Summary
Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von gestreiften Muskelmyofibrils mit Nano-Newton-Auflösung vorgestellt. Das Protokoll verwendet ein Setup mit einer Interferometrie-basierten optischen Kraftsonde. Dieses Setup erzeugt Daten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht die Beurteilung der kontraktilen Kinetik von Myofibrils.
Abstract
Gestreifte Muskelzellen sind für die Aktivität von Mensch und Tier unverzichtbar. Einzelne Muskelfasern bestehen aus Myofibrillen, die aus seriell verbundenen Sarkomen bestehen, den kleinsten kontraktilen Einheiten im Muskel. Sarkomische Dysfunktion trägt zur Muskelschwäche bei Patienten mit Mutationen in Genen bei, die für sarkomerische Proteine kodieren. Die Untersuchung der Myofibril-Mechanik ermöglicht die Beurteilung von Actin-Myosin-Wechselwirkungen ohne mögliche verwirrende Auswirkungen von beschädigten, benachbarten Myofibrils bei der Messung der Kontraktilität einzelner Muskelfasern. Ultrastrukturelle Schäden und Fehlausrichtung von Myofibrils können zu einer beeinträchtigungen Kontraktilität beitragen. Wenn strukturelle Schäden in den Myofibrils vorhanden sind, brechen sie wahrscheinlich während des Isolationsverfahrens oder während des Experiments. Darüber hinaus liefern Studien an Myofibrils die Beurteilung von Actin-Myosin-Wechselwirkungen in Gegenwart der geometrischen Zwänge der Sarkome. Beispielsweise können Messungen in Myofibrils klären, ob myofibrillare Dysfunktion die primäre Wirkung einer Mutation in einem sarkomischen Protein ist. Darüber hinaus ist die Perfusion mit Calciumlösungen oder Verbindungen aufgrund des geringen Durchmessers des Myofibrils fast sofort. Dies macht myofibrils hervorragend geeignet, um die Aktivierungs- und Entspannungsraten während der Kraftproduktion zu messen. Das in diesem Papier beschriebene Protokoll verwendet eine optische Kraftsonde, die auf dem Prinzip eines Fabry-Pérot-Interferometers basiert, das kräfte im Nano-Newton-Bereich messen kann, gekoppelt an einen Piezolängenmotor und ein Schnellschritt-Perfusionssystem. Dieses Setup ermöglicht das Studium der myofibril Mechanik mit hochauflösenden Kraftmessungen.
Introduction
Gestreifte Muskelzellen sind für den Alltag unverzichtbar. Die Bewegung der Gliedmaßen, die Atemfunktion und die Pumpbewegung des Herzens verlassen sich auf die Kraft, die von Muskelzellen erzeugt wird. Skelettmuskel besteht aus Muskelfascicles, die Bündel von einzelnen Muskelfasern enthalten (Abbildung 1A). Diese Muskelfasern bestehen aus Myofibrillen, die durch seriell verknüpfte Sarkome gebildet werden (Abbildung 1B,D). Die Sarkome enthalten dünne und dicke Filamente. Diese bestehen in erster Linie aus Ketten von Aktin- bzw. Myosinmolekülen (Abbildung 1B). Actin-Myosin-Wechselwirkungen sind verantwortlich für die krafterzeugende Kapazität der Muskeln. Patienten mit Mutationen in Genen, die für sarmere Proteine wie Nebulin, Actin und Troponin T kodieren, leiden an Muskelschwäche aufgrund kontraktiler Dysfunktion1.
Die Qualität der Muskelkontraktilität kann auf verschiedenen Ebenen der Organisation untersucht werden, von in vivo ganze Muskeln zu Actin-Myosin-Wechselwirkungen in In-vitro-Motilität assays. In den letzten Jahrzehnten haben mehrere Forschungsgruppen Setups entwickelt, um die Kontraktilität einzelner Myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,,10zu bestimmen. Diese Setups basieren auf der Detektion von Veränderungen der Laserablenkung durch einen Ausleger (d.h. optische Strahlverformung), die durch die Kontraktion des Myofibrils verursacht wird (Details siehe Labuda et al.11). Obwohl die Bestimmung der kontraktilen Funktion von Myofibrils einige Einschränkungen aufweist (z.B. fehlt die Dynamik der Anregungs-Kontraktions-Kopplungsprozesse, die vor den Myofibrils liegen), gibt es mehrere Vorteile für diesen Ansatz. Dazu gehören: 1) die Fähigkeit, Actin-Myosin-Wechselwirkungen in Gegenwart der geometrischen Abhängigkeiten der Sarkome zu bewerten; 2) die Fähigkeit, Actin-Myosin-Wechselwirkungen ohne mögliche verwirrende Auswirkungen von beschädigten, benachbarten Myofibrils zu bewerten (bei der Messung der Kontraktilität von einzelnen Muskelfasern ultrastrukturelle Schäden und Fehlausrichtung von Myofibrils könnte zu einer beeinträchtigten Kontraktilität beitragen) (Abbildung 1D); 3) der kleine Durchmesser von Myofibrils (1 m, Abbildung 2A) und der Mangel an Membranen ermöglichen eine fast sofortige Calciumdiffusion in die Sarkome. Wenn strukturelle Schäden in den Myofibrils vorhanden sind, brechen sie wahrscheinlich während ihrer Isolation oder während des Experiments. Daher ist die Beurteilung der myofibrilKontraktilität eine elegante Methode, um die grundlegenden Mechanismen der Muskelkontraktion zu studieren und zu verstehen, ob gestörte Actin-Myosin-Wechselwirkungen die primäre Ursache für Muskelerkrankungen sind, die durch Mutationen in sarkomerischen Proteinen verursacht werden.
Dieses Protokoll stellt ein neu entwickeltes Setup dar, um die Kontraktilität von Myofibrils zu bestimmen, die eine Freischwinger-Kraftsonde mit Nano-Newton-Auflösung (d. h. Optiforce) enthalten. Diese Kraftsonde basiert auf dem Prinzip der Interferometrie. Die Interferometrie ermöglicht die Verwendung relativ steifer Ausleger. Dies macht es möglich, Kraft mit wenig Ablenkung des Auslegers zu messen, nähern sich isometrischen Kontraktionen des Myofibrils. Die Sonde ermöglicht die Beurteilung niedriger passiver und aktiver Kräfte, die von einem einzelnen Myofibril erzeugt werden, das aus verschiedenen Muskelbiopsien, einschließlich von Menschen, mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis isoliert wird. Die in diesem Setup integrierte optische Auslegerkraftsonde basiert auf einem Fabry-Pérot Interferometer12. Das Interferometer erkennt kleine Verschiebungen zwischen einer Glasfaser und einem goldbeschichteten Ausleger, der auf einer Ferrule montiert ist (Abbildung 3). Der Spalt zwischen der Glasfaser und dem Ausleger wird Fabry-Pérot Hohlraum genannt. Myofibrils werden zwischen Sonde und Piezomotor mit zwei leimbeschichteten Glasfasern montiert. Die vom Myofibril erzeugte Kraft kann mathematisch aus den Interferometerdaten abgeleitet werden. Die Interferometrie basiert auf der Überlagerung oder Interferenz von zwei oder mehr Wellen (in diesem Setup drei Lichtwellen). Laserlicht mit einer Wellenlänge zwischen 1.528,77–1.563,85 nm wird vom Interferometer emittiert und durch die Optische Faser gesendet. In der Sonde wird das Licht 1) an der Schnittstelle zwischen der Optischen Faser und dem Medium reflektiert (Abbildung 3A); 2) an der Schnittstelle des Mediums und des Auslegers (Abbildung 3B); und 3) an der Schnittstelle zwischen der Metall- und Goldbeschichtung des Auslegers (Abbildung 3C). Die Reflexion an den Schnittstellen A und B ist abhängig vom Brechungsindex (n) des Mediums, in das die Sonde eingetaucht ist. Das Licht, bestehend aus den drei überlagerten Reflexionen, kehrt zu einer Photodiode im Interferometer zurück. Die Photodiode misst die Intensität des Lichts, die das Ergebnis des Interferenzmusters der drei überlagerten Reflexionen ist. Wenn kontraktile Kraft durch Aktivieren oder Dehnen eines Myofibril erzeugt wird, zieht das Myofibril auf den Ausleger. Diese Bewegung ändert die Hohlraumgröße(d) und damit die Anzahl der Wellenlängen, die in den Hohlraum passen. Das licht reflektiert am Ausleger hat eine andere Phase, was zu einem anderen Interferenzmuster führt. Die Photodiode zeichnet diese Änderung der Interferenzmusterintensität als Eine Änderung der Volt auf. Anschließend wird aus dieser Änderung die Myofibril-Krafterzeugung unter Berücksichtigung der Auslegersteifigkeit berechnet. Die Kraftsonde wird vom Hersteller kalibriert, indem die Spitze der Montagenadel, die am freien Handende des Auslegers befestigt ist, gegen eine Waage gedrückt wird, während die Biegung des Auslegers einem Vielfachen der Wellenlänge des Ausleselasers13entspricht. Daher ist die Interferometrie eine hochempfindliche Methode, um kleine Entfernungsänderungen zu erkennen, die eine Messung von Kräften mit Nano-Newton-Auflösung ermöglichen. Diese Auflösung ermöglicht die Beurteilung der myofibrillaren Kraftproduktion mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Während die traditionelle Interferometrie den Messbereich auf den linearen Teil der Interferenzkurve begrenzt, überwindet die Verwendung eines Einsperrverstärkers und die Modulation der Laserwellenlänge diese Einschränkung14. Dies wird im Diskussionsteil ausführlicher erläutert.
Um die myofibril aktive Spannung zu messen, wurde ein schnelles Perfusionssystem eingebaut, um das Myofibril Calciumlösungen auszusetzen (Abbildung 4A). Das schnelle Perfusionssystem ermöglicht Lösungsänderungen innerhalb von 10 ms. Aufgrund ihres geringen Durchmessers ist die Kalziumdiffusion in die Myofibrils fast augenblicklich. Daher eignet sich dieses System besonders zur Messung der Aktin-Myosin-Bindungsraten während der Aktivierung und Freisetzung während der Entspannung. Die Aktivierungsrate (kACT) und Entspannung (kREL) kann aus den Aktivierungs-Entspannungskurven bestimmt werden. Auch durch die Exposition der Myofibrils gegenüber Kalziumlösungen mit steigender Konzentration kann die Kraft-Calcium-Beziehung und Kalziumempfindlichkeit bestimmt werden.
Darüber hinaus ermöglicht ein Piezolängenmotor eine schnelle Dehnung und Verkürzung des Myofibrils. Dies bietet die Möglichkeit, die viskoelastischen Eigenschaften (d.h. passive Spannung) des Myofibrils zu untersuchen, sowie eine schnelle Verkürzung und Redehnung des Myofibrils durchzuführen, um die Spannungsrate der Neuentwicklung (kTR) zu bestimmen. Die Parameter, die sowohl aus aktiven als auch aus passiven Spannungsexperimenten gewonnen werden, können durch Genmutationen in einem sarkomischen Protein verändert werden.
Diese maßgeschneiderte Einrichtung wurde verwendet, um die aktiven und passiven kontraktilen Eigenschaften von Myofibrils zu messen, die aus gesunden menschlichen, geduldigen und Mausskelettmuskeln isoliert sind.
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Protocol
Das Protokoll zur Erlangung menschlicher Biopsien wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss des VU University Medical Center (#2014/396) genehmigt und die schriftliche Zustimmung der Probanden in Kenntnis der Sachlage eingeholt. Das Protokoll zur Gewinnung von Tiermuskelbiopsien wurde von der lokalen Tierethikkommission der VU-Universität (AVD114002016501) genehmigt.
1. Vorbereitung und myofibril Isolation
HINWEIS: Verwenden Sie zuvor beschriebene Methoden, um Biopsien zu glycerinisieren, die verschiedenen Calciumkonzentrationslösungen (pCa)7,16,17, vorzubereiten und Myofibrils2,18zu isolieren.
- Die entspannenden (pCa 9.0, Rx) und aktivierenden (pCa 4.5, Act) Lösungen sowie die Inhibitoren (1 M E64, 1 M DTT, 1 M Leupeptin, 1 M PMSF), die bei -80 °C gelagert werden, auftauen.
- Nehmen Sie ein zerglyzeriniertes Stück gestreifte Muskelbiopsie von ca. 1 mm3 und legen Sie es in eine kleine Petrischale mit 1:1 Rx/Glycerin (v/v) Lösung und legen Sie die Petrischale auf eine kalte Platte bei 4 °C.
- Sezieren Sie das Muskelstück mit Seziermikroskop und Zangen, trennen einzelne Muskelfasern, ohne sie vom Muskelstück zu isolieren.
HINWEIS: Entfernen Sie so viel Fett- und Bindegewebe wie möglich, um eine Kontamination der MyofibrilSuspension zu verhindern. - Übertragen Sie das Stück des sezierten Gewebes in ein 5 ml-Rohr mit 1,5 ml Entspannungslösung mit Inhibitoren (1 l/ml E-64, 1 l/ml Leupeptin, 1 L/ml/ml DTT und 125 l/ml PMSF). Lassen Sie das Gewebe bei ca. 4 °C für 1 h temperieren.
- Starten Sie während der Inkubation beide PCs hoch, schalten Sie die Geräte ein, und öffnen Sie die zugehörige Software (siehe Tabelle der Materialien).
- Untertauchen Sie die Kraftsonde in Reinstwasser in eine Petrischale und kalibrieren Sie die Sonde.
- Drücken Sie den 'Start-Assistent' auf dem Interferometer und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm. Tippen Sie nach dem Drücken von Kalibrierenauf die Mikroskopstufe.
HINWEIS: Das Tippen auf die Mikroskopstufe führt dazu, dass der Ausleger abgelenkt wird und durch Fransen geht. Dies ermöglicht die Kalibrierung der Sonde. - Lassen Sie die Sonde nach der Kalibrierung in das Reinstwasser in der Petrischale eintauchen.
- Drücken Sie den 'Start-Assistent' auf dem Interferometer und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm. Tippen Sie nach dem Drücken von Kalibrierenauf die Mikroskopstufe.
- Initialisieren Sie die Piezomotorposition. Führen Sie dazu einen der unten aufgeführten Schritte aus.
- Wenn der Piezomotor für kTR-Spannung verwendet wird, stellen Sie die Länge auf 0 m ein.
Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in Tabelle 1, Abbildung 5A. - Wenn der Piezomotor für passive Spannung verwendet wird, stellen Sie die Länge auf 50 m ein.
Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in Tabelle 1.
HINWEIS: Der Unterschied zwischen den Schritten ist die Ausgangsposition des Piezolängenmotors. Um die Myofibril zu dehnen, muss der Piezomotor ziehen, um den Abstand zwischen beiden Befestigungsnadeln zu erhöhen und die Myofibril zu verlängern. Um das Myofibril zu lockern, muss der Piezomotor drücken, um den Abstand zwischen beiden Befestigungsnadeln zu verringern und die Myofibril zu verkürzen.
- Wenn der Piezomotor für kTR-Spannung verwendet wird, stellen Sie die Länge auf 0 m ein.
- Bereiten Sie ein Mikroskopschlitten vor. Pipette 150 l Polyhydroxyethylmethacrylat (Poly-HEMA) Lösung (5% Poly-HEMA in 95% Ethanol, w/v) auf einem Mikroskopschlitten und verteilen Sie es über den Schlitten, so dass es alles abgedeckt ist.
HINWEIS: Wenn eine myofibril Suspension auf einem unbeschichteten Mikroskopschlitten gepipetiert wird, kleben die Myofibrils, die nach unten sinken, am Mikroskopschlitten und es ist nicht möglich, sie zu kleben. - Füllen Sie Spritzen mit pCa-Lösungen (siehe Abbildung 4A) und grunden Sie das Perfusionssystem.
HINWEIS: In diesen Schritten werden alle Rohre mit der entsprechenden Lösung vorgefüllt, um sicherzustellen, dass alle Luftblasen aus dem Schlauch entfernt werden.- Füllen Sie den Zuflussschlauch des Strömungskammerhintergrundstroms (Abbildung 3, 4A) mit Rx.
- Bei Verwendung spülen Sie den Verteiler mit reinem Reinstwasser, um Luft zu entfernen. Schließen Sie dazu die Spritze mit Reinstwasser an den Auslass an und spülen Sie sie in umgekehrter Richtung ein. Blockieren Sie die ungenutzten Anschlüsse des Verteilers.
- Ermöglichen Sie jeder pCa-Spritze, ihre jeweiligen Schläuche mit pCa-Lösung zu füllen. Verbinden Sie sie dann mit dem Verteiler und dem Glas.
- Öffnen Sie die Ventile 1 und 6 mit der Datenerfassungspanel-Software (siehe Tabelle der Materialien), indem Sie die Taste '1+6' (Abbildung 6A) überprüfen, um das Glas mit den entspannenden (pCa 9.0) und aktivierenden (4.5) Lösungen zu füllen und Ventile zu schließen, wenn das Glas gefüllt ist (Abbildung 6B).
2. Montage eines Myofibrils
- Mantel Sie ein Mikroskop-Dia mit Poly-HEMA, um zu verhindern, dass Myofibrils am Glas kleben.
- Bereiten Sie den Homogenisator (siehe Materialtabelle) auf die Gewebehomogenisierung vor. Reinigen Sie den inneren Rotorstab mit sauberem Gewebepapier, montieren Sie den Homogenisator und drehen Sie 1x für 15 s Alkohol und dreimal für 15 s in Reinstwasser. Prerinse den Homogenisator in Entspannungslösung 1 x für 15 s auf Eis.
- Legen Sie die Homogenisatorstange in das Rohr, die das Muskelgewebe enthält, wie in Schritt 1.4 beschrieben, und drehen Sie den Rotor, während Sie das Rohr auf Eis halten, den Rotor für 15 s auf Geschwindigkeit 5, um das Muskelgewebe zu reißen und eine myofibril Suspension zu erhalten.
- Pipette 50 l der myofibril Suspension und 250 l der Entspannungslösung auf dem Mikroskopschlitten, der mit Poly-HEMA im Gewebebad beschichtet ist. Dies bildet einen flüssigen Tropfen. Bedecken Sie das Bad mit einem Deckel, um vor Staub zu schützen und warten Sie 5–10 min, damit die Myofibrils auf den Boden sinken.
ANMERKUNG: Das Verhältnis zwischen der Suspension und der Entspannungslösung hängt von der Qualität der Isolierung ab, daher passen Sie sich entsprechend an. Wenn z. B. die myofibril-Ausbeute gering ist und nur wenige geeignete Myofibrils in der Suspension vorhanden sind, fügen Sie mehr Myofibril Suspension hinzu und verdünnen Sie mit weniger entspannender Lösung (z. B. 75 l Myofibril Suspension und 225 l Entspannungslösung). Herz- und Skelettmuskelgewebe ist aufgrund seines Striationsmusters leicht zu erkennen. Mit einem 10x oder 40x Objektiv ist dieses Muster auch in einem einzelnen Myofibril sichtbar. Falls in der Suspension anderes Gewebe vorhanden ist, können Myofibrillen visuell ausgewählt werden. Man kann die 5-10 min Wartezeit überspringen. Dies erhöht jedoch die Schwierigkeit, ein Myofibril zu kleben. - Beschichtungsnadeln mit Kleber (Shellac + Ethanol; 120 mg Schellack in 2 ml 70% Ethanol). Dazu den Kleber bei 65 °C für 30–60 s und die Pipette 6 l auf einem neuen unbeschichteten Glasschlitten erhitzen. Tauchen Sie die Spitze jeder Montagenadel in den Kleber und wiederholen Sie, bis eine Schicht Kleber sichtbar ist. Bewegen Sie die Sonde und piezo vertikal mit den Mikromanipulatoren nach oben, um Platz zu machen, um das Gewebebad auf die Mikroskopstufe zu stellen. Entfernen Sie die Glasrutsche, die den Kleber enthält.
- Montage der Myofibrils
- Legen Sie das Gewebebad mit dem mit Poly-HEMA beschichteten Mikroskopschlitten, der die myofibrilSuspension enthält, auf die Mikroskopstufe. Nutzen Sie die Bühne, um ein passendes Myofibril mit dem 40x Objektiv zu finden. Bei Bedarf das Gewebebad bewegen und drehen, um das Myofibril in eine montierbare Position zu bewegen.
HINWEIS: Achten Sie auf Myofibrils mit einem sichtbaren Striationsmuster, das ca. 30 m lang ist. Wie in den Schritten 3.1 und 3.2.1 ausführlich beschrieben, ist es möglich, Länge und Sarcomere-Länge vor dem Kleben des Myofibrils zu überprüfen. Kleben Sie nicht zerrissene Myofibrils, weil diese wahrscheinlich während der Kontraktion brechen. - Schieben Sie die Durchflusskammer direkt über dem Flüssigkeitstropfen, der die Myofibrillen im Gewebebad enthält (in Schritt 2.4 auf die Rutsche gepfetet) und senken Sie ihn. Stoppen Sie, bevor es den Flüssigkeitstropfen trifft.
- Senken Sie die Piezo-Montagenadel und drücken Sie sie auf die untere Spitze des Myofibrils. Heben Sie es leicht an, um zu überprüfen, ob das Myofibril an der Nadel befestigt ist.
- Senken Sie die Strömungskammer so weit, dass die Montagenadel der Sonde den Boden erreicht, ohne dass die Sonde die Strömungskammer berührt.
- Drücken Sie die Montagenadel der Sonde auf die obere Spitze des Myofibrils. Heben Sie es leicht an, um zu überprüfen, ob das Myofibril an der Nadel befestigt ist.
- Heben Sie das Myofibril so weit wie möglich von der Unterseite des Bades, ohne die Fähigkeit zu verlieren, sich zu fokussieren, ohne dass das Ziel den Boden des Glases berührt.
- Legen Sie das Gewebebad mit dem mit Poly-HEMA beschichteten Mikroskopschlitten, der die myofibrilSuspension enthält, auf die Mikroskopstufe. Nutzen Sie die Bühne, um ein passendes Myofibril mit dem 40x Objektiv zu finden. Bei Bedarf das Gewebebad bewegen und drehen, um das Myofibril in eine montierbare Position zu bewegen.
3. Initialisierungsexperiment
- Verwenden Sie die Software für Mikromanipulatoren, Kameras und Systemcontroller (Abbildung 7A, siehe Materialtabelle), um die Sarkome-Länge zu messen. Bewegen Sie die Piezo- und/oder Kraftsonde, um die anfängliche Sarcomere-Länge des Myofibrils auf 2,5 m einzustellen.
HINWEIS: Eine Sarcomere-Länge von 2,5 m sorgt für eine optimale Überlappung zwischen Myosinköpfen und Actin. - Mit der Gefäßfunktion der Systemsteuerungssoftware messen Sie die Myofibril-Länge und -Breite (Abbildung 7B,C).
HINWEIS: Beim Drehen der Kamera kann sie horizontal und/oder vertikal geneigt werden. Um die Ausrichtung der Kamera zu überprüfen, kann ein Spirituosenpegel verwendet werden, um zu überprüfen, ob die Kamera gedreht und nicht geneigt ist.- Positionieren Sie das Myofibril in der Mitte des Videobildes mit der Mikroskopstufe.
- Zeichnen Sie ein Quadrat von einer Seite des Myofibrils auf die andere. Stellen Sie für die Länge sicher, dass sie den dunklen Rand der Leimtröpfchen (Abbildung 2A) in das Quadrat einschließen, da die Bildverarbeitung auf Kontrast basiert.
- Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software (siehe Tabelle der Materialien) durch Drücken von 'Start' und nach 5 s Pause die Systemcontroller-Software-Datenaufzeichnung durch Drücken der 'Pause' Taste. Die Länge wird nun in den Daten aufgezeichnet.
- Drehen Sie für die Breite zuerst die Kamera um 90° (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie dann den Kontrast der Kante des Myofibrils selbst.
- Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software (siehe Tabelle der Materialien) durch Drücken von'Start' und nach 5 s Pause die Systemcontroller-Softwaredatenaufzeichnung durch Drücken der Taste'Pause'. Die Breite wird nun in den Daten aufgezeichnet.
- Wenn die aktive Spannung des Myofibrils bestimmt werden muss, muss das Perfusions-Setup verwendet werden. Wenn ja, fahren Sie mit Schritt 3.4 fort. Wenn nur passive Spannung bestimmt wird, überspringen Sie die Schritte 3.4–4.1.3.7 und fahren Sie mit Schritt 4.2 fort.
- Positionieren und initialisieren Sie das Perfusions-Setup.
HINWEIS: Dies ist nur für die Erzeugung von aktiver Kraft erforderlich. Fahren Sie mit Schritt 4.2 fort, wenn Sie passive Spannungsexperimente durchführen.- Stellen Sie die Schnellschrittmotorposition auf 4 V ein (Abbildung 5B).
- Schieben Sie den Perfusionsständer auf dem Tisch, um die linke untere Ecke des Ständers mit dem Klebeband auf dem Tisch auszurichten.
HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht die Kraftsonde oder den Piezomotor zu treffen. - Verwenden Sie den Manipulator, um das Glas mit dem Auge grob zu positionieren.
- Schauen Sie durch das Okular und bewegen Sie vorsichtig das Glas in Richtung Myofibril mit dem Manipulator.
- Richten Sie den oberen Kanal des -glases mit dem Myofibril mit dem Manipulator aus und überprüfen Sie die Position, indem Sie einen Schnellschritt (Signalgeneratoreinstellungen finden Sie in Tabelle 1) mit der Systemsteuerungssoftware(Abbildung 2B–C, siehe Materialtabelle) durchführen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der untere Kanal während der Aktivierungsphase des Schnellschritts (Abbildung 2B–C) am Myofibril ausgerichtet wird.
- Aktivieren Sie den Hintergrundfluss von Rx (Abbildung 4A), um einen laminaren Hintergrundfluss in der Strömungskammer zu erstellen.
ANMERKUNG: Der Hintergrundfluss ist notwendig, um einen turbulenten Fluss infolge des pCa-Lösungsflusses aus dem Glas zu verhindern.- Schalten Sie den Durchfluss der Durchflusskammer mit einem Luer-Ventilhebel ein.
- Senden Sie die folgenden Parameter an die Abflusspumpe, um mit dem Entleeren der Durchflusskammer zu beginnen und ein Überlaufen der Durchflusskammer zu verhindern (Abbildung 9): Ventil = Badventil (2); Microstep-Modus = Mikro; Plunger-Ziel = 48.000; Plunger-Geschwindigkeit = 38–40 (willkürlich).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand jederzeit stabil ist. Das Myofibril sollte nicht trocken laufen und auch der Ausleger nicht. Es ist besser, einen kleinen Überlauf als zu wenig Fluss zu haben.
- Senden Sie die folgenden Parameter an die Abflusspumpe, um mit dem Entleeren der Durchflusskammer zu beginnen und ein Überlaufen der Durchflusskammer zu verhindern (Abbildung 9): Ventil = Badventil (2); Microstep-Modus = Mikro; Plunger-Ziel = 48.000; Plunger-Geschwindigkeit = 38–40 (willkürlich).
- Schalten Sie den Durchfluss der Durchflusskammer mit einem Luer-Ventilhebel ein.
- Um die Temperatur mit dem thermoelektrischen Temperaturregler auf einen gewünschten Wert einzustellen (Abbildung 8, siehe Materialtabelle), geben Sie die gewünschte Temperatur ein und drücken Sie 'Start'. Warten Sie, bis die gewünschte Temperatur erreicht ist, indem Sie das Diagramm in der thermoelektrischen Temperaturregler-Software überprüfen und fortfahren.
HINWEIS: Bei Experimenten bei Raumtemperatur muss der thermoelektrische Temperaturregler nicht verwendet werden.
4. Experimentelle Protokolle
- Entscheiden Sie, welche aktiven Kraftprotokolle ausgeführt werden müssen.
ANMERKUNG: Abhängig von den für die Studie erforderlichen Daten können mehrere Arten von Aktivkraftexperimenten durchgeführt werden: Schritt 4.1.1, Messung der maximalen Kraft bei der Sättung [Ca2+]; Schritt 4.1.2, Die Erlangung einer Force-pCa-Kurve zur Bestimmung der Calciumempfindlichkeit zusätzlich zu Schritt 4.1.1; Schritt 4.1.3, Bestimmung der Spannungssanierungsrate durch Einkürzen des Restretch-Protokolls zusätzlich zu Schritt 4.1.1 oder 4.1.2.- Messen Sie die maximale aktive Kraft.
- Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software (siehe Tabelle der Materialien) durch Drücken von'Start'.
- Öffnen Sie die Ventile 1 und 6 mit der Datenerfassungs-Software (siehe Tabelle der Materialien) durch Die Überprüfung der Taste '1+6', um den S-Glas-Fluss der Entspannungslösung zu starten und die Lösung durch das Glas zu aktivieren (Abbildung 6A).
- Setzen Sie den Bereich des Interferometers so zurück, dass die Ausgangskraft 0 V beträgt, indem Sie 'Reset Range' auf dem Interferometer auswählen und drücken (siehe Tabelle der Materialien).
- Wenn die Kraftspur stabil ist, führen Sie den Schnellschritt "-Glas" (Schrittgröße = 100 m) aus.
Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in Tabelle 1 (Abbildung 5C). Eine Aktivierungs-Entspannungsspur ähnlich Abbildung 4D wird aufgezeichnet und in der Systemcontroller-Software sichtbar. - Halten Sie die Aufzeichnung der Systemcontroller-Softwaredaten durch Drücken der Taste "Pause"an.
- Wenn keine Aktivierungen mehr durchgeführt werden sollen, schließen Sie die Ventile 1 und 6, um den Durchfluss von B-Glas zu stoppen, indem Sie die Taste '1+6' (Abbildung 6B)deaktivieren, stoppen Sie die Spritzenpumpe (Abbildung 9, siehe Tabelle der Materialien) durch Drücken von'Beenden'und stoppen Sie den Hintergrundfluss, indem Sie das Luer-Ventil schließen.
- Force-pCa-Kurve
HINWEIS: Dies ist ähnlich wie Schritt 4.1.1, um die maximale aktive Kraft zu erhalten, aber mit mehreren Aktivierungen mit verschiedenen pCa-Lösungen.- Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software, indem Sie'Start'drücken.
- Öffnen Sie die Ventile 1 und 2 mit der Datenerfassungspanel-Software, um den Fluss der entspannenden Lösung und pCa 6.2 durch das Glas zu starten.
- Setzen Sie den Bereich des Interferometers zurück, sodass die Ausgangskraft 0 V beträgt, indem Sie auf dem Interferometer denReset-Bereichauswählen und drücken.
- Wenn die Kraftspur stabil ist, führen Sie den Schnellschritt "-Glas" (Schrittgröße = 100 m) aus.
Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in Tabelle 1. - Halten Sie die Systemcontroller-Software an, indem Sie die Taste "Pause"drücken.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2.1–4.1.2.4 für Ventile 1 und 3 (pCa 5.8), Ventile 1 und 4 (pCa 5.6), Ventile 1 und 5 (pCa 5.4) und Ventile 1 und 6 (pCa 4.5).
- Wenn keine Aktivierungen mehr durchgeführt werden sollen, schließen Sie die Ventile 1 und 6, um den Durchfluss von B-Glas zu stoppen, indem Sie die Taste '1+6' (Abbildung 6A)deaktivieren, stoppen Sie die Spritzenpumpe (Abbildung 9) durch Drücken von'Beenden'und stoppen Sie den Hintergrundfluss, indem Sie das Luer-Ventil schließen.
- Messrate der Spannungssanierung (kTR).
HINWEIS: Dies ist ähnlich wie Schritt 4.1.1 für maximale aktive Kraft, aber mit einigen Änderungen und hinzugefügten Schritten.- Berechnen Sie die Piezobewegung, die notwendig ist, um die Myofibril 15% zu lockern, und geben Sie diesen Wert in den Signalgenerator ein (Abbildung 5D, Tabelle 1).
- Starten Sie die Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software, indem Sie 'Start' drücken.
- Öffnen Sie die Ventile 1 und 6 mit der Datenerfassungs-Software (Abbildung 6A), um den Fluss der Entspannungslösung zu starten und pCa 4.5 durch das Glas .
- Setzen Sie den Bereich des Interferometers zurück, sodass die Ausgangskraft 0 V beträgt, indem Sie auf dem Interferometer denReset-Bereichauswählen und drücken.
- Wenn die Kraftspur stabil ist, führen Sie den Schnellschritt "-Glas" (Schrittgröße = 100 m) aus.
Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in Tabelle 1. - Wenn das Kraftplateau erreicht ist, führen Sie die Verkürzungs-Restretch mit dem Piezo durch.
Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in (Abbildung 5D, Tabelle 1). Eine Aktivierungs-Entspannungsspur ähnlich Abbildung 4E wird aufgezeichnet und in der Systemcontroller-Software sichtbar.
HINWEIS: Es kann ein benutzerdefiniertes Protokoll zur Automatisierung der oben genannten Schritte hergestellt werden. - Halten Sie die Systemcontroller-Software an, indem Sie die Taste "Pause"drücken.
- Wenn keine Aktivierungen mehr durchgeführt werden sollen, schließen Sie die Ventile 1 und 6, um den Durchfluss von B-Glas zu stoppen, indem Sie die Taste '1+6' (Abbildung 6B)deaktivieren, stoppen Sie die Spritzenpumpe (Abbildung 9) durch Drücken von'Beenden'und stoppen Sie den Hintergrundfluss, indem Sie das Luer-Ventil schließen.
- Messen Sie die maximale aktive Kraft.
- Führen Sie passive Kraftmessungen durch.
- Führen Sie eine kontinuierliche Dehnung durch.
- Berechnen Sie die Piezobewegung, die notwendig ist, um das Myofibril zu dehnen, und geben Sie diesen Wert in den Signalgenerator ein (Tabelle 1).
HINWEIS: Dies sind Beispieleinstellungen. Berechnen Sie die Dehnungs- und Dehnungsdauer relativ zur Sarcomere-Länge. Diese Einstellungen sind notwendig, um sicherzustellen, dass die Geschwindigkeit der Dehnung pro Sarcomere in myofibrils gleich bleibt. - Starten Sie die Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software, indem Sie 'Start' drücken.
- Setzen Sie den Bereich des Interferometers zurück, sodass die Ausgangskraft 0 V beträgt, indem Sie auf dem Interferometer denReset-Bereichauswählen und drücken.
- Führen Sie eine kontinuierliche Dehnung mit dem Signalgenerator in der Systemcontroller-Software durch, um den Piezo zu betreiben. Beispiel-Signalgeneratoreinstellungen finden Sie in Tabelle 1.
- Verkürzen Sie die myofibril zu slack Länge mit dem Piezo nach der Strecke beendet ist (Tabelle 1).
- Berechnen Sie die Piezobewegung, die notwendig ist, um das Myofibril zu dehnen, und geben Sie diesen Wert in den Signalgenerator ein (Tabelle 1).
- Führen Sie eine schrittweise Dehnung durch.
- Starten Sie die Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software, indem Sie 'Start' drücken.
- Setzen Sie den Bereich des Interferometers zurück, sodass die Ausgangskraft 0 V beträgt, indem Sie auf dem Interferometer denReset-Bereichauswählen und drücken.
- Führen Sie eine schrittweise Dehnung mit dem Signalgenerator in der Systemcontroller-Software durch, um den Piezo zu betreiben. Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in Tabelle 1 (Abbildung 5E).
- Verkürzen Sie die Myofibril auf Slack Länge mit dem Piezo, nachdem die Strecke beendet ist. Beispiel-Signalgeneratoreinstellungen finden Sie in Tabelle 1.
- Führen Sie eine kontinuierliche Dehnung durch.
- Halten Sie die Systemcontroller-Software an, indem Sie die Taste "Pause"drücken.
- Beenden Sie die Aufzeichnung von Daten, indem Sie die Taste"Stopp"in der Systemcontroller-Software drücken.
- Speichern Sie die Daten, indem Sie 'Datei' und 'Daten speichern' in der Systemcontroller-Software drücken.
5. Reinigung
- Entfernen Sie das gemessene Myofibril und bereiten Sie sich auf das nächste Myofibril vor.
- Um dies zu tun, reißen Sie vorsichtig das Myofibril ab, während Sie mit dem 40x Objektiv durch das Okular schauen.
- Bewegen Sie die Kraftsonde und den Piezo nach oben. Bewegen Sie das Glas ganz nach oben, nach rechts und nach hinten. Dann nach oben und schieben Sie die Strömungskammer weg. Entfernen Sie das Gewebebad.
- Um die Montagenadel zu reinigen, bringen Sie sie mit dem 10x und dem Okular in den Fokus. Tauchen Sie die Bürste in Ethanol und bürsten Sie vorsichtig ab und entfernen Sie den Kleber von der Nadel.
HINWEIS: Denken Sie daran, dass es einige Zeit dauern kann, bis der Kleber abkommt. - Spülen Sie die Durchflusskammer und das Gewebebad mit Reinstwasser.
- Legen Sie die Sonde in kleine eine Petrischale gefüllt mit reinem Wasser. Stellen Sie sicher, dass die Sonde vollständig untergetaucht ist.
- Wenn die Experimente abgeschlossen sind, reinigen Sie das Setup wie oben, und führen Sie die folgenden zusätzlichen Schritte aus.
- Leeren Sie die Schläuche aus dem Durchflussbad. Senden Sie die Parameter an die Abflussspritzenpumpe (siehe Materialtabelle, Abbildung 9). Ventil = Badventil (2); Microstep-Modus = Normal; Plunger-Ziel = 0; Plunger-Geschwindigkeit = 30.
HINWEIS: Beenden Sie den Befehl, wenn der Schlauch leer ist. - Initialisieren Sie die Pumpe mehrmals (Abbildung 9B).
- Entleeren Sie die Spritzen. Schließen Sie dazu alle Luer-Ventile, öffnen Sie alle Ventile, entfernen Sie die Schläuche von der Nadel der Spritze, halten Sie das Rohr eines bestimmten pCa unter der Nadel und öffnen Sie das Luer-Ventil. Verwenden Sie die Druckstecker, um den Prozess zu beschleunigen.
- Befestigen Sie den Schlauch wieder an der Nadel der Spritze. Füllen Sie Spritzen mit 5 ml Reinstwasser. Legen Sie eine Tasse unter das Glas. Öffnen Sie alle Ventile und öffnen Sie das Druckventil, um das System zu spülen.
- Fahren Sie das System herunter. Schalten Sie den Stromblock PC, Interferometer und Piezo-Controller aus.
- Leeren Sie die Schläuche aus dem Durchflussbad. Senden Sie die Parameter an die Abflussspritzenpumpe (siehe Materialtabelle, Abbildung 9). Ventil = Badventil (2); Microstep-Modus = Normal; Plunger-Ziel = 0; Plunger-Geschwindigkeit = 30.
6. Datenanalyse
- Exportieren Sie Datenablaufverfolgungen aus der Systemcontroller-Software (siehe Tabelle der Materialien) in ein Tabellenkalkulationssoftwareprogramm oder eine Zwischenablage, indem Sie die Datendatei öffnen und das gewünschte Segment auswählen. Die gezeigten Spuren werden exportiert (z. B. Rohkraft, Sarcomere-Länge und Piezoposition).
- Führen Sie die Analyse mit der Software der Wahl (z.B. MATLAB) durch.
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Representative Results
Datenablaufverfolgungen wurden aufgezeichnet und mit der Systemcontroller-Software geöffnet (siehe Tabelle der Materialien). Vollständige Ablaufverfolgungen oder ausgewählte Segmente wurden zur weiteren Analyse mit einer gewünschten Software in die Zwischenablage oder Textdatei exportiert. Ventile zur Steuerung des Durchflusses der verschiedenen Lösungen wurden mit kundenspezifischer Software oder manuell geschaltet. Ein benutzerdefiniertes MATLAB-Skript wurde verwendet, um die Aktivierungs-, Spannungs- und Entspannungsraten zu analysieren. Die maximale aktive Kraft und die Spitze und die Plateaukraft der passiven Kraftexperimente wurden direkt aus der Systemsteuerungs-Softwarekraftspur entnommen. Nach der Montage eines Myofibrils (Abbildung 2) wurde das gewünschte Protokoll ausgewählt.
Maximale aktive Kraft und Kalzium- Empfindlichkeit der Kraft inMyofibrils isoliert von Maus und menschlichen Skelettmuskelbiopsien
In Abbildung 4A wird der für die Aktivkraftexperimente verwendete Versuchsaufbau schematisch dargestellt. Gezeigt werden Kraftspuren eines Aktiven-Kraftexperiments mit einem Myofibril, das aus einem gesunden menschlichen Quadrizepsmuskel isoliert ist. Das Myofibril wurde 5 Mal mit Lösungen mit unterschiedlichen pCa aktiviert (pCa 6.2, 5.8, 5.6, 5.4, 4.5; Daten in Abbildung 4B). Die durchschnittliche maximale Kraft aller Myofibrils in diesem Experiment betrug 123 mN/mm2. Aus den Plateaukräften, die bei jeder Aktivierung in jeder der fünf Calciumlösungen erreicht wurden, wurde eine Kraft-pCa-Kurve aufgebaut. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4Cdargestellt. Aus dieser Kurve wurde die pCa bei 50% der maximalen Kraftproduktion (pCa50) berechnet. In diesem Myofibril war die pCa50 5,75.
Zusätzlich könnte der durchgefügten Lösung eine oder mehrere Verbindungen zugesetzt werden, um ihre Wirkung auf die durch das Myofibril erzeugte Kraft zu messen. In Abbildung 4Dwird die Wirkung von N-Benzyl-p-Toluolsulfonamid (BTS), einem fast zuckenden Muskel (Typ II) Myosin-Schwerketten-II-Inhibitor (MHCII) dargestellt. 19 Ein Myofibril wurde zuerst mit einer pCa 5.6-Lösung und anschließend mit einer pCa 5.6 + BTS-Lösung aktiviert. Während der zweiten Aktivierung wurde weniger Kraft erzeugt, was darauf hindeutet, dass es sich um ein Myofibril handelte, das MHCII enthielt. Es gibt Mutationen in Proteinen, die ausschließlich in bestimmten Muskeltypen vorhanden sind und daher nur Myofibrils von diesem spezifischen Muskeltyp beeinflussen. In diesem Fall ist die "Typisierung" der Myofibrils wichtig, um die Mutationswirkung auf die verschiedenen Muskeltypen zu erkennen. Dieses Beispiel veranschaulicht auch die Möglichkeit, die Wirksamkeit von therapeutischen Verbindungen in Myofibrils zu testen.
Abbildung 4E zeigt eine aktive Kraftspur eines einzelnen Myofibrils, das aus dem Skelettmuskelgewebe des Skeletts der Maus isoliert ist. Das Myofibril wurde im Setup montiert und mit entspannender Lösung (pCa 9.0) durchdrungen, gefolgt von perfusion mit aktivierender Lösung (pCa 4.5, 0,032 mM Calcium). Wir zeichneten gleichzeitig die Kraft und sarcomere Länge. Dies war eine nahezu isometrische Kontraktion, da die Auslegerverformung 0,5 m betrug, was etwa 1% der Kurzzeitlänge des Myofibrils (ca. 50 m) betrug. In Abbildung 4E wurde während der aktiven Kontraktion ein schnelles Shortening-Restretch-Protokoll durchgeführt, um die Geschwindigkeit der Spannungssanierung zu bewerten (kTR, gelb gestrichelte Linie). Der kTR ist ein Maß für die Brücken-Fahrradkinetik. Außerdem wurden die Aktivierungs- und Entspannungskurven angepasst, um die Aktivierungsrate (kACT, rote gestrichelte Linie) bzw. Entspannung (kREL, grün gestrichelte Linie) zu bestimmen. Abbildung 4 zeigt eine detailliertere Ansicht der Entspannungsphase, die in Abbildung 4Fhervorgehoben ist. Zwei Phasen wurden deutlich: 1) eine anfängliche langsame Phase der Entspannung (dominiert von Querbrückenablösung) und 2) eine schnelle Phase der Entspannung (dominiert von Querbrückenablösung und Kalziumdissoziation)20.
Passive Kraft in Myofibrils isoliert aus einer menschlichen Skelettmuskelbiopsie
Abbildung 10 zeigt eine Spur eines passiven Kraftexperiments mit einem Myofibril, das aus gesundem menschlichen Zwerchfellmuskelgewebe isoliert ist. Das erste Protokoll umfasste eine oder mehrere passive Dehnungen, um die viskoelastischen Eigenschaften der Sarkome zu bestimmen. Abbildung 10 zeigt eine Kraftspur einer kontinuierlichen Strecke eines Myofibrils (Stretch von der Sarkomelänge 2,2–3,0 m). Während der Dehnung zeigten Myofibrils sowohl viskose als auch elastische Eigenschaften. Dies zeigt sich in der Kurve in Abbildung 10A. Der scharfe Gipfel stellt beide Eigenschaften dar, während die Plateaukraft ein Maß für die Elastizität ist. Viskosität widersteht Dehnung linear. So fiel die Kraft, nachdem die Belastung entfernt wurde. Abbildung 10B zeigt die Dehnung selbst und veranschaulicht das hohe Signal-Rausch-Verhältnis. Beachten Sie, dass Kraftablaufverfolgungen ungefiltert sind.
Abbildung 1: Schematische Darstellung und Elektronenmikroskopie Bilder eines Skelettmuskels und seiner Morphologie. (A) Zeigt die Struktur des Skelettmuskels und (B) zeigt die Struktur des Sarcomere, der kleinsten kontraktilen Einheit. Diese schematischen Bilder sind von Servier Medical Art. (C) Zeigt ein Bild einer einzelnen Muskelfaser und (D) zeigt ein Elektronenmikroskopiebild einer Muskelfaser, die myofibrillare Schäden sowie erhaltene myofibrillare Ultrastruktur zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bilder, die eine montierte Myofibril-, -glasausrichtung und Piezo-Montagenadel zeigen. (A) Ein Myofibril, das in lockerer Länge zwischen den glasfaserbeschichteten Nadeln mit Schellack befestigt ist, wie durch ein 40-faches Objektiv gesehen. (B) Bilder der Position des Glases relativ zum Myofibril (hervorgehoben mit den weißen Ovalen) durch ein 10-faches Objektiv gesehen. (Oben) Ausgerichtet am oberen Kanal (Entspannungslösung, pCa 9.0); (Unten) Ausgerichtet am unteren Kanal (aktivierende Lösung, pCa 4.5), um das Myofibril mit Kalzium zu durchdringen und Kontraktion zu induzieren. (C) Schematische Darstellungen der Position des Glases relativ zum Myofibril. (Oben) Ausgerichtet am oberen Kanal (Entspannungslösung, pCa 9.0); (Unten) Ausgerichtet am unteren Kanal (aktivierende Lösung, pCa 4.5), um das Myofibril mit Kalzium zu durchdringen und Kontraktion zu induzieren. (D) Befestigungsnadel am Carbonstab des Piezohalters befestigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Aufbau- und Endteils der Gewebeflusskammer. In Dunkelblau die Gewebeflusskammer aus Aluminium und in Weiß der Hohlraum, in dem die Kraftsonde und das Glas in Position dargestellt sind; (Mitte) Myofibril zwischen zwei Glasfaser-Montagenadeln befestigt, die an der Kraftsonde und dem Piezolängenmotor befestigt sind. Das Glas ist auf das Myofibril ausgerichtet. Das Glas kann sich nach oben und unten bewegen, um das Myofibril der Kalziumlösung auszusetzen. (Rechts) Nahaufnahme der Auslegerkraftsonde. Angezeigt sind die Hohlraumgröße (oder Fabry-Pérot-Hohlraum, d); Reflexionsschnittstellen A, B und C; und ein Beispiel für eine vom Laser emittierte Lichtwelle (rot). Der Ausleger ist auf der Schulter der Ferrule montiert. Die Faser, die den Laser vom Interferometer trägt, verlässt die Ferrule an der Spitze des Auslegers. Eine Glasfaser aus Glasfaser wird mit Wachs am Ausleger befestigt. (Oben links) Das Interferometer analysiert das an die Systemcontroller-Software übertragene Interferometersignal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Versuchsaufbau und Daten aus aktiven Spannungsexperimenten. (A) Schematische Darstellung der Perfusionseinrichtung und der verwendeten Lösungen. Beachten Sie, dass die ersten und letzten Röhrchen (hellblau) kalziumfreie Lösung enthalten (d. h. entspannende Lösung). (B) Beispiel kraftt Spuren eines aktiven Spannungsexperiments mit einem aus menschlichem Skelettmuskelgewebe isolierten Myofibril, das fünf Aktivierungen von der Entspannungslösung (pCa 9.0) bis hin zu mehreren Aktivierungslösungen (pCa 6.2 – 4.5) zeigt. (C) Eine Kraft-Calcium-Kurve; Die Kraftwerte an den Plateaus in Panel (B) wurden normalisiert und gegen ihren jeweiligen Kalziumspiegel dargestellt. (D) Beispielkraftspur eines Typ-II-Myofibrils, das aus dem menschlichen Skelettmuskel isoliert ist und mit der pCa 5.6-Lösung (blau) und anschließend mit pCa 5.6 + BTS (ein Typ-II-spezifischer Querbrückeninhibitor, rot) aktiviert wurde. (E) Beispieldateneines Voneinere eines aktiven Spannungsexperiments mit Myofibrils, die aus dem Skelettmuskelgewebe der Maus isoliert sind, mit einem schnellen Shortening-Restretch-Protokoll während der Aktivierung, um die Spannungsrate der Neuentwicklung zu bestimmen (kTR,gelbe gestrichelte Linie). Außerdem wurden die Aktivierungs- und Entspannungskurve angepasst, um die Aktivierungsrate (kACT, rote gestrichelte Linie) bzw. Entspannung (kREL, grün gestrichelte Linie) zu bestimmen. (F) Ein Zoom der Entspannungsphase (oben links), hervorgehoben in (E). Das Schnellmotorsignal (unten links) zeigte den Zeitpunkt an, an dem sich die Lösung von einer Aktivierungslösung (pCa 4.5) zu einer entspannenden Lösung (pCa 9.0) wandelte. Die Entspannungsphase bestand aus einer linearen, langsamen Phase (oben rechts) und einer exponentiellen, schnellen Phase (unten rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Beispieleinstellung für den Signalgenerator in der Systemsteuerungssoftware. (siehe Materialtabelle). 1) Gibt die Schaltfläche an, um Befehle auszuführen, die in den Signalgenerator eingegeben werden. (A) Einrichten des Piezolängenmotors. (B) Einrichten des Schnellmotors. (C) Ausführen eines schnellen Schrittes, um ein Myofibril für eine Dauer von 5 s zu aktivieren . (D) Durchführen einer schnellen Verkürzung-Restretch eines Myofibrils, um die kTRzu bestimmen. (E) Durchführen einer schrittweisen Strecke eines Myofibrils zur Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Ventilsteuerungssoftware, wie sie auf dem PC verwendet wird. (A) Die Taste zum Öffnen der Ventile 1 (Rx) und 6 (Act). (B) Der Zustand der Tasten, wenn alle Ventile geschlossen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Messen der Sarkomelänge, der Myofibril-Länge und der myofibril-Breite mit der Systemsteuerungssoftware. Ein Lineal wird als Beispiel verwendet. (A) Messung der Sarcomere-Länge: Die violette Box wird um das Myofibril gelegt und die Sarcomere-Länge ist in (1) dargestellt. (B) Längenmessung: Die Cyanbox wird vom Anfang bis zum Ende des Myofibrils platziert. (C) Messbreite: Nach dem Drehen der Kamera um 90° wird die Cyan-Box von einer Seite des Myofibrils zur anderen platziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Thermoelektrische Temperaturregler-Software. (A) Stellen Sie eine Verbindung mit dem thermoelektrischen Temperaturregler her. (B) Erweitern Sie die Temperatureinstellungen. (C) Die gewünschte Temperatur einstellen, in diesem Fall: 15 °C. (D) Thermoelektrischer Temperaturregler einschalten und Spannung an das thermoelektrische Kühlermodul Peltier senden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Einstellungen für die Spritzenabflusspumpe. (A) Öffnen Sie den Anschluss an die Pumpe durch Drücken (1). (B) Starten Sie die Pumpe mit vordefinierten Einstellungen durch Drücken (2). (C) Starten Sie das Abflusspumpen, indem Sie die 'Ventilbefehle' auf 'Bath Valve' (2) setzen und die 'Befehlssatzparameter' wie gezeigt eingeben. Führen Sie den Befehl durch Drücken (3) aus. Befehle können durch Drücken (4) beendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Beispieldaten eines passiven Spannungsexperiments mit Myofibrils, die aus menschlichem Skelettmuskelgewebe isoliert sind. (A) Aufzeichnung der Kraft (Ober) und Sarcomere-Länge (Nieder) während eines Dehnungs- und Freigabeprotokolls. (B) Zoom von (A) zeigt die Kraft (Obere) und Sarcomere-Länge während der Dehnungsphase des Myofibrils. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 11: Versuchsaufbau und Daten aus Kardiomyozyten-Calcium-Voraktivierungsexperimenten. (A) Schematische Darstellung des Perfusions-Setups. Beachten Sie, dass die letzte Röhre (hellblau) kalziumfreie Lösung (Entspannungslösung) enthält. (B) Überlagerte Aktivierungskurven einer Kardiomyozyten ohne (hellblau) und mit (dunkelblauer) Calciumvoraktivierung mit Calciumkonzentrationen von 1 nM bzw. 80 nM. (C) Vergleich der Kalziumvoraktivierung in Wildtyp (WT) und heterozygoten RBM20 (HET) Kardiomyozyten, die aus dem linken Ventrikel der Ratte isoliert sind. Diese Zahl wurde von Najafi et al.21geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Schritt | Gerät | Beschreibung | Form | Ersten | ||||||||
| 1.7.1. | Piezo | Initialisierung passiver Spannung | Fest | 51,6 m | ||||||||
| 1.7.2. | Piezo | Initialisierung aktive Spannung | Fest | 0 m | ||||||||
| Schritt | Gerät | Beschreibung | Form | Ersten | Verzögerung | Wiederholungen | Ebene | Verzögerung | Ebene | Verzögerung | ||
| 3.4.4. / 4.1.1.4. / 4.1.2.4. | Fast-Step | Prüfung der Glasposition / Aktivierung von myofibril | Puls | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 5 s | 4 V | 1 s | ||
| 4.1.3.4. | Fast-Step | Aktivierung von myofibril (einschließlich kTR) | Puls | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 10er Jahre | 4 V | 1 s | ||
| Schritt | Gerät | Beschreibung | Form | Ersten | Verzögerung | Wiederholungen | Ramp-Ebene | Rampendauer | Verzögerung | Ramp-Ebene | Rampendauer | Verzögerung |
| 4.1.3.1. / 4.1.3.6. | Piezo | Verkürzung-Restretch für kTR | Trapez | 0 m | 0,5 s | 1 x | 0 + 0,15 * L0 = __ | 0,01 s | 0,01 s | 0 m | 0,01 s | 1 s |
| 4.2.1.1. / 4.2.1.4. | Piezo | Fortsetzung der Dehnung | Trapez | 51,6 m | 2 s | 1 x | 51,6 - 0,30 * L0 = __ | 2 s | 0 s | 51,6 - 0,30 * L0 = __ | 0 s | 1 s |
| 4.2.1.4. | Piezo | Myofibril wieder auf slack-Länge zurückgeben | Trapez | 1,6 m | 2 s | 1 x | 51,6 m | 5 s | 0 s | 51,6 m | 0 s | 1 s |
| 4.2.2.3. | Piezo | Schrittweise Dehnung | Trapez | 51,6 m | 2 s | 10 x | 51,6 - 5 m | 0,5 s | 10 s | 51,6 - 5 m | 0 s | 0 s |
| 4.2.3. | Piezo | Myofibril wieder auf slack-Länge zurückgeben | Trapez | 1,6 m | 2 s | 1 x | 51,6 m | 5 s | 0 s | 51,6 m | 0 s | 0 s |
Tabelle 1: Tabelle, die die verschiedenen Signalgeneratoreinstellungen beschreibt, die in der Systemsteuerungssoftware für den Betrieb des Piezolängenmotors und des Schnellfahrmotors verwendet werden.
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Discussion
Beschrieben ist ein Protokoll zur Beurteilung der kontraktilen Funktion von Myofibrils, die aus menschlichen oder tierischen Skelettmuskelgeweben isoliert sind. Die Kraftauflösung dieses Setups wurde bereits von Chavan et al.12beschrieben. Kurz gesagt, wird durch die zufälligen Schwankungen der Länge der Fabry-Pérot-Kavität zwischen der Detektionsfaser und dem Ausleger gebildet, die den dominanten Teil des Rauschens am Ausgang der Auslese erzeugen (ausgedrückt in V), die, multipliziert mit der Ablenkempfindlichkeit (ausgedrückt in m/V) und der Federkonstante des Auslegers (ausgedrückt in N/m), das Kraftrauschen liefert. Für unser Setup beträgt das Wurzelmittelquadrat (rms) in der Luft am Ausgang des Auslesevorgangs, das bei 1.000 Datenpunkten/s (Sample/s) abgetastet wird, ca. 2 mV. Für eine typische myofibril-Messung wird eine Ferrule-Top-Sonde mit einer Federkonstante von 0,7 N/m (Ablenkempfindlichkeit 300 nm/V) verwendet. Dieser rms-Wert entspricht einer Ausleger-Ablenkungsauflösung von 0,6 nm, was einer Kraftempfindlichkeit von 0,37 nN entspricht. Die Kraftsonde wird kalibriert, indem die Spitze der Montagenadel gegen eine Waage gedrückt wird, während die Biegung des Auslegers einem Vielfachen der Wellenlänge des Ausleselasers13entspricht. Diese Kalibrierungsmethode beinhaltet sowohl die Ausleger- und Montagenadelsteifigkeit als auch mögliche Drehmomentschwankungen des Auslegers und der Montagenadel aufgrund der Geschwindigkeit und Größe der myofibril Kontraktion. Derzeit steht ein Setup zur Beurteilung der myofibril Kontraktilität zur Verfügung, das auf der Detektion eines vom Ausleger abgelenkten Lasers basiert, d.h. der optischen Strahlablenkung (1.700 A; 1 nN Kraftauflösung). Dieses System wurde von Labuda et al. mit einem optischen Periskop entwickelt, um ein Laserlicht in den einschränkenden Konfigurationen11zum und weg vom Ausleger zu führen. In diesem System ist ein Myofibril zwischen dem Atomkraftausleger und einer starren Glasnadel montiert. Ein Vorteil des hier beschriebenen Systems ist die höhere Kraftempfindlichkeit und das Signal-Rausch-Verhältnis. Darüber hinaus können in diesem Setup relativ steife Ausleger verwendet werden, was bei Anwendung der myofibrillaren Kraft zu einer kleinen Auslegerverformung führt. Dies ist wichtig, da es Kraftmessungen bei nahezu konstanter Sarcomere-Länge ermöglicht. Schließlich verwendet das System hier im Vergleich zu dem von Labuda et al. beschriebenen System ähnliche oder identische Methoden, um die Temperatur zu steuern, Längenänderungen am Myofibril zu induzieren und die Perfusionslösungen mit einem Glas- und Schnellschrittmotor zu ändern. Der Vorteil des von Labuda et al. beschriebenen Systems besteht darin, dass eine Änderung der Lösungszusammensetzung (zwischen Freischwinger und optischem Periskop) den Signalausgang nicht beeinflusst. Im hier beschriebenen System muss die Lösungszusammensetzung zwischen Ausleger und Glasfaser konstant bleiben. Die Lösung für diese Einschränkung wird im Folgenden ausführlicher beschrieben.
Optimierung
Die optische Kraftsonde in Kombination mit dem Schnellschritt-Perfusionssystem führte zu Komplikationen. Der Unterschied in den optischen Eigenschaften zwischen Ca2+-Lösungen mit niedriger und hoher Konzentration stört die Kraftmessungen. Um einen Rückfluss der Hochkalziumlösung zu verhindern, wurde eine kundenspezifische Durchflusskammer entwickelt (Abbildung 3). Ein konstanter Hintergrundfluss der kalziumfreien Lösung wird von rechts nach links induziert, um die Lösung zwischen der Oberseite der optischen Faser und dem Ausleger konstant zu halten (Abbildung 3D).
Zur Temperaturregelung ist ein Peltier-Element mit Flüssigkeitskühlung auf der Durchflusskammer montiert. Diese Durchflusskammer wird durch Montage auf einem Kunststoffadapter thermisch vom Mikroskop abgekoppelt. Mit dem Peltier-Element, das von einem TEC-System gesteuert wird, ist es möglich, die Temperatur der Lösung über die Zeit mit 0,1 °C Präzision zu steuern. Die Temperatur wird durch einen temperatursensor überwacht, der an der Durchflusskammer montiert ist. Die Temperaturstabilität ist aufgrund der Art des Kraftgebers wichtig. Der Ausleger besteht aus einem vergoldeten Glasstreifen, was ihn zu einem Thermometer macht. So biegt sich der Ausleger mit Temperaturänderungen.
Das Setup verwendet ein schnelles Perfusionssystem (siehe Materialtabelle), um die Bewegung des Glases zu steuern. Dieses System ermöglicht Perfusionsschalter innerhalb von 10 ms. Durch die Kombination der Methode der Temperaturregelung und des Lösungswechsels eignet sich dieses System besonders zur Messung der Kinetik der Sarkome-Kontraktilität (d. h. der Geschwindigkeit enthinen Kraftentwicklung, Spannungssanierung und Entspannung) in Myofibrils.
Der Nachteil der Interferometrie war zunächst der kleine nutzbare Bereich aufgrund der Notwendigkeit, den linearen Teil der Interferenzkurve zu verwenden (8, wobei die Wellenlänge des Lasers dies ist). Die jüngsten Innovationen beseitigten diese Notwendigkeit jedoch, indem sie Wellenlängenmodulation mit einem Einsperrverstärker kombinierten. Daher ist das System nicht auf einen einzelnen linearen Teil der Interferenzkurve beschränkt. Dies ermöglicht die Messung der unendlichen Durchbiegung des Auslegers14. Somit ist der Bereich der Auslese der Auslegerablenkung dieses Systems im Vergleich zur herkömmlichen Interferometrie stark erweitert. Darüber hinaus sind die beschriebenen Kraftsonden leicht zu ersetzen und es stehen viele Ausleger zur Verfügung, mit Steifigkeiten von 0,5 N/m bis >20 N/m. Daher ist es möglich, schnell zwischen Auslegern zu wechseln und die Steifigkeit auszuwählen, die für das durchgeführte Experiment am besten geeignet ist.
Herausforderungen
Das aktuelle System ist ein Prototyp, der auf einem Kardiomyozytenmesssystem basiert (siehe Materialtabelle). Mehrere Komponenten können verbessert werden, um eine bessere Benutzererfahrung und Daten von höherer Qualität zu bieten. Erstens können Vibrationunden und Resonanz aufgrund von Add-ons zum System ein Problem sein, das dem Signal Rauschen hinzufügt. Außerdem könnten der Glashalter und die schnelle Motorbefestigungsmethode verbessert werden, um sie weniger anfällig für Vibrationen zu machen.
Zweitens ist es wünschenswert, den Schnellmotor durch einen Piezolängenantrieb zu ersetzen, um die Geschwindigkeit des Lösungswechsels zu erhöhen und eine gleichmäßigere Bewegung zu erhalten.
Drittens enthielten die Kalziumlösungen, die wir zuvor zur Aktivierung einzelner gestreifter Muskelfasern verwendet haben, Propionsäure, aber diese Lösungen absorbieren Nahinfrarotlicht und stören die Kraftmessungen. Calciumchlorid wurde verwendet, um die Notwendigkeit von Propionsäure zu beseitigen, die diesen Effekt stark reduziert. Dieses Problem ist einem System inhärent, das auf Interferometrie basiert und bei der Verwendung der optischen Strahlablenkung nicht vorhanden ist.
Viertens wurde ein benutzerdefiniertes Durchflussbad entwickelt, um einen laminaren Fluss zu schaffen, der dem Fluss des Glases entspricht. Dies verhindert rückfluss durch Turbulenzen der kalziumreichen Lösung. Daher bleibt die Lösung zwischen der Spitze der Glasfaser und dem Ausleger konstant. Der Deckelschlupf mit den Myofibrils kann sich frei unter der Strömungskammer bewegen und daher ist die Auswahl geeigneter Myofibrils nicht auf den kleinen Bereich der Strömungskammer beschränkt.
Reproduzierbarkeit und Variabilität
Es gibt mehrere Elemente des Systems und Protokolls, die für den Grad der Reproduzierbarkeit und Variabilität der erhaltenen Daten wichtig sind.
Erstens hängt die Qualität der Messungen stark von der Qualität der myofibril Isolierung ab. Identische Protokolle ergeben unterschiedliche Qualitäten und Mengen von Myofibrils aus verschiedenen Biopsien. In einigen Fällen ergeben Biopsien kaum nutzbare Myofibrils oder gar keine. Gemeinsamer Konsens ist, dass beschädigte Myofibrils während der Kontraktion brechen und daher nicht in den Ergebnissen berücksichtigt werden.
Zweitens besteht Unsicherheit bei der Bestimmung des Querschnittsbereichs des Myofibrils. Aufgrund technischer Zwänge ist es möglich, die Breite des Myofibrils in nur einer Ebene zu messen. Um die Querschnittsfläche zu berechnen, gehen wir daher davon aus, dass breite und tiefe gleich sind. Wenn die Kraft auf einen Querschnittsbereich normalisiert wird, um die maximale aktive Spannung zu berechnen, sollte man sich dieser Annahme bewusst sein.
Montage von Myofibrils durch myofibril Montagewinkel, Position und die Integrität des Klebers.
Obwohl Montagewinkel und Position weitgehend visuell gesteuert werden können, können kleine Variationen zwischen Myofibrils vorhanden sein. Die Klebstoffintegrität wurde nicht umfassend untersucht. Die Leimintegrität kann jedoch durch Die Überwachung der Sarkomelänge im Myofibril vor und nach der Aktivierung überprüft werden. Wenn sich nach einem Protokoll mehr Sarkome zwischen dem Leim befinden, deutet dies darauf hin, dass das Myofibril im Leim verrutscht ist. Folglich sollte dieses Myofibril aus dem Datensatz ausgeschlossen werden.
Andere Anwendungen des Setups: Calciumvoraktivierung in Kardiomyozyten isoliert aus Ratte linken Ventrikel
Neben der Beurteilung der kontraktilen Funktion von Myofibrils kann das System auch zur Messung der Kardiomyozytenmechanik verwendet werden. Abbildung 11 zeigt beispielsweise die Verwendung von membranpermeabilisierten Einzelkardiomyozyten, die aus dem linken Herzkammerder der Ratte isoliert sind21. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Experimenten wurde die Entspannende Lösung verändert und die aktivierende Lösung konstant gehalten. Jede Kardiomyozyten wurde fünf Aktivierungen unterzogen, die sie einer 2-M-freien Kalziumlösung für 1 s aussetzten. Die Zeitbeschränkung von 1 s wird gewählt, um die zeitlich begrenzte Natur von Herzkontraktionen nachzuahmen, bei denen die Exposition gegenüber Lösungen mit niedriger Kalziumkonzentration die diastolische Phase imitiert und die Exposition gegenüber Lösungen mit hoher Kalziumkonzentration die systolische Phase der Kardionkontraktionskontraktion imitiert (Abbildung 11A). Für jeden der fünf Sätze war diastolisches Kalzium variiert (1, 80, 160, 250 und 400 nM Calcium), während systolisches Calcium konstant blieb(Abbildung 11A). Ein Satz bestand aus zwei Sätzen von drei Aktivierungs-Entspannungszyklen bei 1,8 m gegenüber 2,0 m und 2,0 m gegenüber 2,2 m für verschiedene Versuchsgruppen. Die Spitzenkraft wurde bei 1 s vom Schalter der Pipette gemessen und für den Satz von drei Aktivierungs-Entspannungszyklen gemittelt. Das hohe Signal-Rausch-Verhältnis und der hohe Dynamikbereich dieses Kraftwandlers ermöglichten es uns, sowohl die kleinen Veränderungen der diastolischen Kraft als auch die viel größeren systolischen Kräfte zu messen (Abbildung 11B). Die Erhöhung des diastolischen Kalziums führte zu einer höheren Kraft bei 2 M Calcium im Vergleich zur ersten Aktivierung (Abbildung 11B). WT-Ratte-Kardiomyozyten wurden mit heterozygoten (HET) RMB20-Ratten-Kardiomyozyten verglichen. Aufgrund alternativer Spleißen haben HET-Ratten ein konformeres Titinprotein im Vergleich zu den WT-Ratten. Der Effekt wurde bei HET-Kardiomyozyten bei 80 und 160 M Calcium übertrieben (Abbildung 11C).
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Disclosures
Michiel Helmes ist Gesellschafter und Miteigentümer der IONOptix Inc.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde von AFM-Telethon und A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies finanziert. Die Autoren möchten den Schöpfer der in diesem Artikel genannten Produkte, IONOptix Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
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