Summary
Deze test is een eenvoudige methode om hematopoëtische cellen te kwantificeren bij de ontwikkeling van embryonale zebravissen. Bloedcellen van gedissocieerde zebravissen worden onderworpen aan flow cytometrie analyse. Dit maakt het mogelijk om bloeddefecten bij gemuteerde dieren en na genetische modificatie te detecteren.
Abstract
De diversiteit van cellijnen die volwassen bloed in gewervelde dieren omvatten, komt voort uit de differentiatie van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPCs). Dit is een kritisch proces dat optreedt gedurende de hele levensduur van organismen, en verstoring van de moleculaire paden die betrokken zijn bij embryogenese kan catastrofale gevolgen op lange termijn hebben. Om een veelheid van redenen is zebravis (Danio rerio) een modelorganisme geworden om hematopoiese te bestuderen. Zebravisembryo's ontwikkelen zich extern en hebben na 7 dagen postfertilisatie (dpf) de meeste subtypes van definitieve bloedcellen geproduceerd die hun leven lang zullen aanhouden. Er zijn testen ontwikkeld om het aantal hematopoëtische cellen te beoordelen, voornamelijk met behulp van specifieke histologische vlekken, in situ hybridisatietechnieken en microscopie van transgene dieren die bloedcelspecifieke promotors gebruiken die de expressie van fluorescerende eiwitten stimuleren. De meeste kleuringstesten en in situ hybridisatietechnieken kwantificeren echter niet nauwkeurig het aantal aanwezige bloedcellen; alleen grote verschillen in celnummers zijn gemakkelijk te visualiseren. Het gebruik van transgene dieren en het analyseren van individuen met fluorescerende of confocale microscopie kan worden uitgevoerd, maar de kwantificering van deze testen is afhankelijk van handmatig tellen of het gebruik van dure beeldvormingssoftware, die beide fouten kunnen maken. De ontwikkeling van aanvullende methoden om het aantal bloedcellen te beoordelen zou economisch, sneller en zelfs geautomatiseerd zijn om snel het effect van CRISPR-gemedieerde genetische modificatie, morfolino-gemedieerde transcriptiereductie en het effect van medicijnverbindingen die hematopoiese op grote schaal beïnvloeden, snel te beoordelen. Deze nieuwe test om bloedcellen te kwantificeren wordt uitgevoerd door hele zebravisembryo's te dissocieren en de hoeveelheid fluorescerend gelabelde bloedcellen te analyseren. Deze assays moeten het mogelijk maken om moleculaire routes op te helderen die verantwoordelijk zijn voor de vorming, uitbreiding en regulatie van bloedcellen tijdens embryogenese, waardoor onderzoekers nieuwe factoren kunnen ontdekken die zijn veranderd tijdens bloedziekten, evenals paden die essentieel zijn tijdens de evolutie van gewervelde hematopoiese.
Introduction
Bloedproductie (hematopoiese) is een essentieel ontwikkelingsproces dat voor het eerst begint in het vroege embryo. Dit proces begint met het genereren van primitieve rode bloedcellen en macrofagen rechtstreeks van mesoderm, en verschuift later naar de productie van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPCs). Deze stamcellen, die multipotent zijn, genereren alle variëteiten van volwassen bloedcellen in het organisme. In staat tot zelfvernieuwing wordt het systeem voortdurend aangevuld via deze HSPCs. Hoewel dit proces vroeg in de ontwikkeling begint, gaat hematopoiese door voor het leven van het dier, waardoor zuurstof naar verre plaatsen van het lichaam kan worden getransporteerd, bloedingen na letsel kunnen worden gestopt en het lichaam tegen infectie kan worden beschermd. De ontwikkeling van dit complexe systeem wordt tijdelijk en ruimtelijk gecontroleerd tijdens de ontwikkeling en eventuele verstoringen in de bloedcelproductie kunnen catastrofaal zijn voor het organisme, wat resulteert in bloedarmoede, trombocytopenie, leukopenie en leukemie.
Een populair diermodel dat wordt gebruikt voor hematopoëtisch onderzoek is de zebravis (Danio rerio) omdat ze een vergelijkbare bloedontwikkeling hebben in vergelijking met mensen. In feite worden veel van de genen en moleculaire paden die tijdens hematopoiese worden gebruikt, bewaard tijdens de evolutie van gewervelde dieren, waardoor we meer te weten kunnen komen over menselijke genen door zebravissen te bestuderen. Belangrijk is dat zebravisembryo's zich buiten het lichaam ontwikkelen en binnen 7 dagen de meeste volwassen bloedceltypen hebben gegenereerd, waardoor het hematopoëtische systeem in korte tijd direct kan worden gevist. Zebravissen zijn ook extreem vruchtbaar, waardoor onderzoekers in korte tijd een groter aantal monsters kunnen observeren, wat ook belangrijk is voor het genereren van reproduceerbare gegevens. De korte generatietijd en externe ontwikkeling van de zebravis zorgt voor eenvoudigere manipulatie en observatie tijdens mutagenesestudies1,2,3,4,5 en drugsscreening6,7,8,9,10. Hierdoor kan een panel van veelbelovende therapeutische verbindingen voor menselijke bloedaandoeningen snel en efficiënt worden getest.
Belangrijk is dat zebravissen ook genetisch vatbaar zijn en dat het genoom wordt gesequenced en geannoteerd. Deze tractabiliteit maakt het mogelijk om omgekeerde genetische technieken zoals morfolino- (MO-) gemedieerde knockdown en CRISPR-gemedieerde genetische ablatie uit te voeren. Zebravissen hebben ook hun nut bewezen als model om voorwaartse genetische schermen uit te voeren; veel essentiële genen en paden die betrokken zijn bij gewervelde bloedvorming zijn op deze manier ontdekt. Talrijke methoden voor het observeren van bloedcellen zijn ook ontwikkeld bij zebravissen. Hoewel er traditionele histologische kleuringstechnieken bestaan, is het ook mogelijk om in situ hybridisatie uit te voeren voor bloedspecifieke transcripties. Belangrijk is dat er ook tal van transgene vislijnen bestaan waarbij fluorescerende eiwitten worden uitgedrukt door afstammingsspecifieke promotors, waardoor de etikettering van specifieke bloedcellen met fluorescerende eiwitten11mogelijk is. Dit stelt onderzoekers in staat om up-to-the-minute observatie van het ontstaan, de expansie en de regulatie van bloedcellen in een levend organisme in de loop van de tijd uit te voeren.
Over het algemeen heeft het behoud van het hematopoëtische systeem, de aanwezigheid en gemakkelijke ontwikkeling van transgene lijnen, eenvoudige visualisatie en korte generatietijd de zebravis een economisch, snel en aanpasbaar model van hematopoiese gemaakt. Om de toolbox met technieken voor zebravisonderzoekers te verbeteren, ontwikkelden we deze test om het aantal bloedcellen in embryo's robuust te kwantificeren. De methode omvat het verteren van transgene dieren en het uitvoeren van flowcytometrie voor fluorescerende bloedcellen. Op deze manier kunnen bloedcellen van gemuteerde dieren, het effect van MO- en CRISPR-modificatie en het effect van kleine moleculen op een snelle en reproduceerbare manier kwantitatief worden geanalyseerd. Deze onderzoeken zijn gebruiksvriendelijke en economische manieren om bloedcellen op te sommen, waardoor onderzoek van hun generatie, proliferatie en onderhoud in de loop van de tijd mogelijk is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) adviesraad van de California State University, Chico, keurde alle hieronder beschreven methoden goed.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om embryo's te behandelen met 1-fenyl 2-thiourea (PTU; Tabel 1) na 24 uur postfertilisatie (hpf) om pigmentatie te voorkomen die een negatieve invloed heeft op fluorescentiediscriminatie door flowcytometrie. Alle onderstaande procedures zijn aanvaardbaar voor flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Als iemands doel echter is om de hematopoëtische cellen na FACS te gekweekt, houd je dan aan steriele praktijken bij het verwerken van monsters. Het protocol voor het steriel bleken en bereiden van embryomonsters is eerder beschreven12.
1. Dechorionatie van 48 hpf zebravisembryo's
- Met embryo's (minstens 5, maar niet meer dan 200 embryo's) in een plastic petrischaal van 10 cm, kantel de schaal zodat de embryo's naar de onderrand zinken.
OPMERKING: Het is gemakkelijk om de schaal te kantelen door het deksel te verwijderen en het deksel onder één rand van de Petrischaal te plaatsen. - Verwijder en gooi zoveel mogelijk E3 medium (tabel 1) weg en voeg 500 μL dechorionatie protease (10 mg/ml) toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Pak na 5 minuten de Petrischaal op (houd alle embryo's aan de onderkant van de plaat) en tik voorzichtig op de zijkant van de Petrischaal, zodat embryo's zachtjes tegen de bodem van de plaat kunnen wrijven om koraal volledig te verwijderen.
- Voeg met een knijpfles ~ 20 ml E3-medium toe om protease te verdunnen. Laat embryo's bezinken en verwijder het E3-medium door te decanteren.
- Herhaal stap 1.4 3x om alle sporen van het dechorionatie protease te verwijderen.
OPMERKING: Voor elk afzonderlijk monster dat moet worden geanalyseerd, zijn ten minste 5 embryo's vereist. Deze dechorionatieprocedure biedt plaats aan maximaal 200 embryo's per petrischaal. Monsters kunnen in dit stadium worden gegroepeerd en indien gewenst later worden gescheiden. Als alternatief kan handmatige dechorionatie worden uitgevoerd door de koraallen voorzichtig te scheuren met de tang van de horlogemaker. Dit is voordelig wanneer er kleine aantallen embryo's zijn. Meestal komen zebravissen uit hun koraal met 72 pkf. Ernstig misvormde embryo's kunnen echter niet en vereisen na die tijd dechorionatie (handmatig of chemisch).
2. Bereiding van embryomonsters voor dissociatie
- Plaats met behulp van een P1000 pipet 5−10 embryo's in een enkele microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Verwijder het E3-medium met een pipet en gooi het weg.
LET OP: Pipet met zorg omdat embryo's gemakkelijk kunnen worden weggegooid tijdens de volgende stappen. - Voeg 1 ml 10 mM dithiothreitol (DTT) toe in E3-medium om de slijmlaag rond de embryonale zebravis11,12,13,14te verwijderen . Leg de microcentrifugebuis horizontaal en incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
3. Embryodissociatie
- Was de embryo's 3x met 1 ml dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) met Ca2+ en Mg2+ om sporen van DTT te verwijderen. Voeg na de laatste wasbeurt 500 μL DPBS toe met Ca2+ en Mg2+ en 5 μL van 5 mg/ml (26 U/ml) dissociatie protease.
OPMERKING: Andere isotone gebufferde oplossingen kunnen worden gebruikt, maar ze moeten Ca2+ en Mg2+ bevatten om het dissociatie-enzym goed te laten functioneren. - Incubeer monsters bij 37 °C op een horizontale orbitale shaker bij 185 tpm gedurende 60 minuten. Trituraatembryo's met een P1000 pipet tot de monsters volledig zijn gedissocieerd.
LET OP: Zorg ervoor dat u de embryo's niet overdigest; er moet wat vast weefsel aanwezig zijn en het mag niet volledig homogeen zijn. Het is mogelijk om overdigest, die de doelbloedcellen zal vernietigen die op de stroomcytometer moeten worden waargenomen (Aanvullende figuur 1).
OPMERKING: Deze procedure werkt het beste voor 48−72 hpf embryo's. Latere stadia kunnen een langere incubatie met dissociatie protease vereisen. De timing voor verschillende fasen moet empirisch worden bepaald. Er zijn snellere alternatieve methoden om embryonaal weefsel te dissocieren, maar empirisch wordt vastgesteld dat deze methode, hoewel het 60 minuten duurt, zacht en grondig genoeg is om een efficiënte isolatie van levende hematopoëtische cellen mogelijk te maken.
4. Bereiding van gedissocieerde embryo's voor flowcytometrie
- Pipetteer de 5 gedissocieerde embryo's op het bovenste reservoir van een 5 ml polystyreen ronde bodembuis met een 35 μmM celzeefdop.
- Spoel cellen door 4 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2+ of Mg2+ toe te voegen aan de zeefdop van de polystyreenbuis van 5 ml die de gefilterde cellen bevat.
OPMERKING: Andere isotone gebufferde oplossingen kunnen ook worden gebruikt, maar ze moeten Ca2+ of Mg2+ missen om het dissociatie-enzym te verdunnen en ineffectief te maken. - Centrifugeer buizen bij 4 °C en 300 x g gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Verwijder en gooi supernatant met een pipet weg. Resuspend de cellen in 500 μL PBS (zonder Ca2+ of Mg2+).
5. Flow cytometrie
- Draai de celsuspensie voorzichtig om en voeg 1:1.000 rode dode celvlek(Tabel met materialen) toe.
OPMERKING: De rode dode celvlek is een celdoorlatende kleurstof die het mogelijk maakt dode cellen en vuil uit doelcellen te verwijderen en is een uitstekende keuze van kleurstof voor dode celdiscriminatie, omdat deze wordt opgewekt door de 633 nm-laser, die verschilt van de 488 nm-laser die wordt gebruikt om gemeenschappelijke fluoroforen zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) en DsRed op te wekken. Op deze manier is er geen spectrale overlap van dode cellen en transgene bloedcellen. Propidiumjodide (PI) bij 1 mg/ml is een goedkoop alternatief voor de rode dode celvlek, maar zorg ervoor dat u sommige monsters alleen met PI en monsters alleen reserveert met de fluorofoor van belang om de instrumentcompensatie vast te stellen. Anders zullen de signalen van PI en fluoroforen zoals GFP elkaar overlappen, wat resulteert in vals-positieve resultaten. Als de flow cytometer ook een 405 nm laser heeft, zijn ook andere kleurstoffen zoals blue dad cell stain een uitstekende keuze.
LET OP: Houd er bij het analyseren van bloedcellen rekening mee dat na 30 minuten bepaalde celtypen de rode dode celvlek beginnen te fagocytose. Houd cellen beschermd tegen licht en op ijs tot analyse en voer flowcytometrie uit binnen 30 minuten na het toevoegen van de kleurstof. - Flow cytometrie analyse
OPMERKING: Elke flowcytometer is een beetje anders, maar de volgende stappen zullen helpen bij het voorbereiden van monsters voor analyse op de meeste machines. Voor gebruikers die nieuw zijn in flowcytometrie, moet u het advies inwinnen van iemand die een expert is op het gebied van het specifieke apparaat. De volgende instructies hebben betrekking op de BD FACSAria Fusion flow cytometer.- Zet de cytometer aan en laat lasers 20 minuten opwarmen. Lege afvaltank, vul de manteltank met de juiste oplossing (varieert op basis van flowcytometer) en start het fluidics-systeem.
OPMERKING: Er is meestal een bepaalde opstartprocedure voor elk type flowcytometer; volg die opstartprocedure zorgvuldig. - Teken in de analysesoftware vijf plots (figuur 1A).
- Laat de eerste puntplotmeting voorwaartse spreiding (FSC) op de x-as en zijverstrooiing (SSC) op de y-as. Stel FSC in als lineair en SSC als logboek.
OPMERKING: FSC is een meting van de celgrootte en SSC is een meting van granulariteit; dit zal de discriminatie van cellen uit puin mogelijk maken. Embryonale zebravisbloedcelpopulaties scheiden zich niet naar grootte en granulariteit op dezelfde manier als volwassen zebravisbloedcellen die eerder werden beschreven15. In plaats daarvan verschijnen ze in dezelfde populatie met alle andere verteerde embryonale cellen. - Stel het tweede perceel in om de FSC-hoogte (H) versus de FSC-breedte (W) te onderzoeken. Stel de derde plot in om SSC (H) versus SSC (W) te meten.
OPMERKING: Deze stap wordt gebruikt om doubletten uit te sluiten (cellen die aan elkaar vastzitten wanneer ze door de laser gaan). - Stel de vierde puntplot in om de rode dode celvlek op de x-as te meten (afhankelijk van de cytometer is dit meestal gelijk aan het filter dat wordt gebruikt voor allofycocyanine [APC]) en SSC op de y-as. Hierdoor kunnen levende cellen uit dode cellen worden gediscrimineerd.
OPMERKING: Filtersets van elke cytometer kunnen verschillen. Zorg ervoor dat u het juiste detectiefilter gebruikt voor de dode cel discriminatie kleurstof. - Het vijfde perceel meet de fluorofoor van keuze. Visualiseer dit als een histogram van de fluorofoor (figuur 1) of gebruik een puntplot (Aanvullende figuur 2).
OPMERKING: Wanneer u meer dan één fluorofoor bij hetzelfde dier onderzoekt, wordt aanbevolen om een puntplot te gebruiken om beide parameters tegelijkertijd weer te geven. Als er een kans is dat de fluoroforen spectrale overlap met elkaar hebben(aanvullende figuur 2),wordt ook een puntplot aanbevolen. Gebruik de gebiedsinstellingen (A) om het gebied te berekenen onder de curve die wordt gegenereerd door de laserpuls van de cytometer voor alle parameters, omdat ze nauwkeuriger zijn.
- Laat de eerste puntplotmeting voorwaartse spreiding (FSC) op de x-as en zijverstrooiing (SSC) op de y-as. Stel FSC in als lineair en SSC als logboek.
- Laad het monster en verlaag het debiet zodat het monster niet snel opraakt. Pas de FSC- en SSC-instellingen aan zodat het grootste deel van de celpopulatie duidelijk zichtbaar is (figuur 1A).
- Teken een poort rond de celpopulatie en label deze cellen. Ervoor zorgen dat de tweede puntplot op cellen is gated, doubletten uitsluiten door eerst gating op FSC en vervolgens op SSC singlets.
- Pas op het vierde perceel de instellingen van de rode dode celvlek aan, zodat er duidelijk een negatieve populatie is. Teken een poort rond deze cellen en label ze levende cellen. Op het vijfde perceel, poort op levende cellen en onderzoek fluorofoor negatieve en positieve cellen. Teken een poort rond de positieve cellen.
OPMERKING: Deze hiërarchische gatingstrategie onderzoekt enkele fluorofoor+ cellen die zich in de poort van de levende cellen bevinden, die zich ook in de celpoort bevinden. Zorg ervoor dat u de poorten goed instelt. Deze poorten kunnen worden aangepast, afhankelijk van het experiment. - Voer elk monster uit en verzamel ten minste 25.000 live celgebeurtenissen.
- Volg de uitschakelprocedure om de fluidics uit te schakelen. Vul de hulstank bij en leeg de afvaltank.
OPMERKING: Het is vaak moeilijk om fluorofoor+ cellen te visualiseren wanneer de eiwitexpressie laag is of de celpopulatie zeldzaam is. Om ervoor te zorgen dat de parameters correct zijn ingesteld, moeten fluorofoor- embryo's van broers en zussen worden voorbereid om poorten goed te trekken en laserspanningen aan te passen (Aanvullende figuur 2). Als de doelcelpopulatie zeldzaam is, verzamelt u meer dan 25.000 gebeurtenissen. Met 5−10 verteerde dieren moet men miljoenen gebeurtenissen kunnen verzamelen. Het totale aantal fluorofoor+ cellen kan ook worden verkregen met deze gegevens. Tel gewoon het totale aantal cellen in het monster met een hemocytometer en vermenigvuldig het percentage fluorofoor+ cellen om het absolute aantal fluorofoor+ cellen per vis te verkrijgen.
- Zet de cytometer aan en laat lasers 20 minuten opwarmen. Lege afvaltank, vul de manteltank met de juiste oplossing (varieert op basis van flowcytometer) en start het fluidics-systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om rode bloedcellen in embryonale zebravissen op te sommen, werden lcr:GFP16 embryo's geïnjecteerd in het eencellige stadium met PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO, of 7,0 ng/nL ism1 MO met 7,0 ng ism1 mRNA12. Bij 48 hpf werden ze verteerd en onderworpen aan flow cytometrie analyse. Na analyse van het percentage GFP+ rode bloedcellen uit elk monster (elk monster bestaat uit 5 willekeurig geselecteerde embryo's; Figuur 1A), werd het gemiddelde van alle controlegroep berekend. Dit gemiddelde is ingesteld op 1en alle percentages zijn berekend op basis van dat referentiepunt. Deze gegevens geven aan dat het verminderen van ism1 transcript met een specifieke MO het aantal GFP+ rode bloedcellen in het 48 hpf embryo verminderde. Bovendien, het redden van deze vermindering van ism1 niveaus met exogene mRNA keerde het aantal rode bloedcellen terug naar normaal.
Figuur 1: ism1 MO vermindert het aantal rode bloedcellen geproduceerd tijdens embryogenese. (A) lcr:GFP16 embryo's werden geïnjecteerd met PBS en onderworpen aan flow cytometrie analyse. Eerst werden grootte en granulariteit bepaald en werd een poort getrokken rond de celpopulatie van belang(cellen,linkerpaneel). Vervolgens werden FSC H en FSC W geëvalueerd om cellen te elimineren die aan elkaarvastzaten (singlets FSC). SSC H en W werden ook geëvalueerd om de mogelijkheid te verkleinen om cellen te evalueren die aan elkaar vastzitten (singlets SSC). Rode fluorescentie werd vervolgens onderzocht om levende cellen(levende cellen)te bepalen. Ten slotte werden levende cellen onderzocht op GFP-fluorescentie (rechterpaneel). (B) lcr: GFP12 embryo's werden geïnjecteerd met PBS (controle, cirkels), ism1 MO(ism1 MO, vierkanten), of ism1 MO + ism1 mRNA12 (redding, driehoeken) in het stadium van ontwikkeling met één cel. Na 48 uur werden ze verzameld, verteerd en onderworpen aan flowcytometrie zoals weergegeven in paneel A. Elk punt vertegenwoordigt vijf willekeurig gekozen individuele embryo's. Vouwverandering wordt berekend door het gemiddelde percentage GFP+ cellen van het controlemonster te nemen en dat in te stellen op 1. Alle andere monsters worden vergeleken met dat gemiddelde. *p < 0,005, en N.S. = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Oplossing | Ingrediënten | Notities |
| E3 medium (50x) | 14,61 g NaCl, 0,63 g KCI, 1,99 g MgSO4·7H2O, 1,83 g CaCl2·2H2O | Voeg aan een 2 L gegradueerde cilinder de ingrediënten en voldoende gedestilleerd water toe om het totale volume op 1 L te brengen. |
| E3 medium (1x) | 40 ml 50x E3 | Voeg aan een 2 L gegradueerde cilinder voldoende gedestilleerd water toe om het totale volume op 2 L te brengen. |
| 1-Fenyl-2-thiourea (PTU) in E3 medium | 40 ml 50x E3 in een fles van 2 L, 40 mg PTU | Voeg aan een 2 L gegradueerde cilinder voldoende gedestilleerd water toe om het totale volume op 2 L te brengen. Roer minstens 2 dagen om PTU volledig op te lossen. |
Tabel 1: Recepten voor oplossingen.
Aanvullende figuur 1: Vertering van embryo's met dissociatie protease. Afbeeldingen van 10 embryo's die niet goed zijn verteerd (links; onverteerd), na een adequate spijsvertering (midden; verteerd) en na overmatige spijsvertering (rechts; oververteerd). Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullend figuur 2: Evaluatie van twee fluoroforen in 5 dpf embryo's. Poorten werden getrokken om FSC en SSC te evaluerenom de celpopulatie van belang te bepalen(cellen,linkerkolom), om singlets te evalueren (niet weergegeven), om levende cellen(levend,middelste kolom) en fluorofoorexpressie(mpx: GFP17 en gata1:D sRed15) te bepalen. Eerst werden poorten geplaatst op een dier dat geen fluoroforen heeft (bovenste rij). Vervolgens werden mpx:GFP+ (zonder gata1:D sRed) dieren geëvalueerd om de poorten en compensatie voor GFP (tweede rij) in te stellen. gata1:D sRed+ (zonder mpx:GFP) dieren werden geëvalueerd om de poorten en compensatie voor DsRed (derde rij) in te stellen. Ten slotte kunnen de twee kleuren worden geëvalueerd in dubbele positieve dieren die mpxzijn: GFP+ en gata1:D sRed+. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebravissen zijn een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van primitieve en definitieve gewervelde hematopoiese. In de afgelopen decennia zijn meerdere tests ontwikkeld en verfijnd, waardoor zebravissen een snel en economisch model kunnen worden voor het testen van medicijnen, het genereren en testen van genetische mutanten, en over het algemeen kunnen onderzoekers moleculaire paden analyseren die essentieel zijn voor hematopoiese. Dit protocol maakt gebruik van embryonale zebravissen die snelle gegevensverzameling, het gebruik van minder fysieke ruimte dan volwassen dieren en het gebruik van minder medicijnen voor grootschalige chemische schermen mogelijk maken. Het maakt ook kwantificering mogelijk na overexpressie van mRNA, generatie van CRISPR-mutanten en MO-geïnduceerde transcriptiereductie om specifieke genetische paden te veranderen die optreden tijdens de vroege embryonale ontwikkeling. Belangrijk is dat het gevoelige, robuuste kwantificering van bloedcellen mogelijk maakt, wat moeilijk te doen is met in situ hybridisatie of histologische kleuringstechnieken.
Deze test is flexibel en kan worden aangepast om veel onderzoeksvragen te beantwoorden. Een wijziging van dit protocol kan worden uitgevoerd waarbij de ontwikkelingsfase van het dier wordt gemanipuleerd om verschillende bloedceltypen te kwantificeren. Rode bloedcellen ontstaan bijvoorbeeld vroeg in de ontwikkeling van zebravissen en bij transgene dieren zoals de lcr:GFP16 kan transgene lijn al in de 16-somietfase worden gedetecteerd. Als men echter geïnteresseerd is in het bestuderen van trombocyten, begint de itga2b:GFP18 (ook bekend als cd41:GFP) transgene lijn GFP uit te drukken bij 48 hpf, met volwassen circulerende trombocyten waargenomen bij 72 hpf. Als men B-cellen met deze test wil kwantificeren, kan het worden uitgevoerd met ighm:EGFP19 transgene dieren dichter bij 20 dpf. Belangrijk is dat deze test ook kan worden gebruikt om bloedcellen in de loop van de tijd te volgen. Door bijvoorbeeld de aantallen lcr:GFP+ cellen te analyseren op 24 hpf, 48 hpf, 72 hpf, zou men kunnen bepalen of een genetische modificatie (of medicijn) het onderhoud van rode bloedcellen reguleert ten opzichte van alleen hun generatie.
Deze onderzoeken stellen onderzoekers in staat om genexpressie met CRISPR of MOs of overexpressie genexpressie te verminderen door mRNA te injecteren in het stadium van ontwikkeling met één cel en het aantal bloedcellen dat in deze gemodificeerde embryo's wordt geproduceerd nauwkeurig te vergelijken. Er moet altijd voor worden gezorgd dat deze experimenten tegelijkertijd de juiste controles uitvoeren door broers en zussen te injecteren met niet-specifieke gids-RNA's of niet-overeenkomende MOs en hun bloed naast de experimentele groepen te onderzoeken. De ontwikkelingsfase is van cruciaal belang; veranderingen van slechts een paar uur tijdens de ontwikkeling kunnen enorm verschillende aantallen bloedcellen in een embryo vertonen. Met andere woorden, zorg ervoor dat u de uren van ontwikkeling zorgvuldig controleert bij het vergelijken van embryo's. Om ervoor te zorgen dat embryo's leeftijdsgematcht zijn, moeten morfologische aanwijzingen worden gebruikt. Overweeg in vroege embryo's somieten te tellen om ouder te worden. Later in de ontwikkeling kunnen andere markers zoals het begin van het kloppende hart, de grootte van het blaasje of de lengte van het lichaam worden gebruikt om de stadia van gemodificeerde vissen te matchen om vissen te controleren. Bovendien kunnen de aantallen totale cellen worden geïnd uit verteerd embryo's om ervoor te zorgen dat hetzelfde aantal cellen aanwezig is in proef- en controledieren. Naast het gebruik van deze assays om genetische modificatie te onderzoeken, kunnen deze assays ook worden aangepast om grootschalige medicijnschermen uit te voeren. Embryo's kunnen tijdens de ontwikkeling tijdelijk worden blootgesteld aan verschillende concentraties verbindingen om te zien of de chemicaliën in kwestie enig effect hebben op hematopoiese. Als het experiment is ontworpen om het effect van een bepaald geneesmiddel te testen, mogen dieren die alleen met een voertuig worden behandeld, ook als controle worden opgenomen. Op deze manieren kunnen onderzoekers bepalen of winst- of functieverlies van specifieke genen of signaleringsroutes een essentiële rol spelen bij hematopoiese.
Het is van essentieel belang dat bij het onderzoek van verschillende transgenen het aantal dieren dat per monster wordt verteerd, wordt geoptimaliseerd; te weinig dieren kunnen weinig of geen fluorescentie veroorzaken. Dit geldt met name bij het onderzoeken van HSPCs die op een bepaald moment niet overvloedig aanwezig zijn. Het is ook van cruciaal belang bij het onderzoeken van transgenica die zwakke promotors hebben die fluorescentie stimuleren. Om deze problemen tegen te gaan zijn meer dieren (en dus meer cellen) nodig voor nauwkeurige tellingen. Bij het veranderen van ontwikkelingsfasen is het ook van cruciaal belang om de spijsverteringstijd te optimaliseren. Dit protocol is geoptimaliseerd voor 5 individuele 48 hpf embryo's per buis. Het verteren van meer volwassen embryo's zal waarschijnlijk langere tijd vergen.
Tijdens de procedure kunnen zich enkele mogelijke problemen voordoen. Als er geen fluorescentie wordt waargenomen, kan er een technisch probleem zijn met de cytometer dat moet worden opgelost. Om deze reden is het essentieel om te controleren of de embryo's fluorescerend zijn voordat de procedure begint door ze snel onder een microscoop te controleren. Een ander veel voorkomend probleem is het oververteren van de embryo's, waardoor de cellen worden vernietigd. Wees voorzichtig bij de spijsverteringsstap en verander de timing als er te veel dode cellen worden waargenomen.
Deze assays hebben een paar beperkingen. Het grootste probleem is dat deze assays afhankelijk zijn van de expressie van een transgene marker. Mogelijk weerspiegelt de verandering van de expressie van de transgene marker mogelijk niet de biologie van wat er in het embryo gebeurt. Bovendien is flowcytometrie mogelijk niet de beste methode om cellen te kwantificeren als de doelcelpopulatie extreem laag is. Om met deze mogelijkheden om te gaan, kunnen andere assays zoals in situ of histologische kleuringstechnieken worden gebruikt. Als er specifieke antilichamen bestaan voor het celtype van interesse, kan immunohistochie ook worden uitgevoerd. Embryo's kunnen ook worden onderworpen aan qRT-PCR om afstammingsspecifieke genen te meten, en als deze test wordt uitgevoerd op een FACS-machine, kunnen de cellen worden geïsoleerd en individueel worden bestudeerd met nog gevoeligere methoden. Met uitzondering van deze problemen kan deze kwantitatieve flow cytometrietest veel nuttige informatie genereren voor onderzoekers.
Met deze testen kunnen onderzoekers hematopoëtische defecten bij gewervelde dieren gemakkelijk waarnemen. Het wijzigen van genetische routes met MOs of CRISPR en vervolgens het uitvoeren van flowcytometrie om op te helderen of het gen een rol speelt bij hematopoiese kan snel worden gedaan en is kwantitatief. Bovendien kunnen voorwaartse genetische schermen (zolang de dieren een fluorescerend label hebben) worden uitgevoerd en defecten worden beoordeeld. Zebravissen zijn ook een uitstekend model geworden voor grootschalige medicijnschermen6,7,8,9,10, waardoor efficiënte geneesmiddelenscreeningstesten op levende organismen kunnen observeren of de geneesmiddelen effectief zijn en of ze negatieve effecten hebben op de ontwikkeling / overleving. Door deze test te koppelen aan geautomatiseerde flowcytometrietechnologie verbeterd door robotica, zou het nog efficiënter worden20,21,22, waardoor echt grootschalige analyse en screening mogelijk wordt van paden die belangrijk zijn voor het ontstaan, de groei en de regulatie van bloedcellen die onduidelijk blijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.L.S. is een wetenschappelijk adviseur en heeft compensatie ontvangen van Finless Foods, Inc. en Xytogen Biotech, Inc. K.F.R. verklaart geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
De financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health (NIH: R15 DK114732-01 aan D.L.S.), de National Science Foundation (NSF: MRI 1626406 tot D.L.S.), en van het Honor's Program aan california state university Chico (naar K.F.R.). De auteurs bedanken Betsey Tamietti voor laboratoriumbeheer en Kathy Johns voor administratieve hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 10 mm Polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| 5 ml Polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| BD FACSAria Fusion flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| DPBS (10x) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| Librease | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| SYTOX Red Dead Cell Stain | Invitrogen | S34859 |
References
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al.
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes & Development. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nature Chemical Biology. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Stachura, D. L., Traver, D.
- Berrun, A. C., Stachura, D. L. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (129), e56836 (2017).
- Westerfield, M., Zon, L. I., Detrich, H. W. III Essential Zebrafish Methods: Cell and Developmental Biology. , Academic Press. Cambridge, MA. (2009).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. I. 100, Elsevier. Boston, MA. 233-260 (2010).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, 1238-1246 (2003).
- Ganis, J. J., et al. Zebrafish globin switching occurs in two developmental stages and is controlled by the LCR. Developmental Biology. 366, 185-194 (2012).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, e1-e11 (2013).
- Ding, M., et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective. SLAS Discovery. 23, 719-731 (2018).
- Ding, M., Kaspersson, K., Murray, D., Bardelle, C. High-throughput flow cytometry for drug discovery: principles, applications, and case studies. Drug Discovery Today. 22, 1844-1850 (2017).
- Joslin, J., et al. A Fully Automated High-Throughput Flow Cytometry Screening System Enabling Phenotypic Drug Discovery. SLAS Discovery. 23, 697-707 (2018).
