Summary
Denne analyse er en simpel metode til at kvantificere hæmatopoietiske celler i udviklingen af embryonale zebrafisk. Blodlegemer fra dissociated zebrafisk udsættes for flow cytometri analyse. Dette gør det muligt at opdage bloddefekter hos mutante dyr og efter genetisk modifikation.
Abstract
Mangfoldigheden af celleafstamler, der omfatter modent blod hos hvirveldyr, skyldes differentieringen af hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSC'er). Dette er en kritisk proces, der opstår i hele organismernes levetid, og forstyrrelse af de molekylære veje, der er involveret under embryogenese, kan have katastrofale langsigtede konsekvenser. Af en lang række årsager er zebrafisk (Danio rerio) blevet en modelorganisme til at studere hæmatopoiesis. Zebrafisk embryoner udvikle sig eksternt, og ved 7 dage efterfertilisering (dpf) har produceret de fleste af de undertyper af endelige blodlegemer, der vil vare ved i deres levetid. Der er udviklet assays til vurdering af antallet af hæmatopoietiske celler, hovedsagelig ved hjælp af specifikke histologiske pletter, in situ-hybridiseringsteknikker og mikroskopi af transgene dyr, der bruger blodcellespecifikke promotorer, der driver ekspressionen af fluorescerende proteiner. Men de fleste farvning assays og in situ hybridisering teknikker ikke præcist kvantificere antallet af blodlegemer til stede; Kun store forskelle i cellenumre kan let visualiseres. Brug af transgene dyr og analyse af personer med fluorescerende eller konfokal mikroskopi kan udføres, men kvantantitationen af disse assays afhænger af enten at tælle manuelt eller bruge dyre billedbehandlingssoftware, som begge kan begå fejl. Udvikling af yderligere metoder til vurdering af blodcellenumre ville være økonomisk, hurtigere og kunne endda automatiseres til hurtigt at vurdere effekten af CRISPR-medieret genetisk modifikation, morpholino-medieret transskriptionsreduktion og effekten af lægemiddelforbindelser, der påvirker hæmatopoiesis i stor skala. Denne nye analyse for at kvantificere blodlegemer udføres ved at adskille hele zebrafiskembryoner og analysere mængden af fluorescerende mærkede blodlegemer til stede. Disse assays bør give mulighed for belysning af molekylære veje, der er ansvarlige for blodcellegenerering, ekspansion og regulering under embryogenese, hvilket vil gøre det muligt for forskere yderligere at opdage nye faktorer ændret under blodsygdomme samt veje, der er afgørende under udviklingen af hvirveldyr hæmatopoiesis.
Introduction
Blodproduktion (hæmatopoiesis) er en væsentlig udviklingsproces, der først starter i det tidlige foster. Denne proces begynder med at generere primitive røde blodlegemer og makrofager direkte fra mesoderm, og senere skifter til produktion af hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSC'er). Disse stamceller, som er multipotente, genererer alle sorter af modne blodlegemer i organismen. Systemet er i stand til selvfornyelse og genopfyldes løbende gennem disse HSC'er. Mens denne proces starter tidligt i udviklingen, fortsætter hæmatopoiesis for dyrets liv, hvilket giver evnen til at transportere ilt til fjerne steder i kroppen, stoppe blødning efter skade og beskytte kroppen mod infektion. Udviklingen af dette komplekse system styres tidsmæssigt og rumligt under udvikling, og eventuelle linger i blodcelleproduktionen kan være katastrofale for organismen, hvilket resulterer i anæmi, trombocytopeni, leukæmi og leukæmi.
En populær dyremodel, der bruges til hæmatopoietisk forskning, er zebrafisken (Danio rerio), fordi de har lignende blodudvikling sammenlignet med mennesker. Faktisk bevares mange af de gener og molekylære veje, der bruges under hæmatopoiesis, gennem hvirveldyrudviklingen, så vi kan lære om menneskelige gener ved at studere zebrafisk. Det er vigtigt, zebrafisk embryoner udvikle sig uden for kroppen og inden for 7 dage har genereret mest modne blodlegemer typer, der giver mulighed for direkte visualisering af det hæmatopoietiske system i en kort tid. Zebrafisk er også ekstremt fecund, hvilket gør det muligt for forskere at observere et større antal prøver inden for en kort tidsramme, hvilket også er vigtigt for at generere reproducerbare data. Zebrafiskens korte generationstid og eksterne udvikling giver mulighed for lettere manipulation og observation under mutagenesisstudier1,2,3,4,5 og lægemiddelscreening6,7,8,9,10. Dette gør det muligt hurtigt og effektivt at teste et panel af lovende terapeutiske forbindelser til menneskelige blodsygdomme.
Det er vigtigt, at zebrafisk også er genetisk modtagelige, og genomet er sekventeret og kommenteret. Denne trækkraft gør det muligt at udføre omvendt genetikteknikker som morpholino- (MO-) medieret knockdown og CRISPR-medieret genetisk ablation. Zebrafisk har også bevist deres nytte som en model til at udføre fremad genetiske skærme; mange væsentlige gener og veje, der er involveret i hvirveldyr bloddannelse er blevet opdaget på denne måde. Talrige metoder til observation af blodlegemer er også blevet udviklet i zebrafisk. Mens traditionelle histologiske farvningsteknikker findes, er det også muligt at udføre in situ-hybridisering for blodspecifikke udskrifter. Det er vigtigt, at der også findes talrige transgene fiskelinjer, hvorved fluorescerende proteiner udtrykkes af afstamningsspecifikke initiativtagere, hvilket gør det muligt at mærke specifikke blodlegemer med fluorescerende proteiner11. Dette gør det muligt for forskere at udføre up-to-the-minute observation af blodcellegenese, ekspansion og regulering i en levende organisme over tid.
Samlet set har bevarelse af det hæmatopoietiske system, tilstedeværelsen og den nemme udvikling af transgene linjer, nem visualisering og kort generationstid gjort zebrafisken til en økonomisk, hurtig og tilpasningsbar model af hæmatopoiesis. For at forbedre værktøjskassen af teknikker til rådighed for zebrafisk forskere, udviklede vi denne analyse til robust at kvantificere antallet af blodlegemer i embryoner. Metoden indebærer fordøje transgene dyr og udfører flow cytometry for fluorescerende blodlegemer. På denne måde kan blodceller fra mutante dyr, effekten af MO og CRISPR modifikation, og effekten af små molekyler kvantitativt analyseres på en hurtig og reproducerbar måde. Disse assays er brugervenlige og økonomiske måder at opregne blodlegemer, så undersøgelse af deres generation, spredning og vedligeholdelse over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) advisory board ved California State University, Chico, godkendte alle nedenstående metoder.
BEMÆRK: Det anbefales at behandle embryoner med 1-phenyl 2-thiourea (PTU; Tabel 1) 24 timer efter udfrugtning (hpf) for at forhindre pigmentering, som påvirker fluorescensdiskriminationen negativt ved strømningscytometik. Alle nedenstående procedurer er acceptable for flowcytometry og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Men hvis ens mål er at dyrke de hæmatopoietiske celler efter FACS, skal du overholde steril praksis ved behandling af prøver. Protokollen for blegning og tilberedning af embryonprøver på steril vis er beskrevet tidligere12.
1. Dechorionation af 48 hkf zebrafisk embryoner
- Med embryoner (mindst 5, men ikke mere end 200 embryoner) i en 10 cm plast petriskål, vippes skålen, så embryonerne synker til den nederste kant.
BEMÆRK: Det er nemt at vippe skålen ved at fjerne låget og placere låget under den ene kant af petriskålen. - Der fjernes og kasseres så meget E3-medium (tabel 1) som muligt, og der tilsættes 500 μL dechorionation protease (10 mg/mL). Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- Efter 5 minutter skal du hente petriskålen (holde alle embryonerne i den nederste kant af pladen) og forsigtigt trykke på siden af petriskålen, så embryoner forsigtigt gnider mod bunden af pladen for helt at fjerne chorions.
- Med en klemmeflaske tilsættes ~ 20 mL E3 medium for at fortynde protease. Lad embryoner afregne og fjerne E3-mediet ved dekantering.
- Gentag trin 1.4 3x for at fjerne alle spor af dechorionation protease.
BEMÆRK: For at hver enkelt prøve kan analyseres, kræves der mindst 5 embryoner. Denne dechorionation procedure kan rumme op til 200 embryoner pr Petri parabol. Prøver kan grupperes på dette tidspunkt og adskilles senere, hvis det ønskes. Alternativt kan manuel dechorionation udføres ved forsigtigt at rive chorions med urmagerens pincet. Dette er fordelagtigt, når der er et lille antal embryoner. Normalt zebrafisk vil luge fra deres chorions med 72 hkf. Alvorligt misdannede embryoner kan dog ikke, og vil kræve dechorionation (enten manuel eller kemisk) efter dette tidspunkt.
2. Udarbejdelse af embryonprøver til dissociation
- Ved hjælp af en P1000 pipette placeres 5−10 embryoner i et enkelt 1,5 mL mikrocentrifugerør.
- Fjern E3 medium med en pipette og kassér.
ADVARSEL: Pipetter med forsigtighed, da embryoner let kan kasseres under de følgende trin. - Der tilsættes 1 mL 10 mM dithiothreitol (DTT) i E3-medium for at fjerne slimbelægningen omkring den embryonale zebrafisk11,12,13,14. Læg mikrocentrifugerøret vandret, og inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
3. Dissociation af embryoner
- Embryonerne vaskes 3x med 1 mL Dulbeccos fosfatbufferet saltvand (DPBS) med Ca2+ og Mg2+ for at fjerne spor af DTT. Efter den sidste vask tilsættes 500 μL DPBS med Ca2+ og Mg2+ og 5 μL på 5 mg/mL (26 U/mL) dissociation protease.
BEMÆRK: Andre isotoniske bufferopløsninger kan anvendes, men de skal indeholde Ca2+ og Mg2+, for at dissociationsenzymet kan fungere korrekt. - Der inkuberes prøver ved 37 °C på en vandret orbital shaker ved 185 omdrejninger i 60 min. Trituratfostre med en P1000 pipette, indtil prøverne er helt adskilt.
ADVARSEL: Pas på ikke at overfordøje embryonerne; noget fast væv bør være til stede, og det bør ikke være helt homogent. Det er muligt at overfordøje, hvilket vil ødelægge de målblodceller, der skal observeres på flowcytometeret (Supplerende figur 1).
BEMÆRK: Denne procedure fungerer bedst for 48−72 hkf embryoner. Senere stadier kan kræve længere inkubation med dissociation protease. Tidspunktet for de forskellige etaper skal bestemmes empirisk. Der er hurtigere alternative metoder til at adskille embryonalt væv, men det findes empirisk, at denne metode, selv om det tager 60 min, er blid og grundig nok til at muliggøre effektiv isolering af levende hæmatopoietiske celler.
4. Forberedelse af dissociated embryoner til flow cytometri
- Pipetter de 5 dissociated embryoner på toppen reservoir af en 5 mL polystyren runde bundrør med en 35 μmM celle si cap.
- Celler skylles ved at tilsætte 4 mL fosfatbufferet saltvand (PBS) uden Ca2+ eller Mg2+ til sihætten på det 5 mL polystyrenrør, der indeholder de filtrerede celler.
BEMÆRK: Andre isotoniske bufferopløsninger kan også anvendes, men de bør mangle Ca2+ eller Mg2+ til at fortynde og gøre dissociationsenzymet ineffektivt. - Centrifugerør ved 4 °C og 300 x g i 5 minutter for at pellet cellerne. Med en pipette fjernes og kasseres supernatant. Resuspend cellerne i 500 μL PBS (uden Ca2+ eller Mg2+).
5. Flow cytometry
- Forsigtigt vortex cellen suspension og tilsæt 1:1.000 røde døde celle pletten (Tabel over materialer).
BEMÆRK: Den røde døde celle plet er en celle-gennemtrængelig farvestof, der tillader udelukkelse af døde celler og snavs fra målceller og er et glimrende valg af farvestof til døde celler diskrimination, fordi det er begejstret for 633 nm laser, som er forskellig fra 488 nm laser bruges til at formane fælles fluorophores såsom grøn fluorescerende protein (GFP) og DSRed. På denne måde er der ingen spektral overlapning fra døde celler og transgene blodlegemer. Propidiumjodid (PI) ved 1 mg/mL er et billigt alternativ til pletten af røde døde celler, men sørg for at reservere nogle prøver, der kun er farvet med PI, samt kun prøver med fluorophore af interesse for at indstille instrumentkompensationen. Ellers vil signalerne fra PI og fluorophorer som GFP overlappe, hvilket resulterer i falsk-positive resultater. Hvis flowcytometeret også har en 405 nm laser, er andre farvestoffer som blå far celleplet også et fremragende valg.
ADVARSEL: Når du analyserer blodlegemer, skal du være opmærksom på, at visse celletyper efter 30 minutter vil begynde at phagocytose den røde døde celleplet. Hold celler beskyttet mod lys og på is, indtil analyse og udføre flow cytometry inden for 30 minutter for at tilføje farvestoffet. - Analyse af flowcytometri
BEMÆRK: Hvert flowcytometer er lidt anderledes, men følgende trin hjælper med at forberede prøver til analyse på de fleste maskiner. For brugere nye til at flyde cytometry, søge råd hos en person, der er ekspert på det pågældende stykke udstyr. Følgende instruktioner vedrører BD FACSAria Fusion flow cytometer.- Tænd for cytometeret og lad lasere varme op i 20 minutter. Tom affaldstank, fyld kappetanken med passende opløsning (varierer baseret på flowcytometer) og start fluidics-systemet.
BEMÆRK: Der er normalt en særlig opstartsprocedure for hver type flowcytometer; følge denne opstartsprocedure nøje. - I analysesoftwaren tegnes fem observationsområder (Figur 1A).
- Få det første punktdiagram for punkt (FSC) på x-aksen og sidespredningen (SSC) på y-aksen. Angiv FSC som lineær og SSC som log.
BEMÆRK: FSC er en måling af cellestørrelse, og SSC er en måling af granularitet; dette vil gøre det muligt at forskelsbehandling af celler fra affald. Embryonale zebrafiskblodcellepopulationer adskilles ikke efter størrelse og granularitet på samme måde som voksne zebrafiskblodceller beskrevet tidligere15. I stedet vises de i samme population med alle de andre fordøjede embryonale celler. - Indstil den anden afbildning til at undersøge FSC-højde (H) versus FSC-bredde (W). Indstil det tredje plot til måling af SSC (H) versus SSC (W).
BEMÆRK: Dette trin bruges til at udelukke doublets (celler, der sidder fast sammen, når de passerer gennem laseren). - Indstil den fjerde punkt-plot til at måle den røde døde celleplet på x-aksen (afhængigt af cytometeret svarer dette normalt til det filter, der bruges til allophycocyanin [APC]) og SSC på y-aksen. Dette vil gøre det muligt at forskelsbehandling af levende celler fra døde celler.
BEMÆRK: Filtreringssættene for hvert cytometer kan være forskellige. Sørg for at bruge det korrekte detektionsfilter til farvestof til forskelsbehandling af døde celler. - Det femte område måler den foretrukne fluorophore. Visualiser dette som et histogram af fluorrøret (figur 1) eller brug et prikområde (supplerende figur 2).
BEMÆRK: Ved undersøgelse af mere end én fluorophore i samme dyr anbefales det at bruge et prikområde til at se begge parametre på samme tid. Hvis der er nogen chance for, at fluorophorerne har spektral overlapning med hinanden (Supplerende figur 2), anbefales også et prikområde. Brug områdeindstillingerne (A) til at beregne området under kurven, der genereres af cytometerets laserpuls for alle parametre, fordi de er mere nøjagtige.
- Få det første punktdiagram for punkt (FSC) på x-aksen og sidespredningen (SSC) på y-aksen. Angiv FSC som lineær og SSC som log.
- Indlæs prøven, og reducer strømningshastigheden, så prøven ikke løber hurtigt ud. Juster FSC- og SSC-indstillingerne, så hovedparten af cellepopulationen kan ses tydeligt (Figur 1A).
- Tegn en port rundt om cellepopulationen, og mærk den celler. Sørg for, at den anden prik plot er gated på celler, udelukke doublets ved først at gating på FSC og derefter på SSC singlets.
- På det fjerde plot justere den røde døde celle pletten indstillinger, så der er klart en negativ befolkning. Tegn en port omkring disse celler, og mærke dem levende celler. På det femte plot, gate på levende celler og undersøge fluorophore negative og positive celler. Tegn en port rundt om de positive celler.
BEMÆRK: Denne hierarkiske gating strategi undersøger enkelt fluorophore+ celler, der findes i de levende celler gate, som også er bosat i cellen porten. Pas på at indstille portene ordentligt. Disse porte kan tilpasses afhængigt af eksperimentet. - Kør hver prøve, indsamle mindst 25.000 live celle begivenheder.
- Følg nedlukningsproceduren for at slukke for fluidik. Genopfyld kappetanken, og tøm affaldstanken.
BEMÆRK: Det er ofte svært at visualisere fluorophore+ celler, når proteinudtrykket er lavt, eller cellepopulationen er sjælden. For at sikre, at parametrene er indstillet korrekt, bør fluorophore- søskendefostre fremstilles sammen med for at tegne porte korrekt og justere laserspændinger (supplerende figur 2). Hvis målcellepopulationen er sjælden, skal du indsamle mere end 25.000 hændelser. Med 5−10 fordøjede dyr skal man kunne indsamle millioner af hændelser. Det samlede antal fluorophore+ celler kan også opnås med disse data. Du skal blot tælle det samlede antal celler i prøven med et hæmocytometer og gange procentdelen af fluorophore+ celler for at opnå det absolutte antal fluorophore+ celler pr. fisk.
- Tænd for cytometeret og lad lasere varme op i 20 minutter. Tom affaldstank, fyld kappetanken med passende opløsning (varierer baseret på flowcytometer) og start fluidics-systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at opregne røde blodlegemer i embryonale zebrafisk blev derinjiceret16 embryoner i encellet fase med PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO eller 7,0 ng/nL ism1 MO med 7,0 ng ism1 mRNA12. Ved 48 hkf blev de fordøjet og udsat for flowcytometrianalyse. Efter at have analyseret procentdelen af GFP+ røde blodlegemer fra hver prøve (hver prøve er 5 tilfældigt udvalgte embryoner; Figur 1A) blev gennemsnittet af hele kontrolgruppen beregnet. Dette gennemsnit blev angivet til 1, og alle procenter blev beregnet ud fra dette referencepunkt. Disse data tyder på, at reducere ism1 udskrift med en bestemt MO reduceret antallet af GFP+ røde blodlegemer til stede i 48 hkf embryo. Derudover, redde denne reduktion i ism1 niveauer med udefrakommende mRNA returneres antallet af røde blodlegemer til normal.
Figur 1: Ism1 MO reducerer antallet af røde blodlegemer, der produceres under embryogenese. For det første blev størrelse og granularitet bestemt, og en port blev trukket rundt om cellepopulationen af interesse(celler, venstre panel). Derefter blev FSC H og FSC W evalueret for at eliminere celler, der sad fast sammen (singler FSC). SSC H og W blev også evalueret for at reducere muligheden for at evaluere celler, der sidder fast sammen (singler SSC). Rød fluorescens blev derefter undersøgt for at bestemme levende celler (levende celler). Endelig blev levende celler undersøgt for GFP fluorescens (højre panel). (B) LCR: GFP12 embryoner blev injiceret med PBS (kontrol, cirkler), ism1 MO(ism1 MO, firkanter), eller ism1 MO + ism1 mRNA12 (redning, trekanter) på en-celle-fase af udviklingen. Efter 48 timer blev de indsamlet, fordøjet og udsat for flowcytometri som vist i panel A. Hvert punkt repræsenterer fem tilfældigt udvalgte individuelle embryoner. Foldningsændringen beregnes ved at tage den gennemsnitlige procentdel af GFP+ celler i kontroleksemplet og angive det som 1. Alle andre prøver sammenlignes med dette gennemsnit. *p < 0,005, og N.S. = ikke signifikant. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning | Ingredienser | Noter |
| E3-medium (50x) | 14,61 g NaCl, 0,63 g KCI, 1,99 g MgSO4,7H2O, 1,83 g CaCl2,2H2O | Til en 2 L gradueret cylinder tilsættes ingredienserne og nok destilleret vand til at bringe det samlede volumen til 1 L. |
| E3-medium (1x) | 40 mL af 50x E3 | Til en 2 L gradueret cylinder tilsættes nok destilleret vand til at bringe det samlede volumen til 2 L. |
| 1-Phenyl-2-thiourea (PTU) i E3 medium | 40 mL 50x E3 i en 2 L flaske, 40 mg PTU | Til en 2 L gradueret cylinder tilsættes nok destilleret vand til at bringe det samlede volumen til 2 L. Rør i mindst 2 dage for helt at opløse PTU. |
Tabel 1: Opskrifter på løsninger.
Supplerende figur 1:Fordøjelse af embryoner med dissociationsprotease. Billeder af 10 embryoner ikke korrekt fordøjet (venstre; ufordøjet), efter tilstrækkelig fordøjelse (midten, fordøjet), og efter overskydende fordøjelse (højre; overdigested). Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2:Vurdering af to fluorophorer i 5 dpf embryoner. Gates blev tegnet for at evaluereFSC og SSC for at bestemme cellepopulationen af interesse (celler, venstre kolonne), for at evaluere singlets (ikke vist), for at bestemme levende celler (live, midterste kolonne) og fluorophore udtryk (mpx: GFP17 og gata1:D sRed15). For det første blev porte sat på et dyr, der ikke har fluorophorer (øverste række). Derefter blev mpx:GFP+ (uden gata1:D sRed) dyr evalueret for at indstille portene og kompensation for GFP (anden række). gata1:D sRed+ (uden mpx:GFP) dyr blev evalueret for at indstille portene og kompensation for DSRed (tredje række). Endelig kan de to farver evalueres i dobbelt positive dyr, der er mpx: GFP+ og gata1:D sRed+. Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk er et fremragende modelsystem til at studere primitiv og endelig hvirveldyr hæmatopoiesis. I løbet af de sidste par årtier er flere analyser blevet udviklet og raffineret, hvilket gør det muligt for zebrafisk at blive en hurtig og økonomisk model til test af lægemidler, generere og teste genetiske mutanter og generelt give forskere mulighed for at analysere molekylære veje, der er afgørende for hæmatopoiesis. Denne protokol anvender embryonale zebrafisk, som giver mulighed for hurtig dataindsamling, brug af mindre fysisk plads end voksne dyr og brug af mindre medicin til store kemiske skærme. Det giver også mulighed for kvantantitation efter overekspression af mRNA, generering af CRISPR-mutanter og MO-induceret transskriptionsreduktion for at ændre specifikke genetiske veje, der opstår under tidlig embryonal udvikling. Det er vigtigt, at det giver mulighed for følsom, robust kvantantitation af blodlegemer, hvilket er svært at gøre med in situ-hybridisering eller histologiske farvningsteknikker.
Denne analyse er fleksibel og kan ændres for at besvare mange forskningsspørgsmål. En ændring af denne protokol kan udføres, hvorved dyrets udviklingsstadium manipuleres for at kvantificere forskellige blodcelletyper. For eksempel opstår røde blodlegemer tidligt i zebrafisk udvikling, og med transgene dyr som lcr: GFP16 transgene linje kan påvises så tidligt som 16-somite fase. Hvis man er interesseret i at studere trombocytter, begynder itga2b:GFP18 (også kendt som cd41:GFP) transgen linje imidlertid at udtrykke GFP ved 48 hkf, med modne cirkulerende thrombocytter observeret ved 72 hkf. Hvis man ønsker at kvantificere B-celler med denne analyse, så kan det udføres med ighm:EGFP19 transgene dyr tættere på 20 dpf. Vigtigere, denne analyse kan også bruges til at følge blodlegemer over tid. For eksempel ved at analysere antallet af lcr: GFP+ celler ved 24 hpf, 48 hpf, 72 hpf, kunne man afgøre, om en genetisk modifikation (eller lægemiddel) regulerer vedligeholdelsen af røde blodlegemer versus bare deres generation.
Disse assays gør det muligt for forskere at reducere genekspression med CRISPR eller MOs eller overekspresse genekspression ved at injicere mRNA på encellestadiet af udviklingen og nøjagtigt sammenligne antallet af blodlegemer, der produceres i disse modificerede embryoner. Det bør altid sikres, at der foretages passende kontrol af disse forsøg på samme tid ved at injicere søskendedyr med ikke-specifikke vejledende RNA'er eller uoverensstemmende MO'er og undersøge deres blod sammen med forsøgsgrupperne. Udviklingsstadiet er kritisk. ændringer på kun et par timer under udviklingen kunne vise meget forskellige antal blodlegemer til stede i et foster. Med andre ord skal du sørge for omhyggeligt at overvåge udviklingstimerne, når du sammenligner embryoner. For at sikre, at embryoner er aldersmatchede, bør morfologiske signaler anvendes. I tidlige embryoner, overveje at tælle somites til alder-match. Senere i udviklingen kan andre markører som begyndelsen af hjertet slå, størrelsen af otic vesikel, eller længden af kroppen bruges til at matche stadier af modificerede fisk til at kontrollere fisk. Desuden kan antallet af samlede celler opregnes fra fordøjede embryoner for at sikre, at det samme antal celler er til stede i forsøgs- og kontroldyr. Ud over at bruge disse assays til at undersøge genetisk modifikation, disse assays kan også ændres til at udføre store stof skærme. Embryoner kan udsættes for forskellige koncentrationer af forbindelser tidsmæssigt under udviklingen for at se, om de pågældende kemikalier har nogen effekt på hæmatopoiesis. Hvis forsøget har til formål at teste virkningen af et bestemt lægemiddel, bør dyr, der kun behandles med køretøjet, også medtages som kontrol. På disse måder kan forskere afgøre, om gevinst- eller tab af funktion af specifikke gener eller signalveje spiller en væsentlig rolle i hæmatopoiesis.
Det er vigtigt, at antallet af dyr, der fordøjes pr. prøve, optimeres ved undersøgelsen af forskellige transgener; for få dyr kan generere ringe eller ingen fluorescens. Dette gælder især ved undersøgelse af HSC'er, som ikke er rigelige på et bestemt tidspunkt. Det er også kritisk, når man undersøger transgenik, der har svage initiativtagere, der driver fluorescens. For at modvirke disse problemer kræves der flere dyr (og dermed flere celler) til nøjagtige optællinger. Ved ændring af udviklingsstadier er det også vigtigt at optimere fordøjelsestiden. Denne protokol er optimeret til 5 individuelle 48 hkf embryoner per rør. Fordøje mere modne embryoner vil sandsynligvis kræve længere tid.
Nogle potentielle problemer kan opstå under proceduren. Hvis der ikke observeres fluorescens, kan der være et teknisk problem med det cytometer, der skal løses. Af denne grund er det vigtigt at kontrollere, at embryonerne er fluorescerende, før du begynder proceduren ved hurtigt at kontrollere dem under et mikroskop. Et andet almindeligt problem er over-fordøje embryoner, som ødelægger cellerne. Pas på fordøjelsestrinnet og ændre timingen, hvis der observeres for mange døde celler.
Disse assays har et par begrænsninger. Det største problem er, at disse assays er afhængige af udtrykket af en transgen markør. Potentielt kan ændringen af den transgene markørs udtryk ikke afspejle biologien af, hvad der forekommer i embryoet. Derudover er flowcytometri muligvis ikke den bedste metode til at kvantificere celler, hvis målcellepopulationen er ekstremt lav. For at håndtere disse muligheder kunne andre assays som in situ eller histologiske farvningsteknikker udnyttes. Hvis der findes specifikke antistoffer for celletypen af interesse, kan immunhistokemi også udføres. Embryoner kan også udsættes for qRT-PCR til måling af afstamningsspecifikke gener, og hvis disse assays udføres på en FACS-maskine, kan cellerne isoleres og studeres individuelt med endnu mere følsomme metoder. Bortset fra disse spørgsmål, kan denne kvantitative flow cytometry assay generere en masse nyttige oplysninger for forskere.
Med disse assays kan forskere nemt observere hæmatopoietiske defekter hos hvirveldyr. Ændring af genetiske veje med MOs eller CRISPR og derefter udføre flow cytometry at belyse, hvis genet spiller en rolle i hæmatopoiesis kan gøres hurtigt og er kvantitativ. Derudover kan fremad genetiske skærme (så længe dyrene har en fluorescerende tag) udføres og fejl vurderes. Zebrafisk er også blevet en fremragende model for store lægemiddelskærme6,7,8,9,10, så effektive lægemiddelscreeningsanalyser på levende organismer kan observere, om stofferne er effektive, og om de har negative virkninger på udvikling / overlevelse. Kobling denne analyse med automatiseret flow cytometry teknologi forstærket af robotteknologi ville gøre det endnu mere effektivt20,21,22, så virkelig storstilet analyse og screening af veje vigtige i blodlegemer tilblivelse, vækst og regulering, der forbliver obskure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.S. er videnskabelig konsulent og har modtaget kompensation fra Finless Foods, Inc. og Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Finansieringen blev ydet af National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 til D.L.S.), National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 til D.L.S.), og fra Honor's Program på California State University Chico (til K.F.R.). Forfatterne takker Betsey Tamietti for laboratorieledelse og Kathy Johns for administrativ bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al.
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D.
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
