er dannet av serielt tilknyttede sarkomer (figur 1B, D). Sarkomene inneholder tynne og tykke filamenter. Disse består hovedsakelig av kjeder av actin og myosin molekyler, henholdsvis (Figur 1B). Actin-myosin interaksjoner er ansvarlig for kraftgenererende kapasitet av muskel. Pasienter med mutasjoner i gener koding for sarcomeric proteiner, som nebulin, actin, og troponin T, lider av muskelsvakhet på grunn av kontraktildysfunksjon 1.
Kvaliteten på muskelkontraktilitet kan studeres på ulike nivåer av organisasjon, alt fra in vivo hele muskler til actin-myosin interaksjoner i in vitro motilitetsanalyser. I løpet av de siste tiårene har flere forskningsgrupper utviklet oppsett for å bestemme kontraktiliteten til individuelle myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10. Disse oppsettene er basert på påvisning av endringer i laserdebøyning fra en cantilever (det vil si optisk stråledebøyning) forårsaket av sammentrekning av myofibril (for detaljer, se Labuda et al.11). Selv om det å bestemme den kontraktile funksjonen til myofibriller har noen begrensninger (f.eks. dynamikken i excitation-sammentrekningskoblingsprosessene som er oppstrøms av myofibrilene mangler), er det flere fordeler med denne tilnærmingen. Disse inkluderer: 1) evnen til å vurdere actin-myosin interaksjoner i nærvær av geometriske begrensninger av sarcomeres; 2) evnen til å vurdere actin-myosin interaksjoner uten potensielle forvirrende effekter av skadede, tilstøtende myofibriller (når du måler kontraktiliteten til enkelt muskelfibre ultrastrukturell skade og feiljustering av myofibrils kan bidra til nedsatt kontraktilitet) (Figur 1D); 3) den lille diameteren av myofibriller (~ 1 μm, figur 2A) og mangel på membraner tillater nesten øyeblikkelig kalsiumdiffusjon i sarkomene. Videre, hvis strukturell skade er tilstede i myofibrils, bryter de sannsynligvis under isolasjonen eller under eksperimentet. Derfor er vurdering av myofibril kontraktilitet en elegant metode for å studere de grunnleggende mekanismene for muskelsammentrekning og for å forstå om forstyrret actin-myosin interaksjoner er den primære årsaken til muskelsykdom forårsaket av mutasjoner i sarkomeriske proteiner.
Denne protokollen presenterer et nyutviklet oppsett for å bestemme kontraktiliteten til myofibriller som omfatter en cantilever force probe med nano-Newton-oppløsning (det vil si Optiforce). Denne kraftsonden er basert på prinsippet om interferometri. Interferometri muliggjør bruk av relativt stive cantilevers. Dette gjør det mulig å måle kraft med liten nedbøyning av cantilever, nærmer isometriske sammentrekninger av myofibril. Sonden gjør det mulig å vurdering av lave passive og aktive krefter som produseres av en enkelt myofibril isolert fra forskjellige muskelbiopsier, inkludert de fra menneskelige, med et høyt signal-til-støy-forhold. Den optiske cantilever force probe innlemmet i dette oppsettet er basert på en Fabry-Pérot interferometer12. Interferometeret oppdager små forskyvninger mellom en optisk fiber og en gullbelagt cantilever montert på en ildsjød (figur 3). Gapet mellom den optiske fiberen og cantilever kalles Fabry-Pérot hulrom. Myofibrils er montert mellom sonden og piezo motor ved hjelp av to limbelagte glass monteringsfibre. Kraften produsert av myofibril kan matematisk avledet fra interferometerdataene. Interferometri er basert på superposisjon eller interferens av to eller flere bølger (i dette oppsettet tre lysbølger). Laserlys med bølgelengde mellom 1,528.77-1,563.85 nm slippes ut fra interferometeret og sendes gjennom den optiske fiberen. I sonden reflekteres lyset 1) ved grensesnittet mellom den optiske fiberen og mediet (figur 3A); 2) på grensesnittet til mediet og cantilever (Figur 3B); og 3) i grensesnittet mellom metall og gull belegg av cantilever (Figur 3C). Refleksjonen ved grensesnitt A og B er avhengig av brytningsindeksen (n) av mediet der sonden er nedsenket. Lyset, bestående av de tre overliggende refleksjonene, går tilbake til en fotodiode i interferometeret. Fotodioden måler intensiteten av lyset, som er et resultat av interferensmønsteret til de tre overliggende refleksjonene. Når kontraktil kraft genereres ved å aktivere eller strekke en myofibril, trekker myofibril på cantilever. Denne bevegelsen endrer hulromsstørrelsen (d) og dermed antall bølgelengder som passer i hulrommet. Lyset som reflekteres på cantilever vil ha en annen fase, noe som resulterer i et annet interferensmønster. Fotodioden registrerer denne endringen av interferensmønsterintensitet som en endring i Volt. Deretter beregnes myofibril kraftgenerering fra denne endringen, med hensyn til cantilever stivheten. Kraftsonden kalibreres av produsenten ved å skyve spissen av monteringsnålen, festet til den frie utdelingsenden av kantileveren, mot en veieskala samtidig som bøyingen av kantileveren tilsvarer et multiplum av bølgelengden til avlesningslaseren13. Dermed er interferometri en svært følsom metode for å oppdage små endringer i avstand, noe som åpner for måling av krefter med nano-Newton-oppløsning. Denne oppløsningen muliggjør vurdering av myofibrillar kraftproduksjon med et høyt signal-til-støy-forhold. Mens tradisjonell interferometry begrenser omfanget av målinger til den lineære delen av interferenskurven, overvinner bruk av en innlåst forsterker og modulering av laserbølgelengden dennebegrensningen 14. Dette forklares nærmere i diskusjonsdelen.
For å måle myofibril aktiv spenning ble et raskt skritts perfusjonssystem innlemmet for å utsette myofibril for kalsiumløsninger (figur 4A). Det raske perfusjonssystemet gjør det mulig å finne løsningsendringer innen 10 ms. På grunn av deres lille diameter er kalsiumdiffusjon i myofibrillene nesten øyeblikkelig. Derfor er dette systemet spesielt egnet for å måle frekvensen av actin-myosin binding under aktivering og frigjøring under avslapning. Aktiveringshastigheten (kACT)og avslapning (kREL)kan bestemmes av aktiverings-avslapningskurvene. Også ved å utsette myofibrillene for kalsiumløsninger av økende konsentrasjon, kan kraftkalsiumforholdet og kalsiumfølsomheten bestemmes.
Videre muliggjør en piezo lengde motor rask strekking og forkortelse av myofibril. Dette gir mulighet til å studere de viskoelastiske egenskapene (det vil si passiv spenning) av myofibril, samt utføre en rask forkortelse og restretch av myofifi for å bestemme frekvensen av spenningsutvikling (kTR). Parametrene hentet fra både aktive og passive spenningseksperimenter kan endres av genmutasjoner i et sarkomerisk protein.
Dette spesialbygde oppsettet ble brukt til å måle de aktive og passive kontraktile egenskapene til myofibriller isolert fra sunn menneskelig, pasient og mus skjelettmuskulatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen for å skaffe menneskelige biopsier ble godkjent av den institusjonelle gjennomgangstavlen ved VU University Medical Center (#2014/396) og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra fagene. Protokollen for å skaffe dyremuskelbiopsier ble godkjent av den lokale dyreetikkkomiteen ved VU University (AVD114002016501)
1. Forberedelse og myofibril isolasjon
MERK: Bruk tidligere beskrevne metoder for å glyserin biopsier, forberede de forskjellige kalsiumkonsentrasjonen (pCa)løsninger 7,,16,,17,og isolere myofibrils2,,18.
- Tin de avslappende (pCa 9.0, Rx) og aktivere (pCa 4.5, Act) løsninger samt hemmere (1 M E64, 1 M DTT, 1 M leupeptin, 1 M PMSF), som er lagret ved -80 °C.
- Ta et glyserinert stykke striated muskelbiopsi på ca. 1 mm3 og legg den i en liten petriskål med 1:1 Rx/glyserol (v/v) oppløsning og plasser petriskålen på en kald tallerken ved 4 °C.
- Dissekere muskelstykket ved hjelp av disseksjonsmikroskop og tang, som skiller enkeltmuskelfibre uten å isolere dem fra muskelstykket.
MERK: Fjern så mye fett- og bindevev som mulig for å forhindre kontaminering av myofibrilfjæringen. - Overfør det stykke dissekert vev til et 5 ml rør med 1,5 ml avslappende oppløsning med inhibitorer (1 μL/ml E-64, 1 μL/ml leupeptin, 1 μL/ml DTT og 125 μL/ml PMSF). La vevet temperere ved ca. 4 °C i 1 time.
- Under inkubasjon starter du opp begge PCene, slår på enhetene og åpner den tilknyttede programvaren (se Materials tabell).
- Senk kraftsonden ned i ultrarent vann i en petriskål og kalibrer sonden.
- Trykk på 'Start Wizard' på interferometeret og følg instruksjonene på skjermen. Når du har trykket på Kalibrer, trykker du på mikroskopstadiet.
MERK: Hvis du trykker på mikroskopstadiet, vil det føre til at kantileveren bøyer seg og passerer gjennom frynser. Dette muliggjør kalibrering av sonden. - La sonden være nedsenket i det ultrapure vannet i petriskålen etter kalibreringen.
- Trykk på 'Start Wizard' på interferometeret og følg instruksjonene på skjermen. Når du har trykket på Kalibrer, trykker du på mikroskopstadiet.
- Initialiser piezo motorposisjonen. Hvis du vil gjøre dette, følger du ett av trinnene som er beskrevet nedenfor.
- Når piezomotoren skal brukes mot kTR-spenning, setter du lengden til 0 μm.
Innstillinger for signalgenerator finnes i tabell 1, figur 5A. - Når piezomotoren skal brukes til passiv spenning, sett lengden til 50 μm.
Innstillinger for signalgenerator finnes i tabell 1.
MERK: Forskjellen mellom trinnene er startposisjonen til piezo lengdemotoren. For å strekke myofibril, piezo motoren må trekke for å øke avstanden mellom både montering nåler og for å forlenge myofibril. For å slakke myofibril, piezo motoren må presse for å redusere avstanden mellom både montering nåler og for å forkorte myofibril.
- Når piezomotoren skal brukes mot kTR-spenning, setter du lengden til 0 μm.
- Forbered et mikroskop lysbilde. Pipette 150 μL polyhydroksyetylmetakrylat (poly-HEMA) oppløsning (5% poly-HEMA i 95% etanol, w / v) på et mikroskop lysbilde og spre den over lysbildet slik at alt er dekket.
MERK: Hvis en myofibril suspensjon er pipetted på et ubestrøket mikroskop lysbilde, myofibrils som synker til bunnen vil holde seg til mikroskopet lysbildet og det vil ikke være mulig å lime dem. - Fyll sprøyter med pCa-oppløsninger (se figur 4A) og prime perfusjonssystemet.
MERK: I disse trinnene er alle rørene forhåndsutfylt med riktig løsning for å sikre at alle luftbobler fjernes fra slangen.- Fyll tilsigslangen i strømningskammerets bakgrunnsstrøm (figur 3, 4A) tilsig med Rx.
- Når den brukes, skyll manifolden med ultrarent vann for å fjerne luft. For å gjøre dette, koble sprøyten med ultrarent vann til utløpet og skyll i motsatt retning. Blokker de ubrukte portene på manifolden.
- Gjør det mulig for hver pCa-sprøyte å fylle sine respektive rør med pCa-oppløsning. Deretter kobler du dem til manifolden og Ɵ-glass.
- Åpne ventiler 1 og 6 med datainnsamlingspanelprogramvaren (se Materialstabell ) ved å kontrollere knappen '1+6' (Figur 6A) for å fylle Ɵ-glasset med den avslappende (pCa 9.0) og aktivere (4.5) løsninger og lukke ventiler når Ɵ-glasset er fylt (figur 6B).
2. Montere en myofibril
- Coat et mikroskop lysbilde med poly-HEMA for å hindre myofibrils fra å holde seg til glasset.
- Forbered homogenisatoren (se Materialtabell)for vevhomogenisering. Rengjør den indre rotorstangen med rent vevpapir, monter homogenisatoren og spinn 1x for 15 s i alkohol og tre ganger i 15 s hver i ultrarent vann. Forord homogenisatoren i avslappende løsning 1 x for 15 s på is.
- Plasser homogenisatorstangen i røret som inneholder muskelvevet som beskrevet i trinn 1.4, og mens du holder røret på is, spinner du rotoren i 15 s på hastighet 5 for å rive muskelvevet og få en myofibril suspensjon.
- Pipette ~50 μL av myofibril suspensjon og ~ 250 μL av den avslappende løsningen på mikroskopet lysbildebelagt med poly-HEMA i vevbadet. Dette vil danne en flytende dråpe. Dekk badet med et lokk for å beskytte mot støv og vent 5-10 min for å la myofibrilene synke til bunnen.
MERK: Forholdet mellom fjæringen og den avslappende løsningen er avhengig av kvaliteten på isolasjonen, og juster derfor tilsvarende. For eksempel, hvis myofibril utbyttet er lavt og få passende myofibriler er tilstede i suspensjonen, legg til mer myofibril suspensjon og fortynne med mindre avslappende løsning (f.eks. 75 μL myofibril suspensjon og 225 μL avslappende løsning). Hjerte og skjelettmuskulaturvev er lett å gjenkjenne på grunn av sin striation mønster. Ved hjelp av et 10x eller 40x mål, er dette mønsteret også synlig i en enkelt myofibril. I tilfelle annet vev er tilstede i suspensjonen, kan myofibriller velges visuelt. Man kan hoppe over 5-10 min venting. Dette øker imidlertid vanskeligheten med å lime en myofibril. - Coat montering nåler med lim (skjellakk + etanol; 120 mg skjellakk i 2 ml av 70% etanol). For å gjøre dette, varme limet ved 65 °C i 30–60 s og pipette ~6 μL på en ny ubestrøket glasssklie. Dypp spissen av hver monteringsnål i limet og gjenta til et lag lim er synlig. Flytt sonden og piezoen opp vertikalt med mikromanipulatorene for å gjøre plass til å plassere vevsbadet på mikroskopstadiet. Fjern glasslysbildet som inneholder limet.
- Montering av myofibriller
- Plasser vevsbadet med mikroskopet lysbildebelagt med poly-HEMA som inneholder myofibril suspensjon på mikroskopet scenen. Bruk scenen til å finne en passende myofibril med 40x-målet. Flytt eventuelt og roter vevbadet for å flytte myofibril til en monterbar stilling.
MERK: Se etter myofibriller med et synlig striasjonsmønster som er ca. 30 μm langt. Som beskrevet i detalj i trinn 3.1 og 3.2.1 er det mulig å sjekke lengde og sarcomere lengde før liming myofibril. Ikke lim revet myofibriller, fordi disse er sannsynlig å bryte under sammentrekning. - Skyv strømningskammeret på plass rett over væskedråpen som inneholder myofibrillene i vevsbadet (pipetted på lysbildet i trinn 2.4) og senk den. Stopp før den treffer væskedråpen.
- Senk piezo monteringsnålen og trykk den på den nederste spissen av myofibril. Løft den litt for å sjekke om myofibril er festet til nålen.
- Senk strømningskammeret langt nok til at sondens monteringsnål når bunnen uten at sonden berører strømningskammeret.
- Trykk på monteringsnålen på proben på den øverste spissen av myofibril. Løft den litt for å sjekke om myofibril er festet til nålen.
- Løft myofibril fra bunnen av badekaret så langt som mulig uten å miste evnen til å fokusere uten at målet berører bunnen av glasset.
- Plasser vevsbadet med mikroskopet lysbildebelagt med poly-HEMA som inneholder myofibril suspensjon på mikroskopet scenen. Bruk scenen til å finne en passende myofibril med 40x-målet. Flytt eventuelt og roter vevbadet for å flytte myofibril til en monterbar stilling.
3. Initialisere eksperiment
- Bruk programvaren for mikromanipulatorer, kamera og systemkontroller (figur 7A, se Materials tabell) til å måle sarcomere-lengden. Flytt piezo og/eller kraftsonden for å stille inn den opprinnelige sarkomelengden på myofibril til 2,5 μm.
MERK: En sarkomerlengde på 2,5 μm sikrer optimal overlapping mellom myosinhoder og actin. - Ved hjelp av fartøyets funksjon av systemkontrolleren programvare måle myofibril lengde og bredde (Figur 7B,C).
MERK: Når du roterer kameraet, kan det vippe horisontalt og/eller vertikalt. For å kontrollere justeringen av kameraet, kan et vater brukes til å kontrollere at kameraet roteres og ikke vippes.- Plasser myofibril i midten av videobildet ved hjelp av mikroskopstadiet.
- Tegn en firkant fra den ene siden av myofibril til den andre. For lengden må du passe på å inkludere den mørke kanten av limdråpene (figur 2A) på firkanten fordi bildebehandlingen er basert på kontrast.
- Begynn å registrere dataene i systemkontrollerprogramvaren (se Materials tabell) ved å trykke 'Start' og etter 5 s pause systemkontrolleren programvaredataopptak ved å trykke på 'Pause' -knappen. Lengden registreres nå i dataene.
- For bredden først rotere kameraet 90° (se Table of Materials) og deretter bruke kontrasten på kanten av myofibril selv.
- Begynn å registrere dataene i systemkontrollerprogramvaren (se Materials tabell) ved å trykke 'Start' og etter 5 s pause systemkontrolleren programvaredataopptak ved å trykke på 'Pause' -knappen. Bredden registreres nå i dataene.
- Hvis aktiv spenning av myofibril må bestemmes, må perfusjonsoppsettet brukes. I så fall fortsetter du til trinn 3.4. Hvis bare passiv spenning vil bli bestemt, hopp over trinn 3.4-4.1.3.7 og fortsett i trinn 4.2.
- Plasser og initialiser perfusjonsoppsettet.
MERK: Dette er bare nødvendig for generering av aktiv kraft. Fortsett til trinn 4.2 når du utfører passive spenningseksperimenter.- Still inn hurtigtrinnsmotorposisjonen ved 4 V (figur 5B).
- Skyv perfusjonsstativet på bordet for å justere venstre nederste hjørne av stativet med båndet på bordet.
MERK: Vær forsiktig så du ikke treffer kraftproben eller piezomotoren. - Bruk manipulatoren til å plassere Ɵ glass for øye.
- Se gjennom okularet og forsiktig flytte Ɵ-glass mot myofibril ved hjelp av manipulatoren.
- Juster den øverste kanalen i Ɵ-glasset etter myofibril ved hjelp av manipulatoren og kontroller posisjonen ved å utføre et raskt trinn (signalgeneratorinnstillinger finnes i tabell 1) etter systemkontrollerprogramvaren (figur 2B– C, se Materialtabell).
MERK: Kontroller at den nederste kanalen vil være på linje med myofibril under aktiveringsfasen av hurtigtrinnet (figur 2B–C).
- Slå på bakgrunnsstrømmen til Rx (figur 4A) for å skape en laminær bakgrunnsflyt i strømningskammeret.
MERK: Bakgrunnsstrømmen er nødvendig for å forhindre turbulent strømning som følge av pCa-Ɵ-glasset.- Slå på tilløpet av strømningskammeret med en Luer-ventilspak.
- Send følgende parametere til utløpspumpen for å begynne å tømme strømningskammeret og forhindre overløp av strømningskammeret (figur 9): Ventil = Badeventil (2); Mikrostep-modus = Mikro; Stempelmål = 48 000; Stempelhastighet = 38–40 (vilkårlig).
MERK: Pass på at væskenivået er stabilt til enhver tid. Myofibril bør ikke kjøre tørr og heller ikke bør cantilever. Det er bedre å ha litt overløp enn for lite flyt.
- Send følgende parametere til utløpspumpen for å begynne å tømme strømningskammeret og forhindre overløp av strømningskammeret (figur 9): Ventil = Badeventil (2); Mikrostep-modus = Mikro; Stempelmål = 48 000; Stempelhastighet = 38–40 (vilkårlig).
- Slå på tilløpet av strømningskammeret med en Luer-ventilspak.
- Hvis du vil sette temperaturen til ønsket verdi med den termoelektriske temperaturregulatoren (figur 8, se Materialtabell),angir du ønsket temperatur og trykker på' Start'. Vent til ønsket temperatur er nådd ved å kontrollere grafen i den termoelektriske temperaturregulatorprogramvaren og fortsett.
MERK: Når du utfører eksperimenter ved romtemperatur, trenger ikke den termoelektriske temperaturregulatoren brukes.
4. Eksperimentell protokoll(er)
- Bestem hvilke aktive kraftprotokoller som må utføres.
MERK: Avhengig av dataene som er nødvendige for studien, kan flere typer aktive krafteksperimenter utføres: trinn 4.1.1, måling av maksimal kraft ved mettende [Ca2+]; trinn 4.1.2, og skaffet en Force-pCa-kurve for å bestemme kalsiumfølsomhet i tillegg til trinn 4.1.1; trinn 4.1.3, bestemme frekvensen av spenning ombygging ved å gjøre en forkortelse-restretch protokoll i tillegg til trinn 4.1.1 eller 4.1.2.- Mål maksimal aktiv kraft.
- Begynn å registrere dataene i systemkontrollerprogramvaren (se Materials tabell) ved å trykke 'Start'.
- Åpne ventiler 1 og 6 med datainnsamlingspanelet (se Materialtabell) ved å sjekke knappen '1+6' for å starte Ɵ-glassstrøm av den avslappende løsningen og aktivere løsningen gjennom Ɵ-glass (figur 6A).
- Tilbakestill området til interferometeret slik at grunnlinjekraften er 0 V ved å velge og trykke 'Tilbakestill område'på interferometeret (se Materialtabell).
- Når kraftsporet er stabilt, Ɵ hurtigtrinn i glass (trinnstørrelse = 100 μm).
Innstillinger for signalgenerator finnes i tabell 1 (figur 5C). En aktivering-avslapning spor som ligner figur 4D vil bli registrert og synlig i systemkontrolleren programvare. - Sett systemkontrollerens programvaredataopptak påPausepause ved å trykke på 'Pause'-knappen.
- Hvis det ikke skal utføres flere aktiveringer, må du lukke ventilene 1 og 6 for å stoppe Ɵ-glassstrømmen ved å fjerne merket for knappen '1+6' (figur 6B), stoppe sprøytepumpen (figur 9, se Materialtabell) ved å trykke 'Avslutt', og stopp bakgrunnsstrømmen ved å lukke Luer-ventilen.
- Force-pCa kurve
MERK: Dette ligner på trinn 4.1.1 for å oppnå maksimal aktiv kraft, men med flere aktiveringer ved hjelp av forskjellige pCa-løsninger.- Begynn å registrere dataene i systemkontrollerprogramvaren ved å trykke 'Start'.
- Åpne ventiler 1 og 2 med datainnsamlingspanelprogramvaren for å starte strømmen av avslappende løsning og pCa 6.2 gjennom Ɵ-glass.
- Tilbakestill området til interferometeret slik at grunnlinjestyrken er 0 V ved å velge og trykke 'Tilbakestill område' på interferometeret.
- Når kraftsporet er stabilt, Ɵ hurtigtrinn i glass (trinnstørrelse = 100 μm).
Innstillinger for signalgenerator finnes i tabell 1. - Sett systemkontrollerprogramvaren påPausepause ved å trykke på 'Pause'-knappen.
- Gjenta trinn 4.1.2.1–4.1.2.4 for ventiler 1 og 3 (pCa 5.8), ventiler 1 og 4 (pCa 5.6), ventiler 1 og 5 (pCa 5.4) og ventiler 1 og 6 (pCa 4.5).
- Hvis det ikke skal utføres flere aktiveringer, må du lukke ventilene 1 og 6 for å stoppe Ɵ-glassstrømmen ved å fjerne merket for knappen '1+6' ( figur 6A ), stoppe sprøytepumpen (figur 9) ved å trykke 'Avslutt', og stopp bakgrunnsstrømmen ved å lukke Luer-ventilen.Figure 6A
- Mål hastighet på spenningsutvikling (kTR).
MERK: Dette ligner på trinn 4.1.1 for maksimal aktiv kraft, men med noen endringer og lagt til trinn.- Beregn piezobevegelsen som er nødvendig for å slakke myofibril 15% og angi denne verdien i signalgeneratoren (figur 5D, tabell 1).
- Begynn å registrere dataene i systemkontrollerprogramvaren ved å trykke 'Start'.
- Åpne ventiler 1 og 6 med datainnsamlingspanelet (Figur 6A) programvare for å starte flyten av den avslappende løsningen og pCa 4.5 gjennom Ɵ-glass.
- Tilbakestill området til interferometeret slik at grunnlinjestyrken er 0 V ved å velge og trykke 'Tilbakestill område' på interferometeret.
- Når kraftsporet er stabilt, Ɵ hurtigtrinn i glass (trinnstørrelse = 100 μm).
Innstillinger for signalgenerator finnes i tabell 1. - Når kraftplatået er nådd, utfør forkortingsstøtten med piezoen.
Innstillinger for signalgenerator finnes i (Figur 5D, Tabell 1). En aktivering-avslapning spor som ligner figur 4E vil bli registrert og synlig i systemkontrolleren programvare.
MERK: En egendefinert protokoll kan gjøres for å automatisere trinnene ovenfor. - Sett systemkontrollerprogramvaren påPausepause ved å trykke på 'Pause'-knappen.
- Hvis det ikke skal utføres flere aktiveringer, må du lukke ventilene 1 og 6 for å stoppe Ɵ-glassstrømmen ved å fjerne merket for knappen '1+6' ( Figur 6B ), stoppe sprøytepumpen (figur 9) ved å trykke 'Avslutt', og stopp bakgrunnsstrømmen ved å lukke Luer-ventilen.Figure 6B
- Mål maksimal aktiv kraft.
- Utfør passive kraftmålinger.
- Utfør en kontinuerlig strekning.
- Beregn piezobevegelsen som er nødvendig for å strekke myofibrilen og angi denne verdien i signalgeneratoren (tabell 1).
MERK: Dette er eksempelinnstillinger. Beregn mengden strekk og tid for strekk i forhold til sarcomere lengde. Disse innstillingene er nødvendige for å sikre at hastigheten på strekk per sarcomere forblir lik på tvers av myofibriller. - Begynn å registrere dataene i systemkontrollerprogramvaren ved å trykke 'Start'.
- Tilbakestill området til interferometeret slik at grunnlinjestyrken er 0 V ved å velge og trykke 'Tilbakestill område' på interferometeret.
- Utfør kontinuerlig strekk med signalgeneratoren i systemkontrollerprogramvaren for å betjene piezoen. Eksempel på innstillinger for signalgenerator finnes i tabell 1.
- Forkort myofibrilen til slakk lengde med piezo etter at strekningen er ferdig (Tabell 1).
- Beregn piezobevegelsen som er nødvendig for å strekke myofibrilen og angi denne verdien i signalgeneratoren (tabell 1).
- Utfør en trinnvis strekning.
- Begynn å registrere dataene i systemkontrollerprogramvaren ved å trykke 'Start'.
- Tilbakestill området til interferometeret slik at grunnlinjestyrken er 0 V ved å velge og trykke 'Tilbakestill område' på interferometeret.
- Utfør en trinnvis strekk med signalgeneratoren i systemkontrollerprogramvaren for å betjene piezoen. Eksempel på innstillinger for signalgenerator finnes i tabell 1 (figur 5E).
- Forkort myofibrilen til slakk lengde med piezoen etter at strekningen er ferdig. Eksempel på innstillinger for signalgenerator finnes i tabell 1.
- Utfør en kontinuerlig strekning.
- Sett systemkontrollerprogramvaren påPausepause ved å trykke på 'Pause'-knappen.
- Stopp opptaket av data ved å trykke på'Stop'-knappeni systemkontrollerprogramvaren.
- Lagre dataene ved å trykke 'Fil' og 'Lagre data' i systemkontrollerprogramvaren.
5. Rengjøring
- Fjern den målte myofibril og forberede seg på neste myofibril.
- For å gjøre det, forsiktig rive av myofibril mens du ser gjennom okulær med 40x målet.
- Flytt opp kraftsonden og piezoen. Flytt opp Ɵ-glass hele veien opp, til høyre og til baksiden. Deretter beveger du deg opp og skyver bort strømningskammeret. Fjern vevbadet.
- For å rengjøre monteringsnålen, ta den i fokus ved hjelp av 10x og okulær. Dypp børsten i etanol og børst forsiktig av og fjern limet fra nålen.
MERK: Husk at det kan ta litt tid før limet kommer av. - Skyll strømningskammeret og vevbadet med ultrarent vann.
- Legg sonden i liten petriskål fylt med ultrarent vann. Kontroller at sonden er helt nedsenk.
- Når eksperimentene er ferdige, rengjør du oppsettet som ovenfor og utfører følgende ekstra trinn.
- Tøm slangen fra strømningsbadet. Send parametrene til utløpssprøytepumpen (se Materialtabell, Figur 9). Ventil = Badeventil (2); Mikrostep-modus = Normal; Stempelmål = 0; Stempelhastighet = 30.
MERK: Avslutt kommandoen når slangen er tom. - Initialiser pumpen flere ganger (figur 9B).
- Tøm sprøytene. For å gjøre dette, lukk alle Luer-ventilene, åpne alle ventilene, fjern slangen fra sprøytens nål, hold røret til spesifikk pCa under nålen og åpne Luer-ventilen. Bruk trykkpluggene til å øke hastigheten på prosessen.
- Sett slangen på sprøyten igjen. Fyll sprøyter med ~5 ml ultrarent vann. Legg en kopp under Ɵ-glass. Åpne alle ventilene og åpne trykkventilen for å skylle systemet.
- Slå av systemet. Slå av PC-en, interferometeret og piezo-kontrollerens strømblokk.
- Tøm slangen fra strømningsbadet. Send parametrene til utløpssprøytepumpen (se Materialtabell, Figur 9). Ventil = Badeventil (2); Mikrostep-modus = Normal; Stempelmål = 0; Stempelhastighet = 30.
6. Dataanalyse
- Eksportere dataspor fra systemkontrollerprogramvaren (se Materials tabell) til et regnearkprogram eller utklippstavle ved å åpne datafilen og velge ønsket segment. Sporene som vises vil bli eksportert (f.eks rå kraft, sarcomere lengde, og piezo posisjon).
- Utfør analyse med den du ønsker (f.eks. MATLAB).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataspor ble registrert og åpnet med systemkontrollerprogramvaren (se Materials tabell). Fullstendige spor eller utvalgte segmenter ble eksportert til utklippstavlen eller tekstfilen for videre analyse med ønsket programvare. Ventiler for å kontrollere flyten av de ulike løsningene ble byttet med tilpasset programvare eller manuelt. Et tilpasset MATLAB-skript ble brukt til å analysere aktiveringshastigheten, spenningsutviklingen og avslapningen. Maksimal aktiv kraft og toppen og platåkraften til passive krafteksperimenter ble tatt direkte fra systemkontrollerens programvarekraftspor. Etter montering av myofibril (figur 2) ble ønsket protokoll valgt.
Maksimal aktiv kraft og kalsium-følsomhet av kraften i myofibriller isolert fra mus og menneskelige skjelettmuskelbiopsier
I figur 4A er det eksperimentelle oppsettet som brukes for de aktive krafteksperimentene avbildet skjematisk. Force spor av en aktiv kraft eksperiment med en myofibril isolert fra friske menneskelige quadriceps muskel er vist. Myofibril ble aktivert 5 ganger med løsninger med varierende pCa (pCa 6.2, 5.8, 5.6, 5.4, 4.5; data vist i figur 4B). Den gjennomsnittlige maksimale kraften av alle myofibriller i dette eksperimentet var ~ 123 mN / mm2. En force-pCa kurve ble bygget fra platåkreftene nådd under hver aktivering i hver av de fem kalsiumløsningene. Resultatene vises i figur 4C. Fra denne kurven ble pCa ved 50 % av maksimal kraftproduksjon (pCa50) beregnet. I denne myofibril var pCa50 5,75.
I tillegg kan en eller flere forbindelser legges til den perfused løsningen for å måle effekten på kraften produsert av myofibril. I figur 4Der effekten av N-benzyl-p-toluen sulfonamid (BTS), en rask twitch muskel (type II) myosin tung kjede II (MHCII) hemmer, illustrert. 19 En myofibril ble aktivert først med en pCa 5.6-løsning, og deretter med en pCa 5.6 + BTS-løsning. Under den andre aktiveringen ble det produsert mindre kraft, noe som indikerer at dette var en myofibril som inneholdt MHCII. Det er mutasjoner i proteiner som er tilstede utelukkende i bestemte muskeltyper, og dermed bare påvirker myofibriller fra den spesifikke muskeltypen. I så fall er "skrive" myofibrillene viktig å skjelne mutasjonseffekten på de ulike muskeltypene. Dette eksemplet illustrerer også muligheten for å teste effekten av terapeutiske forbindelser i myofibriller.
Figur 4E viser et aktivt kraftspor av et enkelt myofibril isolert fra mus skjelettsålemuskelvev. Myofibril ble montert i oppsettet og perfused med avslappende løsning (pCa 9.0), etterfulgt av perfusjon med aktiveringsløsning (pCa 4.5, ~ 0.032 mM kalsium). Vi spilte samtidig inn kraften og sarcomere lengde. Dette var en nær isometrisk sammentrekning, da cantilever nedbøyningen var ~ 0,5 μm, som var ca 1% av myofibril slakk lengde (~ 50 μm). I figur 4E ble det utført en rask forkortelse-restretch-protokoll under aktiv sammentrekning for å vurdere frekvensen av spenningsutvikling (kTR, gul stiplet linje). KTR er et mål på cross-bridge sykling kinetikk. Også aktiverings- og avslapningskurvene ble montert for å bestemme aktiveringshastigheten (kACT,rød stiplet linje) og avslapning (kREL, grønn stiplet linje), henholdsvis. Figur 4 viser en mer detaljert visning av avslapningsfasen uthevet i figur 4F. To faser ble tydelige: 1) en innledende langsom fase av avslapning (dominert av kryssbroløsning) og 2) en rask fase av avslapning (dominert av kryssbroløsning og kalsiumdissosiasjon)20.
Passiv kraft i myofibriller isolert fra en menneskelig skjelettmuskelbiopsi
Figur 10 viser et spor av et passivt krafteksperiment med myofibril isolert fra sunt humant membranmuskelvev. Den første protokollen involverte en eller flere passive strekninger for å bestemme de viskoelastiske egenskapene til sarkomene. Figur 10 viser et kraftspor av en kontinuerlig strekning av en myofibril (strekk fra sarcomere lengde 2,2-3,0 μm). Under strekningen viste myofibriller både viskøs og elastiske egenskaper. Dette fremgår av kurven vist i figur 10A. Den skarpe toppen representerer begge egenskapene, mens platåkraften er et mål på elastisitet. Viskositet motstår belastningen lineært. Dermed falt kraften etter at belastningen ble fjernet. Figur 10B fremhever selve strekningen og illustrerer det høye signal-til-støy-forholdet. Legg merke til at kraftspor er ufiltrert.
Figur 1: Skjematisk skildring og elektronmikroskopibilder av en skjelettmuskulatur og dens morfologi. (A) Viser strukturen av skjelettmuskulatur og (B) viser strukturen av sarcomere, den minste kontraktile enhet. Disse skjematiske bildene er tilpasset fra Servier Medical Art. (C) Viser et bilde av en enkelt muskelfiber og (D) viser et elektronmikroskopibilde av en muskelfiber som avslører myofibrillarskade samt bevart myofibrillar ultrastruktur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bilder som viser en montert myofibril, Ɵ-glass justering, og piezo montering nål. (A) En myofibril montert i slakk lengde mellom glassfiber nåler belagt med skjellakk sett gjennom en 40x mål. (B) Bilder av posisjonen til Ɵ-glass i forhold til myofibril (uthevet med de hvite ovaler) sett gjennom en 10x mål. (Øverst) Justert til den øverste kanalen (avslappende løsning, pCa 9.0); (Nederst) Justert til den nederste kanalen (aktiveringsløsning, pCa 4.5) for å perfuse myofibril med kalsium og indusere sammentrekning. (C) Skjematiske skildringer av posisjonen til Ɵ-glass i forhold til myofibril. (Øverst) Justert med den øverste kanalen (avslappende løsning, pCa 9.0); (Nederst) Justert med den nederste kanalen (aktiveringsløsning, pCa 4.5) for å perfuse myofibril med kalsium og indusere sammentrekning. (D)Monteringsnål festet til karbonstangen på piezoholderen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk representasjon av oppsettet og endedelen av vevsstrømningskammeret. I mørk blå vevsstrømmen kammeret laget av aluminium, og i hvitt hulrommet der kraftsonden og Ɵ-glass er vist i posisjon; (I midten) Myofibril festet mellom to glassfiber monteringsnåler festet til kraftsonden og piezo lengde motor. Det Ɵ-glasset er på linje med myofibril. Det Ɵ glasset kan bevege seg opp og ned for å eksponere myofibril for kalsiumløsningen. (Høyre) Nærbilde av cantilever force probe. Indikert er hulromstørrelse (eller Fabry-Pérot hulrom, d); refleksjon grensesnitt A, B, og C; og et eksempel på en lysbølge som sendes ut av laseren (rød). Cantilever er montert på skulderen av ferrule. Fiberen som bærer laseren fra interferometeret, kommer ut av ildstrålen på spissen av cantileveren. En glassmonteringsfiber er festet på cantilever ved hjelp av voks. (Øverst til venstre) Interferometeret analyserer interferometersignalet som overføres til systemkontrollerprogramvaren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksperimentelt oppsett og data fra aktive spenningseksperimenter. (A) Skjematisk representasjon av perfusjonsoppsettet og løsningene som brukes. Legg merke til at de første og siste rørene (lyseblå) inneholder kalsiumfri oppløsning (f.eks. avslappende løsning). (B)Eksempel tvinge spor av en aktiv spenning eksperiment med en myofibril isolert fra menneskelig skjelettmuskulatur vev viser fem aktiveringer fra avslappende løsning (pCa 9.0) til flere aktiveringsløsninger (pCa 6.2 – 4.5). (C) En kraft-kalsium kurve; kraftnivåene på platåene i panelet (B) ble normalisert og plottet mot sine respektive kalsiumnivåer. (D)Eksempel kraft spor av en type II (rask twitch) myofibril isolert fra menneskelig skjelettmuskulatur aktivert med pCa 5.6 løsning (blå) og deretter med pCa 5.6 + BTS (en type II spesifikk cross-bridge inhibitor, rød). (E) Eksempel dataspor av et aktivt spenningseksperiment med myofibriller isolert fra mus soleus skjelettmuskelvev med en rask forkortelse-restretch protokoll under aktivering for å bestemme frekvensen av spenning ombygging (kTR, gul stiplet linje). Aktiverings- og avslapningskurven ble også montert for å bestemme aktiveringshastigheten (kACT,rød stiplet linje) og avslapning (kREL, grønn stiplet linje), henholdsvis. (F) En zoom av avslapningsfasen (Øverst til venstre), uthevet i (E). Det raske motorsignalet (nederst til venstre) indikerte tidspunktet da løsningen endret seg fra en aktiveringsløsning (pCa 4.5) til en avslappende løsning (pCa 9.0). Avslapningsfasen besto av en lineær, langsom fase (øverst til høyre) og en eksponentiell, rask fase (nederst til høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempelinnstilling for signalgeneratoren i systemkontrollprogramvaren. (se Materialtabell). 1) Angir knappen for å utføre kommandoer som er angitt i signalgeneratoren. (A) Sette opp piezo lengde motor. (B) Sette opp hurtigtrinnsmotoren. (C) Utføre et raskt skritt for å aktivere en myofibril for en varighet på 5 s. (D) Utføre en rask forkortelse-restretch av en myofibril å bestemme kTR. (E) Utføre en trinnvis strekning av en myofibril for å bestemme viskoelastiske egenskaper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Ventilkontrollerprogramvare som brukes på PCen. (A) Knappen som brukes til å åpne ventiler 1 (Rx) og 6 (Act). (B) Tilstanden til knappene når alle ventilene er lukket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Måling av sarcomere lengde, myofibril lengde, og myofibril bredde med systemkontrolleren programvare. En linjal brukes som et eksempel. (A)Måling av sarcomere lengde: den lilla boksen er plassert rundt myofibril og sarcomere lengden er vist i (1). (B)Måle lengden: Cyan boksen er plassert fra begynnelse til ende av myofibril. (C) Målebredde: Etter å ha rotert kameraet 90°, plasseres cyanboksen fra den ene siden av myofibril til den andre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Termoelektrisk temperaturregulatorprogramvare. (A) Opprett tilkobling med den termoelektriske temperaturregulatoren. (B) Utvid temperaturinnstillingene. (C) Still inn ønsket temperatur, i dette tilfellet: 15 °C. (D) Slå på termoelektrisk temperaturregulator og send spenning til Peltier termoelektrisk kjølermodul. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Innstillinger for utstrømningspumpen for sprøyten. (A) Åpne tilkoblingen til pumpen ved å trykke på (1). (B) Start pumpen med forhåndsdefinerte innstillinger ved å trykke på (2). (C) Start utstrømningspumpen ved å sette 'Valve Commands' til 'Badeventil' (2) og gå inn i 'Kommandosettparametere' som vist. Utfør kommandoen ved å trykke på (3). Kommandoer kan avsluttes ved å trykke på (4). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Eksempel dataspor av et passivt spenningseksperiment med myofibriller isolert fra humant skjelettmuskelvev. (A) Opptak av kraften (Øvre) og sarkomerlengde (Nedre) under en strekk- og frigjøringsprotokoll. (B) Zoom av (A) som viser kraften (Øvre) og sarkomerlengden i strekkfasen av myofibril. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Eksperimentelt oppsett og data fra kardiomyocytt kalsium preaktivering eksperimenter. (A)Skjematisk representasjon av perfusjonsoppsettet. Merk at det siste røret (lyseblått) inneholder kalsiumfri oppløsning (avslappende løsning). (B)Overliggende kurver for aktivering av kardiomyocyte uten (lyseblå) og med (mørk blå) kalsiumpreaktivering, med kalsiumkonsentrasjoner på henholdsvis 1 nM og 80 nM. (C) Sammenligning av kalsium preaktivering i vill type (WT) og heterozygous RBM20 (HET) kardiomyocytter isolert fra rotte venstre ventrikkel. Dette tallet er endret fra Najafi et al.21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Trinn | Enheten | Beskrivelse | Figuren | Første | ||||||||
| 1.7.1. | Piezo | Initialisering passiv spenning | Fast | 51,6 μm | ||||||||
| 1.7.2. | Piezo | Initialisering aktiv spenning | Fast | 0 μm | ||||||||
| Trinn | Enheten | Beskrivelse | Figuren | Første | Forsinkelse | Reps | Nivå | Forsinkelse | Nivå | Forsinkelse | ||
| 3.4.4. / 4.1.1.4. / 4.1.2.4. | Rask-trinns | Testing ɵ-glass posisjon / Aktivering av myofibril | Puls | 4 V (andre personer) | 1 s | Soverom 1: 1 min | 3 V | 5 s | 4 V (andre personer) | 1 s | ||
| 4.1.3.4. | Rask-trinns | Aktivering av myofibril (inkluderer kTR) | Puls | 4 V (andre personer) | 1 s | Soverom 1: 1 min | 3 V | 10-årene | 4 V (andre personer) | 1 s | ||
| Trinn | Enheten | Beskrivelse | Figuren | Første | Forsinkelse | Reps | Rampe nivå | Rampe Varighet | Forsinkelse | Rampe nivå | Rampe Varighet | Forsinkelse |
| 4.1.3.1. / 4.1.3.6. | Piezo | Forkorte-Restretch for kTR | Trapes | 0 μm | 0.5 s | Soverom 1: 1 min | 0 + 0,15 * L0 = __ μm | 0,01 s | 0,01 s | 0 μm | 0,01 s | 1 s |
| 4.2.1.1. / 4.2.1.4. | Piezo | Fortsetter strekk | Trapes | 51,6 μm | 2 s | Soverom 1: 1 min | 51,6 til 0,30 * L0 = __ μm | 2 s | 0 s | 51,6 til 0,30 * L0 = __ μm | 0 s | 1 s |
| 4.2.1.4. | Piezo | Returner myofibril til slakk lengde | Trapes | 1,6 μm | 2 s | Soverom 1: 1 min | 51,6 μm | 5 s | 0 s | 51,6 μm | 0 s | 1 s |
| 4.2.2.3. | Piezo | Trinnvis strekk | Trapes | 51,6 μm | 2 s | 10 x 10 000 00 | 51,6 - 5 μm | 0.5 s | 10 s | 51,6 - 5 μm | 0 s | 0 s |
| 4.2.3. | Piezo | Returner myofibril til slakk lengde | Trapes | 1,6 μm | 2 s | Soverom 1: 1 min | 51,6 μm | 5 s | 0 s | 51,6 μm | 0 s | 0 s |
Tabell 1: Tabell som beskriver de ulike signalgeneratorinnstillingene som brukes i systemkontrollerprogramvaren til å betjene piezo lengdemotoren og hurtigtrinnsmotoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet er en protokoll for å vurdere kontraktil funksjon av myofibriller isolert fra menneskelig eller dyr skjelettmuskulatur vev. Kraftoppløsningen til dette oppsettet har tidligere blitt beskrevet av Chavan et al.12. Kort sagt, det bestemmes av de tilfeldige svingningene i lengden av Fabry-Pérot-hulrommet dannet mellom deteksjonsfiberen og cantilever, som produserer den dominerende delen av støyen ved utgangen av avlesningen (uttrykt i V) som multiplisert med avbøyningsfølsomheten (uttrykt i m / V) og ved fjærkonstanten til cantilever (uttrykt i N / m), gir kraftstøy. For vårt oppsett er rotens gjennomsnittlige firkantede (rms) støy i luft ved utgangen av avlesningen, samplet ved en 1000 datapunkter / s (prøve / s), ca 2 mV. For en typisk myofibril måling brukes en ferrule-top-probe med en fjærkonstant på ~ 0,7 N / m (avbøyningsfølsomhet ∼ 300 nm / V). Denne rms-verdien tilsvarer en cantilever nedbøyning oppløsning på 0,6 nm, noe som betyr en kraftfølsomhet på ~ 0,37 nN. Kraftsonden kalibreres ved å skyve spissen av monteringsnålen mot en veieskala samtidig som bøyingen av kantileveren er lik et multiplum av bølgelengden tilavlesningslaseren 13. Denne kalibreringsmetoden innebærer både cantilever og montering nål stivhet samt mulige variasjoner i moment av cantilever og montering nål på grunn av hastighet og størrelse på myofibril sammentrekning. For tiden er et oppsett for å vurdere myofibril kontraktilitet tilgjengelig, som er basert på påvisning av en laser som avledes fra cantilever, det vil si optisk stråledebøyning (1700 A; ~ 1 nN kraftoppløsning). Dette systemet ble utviklet av Labuda et al. ved hjelp av et optisk periskop for å lede et laserlys mot og bort fra cantilever i begrensende konfigurasjoner11. I dette systemet er en myofibril montert mellom atomkraftkantilever og en stiv glassnål. En fordel med systemet som er beskrevet her er høyere kraftfølsomhet og signal-til-støy-forhold. Videre, i dette oppsettet, kan relativt stive cantilevers brukes, noe som resulterer i liten cantilever nedbøyning når myofibrillar kraft påføres. Dette er viktig, da det gir mulighet for kraftmålinger på nesten konstant sarcomere lengde. Til slutt, sammenlignet med systemet beskrevet av Labuda et al., bruker systemet her lignende eller identiske metoder for å kontrollere temperaturen, for å indusere lengdeendringer på myofibril, og for å endre perfusjonsløsningene ved hjelp av en Ɵ-glass og hurtigtrinnsmotor. Fordelen med systemet beskrevet av Labuda et al. er at en endring av løsningssammensetning (mellom cantilever og optisk periskop) ikke påvirker signalutgangen. I systemet som er beskrevet her, må løsningssammensetningen mellom cantilever og optisk fiber forbli konstant. Løsningen på denne begrensningen er nærmere beskrevet nedenfor.
Optimalisering
Den optiske kraftsonden i kombinasjon med det raske perfusjonssystemet førte til komplikasjoner. Forskjellen i optiske egenskaper mellom lav og høy konsentrasjon Ca2 + løsninger forstyrrer kraftmålingene. For å forhindre tilbakestrømning av den høye kalsiumløsningen ble det konstruert et tilpasset strømningskammer (figur 3). En konstant bakgrunnsstrøm av kalsiumfri løsning induseres fra høyre til venstre for å holde løsningen konstant mellom toppen av den optiske fiberen og cantilever (figur 3D).
For å kontrollere temperaturen monteres et Peltier-element med væskekjøling på strømningskammeret. Dette strømningskammeret er termisk koblet fra mikroskopet ved å montere det på en plastadapter. Med Peltier-elementet, kontrollert av et TEC-system, er det mulig å kontrollere temperaturen på løsningen over tid med 0,1 °C presisjon. Temperaturen overvåkes av en temperatursensor montert på strømningskammeret. Temperaturstabilitet er viktig på grunn av kraftens svingers natur. Cantilever består av en gullbelagt glassstripe, noe som effektivt gjør den til et termometer. Dermed bøyer cantilever med temperaturendringer.
Oppsettet bruker et hurtigtrinnsperfusjonssystem (se Materialtabell) for å kontrollere bevegelsen Ɵ-glasset. Dette systemet tillater perfusjonsbrytere innen 10 ms. Ved å kombinere metoden for temperaturkontroll og løsningsveksling, er dette systemet spesielt egnet til å måle kinetikken til sarcomere kontraktilitet (det vil si hastigheter på kraftutvikling, spenningsutvikling og avslapning) i myofibriller.
I utgangspunktet var ulempen ved å bruke interferometri det lille brukbare området på grunn av nødvendigheten av å bruke den lineære delen av interferenskurven (λ/8, med λ som bølgelengden til laseren). Imidlertid eliminerte nyere innovasjoner dette behovet ved å kombinere bølgelengdemodulasjon med en innlåst forsterker. Systemet er derfor ikke begrenset til en enkelt lineær del av interferenskurven. Dette gjør det mulig å måle uendelig nedbøyning av cantilever14. Dermed er omfanget av cantilever nedbøyning avlesning av dette systemet sterkt forstørret i forhold til tradisjonell interferometry. I tillegg er kraftsondene som er beskrevet enkle å erstatte, og det er mange cantilevers tilgjengelig, med stivheter fra 0,5 N / m til > 20 N / m. Derfor er det mulig å raskt bytte mellom cantilevers og velge stivheten som passer best for eksperimentet som utføres.
Utfordringer
Det nåværende systemet er en prototype basert på et kardiomyocyttmålesystem (se Materials tabell). Flere komponenter kan forbedres for å gi en bedre brukeropplevelse og data av høyere kvalitet. Først, på grunn av tillegg til systemet, kan vibrasjon og resonans være et problem som vil legge til støy til signalet. Også den Ɵ glassholderen og hurtigtrinnsmotorvedleggsmetoden kan forbedres for å gjøre den mindre utsatt for vibrasjon.
For det andre er det ønskelig å erstatte den raske motoren med en piezo lengde aktuator for å øke hastigheten på løsningsveksling og for å oppnå en mer konsekvent bevegelse.
For det tredje inkluderte kalsiumløsningene vi tidligere brukte til å aktivere enkelt striated muskelfibre propionsyre, men disse løsningene absorberer nær-infrarødt lys, forstyrrer kraftmålingene. Kalsiumklorid ble brukt til å eliminere behovet for propionsyre, noe som i stor grad reduserte denne effekten. Dette problemet er iboende til et system basert på interferometri og ikke til stede når du bruker optisk strålenedbøyning.
For det fjerde ble et tilpasset strømningsbad konstruert for å skape en laminær flyt, for å matche strømmen Ɵ-glasset. Dette forhindrer tilbakestrømning på grunn av turbulens i den kalsiumrike løsningen. Derfor forblir løsningen mellom spissen av den optiske fiberen og cantilever konstant. Dekslepper med myofibrillene kan bevege seg fritt under strømningskammeret, og derfor er valg av egnede myofibriller ikke begrenset til det lille området av strømningskammeret.
Reproduserbarhet og variasjon
Det er flere elementer i systemet og protokollen som er viktige for graden av reproduserbarhet og variasjon av de oppnådde dataene.
For det første avhenger kvaliteten på målingene sterkt av kvaliteten på myofibril-isolasjonen. Identiske protokoller gir forskjellige kvaliteter og mengder myofibriller fra forskjellige biopsier. I noen tilfeller gir biopsier knapt brukbare myofibriller eller ingen i det hele tatt. Felles konsensus er at skadede myofibriller vil bryte under sammentrekning og dermed ikke er redegjør for i resultatene.
For det andre er det usikkerhet i fastsettelsen av tverrsnittsområdet av myofibril. På grunn av tekniske begrensninger er det mulig å måle bredden på myofibril i bare ett plan. Derfor antar vi at bredden og dybden er lik. Når kraften normaliseres til et tverrsnittsområde for å beregne maksimal aktiv spenning, bør man være klar over denne antagelsen.
Montering av myofibriller på grunn av myofibril monteringsvinkel, posisjon og integriteten til limet.
Selv om monteringsvinkel og posisjon i stor grad kan styres visuelt, kan små variasjoner mellom myofibriller være til stede. Limintegritet har ikke blitt undersøkt mye. Limintegritet kan imidlertid verifiseres ved å overvåke sarkomerlengden i myofibril før og etter aktivering. Når flere sarcomeres er mellom limet etter en protokoll, tyder dette på at glidning av myofibril i limet har skjedd. Følgelig bør dette myofibril utelukkes fra datasettet.
Andre anvendelser av oppsettet: Kalsium preaktivering i kardiomyocytter isolert fra rotte venstre ventrikkel
I tillegg til å vurdere den kontraktile funksjonen til myofibriller, kan systemet også brukes til å måle kardiomyocyttmekanikk. For eksempel illustrerer figur 11 bruken av membran-permeabiliserte enkeltkardiomyocytter isolert fra rotte venstre ventrikkel21. I motsetning til eksperimentene beskrevet ovenfor, ble avslappende løsning endret og aktiveringsløsningen ble holdt konstant. Hver kardiomyocytt gjennomgikk fem sett med aktiveringer, og utsatte det for en 2 μM fri kalsiumløsning i 1 s. 1 s tidsbegrensning er valgt for å etterligne den tidsbegrensede arten av hjertesammentrekninger, hvor eksponeringen for lave kalsiumkonsentrasjonsløsninger etterligner den diastoliske fasen og eksponeringen for høye kalsiumkonsentrasjonsløsninger etterligner den systoliske fasen av hjertemuskelsammentrekning (figur 11A). For hvert av de fem settene diastolisk kalsium var variert (1, 80, 160, 250 og 400 nM kalsium), mens systolisk kalsium forble konstant (figur 11A). Et sett besto av to sett med tre aktiverings-avslapningssykluser ved 1,8 μm versus 2,0 μm og 2,0 μm versus 2,2 μm for ulike eksperimentelle grupper. Peak force ble målt ved 1 s fra bryteren av pipetten og gjennomsnitt for settet med tre aktivering-avslapning sykluser. Det høye signal-til-støy-forholdet og det høye dynamiske området til denne krafttransduseren tillot oss å måle både de små endringene i diastolisk kraft og de mye større systoliske kreftene (figur 11B). Økende diastolisk kalsium resulterte i en høyere kraft ved 2 μM kalsium i forhold til den første aktiveringen (figur 11B). WT rottekardiomyocytter ble sammenlignet med heterozygous (HET) RMB20 rottekardiomyocytter. På grunn av alternativ spleising har HET-rotter et mer kompatibelt titinprotein sammenlignet med WT-rotter. Effekten ble overdrevet i HET kardiomyocytter ved 80 og 160 μM kalsium (figur 11C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Michiel Helmes er aksjonær og medeier i IONOptix Inc.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av AFM-Telethon og A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. Forfatterne ønsker å anerkjenne skaperen av produktene nevnt i denne artikkelen, IONOptix Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C.
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
