Summary
Este ensaio é um método simples para quantificar células hematopoiéticas no desenvolvimento de zebrafish embrionário. As células sanguíneas de zebrafish dissociados são submetidas à análise de citometria de fluxo. Isso permite a detecção de defeitos sanguíneos em animais mutantes e após modificação genética.
Abstract
A diversidade de linhagens celulares que compõem sangue maduro em animais vertebrados decorre da diferenciação de células hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs). Este é um processo crítico que ocorre ao longo da vida útil dos organismos, e a interrupção das vias moleculares envolvidas durante a embriogênese pode ter consequências catastróficas a longo prazo. Por uma infinidade de razões, o zebrafish (Danio rerio) tornou-se um organismo modelo para estudar hematopoiese. Os embriões de zebrafish desenvolvem-se externamente, e em 7 dias a pós-fertilização (dpf) produziram a maioria dos subtipos de células sanguíneas definitivas que persistirão por toda a vida. Foram desenvolvidos ensaios para avaliar o número de células hematopoiéticas, utilizando principalmente manchas histológicas específicas, técnicas de hibridização in situ e microscopia de animais transgênicos que utilizam promotores específicos de células sanguíneas que conduzem a expressão de proteínas fluorescentes. No entanto, a maioria dos ensaios de coloração e técnicas de hibridização in situ não quantificam com precisão o número de células sanguíneas presentes; apenas grandes diferenças nos números de células são facilmente visualizadas. A utilização de animais transgênicos e a análise de indivíduos com microscopia fluorescente ou confocal podem ser realizadas, mas a quantitação desses ensaios depende da contagem manual ou do uso de softwares de imagem caros, ambos podem cometer erros. O desenvolvimento de métodos adicionais para avaliar o número de células sanguíneas seria econômico, mais rápido, e poderia até mesmo ser automatizado para avaliar rapidamente o efeito da modificação genética mediada pelo CRISPR, a redução da transcrição mediada por morfolino e o efeito de compostos medicamentosos que afetam a hematopoiese em larga escala. Este novo ensaio para quantificar as células sanguíneas é realizado pela dissociação de embriões inteiros de zebrafish e pela análise da quantidade de células sanguíneas fluorescentes rotuladas presentes. Esses ensaios devem permitir a elucidação de vias moleculares responsáveis pela geração, expansão e regulação das células sanguíneas durante a embriogênese, o que permitirá aos pesquisadores descobrir ainda mais novos fatores alterados durante doenças sanguíneas, bem como caminhos essenciais durante a evolução da hematopeiese vertebrada.
Introduction
A produção de sangue (hematopoiese) é um processo de desenvolvimento essencial que começa primeiro no embrião inicial. Esse processo começa gerando glóbulos vermelhos primitivos e macrófagos diretamente do mesoderme, e posteriormente muda para a produção de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs). Essas células-tronco, que são multipotentes, geram todas as variedades de células sanguíneas maduras no organismo. Capaz de auto-renovação, o sistema é continuamente reabastecido através desses HSPCs. Enquanto esse processo começa no início do desenvolvimento, a hematopoiese continua para a vida do animal, fornecendo a capacidade de transportar oxigênio para locais distantes do corpo, parar de sangrar após lesões e proteger o corpo de infecções. O desenvolvimento deste complexo sistema é controlado temporal e espacialmente durante o desenvolvimento e qualquer perturbação na produção de células sanguíneas pode ser catastrófica para o organismo, resultando em anemia, trombocitopenia, leucopenia e leucemia.
Um modelo animal popular usado para pesquisa hematopoiética é o zebrafish (Danio rerio) porque eles têm desenvolvimento sanguíneo semelhante quando comparados aos humanos. Na verdade, muitos dos genes e vias moleculares usados durante a hematopoiese são conservados ao longo da evolução dos vertebrados, permitindo-nos aprender sobre genes humanos estudando zebrafish. É importante ressaltar que os embriões de zebrafish se desenvolvem fora do corpo e em 7 dias geraram a maioria dos tipos de células sanguíneas maduras, permitindo a visualização direta do sistema hematopoiético em um curto espaço de tempo. Os zebrafish também são extremamente fecundos, o que permite aos pesquisadores observar um número maior de amostras em um curto espaço de tempo, o que também é importante para a geração de dados reprodutíveis. O tempo de curta geração e o desenvolvimento externo do zebrafish proporcionam uma manipulação e observação mais fáceis durante os estudos de mutagênese1,2,3,4,5 e triagem de medicamentos6,7,8,9,10. Isso permite que um painel de compostos terapêuticos promissores para distúrbios sanguíneos humanos seja testado de forma rápida e eficiente.
É importante ressaltar que os zebrafish também são geneticamente favoráveis, e o genoma é sequenciado e anotado. Essa tratobilidade permite que técnicas de genética reversa, como o knockdown mediado por morpholino e ablação genética mediada pelo CRISPR sejam realizadas. Os zebrafish também provaram sua utilidade como modelo para realizar telas genéticas avançadas; muitos genes e caminhos essenciais envolvidos na formação de sangue de vertebrados foram descobertos desta maneira. Numerosos métodos de observação de células sanguíneas também foram desenvolvidos em zebrafish. Embora existam técnicas tradicionais de coloração histológica, também é possível realizar hibridização in situ para transcrições específicas do sangue. É importante ressaltar que existem numerosas linhas transgênicas de peixes pelas quais as proteínas fluorescentes são expressas por promotores específicos da linhagem, permitindo a rotulagem de células sanguíneas específicas com proteínas fluorescentes11. Isso permite que os pesquisadores realizem observação a ponto da gênese das células sanguíneas, expansão e regulação em um organismo vivo ao longo do tempo.
No geral, a conservação do sistema hematopoiético, a presença e o fácil desenvolvimento de linhas transgênicas, fácil visualização e tempo de geração curta tornaram o zebrafish um modelo econômico, rápido e adaptável de hematopoiese. Para melhorar a caixa de ferramentas de técnicas disponíveis para pesquisadores de zebrafish, desenvolvemos este ensaio para quantificar robustamente o número de células sanguíneas em embriões. O método envolve a digestão de animais transgênicos e a realização de citometria de fluxo para células sanguíneas fluorescentes. Desta forma, as células sanguíneas de animais mutantes, o efeito da modificação mo e crispr, e o efeito de pequenas moléculas podem ser analisados quantitativamente de forma rápida e reprodutível. Esses ensaios são formas fáceis de usar e econômicas para enumerar as células sanguíneas, permitindo o exame de sua geração, proliferação e manutenção ao longo do tempo.
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Protocol
O conselho consultivo do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual da Califórnia, Chico, aprovou todos os métodos descritos abaixo.
NOTA: É aconselhável tratar embriões com 1-fenil 2-thiourea (PTU; Tabela 1) em 24 horas de pós-fertilização (hpf) para evitar pigmentação que afeta negativamente a discriminação por fluorescência por citometria de fluxo. Todos os procedimentos listados abaixo são aceitáveis para citometria de fluxo e classificação celular ativada por fluorescência (FACS). No entanto, se o objetivo é cultivar as células hematopoiéticas após o FACS, então adere às práticas estéreis ao processar amostras. O protocolo para branquear e preparar amostras de embriões de forma estéril foi descrito anteriormente12.
1. Descorionação de embriões de zebrafish de 48 hpf
- Com embriões (pelo menos 5, mas não mais do que 200 embriões) em uma placa de Petri de plástico de 10 cm, incline a placa para que os embriões afundem até a borda inferior.
NOTA: É fácil inclinar a placa removendo sua tampa e colocando a tampa sob uma borda da placa de Petri. - Retire e descarte o máximo possível de meio E3(Tabela 1) e adicione 500 μL de protease de descorionação (10 mg/mL). Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos.
- Depois de 5 minutos, pegue a placa de Petri (mantendo todos os embriões na borda inferior da placa), e bata suavemente na lateral da placa de Petri, permitindo que os embriões esfreguem suavemente contra a parte inferior da placa para remover completamente os acordes.
- Com uma garrafa de aperto, adicione ~20 mL de meio E3 para diluir a protease. Permita que os embriões se instalem e removam o meio E3 decantando.
- Repita o passo 1.4 3x para remover todos os traços da protease de descorionação.
NOTA: Para cada amostra individual analisar, são necessários pelo menos 5 embriões. Este procedimento de descorção pode acomodar até 200 embriões por placa de Petri. As amostras podem ser agrupadas nesta fase e separadas mais tarde, se desejarem. Alternativamente, a descorção manual pode ser realizada rasgando suavemente os acordes com fórceps do relojoeiro. Isso é vantajoso quando há um pequeno número de embriões. Normalmente, o zebrafish vai eclodir de seus acordes por 72 hpf. Embriões severamente malformados podem, no entanto, e exigirão descorção (manual ou químico) após esse tempo.
2. Preparação de amostras de embriões para dissociação
- Usando uma pipeta P1000, coloque 5-10 embriões em um único tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
- Remova o meio E3 com uma pipeta e descarte.
ATENÇÃO: Pipeta com cuidado, pois os embriões podem ser facilmente descartados durante as seguintes etapas. - Adicione 1 mL de dithiothiothreitol de 10 mM (DTT) no meio E3 para remover o revestimento do muco em torno do zebrafish embrionário11,12,13,14. Coloque o tubo de microcentrifuge horizontalmente e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.
3. Dissociação do embrião
- Lave os embriões 3x com 1 mL de salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) com Ca2+ e Mg2+ para remover traços de DTT. Após a última lavagem adicione 500 μL de DPBS com Ca2+ e Mg2+ e 5 μL de 5 mg/mL (26 U/mL) protease de dissociação.
NOTA: Outras soluções tamponadas isotônicas podem ser usadas, mas devem conter Ca2+ e Mg2+ para que a enzima dissociação funcione corretamente. - Incubar amostras a 37 °C em um agitador orbital horizontal a 185 rpm por 60 min. Embriões triturados com uma pipeta P1000 até que as amostras sejam totalmente dissociadas.
ATENÇÃO: Tome cuidado para não exagerar nos embriões; algum tecido sólido deve estar presente, e não deve ser completamente homogêneo. É possível exagerar, o que destruirá as células sanguíneas alvo a serem observadas no citômetro de fluxo(Figura Suplementar 1).
NOTA: Este procedimento funciona melhor para embriões de 48-72 hpf. Estágios posteriores podem exigir maior incubação com protease de dissociação. O tempo para diferentes estágios deve ser determinado empiricamente. Existem métodos alternativos mais rápidos para dissociar tecido embrionário, mas é encontrado empiricamente que este método, embora leve 60 minutos, é suave e minucioso o suficiente para permitir o isolamento eficiente das células hematopoiéticas vivas.
4. Preparação de embriões dissociados para citometria de fluxo
- Pipeta os 5 embriões dissociados no reservatório superior de um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL com uma tampa de coador celular de 35 μmM.
- Enxágüe as células adicionando 4 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) sem Ca2+ ou Mg2+ à tampa do filtro do tubo de poliestireno de 5 mL contendo as células filtradas.
NOTA: Outras soluções tamponadas isotônicas também podem ser usadas, mas elas devem não ter Ca2+ ou Mg2+ para diluir e tornar a enzima dissociação ineficaz. - Tubos centrífugas a 4 °C e 300 x g por 5 min para pelotar as células. Com uma pipeta, remova e descarte o supernaspeso. Resuspense as células em 500 μL de PBS (sem Ca2+ ou Mg2+).
5. Citometria de fluxo
- Vórtice suavemente da suspensão celular e adicione 1:1.000 mancha de célula morta vermelha(Tabela de Materiais).
NOTA: A mancha de célula morta vermelha é um corante permeável celular que permite a exclusão de células mortas e detritos de células-alvo e é uma excelente escolha de corante para discriminação de células mortas, pois é animado pelo laser de 633 nm, que é diferente do laser de 488 nm usado para excitar fluoroforos comuns como proteína fluorescente verde (GFP) e DsRed. Desta forma, não há sobreposição espectral de células mortas e células sanguíneas transgênicas. O iodeto de propidium (PI) a 1 mg/mL é uma alternativa barata à mancha de célula morta vermelha, mas certifique-se de reservar algumas amostras manchadas apenas com PI, bem como amostras apenas com o fluorohore de interesse para definir a compensação do instrumento. Caso contrário, os sinais de PI e fluoroforos como o GFP se sobreporão, resultando em resultados falso-positivos. Se o citómetro de fluxo também tem um laser de 405 nm, outros corantes como a mancha de célula azul pai também são uma excelente escolha.
ATENÇÃO: Ao analisar os glóbulos, observe que após 30 min certos tipos de células começarão a fagocitar a mancha de células mortas vermelhas. Mantenha as células protegidas da luz e do gelo até a análise e realize a citometria de fluxo dentro de 30 minutos da adição do corante. - Análise de citometria de fluxo
NOTA: Cada citómetro de fluxo é um pouco diferente, mas as etapas seguintes ajudarão na preparação de amostras para análise na maioria das máquinas. Para usuários novos para fluir citometria, procure o conselho de alguém que seja um especialista no equipamento específico. As seguintes instruções dizem respeito ao citômetro de fluxo BD FACSAria Fusion.- Ligue o cítômetro e deixe os lasers aquecerem por 20 minutos. Tanque de resíduos vazio, encha tanque de baia com solução apropriada (varia de acordo com o citômetro de fluxo) e inicie o sistema fluido.
NOTA: Geralmente há um procedimento de inicialização específico para cada tipo de citómetro de fluxo; siga esse procedimento de inicialização cuidadosamente. - No software de análise, desenhe cinco parcelas(Figura 1A).
- Tenha a primeira medida de gráfico de ponto para frente dispersão (FSC) no eixo x e dispersão lateral (SSC) no eixo y. Defina o FSC como linear e SSC como log.
NOTA: FSC é uma medição do tamanho da célula, e SSC é uma medida de granularidade; isso permitirá a discriminação de células de detritos. As populações de células sanguíneas de zebrafish embrionários não se separam por tamanho e granularidade da mesma forma que as células sanguíneas de zebrafish adultos descritas anteriormente15. Em vez disso, eles aparecerão na mesma população com todas as outras células embrionárias digeridas. - Defina o segundo plot para examinar a altura do FSC (H) versus a largura FSC (W). Defina o terceiro plot para medir SSC (H) versus SSC (W).
NOTA: Esta etapa é usada para excluir doublets (células que ficam presas juntas quando passam pelo laser). - Defina o quarto gráfico de pontos para medir a mancha de célula morta vermelha no eixo x (dependendo do cítmetro, isso geralmente é equivalente ao filtro usado para alofilia [APC]) e SSC no eixo y. Isso permitirá a discriminação de células vivas de células mortas.
NOTA: Os conjuntos de filtros de cada címetro podem ser diferentes. Certifique-se de usar o filtro de detecção correto para o corante de discriminação celular morto. - O quinto lote mede o fluoróforo de escolha. Visualize isso como um histograma do fluorohore(Figura 1) ou use um gráfico de pontos(Figura Suplementar 2).
NOTA: Ao examinar mais de um fluoróforo no mesmo animal, recomenda-se usar um gráfico de pontos para visualizar ambos os parâmetros ao mesmo tempo. Se houver alguma chance de que os fluoroforos tenham sobreposição espectral entre si(Figura Suplementar 2),um gráfico de pontos também é recomendado. Use as configurações da Área (A) para calcular a área sob a curva gerada pelo pulso laser do citômetro para todos os parâmetros, pois são mais precisas.
- Tenha a primeira medida de gráfico de ponto para frente dispersão (FSC) no eixo x e dispersão lateral (SSC) no eixo y. Defina o FSC como linear e SSC como log.
- Carregue a amostra e reduza a taxa de fluxo para que a amostra não se escora rapidamente. Ajuste as configurações FSC e SSC para que a maior parte da população celular possa ser claramente vista(Figura 1A).
- Desenhe um portão em torno da população celular e rotule-o de células. Certificando-se de que o segundo lote de pontos esteja fechado em células, exclua os doublets primeiro gating no FSC e, em seguida, nos singlets SSC.
- No quarto lote ajuste as configurações da mancha de células mortas vermelhas para que haja claramente uma população negativa. Desenhe um portão ao redor dessas células, e rotule-as de células vivas. No quinto enredo, portão em células vivas e examinar células fluoróforas negativas e positivas. Desenhe um portão ao redor das células positivas.
NOTA: Esta estratégia hierárquica de gating examina fluorforas+ células que residem no portão de células vivas, que também residem no portão da cela. Tome cuidado para definir os portões corretamente. Esses portões podem ser personalizados dependendo do experimento. - Execute cada amostra, coletando pelo menos 25.000 eventos de células vivas.
- Siga o procedimento de desligamento para desligar os fluidos. Reabastecer o tanque de baia e esvaziar o tanque de lixo.
NOTA: Muitas vezes é difícil visualizar células fluoróforas+ quando a expressão proteica é baixa, ou a população celular é rara. Para garantir que os parâmetros sejam ajustados corretamente, os embriões fluorforeiros- irmãos devem ser preparados juntamente para desenhar adequadamente os portões e ajustar as tensões a laser(Figura Suplementar 2). Se a população de células-alvo for rara, colecione mais de 25.000 eventos. Com 5-10 animais digeridos, deve-se ser capaz de coletar milhões de eventos. O número total de células fluoróforas+ também pode ser obtido com esses dados. Basta contar o número total de células na amostra com um hemótmetro e multiplicar a porcentagem de células fluoroforas+ para obter o número absoluto de fluorforoto+ células por peixe.
- Ligue o cítômetro e deixe os lasers aquecerem por 20 minutos. Tanque de resíduos vazio, encha tanque de baia com solução apropriada (varia de acordo com o citômetro de fluxo) e inicie o sistema fluido.
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Representative Results
Para enumerar glóbulos vermelhos em zebrafish embrionários, foraminjetados 16 embriões de16 ng no estágio de uma célula com PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO, ou 7,0 ng/nL ism1 MO com 7,0 ng ism1 mRNA12. Com 48 cvf foram digeridos e submetidos à análise de citometria de fluxo. Após analisar a porcentagem de GFP+ glóbulos vermelhos de cada amostra (cada amostra é de 5 embriões selecionados aleatoriamente; Figura 1A), a média de todo o grupo controle foi calculada. Essa média foi definida como 1, e todos os percentuais foram calculados a partir desse ponto de referência. Esses dados indicam que a redução da transcrição ism1 com um MO específico reduziu o número de GFP+ glóbulos vermelhos presentes no embrião de 48 hpf. Além disso, o resgate dessa redução nos níveis de ism1 com mRNA exógeno devolveu o número de glóbulos vermelhos ao normal.
Figura 1: ism1 MO reduz o número de glóbulos vermelhos produzidos durante a embriogênese. (A) lcr:GFP16 embriões foram injetados com PBS e submetidos à análise de citometria de fluxo. Primeiro, tamanho e granularidade foram determinados, e um portão foi desenhado em torno da população celular de interesse(células, painel esquerdo). Em seguida, FSC H e FSC W foram avaliados para eliminar células presas juntas(singlets FSC). SSC H e W também foram avaliados para reduzir a possibilidade de avaliação de células presas juntas (singlets SSC). A fluorescência vermelha foi então examinada para determinar células vivas(células vivas). Finalmente, células vivas foram examinadas para fluorescência GFP (painel direito). (B) lcr:GFP12 embriões foram injetados com PBS (controle, círculos), ism1 MO(ism1 MO, quadrados), ou ism1 MO + ism1 mRNA12 (resgate, triângulos) no estágio de desenvolvimento de uma célula. Após 48 h, foram coletados, digeridos e submetidos à citometria de fluxo, como mostrado no painel A. Cada ponto representa cinco embriões individuais escolhidos aleatoriamente. A mudança do fold é calculada pegando a porcentagem média de células GFP+ da amostra de controle e definindo-a como 1. Todas as outras amostras são comparadas com essa média. *p < 0,005, e N.S. = não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| solução | Ingredientes | anotações |
| Meio E3 (50x) | 14,61 g de NaCl, 0,63 g de KCI, 1,99 g de MgSO4·7H2O, 1,83 g de CaCl2·2H2O | A um cilindro graduado de 2 L, adicione os ingredientes e água destilada suficiente para levar o volume total a 1 L. |
| Meio E3 (1x) | 40 mL de 50x E3 | Para um cilindro graduado em 2 L, adicione água destilada suficiente para levar o volume total a 2 L. |
| 1-Phenyl-2-thiourea (PTU) em meio E3 | 40 mL de 50x E3 em uma garrafa de 2 L, 40 mg de PTU | Para um cilindro graduado em 2 L, adicione água destilada suficiente para levar o volume total a 2 L. Mexa por pelo menos 2 dias para dissolver completamente a PTU. |
Tabela 1: Receitas para soluções.
Figura Suplementar 1: Digestão de embriões com protease de dissociação. Imagens de 10 embriões não digeridos corretamente (esquerda; não digeridas), após digestão adequada (meio; digerido) e após excesso de digestão (direita; superdigesto). Clique aqui para baixar este número.
Figura Suplementar 2: Avaliação de dois fluoroforos em 5 embriões dpf. Os portões foram sorteados para avaliarFSC e SSC para determinar a população celular de interesse (células, coluna esquerda), avaliar singlets (não mostrados), determinar células vivas(vivas,coluna média) e expressão fluorforeiro(mpx:GFP17 e gata1:D sRed15). Primeiro, os portões foram colocados em um animal que não tem fluoroforos (linha superior). Em seguida,foram avaliados os animais mpx :GFP+ (sem gata1:D sRed) para fixar os portões e compensação para GFP (segunda fila). gata1:D sRed+ (sem mpx:GFP) os animais foram avaliados para definir os portões e compensação para DsRed (terceira linha). Por fim, as duas cores podem ser avaliadas em animais duplo positivos que são mpx:GFP+ e gata1:D sRed+. Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
Zebrafish é um excelente sistema modelo para estudar hematopoiese vertebral primitiva e definitiva. Ao longo das últimas décadas, vários ensaios foram desenvolvidos e refinados, permitindo que o zebrafish se tornasse um modelo rápido e econômico para testar drogas, gerar e testar mutantes genéticos, e, em geral, permitir que os pesquisadores analisassem caminhos moleculares essenciais para a hematopoiese. Este protocolo utiliza zebrafish embrionários que permite a coleta rápida de dados, o uso de menos espaço físico do que animais adultos e o uso de menos drogas para telas químicas de grande escala. Também permite a quantitação após a superexpressão do mRNA, geração de mutantes CRISPR e redução de transcrição induzida por MO para alterar vias genéticas específicas que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário precoce. É importante ressaltar que permite uma quantificação sensível e robusta das células sanguíneas, o que é difícil de fazer com técnicas de hibridização in situ ou coloração histológica.
Este ensaio é flexível e pode ser modificado para responder a muitas perguntas de pesquisa. Uma modificação deste protocolo pode ser realizada pela qual o estágio de desenvolvimento do animal é manipulado para quantificar diferentes tipos de células sanguíneas. Por exemplo, os glóbulos vermelhos surgem no início do desenvolvimento de zebrafish, e com animais transgênicos como a linha transgênica LCR:GFP16 pode ser detectada tão cedo quanto o estágio de 16-somite. Se alguém estiver interessado em estudar trombocitos, no entanto, a linha transgênica itga2b:GFP18 (também conhecida como cd41 (GFP)começa a expressar GFP a 48 hpf, com trombocitos de circulação maduros observados a 72 hpf. Se alguém deseja quantificar células B com este ensaio, então ele pode ser realizado com ighm:EGFP19 animais transgênicos mais próximos de 20 dpf. É importante ressaltar que este ensaio também pode ser usado para seguir as células sanguíneas ao longo do tempo. Por exemplo, analisando os números de células LCR:GFP+ a 24 hpf, 48 hpf, 72 hpf, pode-se determinar se uma modificação genética (ou droga) está regulando a manutenção de glóbulos vermelhos versus apenas sua geração.
Esses ensaios permitem aos pesquisadores reduzir a expressão genética com CRISPR ou MOs ou expressar sobre a expressão genética injetando mRNA no estágio de desenvolvimento de uma célula e comparar com precisão o número de células sanguíneas produzidas nesses embriões modificados. Deve-se sempre ter cuidado para realizar controles adequados para esses experimentos ao mesmo tempo, injetando animais irmãos com RNAs guia não específicos ou MOs incompatíveis e examinando seu sangue ao lado dos grupos experimentais. O estágio de desenvolvimento é crítico; alterações de apenas algumas horas durante o desenvolvimento poderiam mostrar um número muito diferente de células sanguíneas presentes em um embrião. Em outras palavras, certifique-se de monitorar cuidadosamente as horas de desenvolvimento ao comparar embriões. Para garantir que os embriões sejam combinados com a idade, devem ser utilizadas pistas morfológicas. Nos primeiros embriões, considere contar somitas para a idade. Mais tarde, em desenvolvimento, outros marcadores como o início do batimento cardíaco, o tamanho da vesícula otica ou o comprimento do corpo podem ser usados para combinar com os estágios dos peixes modificados para controlar os peixes. Além disso, o número de células totais pode ser enumerado a partir de embriões digeridos para garantir que o mesmo número de células esteja presente em animais experimentais e de controle. Além de usar esses ensaios para examinar a modificação genética, esses ensaios também podem ser modificados para realizar telas de drogas em larga escala. Os embriões podem ser expostos a diferentes concentrações de compostos temporalmente durante o desenvolvimento para ver se os produtos químicos em questão têm algum efeito sobre a hematopoiese. Se o experimento for projetado para testar o efeito de uma determinada droga, então os animais tratados com veículo só devem ser incluídos como controle. Dessa forma, os pesquisadores podem determinar se o ganho ou perda de função de genes específicos ou caminhos de sinalização desempenham um papel essencial na hematopoiese.
É essencial que, ao examinar diferentes transgenes, o número de animais digeridos por amostra seja otimizado; muito poucos animais podem gerar pouca ou nenhuma fluorescência. Isso é especialmente verdade ao examinar os HSPCs que não são abundantes em um determinado ponto de tempo. Também é fundamental ao examinar transgênicos que têm promotores fracos dirigindo fluorescência. Para neutralizar essas questões, mais animais (e, portanto, mais células) são necessários para contagem precisa. Ao alterar os estágios de desenvolvimento, também é fundamental otimizar o tempo de digestão. Este protocolo é otimizado para 5 embriões individuais de 48 hpf por tubo. Digerir embriões mais maduros provavelmente exigirá mais tempo.
Alguns problemas potenciais podem surgir durante o procedimento. Se não houver fluorescência observada, pode haver um problema técnico com o cítmetro que precisa ser resolvido. Por essa razão, é essencial verificar se os embriões são fluorescentes antes de iniciar o procedimento, verificando-os rapidamente sob um microscópio. Outra questão comum é a super digestão dos embriões, que destrói as células. Tome cuidado na etapa de digestão e altere o tempo se muitas células mortas forem observadas.
Esses ensaios têm algumas limitações. A maior questão é que esses ensaios dependem da expressão de um marcador transgênico. Potencialmente, a mudança da expressão do marcador transgênico pode não refletir a biologia do que está ocorrendo no embrião. Além disso, a citometria de fluxo pode não ser o melhor método para quantificar as células se a população celular alvo for extremamente baixa. Para lidar com essas possibilidades, outros ensaios como técnicas de coloração in situ ou histológica poderiam ser utilizados. Se existem anticorpos específicos para o tipo celular de imunohistoquímica de interesse também podem ser realizados. Os embriões também poderiam ser submetidos a qRT-PCR para medir genes específicos de linhagem, e se esses ensaios forem realizados em uma máquina FACS, as células podem ser isoladas e estudadas individualmente com métodos ainda mais sensíveis. Excluindo essas questões, esse ensaio de citometria de fluxo quantitativo pode gerar muitas informações úteis para os pesquisadores.
Com esses ensaios, os pesquisadores podem facilmente observar defeitos hematopoiéticos em animais vertebrados. Modificar caminhos genéticos com MOs ou CRISPR e, em seguida, realizar citometria de fluxo para elucidar se o gene desempenha um papel na hematopoiese pode ser feito rapidamente e é quantitativo. Além disso, telas genéticas avançadas (desde que os animais tenham uma etiqueta fluorescente) podem ser realizadas e defeitos avaliados. Os zebrafish também se tornaram um excelente modelo para telas de drogas em larga escala6,7,8,9,10, permitindo que ensaios eficientes de rastreamento de drogas em organismos vivos observem se as drogas são eficazes e se elas têm efeitos negativos no desenvolvimento/sobrevivência. Acoplamento deste ensaio com tecnologia automatizada de citometria de fluxo aprimorada pela robótica o tornaria ainda mais eficiente20,21,22, permitindo uma análise verdadeiramente em larga escala e triagem de caminhos importantes na gênese de células sanguíneas, crescimento e regulação que permanecem obscuras.
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Disclosures
D.L.S. é consultora científica e recebeu compensação da Finless Foods, Inc. e Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. declara que não há interesses concorrentes.
Acknowledgments
O financiamento foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH: R15 DK114732-01 para d.L.S.), pela National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 a D.L.S.), e pelo Programa de Honra da Universidade Estadual da Califórnia Chico (para K.F.R.). Os autores agradecem a Betsey Tamietti pela gestão laboratorial e Kathy Johns pela assistência administrativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
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