Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolera Myofibrils från skelettmuskulatur tarmbiopsier och bestämma Contractile funktion med en Nano-Newton Resolution Force Transducer

Published: May 7, 2020 doi: 10.3791/61002
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 1
1Department of Physiology, Amsterdam UMC, 2Department of Kinesiology and Physical Education, Faculty of Education, McGill University, 3IONOptix BV

Summary

Presenteras här är ett protokoll för att bedöma de kontraktila egenskaperna hos striated muskel myofibrils med nano-Newton upplösning. Protokollet använder en inställning med en interferometri-baserad, optisk kraft sond. Denna inställning genererar data med hög signal-brus-förhållande och möjliggör bedömning av myofibrils kontraktila kinetik.

Abstract

Striated muskelceller är oumbärliga för aktiviteten hos människor och djur. Single muskelfibrer består av myofibrils, som består av seriellt länkade sarkomerer, de minsta kontraktila enheter i muskel. Sarcomeric dysfunktion bidrar till muskel svaghet hos patienter med mutationer i gener kodning för sarkomiska proteiner. Studiet av myofibril mekanik möjliggör bedömning av aktin-myosin interaktioner utan potentiella confounding effekter av skadade, intilliggande myofibrils vid mätning av kontraktilitet av enstaka muskelfibrer. Ultrastructural skador och feljustering av myofibrils kan bidra till nedsatt kontraktilitet. Om strukturella skador är närvarande i myofibrils, de sannolikt bryta under isoleringen förfarandet eller under experimentet. Vidare ger studier i myofibrils bedömningen av aktin-myosin interaktioner i närvaro av de geometriska begränsningar av sarkomerna. Till exempel kan mätningar i myofibrils klargöra om myofibrillar dysfunktion är den primära effekten av en mutation i ett sarkomiskt protein. Dessutom perfusion med kalcium lösningar eller föreningar är nästan omedelbar på grund av den lilla diametern på myofibril. Detta gör myofibrils synnerligen lämplig att mäta andelen aktivering och avkoppling under kraftproduktion. Det protokoll som beskrivs i detta dokument använder en optisk kraft sond baserad på principen om en Fabry-Pérot interferometer kan mäta krafter i nano-Newton sortiment, kopplade till en piezo längd motor och en snabb-steg perfusion system. Denna uppställning möjliggör studier av myofibrilmekanik med högupplösningskraftmätningar.

Introduction

Striated muskelceller är oumbärliga för dagliga livsaktiviteter. Lem rörelse, andningsfunktion, och pumpning rörelse i hjärtat lita på den kraft som genereras av muskelceller. Skelettmuskel består av muskelfascitappar som innehåller buntar av enstaka muskelfibrer (Figur 1A). Dessa muskelfibrer består av myofibrils, som bildas av seriekopplade sarkomerer (Figur 1B,D). Sarkomerna innehåller tunna och tjocka glödtrådar. Dessa består i första hand av kedjor av aktin och myosinmolekyler, respektive (Figur 1B). Actin-myosin interaktioner är ansvariga för kraft-genererande kapacitet av muskel. Patienter med mutationer i gener kodning för sarkomiska proteiner, såsom nebulin, aktin, och troponin T, lider av muskelsvaghet på grund av kontraktil dysfunktion1.

Kvaliteten på muskelkontraktilitet kan studeras på olika nivåer av organisation, allt från in vivo hela muskler till aktin-myosin interaktioner i in vitro motility analyser. Under de senaste decennierna har flera forskargrupper utvecklat uppställningar för att bestämma kontraktiliteten hos enskilda myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10. Dessa uppställningar är baserade på detektion av förändringar i laser avböjning från en cantilever (dvs, optiska strålen avböjning) som orsakas av kontraktion av myofibril (för detaljer, se Labuda et al.11). Även om fastställandet av kontraktil funktion myofibrils har vissa begränsningar (t.ex. dynamiken i excitation-kontraktionskoppling processer som är uppströms av myofibrils saknas), det finns flera fördelar med detta tillvägagångssätt. Dessa inkluderar: 1) förmågan att bedöma aktin-myosin interaktioner i närvaro av de geometriska begränsningar av sarkomerna; 2) förmågan att bedöma aktin-myosin interaktioner utan potentiella confounding effekter av skadade, intilliggande myofibrils (vid mätning av kontraktilitet av single muskelfibrer ultrastrukturella skador och feljustering av myofibrils kan bidra till nedsatt kontraktilitet) (Figur 1D); 3) den lilla diametern på myofibrils (~1 μm, figur 2A) och bristen på membran möjliggör nästan omedelbar kalcium diffusion in i sarkomerna. Vidare, om strukturella skador finns i myofibrils, de sannolikt bryta under sin isolering eller under experimentet. Därför bedöma myofibril kontraktilitet är en elegant metod för att studera de grundläggande mekanismerna för muskelkontraktion och att förstå om störd aktin-myosin interaktioner är den främsta orsaken till muskelsjukdom som orsakas av mutationer i sarcomeric proteiner.

Detta protokoll presenterar en nyutvecklad setup för att fastställa kontraktility av myofibrils införliva en cantilever kraft sond med nano-Newton upplösning (dvs. Optiforce). Denna kraftsond bygger på interferometriprincipen. Interferometry möjliggör användning av relativt styva kantilevers. Detta gör det möjlighet för att mäta styrka med lite avböjning av cantileveren som att närma sig isometric sammandragningar av myofibrilen. Sonden möjliggör bedömning av låga passiva och aktiva krafter som produceras av en enda myofibril isolerad från olika muskelbiopsier, inklusive de från mänskliga försökspersoner, med en hög signal-brus-förhållande. Den optiska cantilever kraft sond införlivas i denna setup är baserad på en Fabry-Pérot interferometer12. Interferometern detekterar små förskjutningar mellan en optisk fiber och en guldbelagd cantilever monterad på en ferrule (Figur 3). Mellanrummet mellan den optiska fibern och cantileveren kallas Fabry-Pérot håligheten. Myofibrils monteras mellan sonden och piezomotorn med hjälp av två limbelagda glasmonteringsfibrer. Kraften som produceras av myofibrilen kan matematiskt härledas från interferometerdatan. Interferometri baseras på superpositionen eller störningen av två eller flera vågor (i denna setup tre ljusvågor). Laserljus med en våglängd mellan 1 528,77–1 563,85 nm avges från interferometern och skickas genom den optiska fibern. I sonden reflekteras ljuset 1) vid gränssnittet mellan den optiska fibern och mediet (Bild 3A); 2) vid gränssnittet för mediet och den kantilever (Figur 3B); och 3) vid gränssnittet mellan metall- och guldbeläggningen på cantilever (figur 3C). Reflektionen vid gränssnitt A och B är beroende av brytningsindexet (n) för det medium där sonden är nedsänkt. Ljuset, som består av de tre överlagrade reflexerna, återgår till en fotodiod i interferometern. Fotodioden mäter ljusets intensitet, vilket är resultatet av interferensmönstret hos de tre överlagrade reflexerna. När kontraktil kraft genereras genom att aktivera eller sträcker en myofibril, den myofibril drar på cantilever. Denna rörelse ändrar hålighetsstorleken (d) och följaktligen antalet våglängder som passar i hålrummet. Ljuset som reflekteras vid cantilever kommer att ha en annan fas, vilket resulterar i ett annat störningsmönster. Fotodioden registrerar denna förändring av störningsmönster intensitet som en förändring i Volts. Därefter är myofibril kraft generation beräknas från denna förändring, med hänsyn till den cantilever styvhet. Kraftsonden kalibreras av tillverkaren genom att trycka på tippen på monteringsnålen, fäst vid fri handingänden på fri handborttagningen, mot en vågvåg samtidigt som böjningen av frisläppen är lika med en multipel av avläsningslasernsvåglängd 13. Således är interferometri en mycket känslig metod för att upptäcka små förändringar i avstånd, vilket möjliggör mätning av krafter med nano-Newton upplösning. Denna resolution möjliggör bedömningen av myofibrillar kraftproduktion med hög signal-brus-förhållande. Medan traditionella interferometri begränsar mätområdet till den linjära delen av störningskurvan, med hjälp av en inlåsningsförstärkare och modulering av laservåglängden övervinner denna begränsning14. Detta förklaras närmare i diskussionsavsnittet.

För att mäta myofibril aktiv spänning, en snabb-steg perfusion system införlivades för att exponera den myofibril till kalcium lösningar (Figur 4A). Perfusionssystemet med snabbstegs-kan lösningsändringar ske inom 10 ms. På grund av deras lilla diameter, är calciumdiffusion in i myofibrilsen nästan ögonblicklig. Därav, detta system är särskilt lämplig för att mäta satserna för actin-myosin bindning under aktivering och release under avkoppling. Aktiveringshastigheten (kACT) och avslappning (kREL) kan bestämmas från aktivering-avkopplingskurvorna. Också, genom att utsätta myofibrils för kalcium lösningar av ökande koncentration, kraft-kalcium relation och kalcium känslighet kan bestämmas.

Vidare möjliggör en motor med piezolängd snabb sträckning och förkortning av myofibrilen. Detta erbjuder möjligheten att studera de viskoelastiska egenskaperna (dvs, passiv spänning) av myofibril, samt utför en snabb förkortning och restretch av myofibril att bestämma graden av spänning ombyggnad (kTR). De parametrar som hämtas från både aktiva och passiva spänningsexperiment kan ändras av genmutationer i ett sarkomiskt protein.

Denna specialbyggda setup användes för att mäta aktiva och passiva contractile egenskaper myofibrils isolerade från friska mänskliga, patient och mus skelettmuskulaturen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollet för att erhålla mänskliga tarmbiopsier godkändes av den institutionella granskningsnämnden vid VU University Medical Center (#2014/396) och skriftligt informerat samtycke erhölls från försökspersonerna. Protokollet för att erhålla djurmuskelbiopsier godkändes av den lokala djuretiska kommittén vid VU-universitetet (AVD114002016501)

1. Förberedelse och isolering av myofibril

OBS: Använd tidigare beskrivna metoder för att glycerinate biopsier, förbereda de olika kalciumkoncentrationen (pCa)lösningarna 7,16,17, och isolera myofibrils2,18.

  1. Tina de avkopplande (pCa 9.0, Rx) och aktiverande (pCa 4.5, Act) lösningar samt hämmarna (1 M E64, 1 M DTT, 1 M leupeptin, 1 M PMSF), som lagras vid -80 °C.
  2. Ta en glycerinerad bit stripar muskelbiopsi på cirka 1 mm3 och placera den i en liten Petriskål med 1:1 Rx/glycerol (v/v) lösning och placera Petriskålen på en kall tallrik vid 4 °C.
  3. Dissekera bit av muskeln med hjälp av dissekering mikroskop och tlysningar, separera enstaka muskelfibrer utan att isolera dem från bit av muskeln.
    OBS: Avlägsna så mycket fett och bindväv som möjligt för att förhindra kontaminering av myofibrilupphängningen.
  4. Överför bit dissekerad vävnad till ett 5 mL-rör med 1,5 mL avslappnande lösning med hämmare (1 μL/mL E-64, 1 μL/mL leupeptin, 1 μL/mL DTT och 125 μL/mL PMSF). Låt vävnaden temperera vid ca 4 °C i 1 h.
  5. Under inkubationen startar du upp båda PC:n, slår på enheterna och öppnar den tillhörande programvaran (se Table of Materials).
  6. Dränk kraftsonden i ultrarent vatten i en petriskål och kalibrera sonden.
    1. Tryck på 'Start Wizard' på interferometern och följ anvisningarna på skärmen. Efter att du tryckt kalibrera,peka på mikroskopet scenen.
      OBS: Knacka på mikroskopet scenen kommer att orsaka cantilever att avleda och passera genom fransar. Detta möjliggör kalibrering av sonden.
    2. Låt sonden vara nedsänkt i det ultrarena vattnet i petriskålen efter kalibrering.
  7. Initiera piezomotorpositionen. Gör det genom att följa ett av stegen som beskrivs nedan.
    1. När piezomotorn kommer att användas för kTR-spänning, ställ in längden på 0 μm.
      Signalgeneratorinställningar finns i tabell 1, bild 5A.
    2. När piezomotorn kommer att användas för passiv spänning, ställ in längden på 50 μm.
      Signalgeneratorinställningar finns i tabell 1.
      OBS: Skillnaden mellan steg är den initiala positionen för piezolängdsmotorn. För att sträcka ut myofibril, piezomotorn måste dra för att öka avståndet mellan både monteringsnålar och för att förlänga myofibril. För att slakna myofibril, piezomotorn måste trycka för att minska avståndet mellan båda monteringsnålar och för att förkorta myofibril.
  8. Förbered ett mikroskopsglas. Pipett 150 μL av polyhydroxietylmetakrylat (poly-HEMA) lösning (5% poly-HEMA i 95% etanol, w/ v) på ett mikroskop glida och sprida den över bilden så det är alla omfattas.
    OBS: Om en myofibril suspension är pipetterad på ett obestruket mikroskop glida, kommer de myofibrils som sjunker till botten fastnar på mikroskopet glida och det kommer inte att vara möjligt att limma dem.
  9. Fyll sprutor med pCa-lösningar (se figur 4A) och prima perfusionssystemet.
    OBS: I dessa steg alla rör är förfyllda med lämplig lösning för att se till att alla luftbubblor tas bort från slangen.
    1. Fyll inflödesslangen i flödeskammarens bakgrundsflöde (Bild 3, 4A) inflöde med Rx.
    2. När det används, spola grenröret med ultrarent vatten för att avlägsna luft. För att göra det, anslut sprutan med ultrarent vatten till utloppet och spola i den i omvänd riktning. Blockera de oanvända portarna i grenröret.
    3. Gör det möjligt för varje pCa-spruta att fylla sina respektive rör med pCa-lösning. Anslut dem sedan till grenröret och Ɵ-glas.
    4. Öppna ventilerna 1 och 6 med programvaran för panelen för dataanskaffning (se Tabell över material) genom att kontrollera knappen '1+6' (Bild 6A) för att fylla Ɵ-glaset med de avslappnande (pCa 9.0) och aktiverande (4.5) lösningar och stäng ventiler när Ɵ-glaset fylls (Bild 6B).

2. Montering av en myofibril

  1. Coat ett mikroskop glida med poly-HEMA för att förhindra myofibrils från att fastna på glaset.
  2. Förbered homogenisatorn (se Tabell över material) för vävnadshomogenisering. Rengör den inre rotorstaven med rent silkespapper, montera homogenisatorn och snurra 1x i 15 s i alkohol och tre gånger för 15 s vardera i ultrarent vatten. Prerinse homogenisatoren i avslappnande lösning 1 x för 15 s på is.
  3. Placera homogenisatorstången i röret som innehåller muskelvävnaden enligt beskrivningen i steg 1.4 och, samtidigt som du håller röret på is, snurra rotorn i 15 s på hastighet 5 för att riva muskelvävnaden och få en myofibril suspension.
  4. Pipett ~50 μL av myofibrilupphängningen och ~250 μL av avslappnande lösningen på mikroskopsglaset belagt med poly-HEMA i vävnadsbadet. Detta kommer att bilda en flytande droppe. Täck badet med lock för att skydda från damm och vänta 5–10 min för att låta myofibrilerna sjunka till botten.
    OBS: Förhållandet mellan suspensionen och avslappnande lösningen är beroende av kvaliteten på isoleringen, därför justera därefter. Till exempel, om den myofibril avkastningen är låg och få lämpliga myofibrils finns i suspensionen, tillsätt mer myofibril suspension och späd med mindre avslappnande lösning (t.ex. 75 μL av myofibril suspension och 225 μL avslappnande lösning). Hjärta och skelettmuskulatur vävnad är lätt att känna igen på grund av dess striation mönster. Med hjälp av en 10x eller 40x objektiv, är detta mönster också synlig i en enda myofibril. I fall annan vävnad är närvarande i suspensionen, kan myofibrils väljas visuellt. Man kan hoppa över 5–10 min väntan. Detta ökar dock svårigheten att limma en myofibril.
  5. Coat montering nålar med lim (shellack + etanol; 120 mg shellack i 2 mL av 70% etanol). För att göra det, värm limmet vid 65 °C för 30–60 s och pipetten ~6 μL på en ny obelagd glasrutschbana. Doppa spetsen på varje monteringsnål i limmet och upprepa tills ett lager lim är synligt. Flytta sonden och piezo upp vertikalt med mikromanipulatorerna för att göra plats för att placera vävnadsbadet på mikroskopstadiet. Ta bort glasglaset som innehåller limmet.
  6. Montering av myofibrilsen
    1. Placera vävnadsbadet med mikroskopsglaset belagt med poly-HEMA innehållande myofibrilupphängningen på mikroskopstadiet. Använd scenen för att hitta en lämplig myofibril med 40x objektivet. Om det behövs, flytta och rotera vävnadsbadet för att flytta myofibril till en monteringsbar position.
      OBS: Leta efter myofibrils med ett synligt striationmönster som är cirka 30 μm långt. Som beskrivs i detalj i steg 3.1 och 3.2.1 är det möjligt att kontrollera längd och sarkomere längd före limning av myofibril. Lim inte slits myofibrils, eftersom dessa sannolikt kommer att bryta under kontraktion.
    2. Skjut flödeskammaren på plats direkt ovanför vätskedroppet som innehåller myofibrilerna i vävnadsbadet (pipetterat på objektglaset i steg 2.4) och sänk ned den. Stanna innan det träffar vätskedrop.
    3. Sänk piezomonteringsnålen och tryck den på underkäppen på myofibrilen. Lyft den något för att kontrollera om myofibril är fäst vid nålen.
    4. Sänk flödeskammaren tillräckligt långt för att sondens monteringsnål ska nå botten utan att sonden rör flödeskammaren.
    5. Tryck på sondens monteringsnål på myofibrilens översta spets. Lyft den något för att kontrollera om myofibril är fäst vid nålen.
    6. Lyft myofibril från botten av badet så långt som möjligt utan att förlora förmågan att fokusera utan att objektivt röra botten av glaset.

3. Initieringsexperiment

  1. Använd programvaran mikromanipulatorer, kamera och systemstyrenhet (Bild 7A, se Tabell över material) för att mäta sarkomerlängd. Flytta piezo och/eller kraftsonden för att ställa in den initiala sarkomerlängden för myofibrilen till 2,5 μm.
    OBS: En sarkomlängd på 2,5 μm säkerställer optimal överlappning mellan myosinhuvuden och aktin.
  2. Använda fartyget funktion systemet styrenhet programvara mäta myofibril längd och bredd (Figur 7B,C).
    OBS: När du roterar kameran kan den luta vågrätt och/eller vertikalt. För att kontrollera inriktningen av kameran kan ett vattenpass användas för att verifiera att kameran är roterad och inte lutas.
    1. Placera myofibril i mitten av videobilden med hjälp av mikroskopstadiet.
    2. Rita en kvadrat från ena sidan av myofibril till den andra. För längden, se till att inkludera den mörka kanten av limdropparna (Bild 2A) i fyrkanten eftersom bildbehandlingen är baserad på kontrast.
    3. Börja registrera data i programvaran systemstyrenhet (se Table of Materials) genom att trycka på 'Start' och efter 5 s pausa systemstyrenhetens programdatainspelning genom att trycka på 'Paus' -knappen. Längden registreras nu i data.
    4. För bredden först rotera kameran 90° (se Tabell över material) och använd sedan kontrasten av själva myofibrilens kant.
    5. Börja registrera data i programvaran systemstyrenhet (se Table of Materials) genom att trycka på 'Start' och efter 5 s pausa systemstyrenhetens programdatainspelning genom att trycka på knappen 'Pause'. Bredden registreras nu i data.
  3. Om aktiv spänning av myofibrilen behöver bestämmas, behöver perfusionsuppställningen användas. Fortsätt i så fall till steg 3.4. Om endast passiv spänning kommer att bestämmas, hoppa över steg 3.4–4.1.3.7 och fortsätt vid steg 4.2.
  4. Placera och initiera perfusionsinställningen.
    OBS: Detta är endast nödvändigt för generering av aktiv kraft. Fortsätt till steg 4.2 när du utför passiva spänningsexperiment.
    1. Ställ faststegsmotorläget på 4 V (Bild 5B).
    2. Skjut perfusionsstativet på bordet för att rikta in det vänstra nedre hörnet av stativet med tejpen på bordet.
      OBS: Var försiktig så att du inte träffar kraftsonden eller piezomotorn.
    3. Använd manipulatorn för att grovt Ɵ glas för öga.
    4. Titta genom okularet och försiktigt flytta Ɵ-glas mot myofibril med hjälp av manipulatorn.
    5. Rikta in den övre kanalen på Ɵ-glaset mot myofibrilen med hjälp av manipulatorn och kontrollera positionen genom att utföra ett snabbsteg (signalgeneratorinställningar finns i tabell 1) med systemstyrenhetens programvara (Bild 2B–C, se Tabell över material).
      OBS: Se till att den nedersta kanalen kommer att riktas in mot myofibrilen under aktiveringsfasen av snabbstegsfasen (Figur 2B–C).
  5. Slå på bakgrundsflödet för Rx (Bild 4A) för att skapa ett laminär bakgrundsflöde i flödeskammaren.
    OBS: Bakgrundsflödet är nödvändigt för att förhindra turbulent flöde till följd av pCa-lösningsflödet från Ɵ-glas.
    1. Slå på inflöde av flödeskammare med en Luerventilspak.
      1. Skicka följande parametrar till utflödespumpen för att börja tömma flödeskammaren och förhindra att flödeskammaren svämmar över (Bild 9): Ventil = Badventil (2); Microstep-läge = Micro; Kolvmål = 48 000; Kolvhastighet = 38–40 (godtyckligt).
        OBS: Se till att vätskenivån är stabil hela tiden. Den myofibril bör inte köra torr och inte heller bör cantilever. Det är bättre att ha lite överflöd än för lite flöde.
  6. För att ställa in temperaturen på ett önskat värde med den termoelektriska temperaturregulatorn (Bild 8, se Tabell över material), ange önskad temperatur och tryck på 'Start'. Vänta tills önskad temperatur har uppnåtts genom att kontrollera grafen i den termoelektriska temperaturstyrenhetens programvara och fortsätt.
    OBS: När experiment i rumstemperatur utförs behöver den termoelektriska temperaturregulatorn inte användas.

4. Experimentellt protokoll(ar)

  1. Bestäm vilka protokoll för aktiv kraft som behöver utföras.
    OBS: Beroende på vilka data som är nödvändiga för studien kan flera typer av experiment med aktiv kraft utföras: steg 4.1.1, mätning av den maximala kraften vid mättning [Ca2+]; steg 4.1.2, erhålla en Force-pCa kurva för att fastställa kalcium känslighet utöver steg 4.1.1; steg 4.1.3, fastställa graden av spänning ombyggnad genom att göra en förkortning-restretch protokoll utöver steg 4.1.1 eller 4.1.2.
    1. Mät maximal aktiv kraft.
      1. Börja registrera data i programvaran för systemstyrenhet (se Table of Materials) genom att trycka på 'Start'.
      2. Öppna ventilerna 1 och 6 med dataanskaffningspanelen (se Table of Materials) programvara genom att kontrollera knappen '1+6' för att starta Ɵ-glasflöde av den avslappnande lösningen och aktivera lösningen genom Ɵ-glaset (Bild 6A).
      3. Återställ interferometerns räckvidd så att baslinjekraften är 0 V genom att välja och trycka på 'Reset Range' på interferometern (se Tabell över material).
      4. När kraftspåret är stabilt utför du Ɵ-glas snabb-steg (stegstorlek = 100 μm).
        Signalgeneratorinställningar finns i tabell 1 (bild 5C). En aktivering-avkoppling spår liknar figur 4D kommer att registreras och synlig i systemet controller programvara.
      5. Pausa systemstyrenhetens datainspelning av programvara genom att trycka på 'Pausa' knappen.
      6. Om inga fler aktiveringar ska utföras, stäng ventilerna 1 och 6 för att stoppa Ɵ-glasflödet genom att avmarkera knappen '1+6' (Figur 6B), stoppa sprutpumpen (Figur 9, se Tabell över material) genom att trycka på "Avsluta', och stoppa bakgrundsflödet genom att stänga Luerventilen.
    2. Kraft-pCa-kurva
      OBS: Detta liknar steg 4.1.1 för att erhålla den maximala aktiva kraften, men med flera aktiveringar med hjälp av olika pCa-lösningar.
      1. Börja registrera data i systemets styrenhetsmjukvara genom att trycka på "Start".
      2. Öppna ventiler 1 och 2 med datainsamling panel programvara för att starta flödet av avslappnande lösning och pCa 6.2 genom Ɵ-glas.
      3. Återställ omfånget för interferometern så att baslinjekraften är 0 V genom att välja och trycka på 'Reset Range' på interferometern.
      4. När kraftspåret är stabilt utför du Ɵ-glas snabb-steg (stegstorlek = 100 μm).
        Signalgeneratorinställningar finns i tabell 1.
      5. Pausa systemstyrenhetens programvara genom att trycka på' Pausa' knappen.
      6. Upprepa steg 4.1.2.1–4.1.2.4 för ventilerna 1 och 3 (pCa 5.8), ventilerna 1 och 4 (pCa 5.6), ventilerna 1 och 5 (pCa 5.4), samt ventilerna 1 och 6 (pCa 4.5).
      7. Om inga fler aktiveringar ska utföras, stäng ventilerna 1 och 6 för att stoppa Ɵ-glasflödet genom att avmarkera knappen '1+6' (Bild 6A), stoppa sprutpumpen (Figur 9) genom att trycka på 'Avsluta', och stoppa bakgrundsflödet genom att stänga Luerventilen.
    3. Mäta klassar av spänningsrebyggnad (kTR).
      OBS: Detta liknar steg 4.1.1 för maximal aktiv kraft men med vissa ändringar och lagt till steg.
      1. Beräkna piezorörelsen som är nödvändig för att slaka myofibrilen 15% och ange detta värde i signalgeneratorn (Bild 5D, Tabell 1).
      2. Börja registrera data i systemets styrenhets programvara genom att trycka på' Start'.
      3. Öppna ventilerna 1 och 6 med dataanskaffningspanelen (Bild 6A) programvara för att starta flöde av den avslappnande lösningen och pCa 4.5 genom Ɵ-glas.
      4. Återställ omfånget för interferometern så att baslinjekraften är 0 V genom att välja och trycka på 'Reset Range' på interferometern.
      5. När kraftspåret är stabilt utför du Ɵ-glas snabb-steg (stegstorlek = 100 μm).
        Signalgeneratorinställningar finns i tabell 1.
      6. När kraftplatån är nådd, utför den förkortande-restretch med piezo.
        Signalgeneratorinställningar finns i (Bild 5D, Tabell 1). En aktivering-avkoppling spår liknar figur 4E kommer att registreras och synlig i systemet controller programvara.
        OBS: Ett anpassat protokoll kan göras för att automatisera stegen ovan.
      7. Pausa systemstyrenhetens programvara genom att trycka på' Pausa' knappen.
      8. Om inga fler aktiveringar ska utföras, stäng ventilerna 1 och 6 för att stoppa Ɵ-glasflödet genom att avmarkera knappen '1+6' (Bild 6B), stoppa sprutpumpen (Figur 9) genom att trycka på 'Avsluta', och stoppa bakgrundsflödet genom att stänga Luerventilen.
  2. Utför passiva kraftmätningar.
    1. Utför en kontinuerlig stretch.
      1. Beräkna piezorörelsen som är nödvändig för att sträcka ut myofibrilen och ange detta värde i signalgeneratorn (Tabell 1).
        OBS: Detta är exempelinställningar. Beräkna mängden stretch och tid för stretch i förhållande till sarkomerelängden. Dessa inställningar är nödvändiga för att säkerställa att hastigheten på stretch per sarkomere förblir lika över myofibrils.
      2. Börja registrera data i systemets styrenhets programvara genom att trycka på' Start'.
      3. Återställ omfånget för interferometern så att baslinjekraften är 0 V genom att välja och trycka på 'Reset Range' på interferometern.
      4. Utför kontinuerlig stretch med signalgeneratorn i systemstyrenhetens programvara för att manövrera piezoen. Exempel på signalgeneratorinställningar finns i tabell 1.
      5. Korta av myofibril till slak längd med piezo efter sträckan är klar (Tabell 1).
    2. Utför en stegvis stretch.
      1. Börja registrera data i systemets styrenhets programvara genom att trycka på' Start'.
      2. Återställ omfånget för interferometern så att baslinjekraften är 0 V genom att välja och trycka på 'Reset Range' på interferometern.
      3. Utför en stegvis stretch med signalgeneratorn i systemstyrenhetens programvara för att manövrera piezoen. Exempel på signalgeneratorinställningar finns i tabell 1 (bild 5E).
    3. Förkorta myofibril att slack längd med piezo efter sträckan är klar. Exempel på signalgeneratorinställningar finns i tabell 1.
  3. Pausa systemstyrenhetens programvara genom att trycka på' Pausa' knappen.
  4. Stoppa inspelningen av data genom att trycka på knappen 'Stopp' i programvaran systemstyrenhet.
  5. Spara data genom att trycka på 'File' och 'Save Data' i systemstyrenhetens programvara.

5. Städning

  1. Ta bort den uppmätta myofibril och förbereda för nästa myofibril.
    1. För att göra det, försiktigt riva av myofibril medan du tittar genom okulär med 40x objektiv.
    2. Flytta upp kraftsonden och piezo. Flytta upp Ɵ-glas hela vägen upp, till höger och till baksidan. Flytta sedan upp och glida bort flödeskammaren. Ta bort vävnadsbadet.
    3. För att rengöra monteringsnålen, föra den i fokus med hjälp av 10x och okulär. Doppa borsten i etanol och borsta försiktigt av och ta bort limmet från nålen.
      OBS: Tänk på att det kan ta lite tid innan limmet lossnar.
    4. Skölj flödeskammaren och vävnadsbadet med ultrarent vatten.
    5. Placera sonden i liten en Petriskål fylld med ultrarent vatten. Se till att sonden är helt nedsänkt.
  2. När experimenten är klara rensar du inställningen enligt ovan och utför följande ytterligare steg.
    1. Töm slangen från flödesbadet. Skicka parametrarna till utflödessprutans pump (se Tabell of Materials, Bild 9). Ventil = Badventil (2); Mikrostegsläge = Normal; Kolvmål = 0; Kolvhastighet = 30.
      OBS: Avsluta kommandot när slangen är tom.
    2. Initiera pumpen flera gånger (Bild 9B).
    3. Töm ut sprutorna. För att göra det, stäng alla Luer ventiler, öppna alla ventiler, ta bort slangen från nålen av sprutan, håll röret av specifika pCa under nålen, och öppna Luer ventilen. Använd tryckpluggarna för att påskynda processen.
    4. Sätt fast slangen på sprutans nål igen. Fyll sprutor med ~5 mL ultrarent vatten. Placera en kopp under Ɵ-glas. Öppna alla ventiler och öppna tryckventilen för att spola systemet.
    5. Stäng av systemet. Stäng av PC- interferometern och piezo-styrenhetens strömblock.

6. Dataanalys

  1. Exportera dataspårningar från programvaran systemstyrenhet (se Table of Materials) till ett program för kalkylprogram eller urklipp genom att öppna datafilen och välja önskat segment. De spår som visas kommer att exporteras (t.ex. råkraft, sarkomere längd, och piezo position).
  2. Utför analys med programvaran i valet (t.ex. MATLAB).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dataspår registrerades och öppnades med programvaran systemstyrenhet (se Table of Materials). Kompletta spårningar eller markerade segment exporterades till urklipps- eller textfilen för vidare analys med en önskad programvara. Ventiler för att styra flödet av de olika lösningarna byttes med anpassad programvara eller manuellt. En anpassad MATLAB skript användes för att analysera andelen aktivering, spänning ombyggnad, och avkoppling. Den maximala aktiva kraften och toppen och platåkraften för experimenten med passiv kraft togs direkt från systemstyrenhetens styrkårskraftspårning. Efter montering av en myofibril (Figur 2) valdes det önskade protokollet.

Maximal aktiv kraft och kalcium- känslighet för kraften imyofibrils isolerade från mus och mänskliga skelettmuskulaturbiopsier
I figur 4A skildras den experimentella uppställning som används för de aktiva kraftexperimenten schematiskt. Force spår av en aktiv kraft experiment med en myofibril isolerad från friska mänskliga quadriceps muskel visas. Myofibril aktiverades 5 gånger med lösningar med varierande pCa (pCa 6.2, 5.8, 5.6, 5.4, 4.5; data som visas i figur 4B). Den genomsnittliga maximala kraften av alla myofibrils i detta experiment var ~ 123 mN/mm2. En kraft-pCa kurva konstruerades från platåkrafterna som nåddes under varje aktivering i var och en av de fem kalciumlösningarna. Resultaten visas i figur 4C. Från denna kurva beräknades pCa vid 50% av maximal kraftproduktion (pCa50). I denna myofibril var pCa50 5,75.

Dessutom, en eller flera föreningar kan läggas till den perfunderade lösningen för att mäta dess effekt på den kraft som produceras av myofibril. I figur 4D, effekten av N-benzyl-p-toluen sulfonamid (BTS), illustreras en snabb rycka muskel (typ II) myosin tung kedja II (MHCII) hämmare. 19 En myofibril aktiverades först med en pCa 5.6-lösning, och därefter med en pCa 5.6 + BTS-lösning. Under den andra aktiveringen mindre kraft producerades, vilket tyder på att detta var en myofibril som innehöll MHCII. Det finns mutationer i proteiner som är närvarande uteslutande i specifika muskeltyper, och därmed bara påverka myofibrils från den specifika muskel typ. I så fall är 'skriva' den myofibrils viktigt att urskilja mutationen effekt på de olika muskeltyper. Också, detta exempel illustrerar möjligheten för att testa effekten av terapeutiska föreningar i myofibrils.

Figur 4E visar en aktiv kraft spår av en enda myofibril isolerat från mus skelett soleus muskelvävnad. Den myofibril var monterad i setup och perfused med avslappnande lösning (pCa 9.0), följt av perfusion med aktiverande lösning (pCa 4.5, ~ 0.032 mM kalcium). Vi spelade samtidigt in kraften och sarkomerlängden. Detta var en nära isometrisk kontraktion, eftersom cantilever-avböjningen var ~0,5 μm, vilket var ungefär 1% av myofibrils slacklängd (~50 μm). I figur 4E en snabb förkortning-restretch protokollet utfördes under aktiv kontraktion för att bedöma graden av spänning ombyggnad (kTR, gul streckad linje). KTR är ett mått på cykelkinetik över bron. Också, den aktivering och avkoppling kurvor monterades för att bestämma graden avaktivering(k ACT , röd streckad linje) och avkoppling (kREL, grön streckad linje), respektive. I figur 4 visas en mer detaljerad bild av den avslappningsfas som markerats i figur 4F. Två arrangerar gradvis blev påtaglig: 1) en initialt långsamt arrangerar gradvis av avkoppling (dominerat av cross-bridge avskildhet) och 2) en fasta arrangerar gradvis av avkoppling (dominerat av cross-bridge avskildhet och calcium-dissociation)20.

Passiv kraft i myofibrils isolerade från en mänsklig skelettmuskelbiopsi
Figur 10 visar ett spår av en passiv kraft experiment med en myofibril isolerad från friska mänskliga mellangärde muskelvävnad. Det första protokollet involverade en eller flera passiva sträckor för att bestämma de viskoelastiska egenskaperna hos sarkomerna. Figur 10 visar ett kraftspår av en sammanhängande sträcka av en myofibril (sträcka från sarkomlängd 2,2–3,0 μm). Under sträckan visade myofibrils både viskösa och elastiska egenskaper. Detta framgår av den kurva som visas i figur 10A. Den skarpa toppen representerar båda egenskaperna, medan platåkraften är ett mått på elasticitet. Viskositet motstår stam linjärt. Således, den kraft som sjunkit efter stammen togs bort. Bild 10B belyser själva sträckan och illustrerar det höga signal-brusförhållandet. Observera att kraftspår är ofiltrerade.

Figure 1
Figur 1: Schematisk avbildning och elektronmikroskopibilder av en skelettmuskel och dess morfologi. (A) Visar strukturen av skelettmuskulaturen och (B) visar strukturen på sarkomet, den minsta kontraktil enhet. Dessa schematiska bilder är anpassade från Servier Medical Art. (C) Visar en bild av en enda muskel fiber och (D) visar en elektronmikroskopi bild av en muskel fiber avslöjar myofibrillar skador samt bevarade myofibrillar ultrastruktur. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Bilder som visar en monterad myofibril, Ɵ-glasinriktning och piezomonteringsnål. (A) En myofibril monterad på slack längd mellan glasfiber nålarna belagda med shellack sett genom en 40x objektiv. (B) Bilder av positionen för Ɵ-glas i förhållande till myofibril (markeras med de vita ovalerna) sett genom en 10x mål. (Överst) Riktas till den övre kanalen (avslappnande lösning, pCa 9.0); (Nederst) Anpassad till den nedersta kanalen (aktiverande lösning, pCa 4.5) för att genomstärka myofibrilen med kalcium och framkalla sammandragning. (C) Schematiska skildringar av den Ɵ-glaset i förhållande till myofibrilen. (Överst) I linje med den övre kanalen (avslappnande lösning, pCa 9.0); (Nederst) I linje med den nedersta kanalen (aktiverande lösning, pCa 4.5) för att genomstärka myofibril med kalcium och inducera sammandragning. (D) Monteringsnål fäst på piezohållarens kolstång. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Schematisk återgivning av uppställnings- och slutdelen av vävnadsflödeskammaren. I mörkblå vävnadsflödeskammaren gjord av aluminium, och i vitt hålrummet där kraftsonden och Ɵ-glas visas i läge; (Mitten) Myofibril fäst mellan två glasfiber montering nålar fäst vid kraft sonden och piezo längd motor. Den Ɵ-glas är i linje med myofibril. Den Ɵ-glas kan flytta upp och ner för att exponera myofibril till kalcium lösning. (Höger) När-upp av cantilever kraft sonden. Indikerade är håligheten storleksanpassar (eller Fabry-Pérot hålighet, d); reflektionsgränssnitt A, B och C; och ett exempel på en ljusvåg som avges av lasern (röd). Den cantilever är monterad på axeln av ferrule. Fibern som bär lasern från interferometern lämnar ferrule vid spetsen av cantilever. En glasmontering fiber är fast på den cantilever med hjälp av vax. (Överst till vänster) Interferometern analyserar interferometersignalen som överförs till systemstyrenhetens programvara. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Experimentell inställning och data från experiment med aktiv spänning. (A) Schematisk representation av perfusionsinställningen och de lösningar som används. Observera att den första och sista rören (ljusblå) innehåller kalciumfri lösning (dvs. avslappnande lösning). (B) Exempel kraft spår av en aktiv spänning experiment med en myofibril isolerad från mänskliga skelettmuskulatur vävnad som visar fem aktiveringar från avslappnande lösning (pCa 9.0) till flera aktiveringslösningar (pCa 6.2 – 4.5). (C) En kraft-kalciumkurva; kraftnivåer vid platåerna i panel (B) normaliserades och plottades mot sina respektive kalciumnivåer. (D) Exempel kraft spår av en typ II (snabb rycka) myofibril isolerad från mänskliga skelettmuskulaturen aktiveras med pCa 5.6 lösning (blå) och därefter med pCa 5.6 + BTS (en typ II specifika korsbrygga hämmare, röd). (E) Exempel data spår av en aktiv spänning experiment med myofibrils isolerade från mus soleus skelettmuskelvävnad med en snabb förkortning-restretch protokoll under aktiveringen att bestämma graden av spänning ombyggnad (kTR, gul streckad linje). Också, aktiveringen och avkoppling kurvan var monterad för att bestämma graden avaktivering(k ACT , röd streckad linje) och avkoppling (kREL, grön streckad linje), respektive. (F) En zoom av avkopplingsfasen (Överst till vänster), markerad i (E). Snabbstegsmotorsignalen (Nere till vänster) indikerade den tidpunkt då lösningen ändrades från en aktiveringslösning (pCa 4.5) till en avslappnande lösning (pCa 9.0). Avkopplingen arrangerar gradvis bestod av ett linjärt, långsamt arrangerar gradvis (Överst rätt) och ett exponential, fastar arrangerar gradvis (Bottnen rätt). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Bild 5: Exempelinställning för signalgeneratorn i programvaran för systemstyrning. (se Tabellen över material). 1) Visar knappen för att utföra kommandon som anges i signalgeneratorn. (A) Ställa in motorn piezo längd. (B) Ställa in snabbstegsmotorn. (C) Utföra en snabb-steg för att aktivera en myofibril under en varaktighet av 5 s. (D) Utföra en snabb förkortning-restretch av en myofibril för att bestämma kTR. (E) Utföra en stegvis sträcka av en myofibril för att bestämma de viskoelastiska egenskaperna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 6
Bild 6: Ventilstyrenhet programvara som används på PC. (A) Knappen som används för att öppna ventilerna 1 (Rx) och 6 (Act). (B) Knapparnas tillstånd när alla ventiler är stängda. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 7
Bild 7: Mätning av sarkomerlängd, myofibrillängd, och myofibrilbredd med systemets styrenhetsprogramvara. En linjal används som exempel. (A) Mätning av sarkomerlängd: den lila lådan placeras runt myofibrilen och sarkomerlängden visas i (1). (B) Mätning av längden: Cyanlådan placeras från början till slutet av myofibrilen. (C) Mätbredd: Efter att ha roterat kameran 90°, placeras cyanlådan från myofibrilens ena sida till den andra. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 8
Bild 8: Termoelektrisk temperaturstyrenhet programvara. (A) Upprätta anslutning med den termoelektriska temperaturregulatorn. (B) Expandera temperaturinställningar. (C) Ställ in önskad temperatur, i detta fall: 15 °C. (D) Slå på termoelektrisk temperaturregulator och skicka spänning till Peltier termoelektrisk kylarmodul. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 9
Bild 9: Inställningar för sprutans utflödespump. (A) Öppna anslutning till pumpen genom att trycka på (1). (B) Starta pumpen med fördefinierade inställningar genom att trycka på (2). (C) Börja utflödespumpningen genom att ställa in 'Valve Commands' till 'Badventil' (2) och mata in de 'KommandoUppsättningsparametrar' enligt bilden. Utför kommandot genom att trycka på (3). Kommandon kan avslutas genom att trycka på (4). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 10
Figur 10: Exempeldataspår av ett passivt spänningsexperiment med myofibriler som isolerats från mänsklig skelettmuskulaturvävnad. (A) Inspelning av kraften (Övre) och sarkomerlängd (Nedre) under ett stretch- och utsättningsprotokoll. (B) Zoom av (A) som visar kraften (Övre) och sarkomere längd under sträckan fasen av myofibril. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 11
Figur 11: Experimentell inställning och data från kardiomyocytekaliumpreaktiveringsexperiment. (A) Schematisk representation av perfusionsinställningen. Observera att den sista tuben (ljusblå) innehåller kalciumfri lösning (avslappnande lösning). (B) Överlagrade kurvor av aktivering av en kardiomyocyte utan (ljusblå) och med (mörkblå) kalciumpreaktivering, med kalciumkoncentrationer på 1 nM respektive 80 nM. (C) Jämförelse av kalcium preaktivering i vild typ (WT) och heterozygous RBM20 (HET) kardiomyocyter isolerade från råtta vänster kammare. Denna siffra har modifierats från Najafi et al.21. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Steg Enhet Beskrivning Form Inledande
1.7.1. Piezo Initialisering passiv spänning Fast 51,6 μm
1.7.2. Piezo Initialisering aktiv spänning Fast 0 μm
Steg Enhet Beskrivning Form Inledande Försening Reps Nivå Försening Nivå Försening
3.4.4. / 4.1.1.4. / 4.1.2.4. Snabb-steg Provning ɵ-glasposition / Aktivering av myofibril Puls 4 V 1 s 1 x 3 V 5 s 4 V 1 s
4.1.3.4. Snabb-steg Aktivering av myofibril (inkludera kTR) Puls 4 V 1 s 1 x 3 V 10-talet 4 V 1 s
Steg Enhet Beskrivning Form Inledande Försening Reps Ramp nivå Ramp Varaktighet Försening Ramp nivå Ramp Varaktighet Försening
4.1.3.1. / 4.1.3.6. Piezo Förkortning-Restretch för kTR Trapetsoid 0 μm 0,5 s 1 x 0 + 0,15 * L0 = __ μm 0,01 s 0,01 s 0 μm 0,01 s 1 s
4.2.1.1. / 4.2.1.4. Piezo Fortsätter stretch Trapetsoid 51,6 μm 2 s 1 x 51,6 - 0,30 * L0 = __ μm 2 s 0 s 51,6 - 0,30 * L0 = __ μm 0 s 1 s
4.2.1.4. Piezo Återgå myofibril till slack längd Trapetsoid 1,6 μm 2 s 1 x 51,6 μm 5 s 0 s 51,6 μm 0 s 1 s
4.2.2.3. Piezo Stegvis stretch Trapetsoid 51,6 μm 2 s 10 x 51.6 - 5 μm 0,5 s 10 s 51.6 - 5 μm 0 s 0 s
4.2.3. Piezo Återgå myofibril till slack längd Trapetsoid 1,6 μm 2 s 1 x 51,6 μm 5 s 0 s 51,6 μm 0 s 0 s

Tabell 1: Tabell som beskriver de olika signalgeneratorinställningar som används i programvaran för systemstyrenhet för att manövrera motorn piezolängd och snabbstegsmotor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Beskrivs är ett protokoll för att bedöma kontraktil funktion myofibrils isolerade från mänskliga eller djur skelettet muskel vävnader. Kraftupplösningen av denna uppställning har beskrivits tidigare av Chavan et al.12. Kort sagt, det bestäms av slumpmässiga fluktuationer av längden på Fabry-Pérot hålighet bildas mellan detektion fiber och cantilever, som producerar den dominerande delen av buller vid utgången av avläsningen (uttryckt i V) som, multiplicerat med avböjning känslighet (uttryckt i m / V) och av fjäderkonstanten av cantilever (uttryckt i N / m), ger buller kraften. För vår setup, är roten medelvärdet kvadrat (rms) buller i luft vid utgången av avläsningen, provsmakade på en 1.000 datapunkter / s (prov / s), är cirka 2 mV. För en typisk myofibrilmätning används en ferrule-top-sond med en fjäderkonstant på ~0,7 N/m (deformationskänslighet ∼300 nm/V). Detta rms-värde motsvarar en nedböjningsupplösning på 0,6 nm, vilket översätts till en kraftkänslighet på ~0,37 nN. Kraftsonden kalibreras genom att man skjuter fästnålens spets mot en vågvåg samtidigt som böjningen av kantileveren håller lika med en multipel av avläsningslaserns våglängd13. Denna metod för kalibrering medför både den cantilever och montering nål styvhet samt eventuella variationer i vridmoment av cantilever och montering nål på grund av hastighet och magnitud av myofibril kontraktion. För närvarande är en setup för bedömning av myofibril kontraktilitet tillgänglig, som bygger på detektion av en laser som avböjs från cantilever, dvs, optisk strål avböjning (1,700 A; ~ 1 nN kraft upplösning). Detta system har utvecklats av Labuda et al. med hjälp av en optisk periskop för att styra en laser ljus mot och bort från cantilever i begränsande konfigurationer11. I detta system är en myofibril monterad mellan atomkraften cantilever och en styv glasnål. En fördel med det system som beskrivs här är den högre kraftkänsligheten och signal-till-brusförhållandet. Vidare, i denna setup, relativt styva kantilevers användas, vilket resulterar i små cantilever avböjning när myofibrillar kraft appliceras. Detta är viktigt, eftersom det möjliggör kraftmätningar vid nästan konstant sarkomerlängd. Slutligen, jämfört med det system som beskrivs av Labuda et al., systemet här utnyttjar liknande eller identiska metoder för att kontrollera temperaturen, att inducera längd förändringar på myofibril, och att ändra perfusion lösningar med hjälp av en Ɵ-glas och snabb-steg motor. Fördelen med det system som beskrivs av Labuda et al. är att en förändring av lösningssammansättning (mellan cantilever och optiskt periskop) inte påverkar signalutgången. I det system som beskrivs här måste lösningssammansättningen mellan cantilever och optisk fiber förbli konstant. Lösningen på denna begränsning beskrivs närmare nedan.

Optimering
Den optiska kraftsonden i kombination med snabbstegsperfusionssystemet ledde till komplikationer. Skillnaden i optiska egenskaper mellan Ca2+-lösningar med låg och hög koncentration stör kraftmätningarna. För att förhindra att den höga kalciumlösningen har återflödes, konstruerades en anpassad flödeskammare (Figur 3). Ett konstant bakgrundsflöde av kalciumfri lösning induceras från höger till vänster för att hålla lösningen konstant mellan toppen av den optiska fibern och fribärande (Bild 3D).

För att styra temperaturen monteras ett Peltier-element med vätskekylning på flödeskammaren. Denna flödeskammare är termiskt frikopplad från mikroskopet genom att montera den på en plastadapter. Med Peltier-elementet, som styrs av ett TEC-system, är det möjligt att med 0,1 °C-precision styra temperaturen på lösningen med tiden. Temperaturen övervakas av en temperatursensor monterad på flödeskammaren. Temperaturstabilitet är viktigt på grund av kraftens givares natur. Den cantilever består av en guld-belagda glas band, effektivt gör det en termometer. Således böjer sig cantilever med temperaturförändringar.

Vid inställningen används ett snabbstegsperfusionssystem (se Tabell över material) för att kontrollera Ɵ-glas. Detta system möjliggör perfusionsbrytare inom 10 ms. Att kombinera metoden för temperaturkontroll och lösningsbyte gör detta system särskilt lämpligt att mäta kinetiken hos sarkomerekontraktilitet (dvs. kraftutvecklingshastighet, spänningsrenovering och avkoppling) i myofibrils.

Inledningsvis var nackdelen med att använda interferometri det lilla användbara intervallet på grund av nödvändigheten att använda den linjära delen av störningskurvan (λ/8, med λ är laserns våglängd). Men nyligen innovationer elimineras detta behov genom att kombinera våglängd modulering med en lock-in förstärkare. Systemet är därför inte begränsat till en enda linjär del av störningskurvan. Detta möjliggör mätning av oändlig avböjning av cantilever14. Således är utbudet av cantilever avböjning av detta system kraftigt förstorad jämfört med traditionella interferometri. Dessutom är de beskrivna kraftproberna lätta att ersätta och det finns många kantilevers tillgängliga, med styvheter som sträcker sig från 0,5 N/m till >20 N/m. Därför är det möjligt att snabbt ändra mellan kantilevers och välja den styvhet som är mest lämplig för det experiment som utförs.

Utmaningar
Det nuvarande systemet är en prototyp som bygger på ett kardiomyocyte mätsystem (se Table of Materials). Flera komponenter kan förbättras för att ge en bättre användarupplevelse och data av högre kvalitet. Först, på grund av tillägg till systemet, vibrationer och resonans kan vara en fråga som kommer att lägga buller till signalen. Dessutom kan Ɵ-glashållare och snabbstegsmotorisk fästmetod förbättras för att göra den mindre benägen att vibrationer.

För det andra är det önskvärt att byta ut snabbstegsmotorn med ett konverzolängdsdon för att öka hastigheten på lösningsbytet och för att få en mer konsekvent rörelse.

För det tredje, kalcium lösningar vi tidigare använt för att aktivera enkelstrigated muskelfibrer ingår propionsyra, men dessa lösningar absorberar nära infrarött ljus, störa kraft mätningar. Kalciumklorid användes för att eliminera behovet av propionsyra, vilket kraftigt minskade denna effekt. Denna fråga är inneboende till ett system som bygger på interferometri och inte närvarande när du använder optiska balk avböjning.

För det fjärde var ett anpassat flöde bad konstruerad för att skapa en laminär flöde, för att matcha flödet av Ɵ-glas. Detta förhindrar återflöde på grund av turbulens av den kalciumrika lösningen. Därför förblir lösningen mellan spetsen på den optiska fibern och cantilever konstant. Överdraget med myofibrilerna kan röra sig fritt under flödeskammaren och därför är val av lämpliga myofibrils inte begränsat till flödeskammarens lilla område.

Reproducerbarhet och variabilitet
Det finns flera delar av systemet och protokollet som är viktiga för graden av reproducerbarhet och variabilitet av de data som erhålls.

Först, kvaliteten på mätningarna beror starkt på kvaliteten på den myofibril isolering. Identiska protokoll ger olika kvaliteter och mängder av myofibrils från olika biopsier. I vissa fall ger biopsier knappt användbara myofibrils eller ingen alls. Gemensam konsensus är att skadade myofibrils kommer att bryta under kontraktion och därmed inte redovisas i resultaten.

För det andra råder det osäkerhet i bestämningen av tvärsnittsarean av myofibrilen. På grund av tekniska begränsningar är det möjligt att mäta bredden på myofibril i endast ett plan. Därför, för att beräkna tvärsnittsområdet antar vi att bredden och djupet är lika. När kraft normaliseras till ett tvärsnittsyta för att beräkna maximal aktiv spänning, bör man vara medveten om detta antagande.

Montering av myofibrils på grund av myofibril monteringsvinkel, position, och integriteten hos limmet.
Även om monteringsvinkel och placering till stor del kan kontrolleras visuellt, kan små variationer mellan myofibrils vara närvarande. Limintegritet har inte undersökts i stor utsträckning. Limintegritet kan dock verifieras genom att övervaka sarkomerlängden i myofibril före och efter aktivering. När fler sarkomerer är mellan limmet efter ett protokoll, tyder detta på att glidning av myofibril i limmet har inträffat. Följaktligen bör denna myofibril uteslutas från datauppsättningen.

Andra tillämpningar av installationen: Kalcium preaktivering i kardiomyocyter isolerade från råtta vänster kammare
Förutom att bedöma myofibrils kontraktila funktion kan systemet även användas för att mäta kardiomycytmekanik. Till exempel illustrerar figur 11 användningen av membran-permeabiliserade enda kardiomyocyter isolerade från råtta vänster kammare21. I motsats till de experiment som beskrivs ovan, var avkopplande lösning ändras och aktivera lösningen hölls konstant. Varje kardiomycyt genomgick fem uppsättningar aktiveringar, utsätta den för en 2 μM fri kalciumlösning för 1 s. Den 1 s tidsbegränsning väljs för att efterlikna den tidsbegränsade karaktären av hjärtsammandragningar, där exponeringen för låg kalciumkoncentration lösningar härmar den diastoliska fasen och exponeringen för hög kalciumkoncentration lösningar härmar den systoliska fasen av hjärt muskelkontraktion (Figur 11A). För var och en av de fem uppsättningarna var diastoliskt kalcium varierat (1, 80, 160, 250, och 400 nM kalcium), medan systoliskt kalcium förblev konstant (Figur 11A). En uppsättning bestod av två uppsättningar av tre aktiverings-avkopplingscykler vid 1,8 μm jämfört med 2,0 μm och 2,0 μm mot 2,2 μm för olika försöksgrupper. Peak kraft mättes vid 1 s från switch av pipetten och i genomsnitt för den uppsättning av tre aktivering-avkoppling cykler. Det höga signal-brusförhållandet och det höga dynamiska omfånget för denna kraftgivare gjorde det möjligt för oss att mäta både de små förändringarna i diastolisk kraft och de mycket större systoliska krafterna (Figur 11B). Ökande diastoliskt kalcium resulterade i en högre kraft vid 2 μM kalcium i förhållande till den första aktiveringen (Figur 11B). WT råtta kardiomyocyter jämfördes med heterozygous (HET) RMB20 råtta cardiomyocytes. På grund av alternativ splitsning har HET-råttor ett mer kompatibelt titinprotein jämfört med WT-råttorna. Effekten var överdriven i HET kardiomyocyter vid 80 och 160 μM kalcium (Figur 11C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Michiel Helmes är aktieägare och delägare i IONOptix Inc.

Acknowledgments

Detta projekt finansierades av AFM-Telethon och A Foundation Building Strength för Nemaline Myopathies. Författarna vill erkänna skaparen av de produkter som nämns i denna artikel, IONOptix Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio Spec Products, Inc. 985370-XL To isolate myofibrils
Custom coded Matlab
Custom fabricated Includes Labview program to control over serial connection; To control valves
Custom fabricated To cool the Peltier module
Custom fabricated
Custom fabricated Aluminum tissue chamber
Custom fabricated To control the valves; Includes PC software to control over USB
IonOptix System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step
IonOptix MCS100 To record sarcomere length
IonOptix Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher
IonOptix Force probe
Koolance ADT-EX004S
Koolance EX2-755 To cool the Peltier module
Microsoft Data registration
Olympus IX71
Olympus TH4-200
Sigma-Aldrich 529265 Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue
Sigma-Aldrich 78471 Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue
TE Technology, Inc. TE-63-1.0-1.3 To cool the tissue flow chamber
TE Technology, Inc. TC-720 Includes PC software to control over USB
Tecan Trading AG 20736652
Tecan Trading AG 20739263 Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber
Thermo scientific 2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) Discontinued Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) TG150-4 To perfuse the tissue
1 PC for IonWizard and 1 PC for other software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
  2. Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).
  3. Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
  4. Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).
  5. Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
  6. Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
  7. Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
  8. de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
  9. Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
  10. Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
  11. Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
  12. Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
  13. Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
  14. van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
  15. Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
  16. Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
  17. Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
  18. Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
  19. Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
  20. Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
  21. Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).

Tags

Biologi skelettmuskulatur sarkomerekinetik myofibrilmekanik kontraktilitet kalcium cantilever nano-Newton kraft sond
Isolera Myofibrils från skelettmuskulatur tarmbiopsier och bestämma Contractile funktion med en Nano-Newton Resolution Force Transducer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van de Locht, M., de Winter, J. M.,… More

van de Locht, M., de Winter, J. M., Rassier, D. E., Helmes, M. H. B., Ottenheijm, C. A. C. Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer. J. Vis. Exp. (159), e61002, doi:10.3791/61002 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter