Summary
Wir präsentieren ein In-vitro-Modell für Gefäßerkrankungen, um Vollblut-Wechselwirkungen mit patientenabgeleitetem Endothel zu untersuchen. Dieses System ermöglicht die Untersuchung der thrombogenen Eigenschaften der primären Endothelzellen unter verschiedenen Umständen. Das Verfahren eignet sich besonders zur Beurteilung der Thrombogenität und Antikoagulationstherapie in verschiedenen Phasen der Gerinnung.
Abstract
Die Bildung von Blutgerinnseln beinhaltet komplexe Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen, ihrer zugrunde liegenden Matrix, verschiedenen Blutzellen und Proteinen. Das Endothel ist die primäre Quelle vieler der wichtigsten hämostatischen Moleküle, die Thrombozytenaggregation, Gerinnung und Fibrinolyse steuern. Obwohl der Mechanismus der Thrombose seit Jahrzehnten untersucht wird, konzentrieren sich In-vitro-Studien hauptsächlich auf Situationen von Gefäßschäden, in denen die subendotheliale Matrix exponiert wird, oder auf Wechselwirkungen zwischen Zellen mit einzelnen Blutbestandteilen. Unsere Methode ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Vollblut und einem intakten, konfluenten Vaskulärenzellnetzwerk.
Durch die Verwendung primärer menschlicher Endothelzellen bietet dieses Protokoll die einzigartige Möglichkeit, den Einfluss von Endothelzellen auf die Thrombusdynamik zu untersuchen und gibt wertvolle Einblicke in die Pathophysiologie thrombotischer Erkrankungen. Die Verwendung von kundenspezifischen mikrofluidischen Strömungskanälen ermöglicht die Anwendung krankheitsspezifischer Gefäßgeometrien und modellspezifische morphologische Gefäßveränderungen. Die Entwicklung eines Thrombus wird in Echtzeit und quantitativ durch Thrombozytenhaftung und Fibrinablagerung charakterisiert. Die Wirkung der Endothelfunktion in der veränderten Thrombusdynamik wird durch Postanalyse durch Immunfluoreszenzfärbung bestimmter Moleküle bestimmt.
Die repräsentativen Ergebnisse beschreiben den Versuchsaufbau, die Datenerfassung und die Datenanalyse. Je nach Forschungsfrage können die Parameter für jeden Abschnitt angepasst werden, einschließlich Zelltyp, Scherraten, Kanalgeometrie, Medikamenttherapie und Postanalyseverfahren. Das Protokoll wird durch Quantifizierung der Thrombusbildung an der Lungenarterieendothel von Patienten mit chronischer thromboembolischer Erkrankung validiert.
Introduction
Das Endothel bildet die innere Zellschicht der Blutgefäße und trennt Blut vom umgebenden Gewebe. Es wurde als dynamisches Organ beschrieben, das seine Mikroumgebung aktiv reguliert und auf äußere Reize reagiert1. Aufgrund seines direkten Kontakts mit fließendem Blut ist das Endothel bei der Kontrolle von Hämostase und Thrombose von entscheidender Bedeutung und ist die primäre Quelle vieler der wichtigsten regulatorischen Moleküle, die Thrombozytenaggregation, Gerinnung und Fibrinolyse steuern2. Gesunde, nicht aktivierte Endothelzellen (EC) produzieren mehrere Moleküle, die der Thrombozytenaktivierung entgegenwirken und die Gerinnung und Thrombusbildung verhindern, um den Blutfluss aufrechtzuerhalten, wie Prostacyclin, Thrombomodulin oder Gewebefaktor-Signalweg-Inhibitor (TFPI)2,3. Dies verhindert die Haftung von Thrombozyten, Thrombozytenaggregation und Thrombusbildung. Die Verletzung oder Aktivierung der Gefäßwand führt zu einem prokoagulanen endothelialen Phänotyp, der lokalisierte Thrombozytenhaftung und Gerinnselbildung2,4initiiert. Bei endotheliale Aktivierungsplättchen haften sie an von Willebrand Factor (VWF), einem multimerischen Protein, das aus ECs freigesetzt wird, oder an exponierten Bindungsstellen der zugrunde liegenden subendotheliaalen Matrix. Anschließend initiieren molekulare Veränderungen in Thrombozyten und die Exposition gegenüber dem Gewebefaktor (TF) die Aktivierung des Gerinnungssystems, das die Thrombusbildung durch Fibrinpolymerisation5,6induziert. Zusammen bildet das resultierende Gerinnsel die Grundlage für den Wundverschluss durch Reendothelialisierung7. Störungen des Gerinnungssystems können zu Blutungsstörungen wie der von Willebrand-Krankheit, Hämophilie oder Thrombose führen, die oft aus einem dysregulierten pro- und antithrombotischen Gleichgewicht des endotheliaalen hämostatischen Weges2,3resultieren.
Der Prozess der Hämostase tritt sowohl in der arteriellen als auch in der venösen Zirkulation auf. Die Mechanismen, die der arteriellen und venösen Thrombose zugrunde liegen, unterscheiden sich jedoch grundlegend. Während die arterielle Thrombose, wie sie bei ischämischen Herzerkrankungen zu beobachten ist, hauptsächlich durch den Bruch einer atherosklerotischen Plaque unter Bedingungen hoher Scherspannung angetrieben wird, entwickelt sich venöse Thrombose meist in Abwesenheit einer endotheliale Verletzung in einem Zustand der Stasi8,9,10. Ein tiefer Venenthrombus kann sich verminnen und in Richtung der Lungenarterien reisen, wo er eine Lungenembolie verursacht. Dies kann zu chronischen gefäßvaskulären Obstruktionen führen, die zu signifikanten Beeinträchtigungen der funktionellen Fähigkeiten führen, die die Entwicklung von chonischen Lungenerkrankungen, einschließlich der Entwicklung von chronischer thromboembolischer pulmonaler Hypertonie (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH zeichnet sich durch erhöhten Lungendruck aufgrund von Verstopfungen der Lungenarterien durch thromboembolisches Material nach mindestens drei Monaten Antikoagulationstherapie15aus. Neben Lungenemboli wird postuliert, dass das lungene Endothel eine prothrombotische Umgebung in CTEPH bietet, die in situ Thrombose und chronische Obstruktionen der Lungenarterien erleichtert, was zu einem Anstieg des Blutdrucks führt, der letztlich zu Herzinsuffizienz führen kann, wenn es unbehandelt16,17.
In den letzten Jahren haben verschiedene Studien zur Entwicklung von Assays zur Untersuchung der Thrombusbildung durch Messung der Thrombozytenfunktion und Gerinnung18geführt. Die meisten von ihnen untersuchen jedoch entweder die Wechselwirkung von Vollblut mit einzelnen extrazellulären Matrixkomponenten wie Kollagenoder oder Fibrasen oder die endotheliale Funktion in Wechselwirkung mit einzelnen Blutbestandteilen, wie Endothel-Thrombolet oder Endothel-Leukozyten-Wechselwirkung19,20,21,22. Diese Assays werden am häufigsten mit menschlichen Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVEC) durchgeführt, da diese Zellen leicht erhalten werden können. Hämostatische Gene werden jedoch differenziell über den Gefäßbaum, Gefäßtypen und Organsysteme23,24, exprimiert, was die Verwendung von HUVECs zur Darstellung von Endothelzellen, die an arterieller Thrombose oder Lungenembolien beteiligt sind, problematisch macht23.
Neben der EC-Plastizität können krankheitsspezifische hämodynamische Veränderungen und Veränderungen in der Gefäßmorphologie die Thrombusbildung am normalen Endothel25fördern. Höhere Scherraten, z. B. aufgrund lokaler Vasokonstriktionen oder Veränderungen der Gefäßgeometrie, können zu einer akuten Thrombusbildung führen, was zu einer Stenose führt, die die Einstellung des Blutflusses beschleunigt26. Die Verwendung von maßgeschneiderten mikrotechnischen Durchflusskanälen ermöglicht es, speziell Gefäßgeometrien zu entwerfen, die repräsentativ für die (Patho-)Biologie sind. Auf diese Weise ist es möglich, die Wirkung lokaler biomechanischer Kräfte auf gesunde oder erkrankte EC27zu untersuchen.
Es gibt Antikoagulationstherapien für die Ausrichtung auf verschiedene Phasen und Moleküle in der Gerinnungskaskade, die alle besondere Risiken und Vorteile darstellen, die für bestimmte Störungen spezifisch sein können. Der in diesem Papier beschriebene Ansatz der Krankheitsmodellierung eignet sich besonders, um die Auswirkungen verschiedener Antikoagulations- und Thrombozytentherapien auf die Thrombusdynamik zu testen.
Ziel ist es, ein Thrombosemodell zu präsentieren, das primäre ECs umfasst und ein vielseitiges Modell liefert, das für die Analyse verschiedener Formen der Thrombose geeignet ist, abhängig von der Art der verwendeten primären ECs. Zur Veranschaulichung verwendeten wir pulmonale Arterien-Endothelzellen von CTEPH-Patienten in Wechselwirkung mit ganzem menschlichen Blut, das alle an der Thrombusbildung beteiligten Komponenten (Thrombozyten, Leukozyten, Erythrozyten, Gerinnungsproteine und Kofaktoren) enthält. Dieser Ansatz kann in kommerziellen Parallelflusskanälen oder in kundenspezifischen mikrofluidischen Durchflusskanälen mit einem spezifischen vaskulären Design angewendet werden. Als solches kann das Modell schließlich in der Untersuchung der Thrombusbildung und -auflösung, für die Beurteilung von Entzündungsreaktionen bei der Krankheitsmodellierung, für die Thrombozyten- oder Antikoagulationstherapie und letztlich für die personalisierte Medizin verwendet werden.
Diese Studie beschreibt die Isolierung der primären menschlichen Lungenarterieen-Endothelzellen. Für die Isolierung anderer primärer menschlicher Endothelzelltypen beziehen wir uns auf zuvor veröffentlichte Methoden, einschließlich pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen25, menschlicher Nabelvenenenenen-Endothelzellen28und blutzirkulierender endothelialer Koloniebildender Zellen Abbildung 1A29.
Protocol
Diese Studie wurde vom institutionellen Medical Ethical Review Board des VU Medical Center Amsterdam, Niederlande (METC VUmc, NL69167.029.19) genehmigt. Die primäre Zellisolierung und Blutentnahme von Menschlichen Probanden wurde durchgeführt, nachdem gemäß der Erklärung von Helsinki eine schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage eingeholt worden war.
1. Isolierung und Kultur der primären menschlichen pulmonalen arteriellen Endothelzellen (PAEC)
- Warmes komplettes Endothelzellmedium (cECM) ergänzt durch 5% fetales Rinderserum (FBS), 1% Penicillin/Streptomycin (P/S), 1% Endothelzellwachstumsergänzungen (ECGS) und 1% nicht essentielle Aminosäuren (NEAA) in einem Wasserbad bei 37 °C. Sterilisieren Sie chirurgische Schere, Zange und ein Skalpell entweder mit einem 120 °C Wärmesterilisator oder 70% Ethanol. Führen Sie die Isolierung von PAEC in einem laminaren Strömungsschrank unter sterilen Bedingungen durch.
- Beschichten Sie eine hochgradig affinitätsgebundene 60-mm-Zellkulturschale (siehe Materialtabelle)mit 2 ml 5 g/ml Fibronectin und inkubieren Sie bei 37 °C für mindestens 15 min.
- Lungenarterie (PA) Gewebe aus der Chirurgie(z.B.,Lobektomie oder pulmonale Endarterektomie) zu erhalten, in 4 °C Kaltkabelpuffer (4 mM Kaliumchlorid, 140 mM Natriumchlorid, 10 mM HEPES, 11 mM D-Glucose und 1% P/S, pH = 7,3) aufEis zu halten und bis zur Isolierung auf Eis zu halten.
- Isolieren Sie Endothelzellen von PA innerhalb von 2 h nach Dergewebeentfernung. Nehmen Sie die PA mit Zange und legen Sie es in eine 10 cm Petrischale mit PBS zu waschen. Wenn die PA noch ein Ring ist, schneiden Sie die Lungenarterie mit einer Schere auf. Achten Sie sehr darauf, die innerste Schicht des Gefäßes nicht mit den Werkzeugen zu berühren, da das Endothel leicht beschädigt und/oder entfernt wird.
- Entfernen Sie das Fibronectin aus der Zellkulturschale und fügen Sie 4 ml cECM-Medium hinzu.
- Nehmen Sie das PA-Gewebe mit Zangen und legen Sie es in das Medium. In der Zwischenzeit die innere Schicht des Gefäßes vorsichtig mit einem Skalpell in das Medium kratzen. Oft sind Lipidansammlungen in der Gefäßwand zu sehen. Versuchen Sie, diese wegzulassen, da sie das Zellwachstum beeinflussen.
- Halten Sie die Zellen in kultur, bis kleine Kolonien von Endothelzellen erscheinen.
- Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag. Wenn Fibroblasten die Kultur verunreinigen, reinigen Sie sie mit magnetischer Affinitätszelltrennung für CD144 mit einem Kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie die zweispaltige Methode für die anfängliche Reinigung und die einspaltige Methode für jede aufeinanderfolgende Reinigung. Im Allgemeinen wird eine Kultur rein definiert, wenn die Durchflusszytometrie ≤10% kontaminierenden Zellen erkennt.
- Split-Zellen in Verhältnissen von 1:3 bis 1:4, bis genügend PAECs für den experimentellen Einsatz angebaut werden. Wenn PAECs einsatzbereit sind, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
- Nach der Reinigung müssen primäre Endothelzellen für das Vorhandensein von EC-spezifischen Markern(z.B.VE-Cadherin, CD31, TIE2) und für das Fehlen glatter Muskelzellen (α-SMA), Fibroblasten (Vimentin) und epitheliale (Cytokeratin)-Marker(Abbildung 1B)charakterisiert werden.
2. Vorbereitung von Strömungskammern und PAEC-Monolayern
ANMERKUNG: Je nach Hypothese verwenden Sie entweder die handelsüblichen Durchflusskammern (siehe Materialtabelle und Abbildung 1C Option A, Schritt 2.1 des Protokolls) oder eine maßgeschneiderte mikrofluidische Durchflusskammer(Abbildung 1C OptionB, Schritt 2.2 des Protokolls).
- Zellsaatierung von endotheliaalen Monolayern in handelsüblichen Mikrorutschen
HINWEIS: Handelsübliche Durchflusskammern sind einfach zu bedienen und bieten ein laminares Strömungsmuster im gesamten Kanal, das bei hohen Scherraten verwendet werden kann. Diese Mikrorutschen sind so konzipiert, dass sie Parallelläufe mit mehreren Kanälen ermöglichen und ein genaues und reproduzierbares Strömungsprofil bieten. Da sie für die invertierte Mikroskopie optimiert sind, ist es möglich, hochwertige fluoreszierende Bilder zu erfassen. Darüber hinaus sind verschiedene Abmessungen von Strömungskammern in verschiedenen Kanalgrößen oder Geometrien erhältlich. Die 6-Well-Flow-Kanäle werden für diesen Test bevorzugt, da diese Mikrorutschen kleine Abmessungen haben und multiparallele Durchläufe ermöglichen.- Um einen Kanal eines 6-Well-Flow-Schlittens (3,5 mm Breite x 0,4 mm Höhe x 17 mm Länge) zu beschichten, verwenden Sie 30 l 0,1% Gelatine pro Kanal und inkubieren bei 37 °C für mindestens 15 min.
- Um einen Kanal auszusäen, versuchen Sie 10 cm2 konfluente PAECs und drehen Sie bei 300 x g für 7 min bei Raumtemperatur (RT) nach unten.
- Suspend PAECs in 600 l cECM und Pipette 100 l (1,5 cm2 ) Zellsuspension in einem Kanal. Dies deckt den Mikrorutsch durch Kapillarwirkung ab. Wenn es zu langsam wird, bilden sich Luftblasen. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, indem Sie ein wenig mehr Kraft beim Pipetieren verwenden.
HINWEIS: Die Zelldichte beeinflusst den endotheliale Phänotyp. Insgesamt 1,5 cm2 konfluente Zellen pro Kanal sind überkonfluent, da der Kanal eine Oberfläche von 0,6 cm2hat. Vor Beginn des Experiments, Kultur diese Zellen für weitere 6 Tage innerhalb der Kanäle, bis sie maximale Konfluenz erreichen. - Fügen Sie dem Kanal weitere 50 l cECM hinzu, um ein ausreichendes Medium für die nächtliche Inkubation bei 37 °C, 5%CO2bereitzustellen. Ändern Sie das Medium am nächsten Tag, um ungebundene Zellen wegzuwaschen.
- Halten Sie die Zellen 6 Tage lang bei 37 °C, 5%CO2, damit die PAEC eine feste, konfluente Monoschicht bilden kann. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag mit 150 l cECM.
- Behandeln Sie am 7. Tag das PAEC mit 100 l mit 1 'M Histamin in ECM und 1% FBS ohne andere Zusatzstoffe für 30 min vor dem Test. Der Stimulus kann ad libitumgewählt werden. Zum Beispiel, TNF-α wurde häufig als entzündliche Aktivator verwendet.
- Vorbereitung von kundenspezifischen mikrofluidischen Durchflusskammern
HINWEIS: Maßgeschneiderte Durchflusskammern werden an die Bedürfnisse des Benutzers angepasst, da die Abmessungen und Geometrien leicht nach Präferenz geändert werden können. Um beispielsweise ein physiologisch relevanteres Gefäß nachzuahmen, kann eine Stenose eingeführt werden (Abbildung 1D). Dieser Ansatz ermöglicht die Verwendung von sehr kleinen Blutmengen, wie sie bei mikrovaskulären Erkrankungen beobachtet werden.- Weiche Lithographie von Polydimethylsiloxan (PDMS) mit gemusterten Wafern
- Kombinieren Sie PDMS-Härtungsmittel und Prepolymer auf einer Mikrowaage im Verhältnis 1:10 und mischen Sie sie gründlich mit einem Allzweck-Labormischer.
- Um die resultierenden Luftblasen zu entfernen, entgasen Sie das PDMS in einem Trockengerät für ca. 1 h.
- Eine Glas-Petrischale mit Aluminiumfolie auslegen und ein paar Tröpfchen Wasser hinzufügen, bevor Sie den Wafer in die gefütterte Petrischale legen. Der Wafer dient als Form für den kundenspezifischen Kanal.
HINWEIS: Die Wafer oder Formen werden von den Reinraumeinrichtungen zur Verfügung gestellt. Negativer Photoresist wird auf Wafer gemustert, um hervorstehende kanalähnliche Features mit den folgenden typischen Abmessungen zu erzeugen: 300 m Breite x 270 m Höhe x 14 mm Länge. - Gießen Sie das entgaste PDMS auf den Wafer, der in eine gläserne Petrischale gelegt wird.
- Degas das PDMS auf den Wafer in einem Trockenturm für weitere 15 min gegossen, um alle Blasen zu entfernen, die während des Gießens gebildet haben könnten.
- Entfernen Sie die Petrischale mit der Form und DEM PDMS aus dem Trockenschrank und legen Sie sie mindestens 4 h in einen 60 °C-Ofen, um das PDMS miteinander zu vernetzen.
- Vorbereitung vernetzter PDMS zum Verkleben an Glasschlitten
- Entfernen Sie Form und vernetztes PDMS aus dem Ofen und bewegen Sie sich auf eine Querstromhaube für eine staubfreie Handhabung des PDMS.
- Entfernen Sie jedes PDMS von der Unterseite der Form mit einem Skalpell und entfernen Sie die obere Platte des vernetzten PDMS aus der Form.
- Säen Sie die freiliegende gemusterte PDMS-Platte mit Klebeband, um zu verhindern, dass Staubpartikel mit den PDMS-Kanälen in Kontakt kommen.
- Schneiden Sie die PDMS-Chips auf größe und stanzen Sie Einlässe und Auslässe mit einem Biopsie-Stanz von 1 mm Durchmesser.
- Sterilisation und Verklebung von mikrofluidischen PDMS-Kanälen und Glasgleitern
- Saubere Glasmikroskopie gleitet durch gründlicheSpülen mit Ethanol gefolgt von einer Isopropylalkoholspülung. Nach jeder Spüle die Rutschen mit einer Stickstoffpistole gründlich trocknen.
HINWEIS: Alternativ können Deckschbelege verwendet werden, wenn die Analyse mit einem konfokalen Mikroskop durchgeführt wird. - Öffnen Sie die Plasmakammer und laden Sie die gereinigten Mikroskopien und mikrofluidischen Chips ohne Schutzband.
- Schließen Sie die Kammer, spülen Sie sie 1 min mit Stickstoff und füllen Sie die Kammer mit gefilterter Luft, bis ein Druck von 500 mTorr erreicht ist.
- Setzen Sie die Glasgische und PDMS-Chips mit einer Leistung von 50 W und einer Frequenz von 5 kHz 40 s dem Plasma aus.
- Nach der Exposition gegenüber dem Plasma die Glasgletten und mikrofluidischen Chips sofort verkleben. Bewahren Sie die Geräte in sterilen Petrischalen auf.
- Saubere Glasmikroskopie gleitet durch gründlicheSpülen mit Ethanol gefolgt von einer Isopropylalkoholspülung. Nach jeder Spüle die Rutschen mit einer Stickstoffpistole gründlich trocknen.
- Weiche Lithographie von Polydimethylsiloxan (PDMS) mit gemusterten Wafern
- Zellsaatierung von endotheliaalen Monolayern in mikrofluidischen Kanälen
- Beschichten Sie den maßgeschneiderten Mikrokanal, indem Sie 10 l 0,1 mg/ml Kollagen Typ I oder 0,1% Gelatine pro Kanal pipetieren und 30 min bei 37 °C inkubieren.
- Um vier Mikrokanäle auszusäen, versuchen Sie 25 cm2 konfluente PAECs und drehen Sie bei 300 x g für 7 min bei RT.
HINWEIS: Nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen haftet an der Oberfläche. Daher ist es notwendig, einen Überschuss an Zellen zu verwenden, um eine konfluente Monoschicht zu erreichen. - Suspendieren Sie DIE PAECs in 20 l cECM und verwenden Sie für jeden Kanal 5 l Zellsuspension. Aufgrund der geringen Kanalabmessungen füllen die Kapillarkräfte den Mikrorutsch und verhindern die Bildung von Luftblasen.
- Wechseln Sie das Medium nach 3-4 h, um ungebundene Zellen zu waschen.
- Bewahren Sie die Zellen 6 Tage lang in Kultur auf, damit die PAEC eine feste, konfluente Monoschicht bilden kann. Aufgrund des geringen Volumens können Sie das Medium täglich mit 150 l cECM wechseln. Lassen Sie die Pipettenspitze mit Medium im Einlass gefüllt und legen Sie eine leere Spitze in den Auslass. Dies wird als Reservoir dienen, das den Zellen ausreichende Nährstoffe und Wachstumsfaktoren liefert und verhindert, dass der Schlitten austrocknet.
- Am 7. Tag die Kerne in den lebenden Zellen mit Hoechst (1:5.000 in cECM) färben und maximal 10 min bei 37 °C und 5%CO2bebrüten.
- 3x mit cECM sorgfältig waschen und vor dem Test mit 1 M Histamin in ECM + 1% FBS 30 min behandeln. Der Stimulus kann ad libitumgewählt werden. Zum Beispiel, TNF-α wurde häufig als entzündliche Aktivator verwendet.
- Verwenden Sie 1,27 mm Durchmesser 90° abgewinkelte Edelstahl-Steckverbinder, um den Auslass der PDMS-Chips an Schläuche anzuschließen.
3. Vorbereitung des menschlichen Vollbluts
- Ziehen Sie venöses Blut von Probanden in 0,109 M Natriumcitrat-Gerinnungsmittel. Dies kann von gesunden oder erkrankten Probanden stammen, die keine Antikoagulationsbehandlung erhalten. Umkehren Sie vorsichtig die Rohre zu mischen. Die Gesamtmenge an Blut, die für ein Experiment benötigt wird, hängt hauptsächlich von der gewählten Durchflussmenge ab. Bei einem Durchfluss von 25 ml/h, bei ibidi 6-Well-Dias, ist ein Gesamtvolumen von 2 ml mit etwas Überschuss zum Auffüllen von Wannen und Durchflusskanal ausreichend.
- Übertragen Sie das Blut in ein 50 ml-Röhrchen und fügen Sie Calcein AM (1:10.000) in fluoreszierend beschriftete Blutzellen und Alexa488-Fibrinogen (15 g/ml) zu konjugierenautotoxiertem Fibrinogen. Lassen Sie das Blut bei 37 °C für 15 min brüten, um eine vollständige Absorption zu ermöglichen.
- Verdünnen Sie das Blut 1:1 mit dem Entkalkungspuffer (154 mM Natriumchlorid, 10,8 mM Trinatriumcitrat, 2,5 mM Calciumchlorid und 2 mM Magnesiumchlorid) unmittelbar vor Beginn des Experiments.
HINWEIS: Hämodilution mit einem Maximum von 50% hatte keinen Einfluss auf die Gerinnungsreaktionszeit30. Darüber hinaus kann menschliches Blut Viren und andere Wirkstoffe enthalten. Die Arbeit mit Blutproben birgt daher das Risiko einer Infektion. Es wird dringend empfohlen, geeignete Sicherheitsmaßnahmen zu treffen und mit dem Material mit Sorgfalt umzugehen.
4. Montage des Strömungssystems
- Vor dem Anschluss der Schläuche die Durchflussrohre mit einer 20 ml Spritze, gefüllt mit Waschpuffer (36 mM Zitronensäure, 103 mM Natriumchlorid, 5 mM Kaliumchlorid, 5 mM EDTA und 0,35 % Gew/Winim-Serumalbumin [BSA], pH = 6,5), um die Blutgerinnung in den Röhrchen zu verhindern, spülen.
- Verwenden Sie eine neue Spritze, um die Durchflussrohre mit HEPES-Puffer (132 mM Natriumchlorid, 20 mM HEPES, 6 mM Kaliumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid, 1% BSA und 5,5 mM D-Glucose, pH = 7,4) zu füllen und vorsichtig mit einem bogenförmigen Luer-Stecker mit dem mikroslide gefüllten Mikroslide in Medium zu verbinden. Versuchen Sie beim Anbringen der Anschlüsse an die Mikrokanäle, die Bildung von Luftblasen im Dia zu verhindern. Blasen beschädigen das Endothel und beeinflussen die Ergebnisse Ihres Experiments. Entfernen Sie den Waschpuffer vollständig und lassen Sie den Puffer nicht mit den Zellen in Kontakt kommen, da dies die Gerinnung hemmt.
- Richten Sie das Durchflusssystem ein, wie in Abbildung 1Edargestellt. Nehmen Sie 2 ml Waschpuffer in einer 20 ml Spritze auf und spülen Sie sie ab, um eine Gerinnung zu verhindern, wenn das Blut in die Spritze gelangt. Setzen Sie die leere Spritze in die Spritzenpumpe ein und schließen Sie das Auslassrohr mit einem weiblichen Luer-Stecker an diese Spritze an. Legen Sie das Einlassrohr in einen Behälter mit dem vorbereiteten menschlichen Blut.
- Schalten Sie die Spritzenpumpe ein und berechnen Sie den Durchfluss. Strömungsprofile folgen einem parabolischen Muster in der Höhe. Unter der Annahme, dass das Blut als Newtonsche Flüssigkeit wirkt, verwenden Sie die folgende Formel, um die Durchflussrate zu berechnen.
(Gleichung 1)
Wo
• = Scherspannung
η = dynamische Viskosität
Q = Volumenstrom
h = Kanalhöhe
w = Kanalbreite
HINWEIS: Für den pulmonalen Arterienfluss mit Blut in den kommerziellen 6-Kanal-Mikrorutschen mit rechteckigen Abmessungen mit 0,4 mm Höhe und 3,5 mm Breite wurde für 5 min eine Volumendurchflussrate von 25 ml/h verwendet. Aufgrund der unterschiedlichen Abmessungen der kundenspezifischen Strömungskanäle wird sich diese Dynamik ebenfalls ändern. Passen Sie die Variablen an, um sicherzustellen, dass die Scherspannung gleich ist. - Definieren Sie den Durchmesser der 20 ml Spritze auf 19,05 mm und stellen Sie das Programm auf Zurückziehenein. Das Ziehen des Blutes durch den zellbeschichteten Kanal durch die Anwendung eines Unterdrucks garantiert konstante Scherraten und minimale Schäden an der Zellschicht.
(Gleichung 1)
5. Einrichten des Mikroskops für die Bildaufnahme
- Verwenden Sie ein 20-faches Objektiv und legen Sie den Mikroschlitten auf die Stufe des invertierten Phasenkontrastfluoreszenzmikroskops. Starten Sie die Mikroskop-Software, um die Bühne in Z-Richtung zu bewegen, um sich auf die Zellmonoschicht zu konzentrieren.
- Wählen Sie einen Bereich von Interesse (ROI) am Anfang, in der Mitte und am Ende jedes Flusskanals aus. Der Anfang und das Ende sollten mindestens 3 mm vom Ein- und Auslass des Kanals entfernt sein. Stellen Sie die blauen, grünen und roten Leuchtstofffilter mit einer Laserleistung und Lichtintensität ein, die einen minimalen Hintergrund anzeigt.
6. Perfusion von Vollblut über PAECs
- Nachdem alles wie in Abbildung 1E verbunden ist und das Mikroskop für die Aufnahme bereit ist, drücken Sie Start, um ein Video aufzunehmen. Drücken Sie Start auf der Spritzenpumpe, um das Blut über das Endothel zu durchdringen.
- Sobald das Blut über das Endothel fließt, erfassen Sie Bilder mit den vorgewählten aktiven Kanälen und ROI-Positionen alle 15 s für 5 min.
- Nach 5 min Perfusion die Aufnahme beenden und die Spritzenpumpe stoppen. Zerlegen Sie die Strömungskammer und entfernen Sie die Schläuche sehr sorgfältig. Oft bildet sich eine Luftblase, wenn dies mit zu viel Kraft geschieht. Versuchen Sie, dies zu verhindern, weil dies das Endothel wegspülen wird.
7. Fixierung und Nachanalyse
ANMERKUNG: Um eine falsch positive Thrombozytenhaftung durch endotheliale Schäden durch das Perfusionsexperiment auszuschließen, ist es notwendig, die Endothelzellen für ihre Spaltbildung und Monoschicht zu charakterisieren. Dies kann durch regelmäßige Immunfluoreszenzfärbung für VE-Cadherin erfolgen.
- Waschen Sie nach Perfusion und Demontage der Schläuche den mikrofluidischen Kanal mit HEPES. Pipette HEPES in den Kanal, so dass es das Blut an den Ausgang schieben wird. Entfernen Sie den Überschuss mit einer anderen Pipette.
- Optional den Kanal mit PBS++ (mit 0,5 mM Magnesiumchlorid und 0,9 mM Calciumchlorid) waschen, um die Ausfällung von Proteinüberstand zu verhindern. Dies reduziert den Hintergrund. Ein zusätzlicher Waschschritt kann jedoch das Zellverhalten und die Morphologie verändern, die die Bildgebung nach der Analyse beeinflussen könnten.
- Entfernen Sie die HEPES und fixieren Sie das Endothel mit aufhaftenden Thrombozyten und abgelagertem Fibrin, indem Sie 37 °C erwärmtes 4% Paraformaldehyd (PFA) in den Kanal pfeifen und 15 min bei RT brüten.
HINWEIS: Seien Sie besonders vorsichtig bei der Befestigung der maßgeschneiderten Mikrofluidik, da diese Kanäle noch kleiner sind, was bei jedem Handhabungsschritt zu höheren Scherkräften im Kanal führt. - Entfernen Sie die PFA aus dem Kanal und waschen Sie 3x mit PBS. Die Mikrorutschen sind nun bereit für ein Standard-Färbeprotokoll zur Charakterisierung von Endothelzellmarkern wie VE-Cadherin, CD31, P-Selectin oder Integrine, CD42b für haftende Thrombozyten oder CD45 für Leukozyten.
- Nach der Färbung nehmen Sie mindestens fünf Bilder mit einem regelmäßigen konfokalen Mikroskop, um die Kolokalisierung zu charakterisieren.
8. Bildanalyse
- Öffnen Sie ein Flow-Assay-Bild, das entweder fluoreszierend markierte Thrombozyten oder fluoreszierendes Fibrin in ImageJ enthält. Ziehen Sie das Bild der Wahl nach ImageJ.
- Das Bild wird in RGB-Farbe aufgenommen. Für die Analyse wird ein 8-Bit-Bild bevorzugt, also transformieren Sie das Bild in 8-Bit: Bild | Typ | 8-Bit.
- Um den Hintergrund zu minimieren, subtrahieren Sie mit einem gleitenden Paraboloid, wobei eine rollende Kugel lokal Hintergrundpixel vom Originalbild berechnet und subtrahiert: Prozess | Subtrahieren Hintergrund | Rolling Ball Radius = 50 Pixel | Gleitendes Paraboloid.
HINWEIS: Die Bildgröße ist in Pixel definiert. Um die Fläche zu messen, ist es jedoch notwendig, die Skala festzulegen. Wenn die Bilder mit einem 20-fachen Objektiv mit einer numerischen Blende von 0,45 aufgenommen werden, hat das Mikroskop eine Skala von 2 Pixelpro-Meter. Meistens werden die zum Festlegen der Skala erforderlichen Informationen in den Metadaten des Bildes gespeichert und können automatisch von ImageJ: Analyze | Set Scale. - Legen Sie einen Schwellenwert fest, um aufgehaltene Thrombozyten oder abgelagertes Fibrin zu definieren. Verwenden Sie die Triangle-Methode, und der Schwellenwert wird automatisch angepasst: Bild | Anpassen | Schwellenwert.
- Analysieren Sie den Bereich, der von den Thrombozyten oder Fibrin abgedeckt wird, mit dem Befehl Partikel analysieren. Stellen Sie die Größe auf 2-Infinity ein, da die minimale Größe eines Thrombozytens 2 m beträgt: Analysieren | Analysieren von Partikeln.
- Die Ergebnisse liefern die Gesamtfläche in m2, mit der durchschnittlichen Größe der Aggregate in2 m und dem Prozentsatz der abgedeckten Fläche.
Representative Results
Die repräsentativen Ergebnisse können in drei Teile unterteilt werden, die jeweils die jeweiligen Schritte des Versuchsaufbaus, der Datenerfassung und der Datenanalyse darstellen. Je nach Forschungsfrage können die Parameter für jeden Schritt geändert werden. Die vorgestellten Daten werden angewendet, um den Einfluss des Endothels auf die Thrombusbildung zu untersuchen.
Experimentelle Einrichtung
Es ist allgemein bekannt, dass Endothelzellen in Struktur und Funktion, je nach Ort und Zeit, während Gesundheit und Krankheit sehr heterogen sind23. Verschiedene Quellen von Endothelzellen können verwendet werden, um die Endothel-Blut-Wechselwirkung zu untersuchen, die in diesem Fall kommerziell erhältliche HUVECs und PAECs waren (Abbildung 1A). HUVECs wurden am häufigsten in Labormodellen verwendet, während PAECs von Patienten abgeleitete isolierte Zellen aus den Lungenarterien sind. Darüber hinaus gibt es etablierte Protokolle zur Isolierung mikrovaskulärer Endothelzellen (MVEC) aus der Lungenzirkulation oder blutzirkulierenden endothelialen koloniebildenden Zellen (ECFC)25,28,29.
Nach der Isolierung wurden Endothelzellen durch VE-Cadherin-, CD31- und TIE2-Färbung charakterisiert, um einen endotheliaalen Phänotyp zu bestätigen. Die Charakterisierung des Vorhandenseins von SMA und Cytokeratin deutete auf das Fehlen eines Fibroblasten oder epitheliaalähnlichen Phänotyps hin (Abbildung 1B). Nach dem Erhalt einer hochreinen Population von ECs wurden Durchgangszellen 3–5 verwendet, um entweder einen kommerziellen Mikrorutsch oder maßgeschneiderte mikrofluidische Durchflusskanäle auszusäen (Abbildung 1C). Während es sich bei den handelsüblichen Mikrorutschen in erster Linie um parallele Strömungskammern oder Y-förmige Kanäle mit speziell definierten Parametern in Höhe oder Bifurkationswinkel handelt, ermöglicht der Einsatz mikrofluidischer Dias die Anpassung der experimentellen Parameter an die In-vivo-Gefäßgeometrie und die Durchblutungsdynamik31. Jedoch, maßgeschneiderte mikrofluidische Größen sind kleiner und neigen dazu, Zellausbreitung zu begrenzen und mehr Zelltodinduzieren 32,33. Die Verwendung eines Überschusses an Zellen kompensiert die Tatsache, dass nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen haftet. Dies wurde beobachtet, wenn eine Stenose eingeführt wurde, wo Endothelzellen einen längeren Phänotyp im Vergleich zu einem parallelen mikrofluidischen Kanal zeigten (Abbildung 1D). Kommerzielle Strömungskammern haben eine größere Oberfläche, an die Zellen binden können. Dies erfordert weniger Zellennummern für die Aussaat.
Um die Endothelzell-Blut-Interaktion zu untersuchen, wurde Vollblut über eine endotheliale Monoschicht durchdrushandelt. Citriertes Blut wurde am Tag des Experiments und unmittelbar vor perfusion recalcified gesammelt. Die Zellen wurden mit Histamin stimuliert, um die FREISETZUNG von VWF und die Thrombozytenhaftung 30 min vor der Perfusion zu induzieren (Abbildung 1E)34,35. Aufgrund der geringen Abmessungen erlaubten die maßgeschneiderten mikrofluidischen Kanäle die Verwendung kleinerer Blutmengen.
Datenerfassung
Zur Untersuchung der Thrombusbildung auf PAECs wurden Calcein AM-Red fluoreszierend blutzellen und Alexa488-konjugiertes Fibrin 5 min bei 2,5 Dyne/cm2 durchdrungen (Abbildung 2A–C). Anhaftete Blutzellen und abgelagertes Fibrin wurden quantifiziert. Die Bilder wurden alle 30 s aufgenommen und mit ImageJ quantifiziert. Es war wichtig, den Hintergrund zu subtrahieren, um die Autofluoreszenz von nicht haftenden Thrombozyten zu beseitigen. Der Dreiecksalgorithmus für schwellenwertende Schwellenwerte wurde verwendet, um minimalen Hintergrund zu definieren. Es ermöglichte die Messung von kleinen Thrombozytenaggregaten (Abbildung 2D).
Voraussichtlich gab es unter nicht stimulierten Bedingungen keine Bindung von Thrombozyten und Fibrin an das Endothel. Um die Freisetzung und Thrombozytenbindung von VWF zu fördern, wurden PAECs mit Histamin stimuliert, was zu einer sofortigen Erhöhung der Thrombozytenhaftung führte, die nach 2,5 min ein Plateau erreichte. Zu dieser Zeit begannen Thrombozyten, autokrine Faktoren zu sezernieren, die Thrombozytenaggregation und fibrinogene Spaltung in Fibrin induzierten. Fibrin wurde nach 3 min abgelagert und bildete nach 4 min ein stabiles Aggregat mit Thrombozyten(Abbildung 2E).
Um zu untersuchen, ob dieser Effekt durch ein direktes orales Antikoagulans (DOAC) gehemmt werden könnte, wurde Blut mit 10 nM Dabigatran behandelt. Dabigatran wurde der Blutverdünnung zugesetzt, wo es Faktor IIa im Gerinnungsweg hemmt und die Spaltung von Fibrinogen verhindert, um Fibrinfasern zu bilden. Wenn dabigatran-behandeltes Blut über stimulierten PAECs durchdrungen wurde, konnte die Gerinnselbildung direkt durch verzögerungsende Fibrinablagerungen gehemmt werden (Abbildung 2F).
Datenanalyse
Um den Einfluss verschiedener Endothelquellen auf die Thrombusbildung zu untersuchen, wurden die zellulären Veränderungen bei 5 min Blutperfusion analysiert. Das Endothel wurde fixiert und die anhaftenden Thrombozyten mit CD42b beschriftet, bevor es unter einem konfokalen Mikroskop gezwickt wurde. Dies lieferte eine detaillierte Analyse für die Kolokalisierung von Blutplättchen und Fibrin, die dysfunktionale Gerinnungsfaktoren im Blut anzeigen könnte. Der Einfluss der EG bei der Gerinnselbildung wurde durch standardimmunfluoreszierende Färbung bestimmt. Endotheliale Zell-Zell-Kontakte wurden aufrechterhalten, wie durch VE-Cadherin-Färbung bestätigt,was darauf hindeutet, dass die Blutgerinnsel auf der Oberseite der endotheliale Monoschicht und nicht auf der zugrunde liegenden Matrix zwischen endotheliaalen Lücken gebildet wurden (Abbildung 3). Darüber hinaus führte die Verwendung verschiedener Zellquellen zu unterschiedlichen Thrombenmustern, die sich auf dem Endothel bildeten. HUVECs sind venöse Endothelzellen und zeigten eine begrenzte Thrombozytenhaftung und Fibrinabscheidung, während kranke primäre PAEC von CTEPH-Patienten eine reichliche Thrombozytenhaftung und mehr Fibrinablagerung bei Histaminstimulation im Vergleich zu gesunder PAEC zeigten. Dies deutet darauf hin, dass das Endothel von CTEPH-Patienten eine höhere Reaktionsfähigkeit auf Vasoaktivierung aufweist, die zu einer erhöhten Thrombusbildung führt.
Abbildung 1: Schematische Übersicht des Protokolls. (A) Verschiedene Quellen und verschiedene Arten von Endothelzellen wurden isoliert und für den Einsatz in einem mikrofluidischen Durchflusskanal für Perfusionsexperimente kultiviert. Repräsentative Hellfeldbilder verschiedener Arten von Endothelzellen. Skala bar = 50 m. (B) Isolierte Zellen wurden durch immunfluoreszierende Färbung gekennzeichnet, um einen endothelialen Phänotyp zu bestätigen. Scale bar = 50 m. (C) Zellen können entweder in kommerziellen Strömungsschlitten oder in kundenspezifischen mikrofluidischen Kanälen gesät werden. (D) Repräsentative Hellfeldbilder von HUVEC, die in verschiedenen Kanalgeometrien angebaut werden. Scale bar = 50 m . (E) Experimentelle Einrichtung von Blutperfusionsexperimenten. Citriertes Blut wurde gesammelt, mit Einem Salinepuffer verdünnt und mit einer Spritzenpumpe über Endothelzellen durchsetzt. Die Lunge und Nabelvene in dieser Abbildung wurden von Servier Medical Art modifiziert, lizenziert unter einer Creative Common Attribution 3.0 Generic Licence. http://smart.servier.com/ Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bildaufnahme und Quantifizierung der Thrombusbildung. (A) Repräsentative Zeitraffer-Bildgebung von aufhaftenden Calcein AM-Red-gekennzeichneten Blutplättchen und abgelagertem Alexa488-konjugiertem Fibrin bei 1, 3 und 5 min nach Vollblutdurchblutung über nicht stimulierten PAECs (B) und über Histamin stimulierten PAECs. (C) Repräsentative Zeitrafferbilder der Thrombozytenhaftung und Der Fibrinablagerung bei 1, 3 und 5 min Perfusion mit Vollblut, inkubiert mit Dabigatran, die über histaminstimulierten PAECs durchdrungen sind. Maßstabsleiste = 50 m (D) Schematische Übersicht der Bildquantifizierung in ImageJ. (E) Quantifizierung der Thrombozytenhaftung und Fibrinablagerung für alle 30 s auf einem stimulierten und histaminstimulierten Endothel. (F) Quantifizierung der Wirkung von Dabigatran auf die Thrombusbildung quantifiziert durch Thrombozytenhaftung und Fibrinablagerung. Daten werden als Mittelwert ± SD, n = 3 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative konfokale Bilder von Strömungsexperimenten zur Charakterisierung der Thrombusbildung bei Thrombozytenhaftung und Fibrinabscheidung auf Endothelzellen. Endotheliale Zell-Zell-Kontakte wurden durch VE-Cadherin charakterisiert und in Kontroll-PAECs, patientenabgeleiteten CTEPH-PAECs und HUVEC gemessen. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Die Gerinnung ist das Ergebnis des komplexen und zeitlich gesteuerten Zusammenspiels zwischen Endothel und Blutbestandteilen. Dieser In-vitro-Test stellt eine Methode zur Untersuchung der thrombogenen Eigenschaften von Endothelzellen in Echtzeit dar. Es können verschiedene Arten von primären menschlichen Endothelzellen verwendet werden, die eine In-situ-Thrombose in einer Organ- und patientenspezifischen Weise erleichtern. In dieser Studie haben wir die Verwendung dieses Protokolls veranschaulicht, in dem die thrombogenen Eigenschaften von PAECs verglichen werden, die von gesunden Spendern isoliert wurden, mit CTEPH-Patienten. Die Bildung von Live Thrombus wurde durch Perfusion von Vollblut von gesunden Probanden über Histamin-aktiviertes Endothel untersucht, während die Wirkung eines DOAC als Antithrombotikum getestet wurde.
Neben der Verwendung kommerziell erhältlicher Mikrokanäle, wie in den repräsentativen Ergebnissen dargestellt, ermöglicht die Einführung der maßgeschneiderten mikrofluidischen Kanäle die Untersuchung des Einflusses von Gefäßgeometrieveränderungen auf die Thrombusbildung. Beispielsweise nimmt der Durchfluss an einem Astpunkt ab, oder die Stenose führt zu einer Erhöhung der Scherspannung und mehr Thrombozytenaktivierung36. Eine wesentliche Einschränkung dieser maßgeschneiderten mikrofluidischen Kanäle ist jedoch die Anforderung hoher Zellzahlen, eine stabile Monoschicht von ECs zu bilden, wie in Schritt 2.3.2 beschrieben. Dies kann einen begrenzenden Faktor darstellen, wenn patientenabgeleitete Zellen knapp sind. Die Stärken der kommerziell erhältlichen Mikrorutschen bestehen darin, dass die Oberflächenflächen für die Zellkultur modifiziert werden und Wachstumsbereiche größer sind, wodurch ECs eine konfluente und stabile Monoschicht bilden können. Auf der anderen Seite wird eine größere Fläche zu einem größeren Lumen führen. Gemäß Gleichung 1erfordert dies höhere Blutmengen, um ähnliche Durchflussraten wie in der maßgeschneiderten Mikrofluidik zu erreichen.
Eine Verbesserung dieses Protokolls könnte darin bestehen, lebende EG-Verluste oder Änderungen der Barriereintegrität zu untersuchen. DER EG-Schaden in diesem Protokoll wird erst am Ende des Experiments gemessen. Für Live-Tracking können ECs mit mCherry VE-cadherin markiert werden, z.B.37. Da dies jedoch ein hochoptimiertes Protokoll mit effizienter Virustransfektion benötigen würde, könnte Electric Cell-Substrat Impedanz-Sensing (ECIS) als Alternative zur Untersuchung der endotheliaalen Integrität und Barrierefunktion38verwendet werden. Die Perfusion über spezielle ECIS-Durchflusskanäle ermöglicht die Längsüberwachung der Endothelbarriereintegrität unter Strömung. Diese spezifischen ECIS-Eigenschaften ermöglichen parallele Messungen der Endothelbarriereeigenschaften und der Thrombusbildung. Alternative Möglichkeiten für parallele EC-Barrieremessungen, insbesondere in den kundenspezifischen Arrays, sind die Verwendung von fluoreszierender Dextrans im Perfusaten, die je nach EG-Barriereeigenschaften aus dem Lumen diffundieren.
Eine Einschränkung des beschriebenen Protokolls ist, dass ECs aus dem menschlichen Körper entfernt und auf Gewebekultur Kunststoff kultiviert werden, die ein steifes, künstliches Substrat ist. Zellen passen sich ihrer biophysikalischen Umgebung an. Dies könnte möglicherweise die endotheliale Reaktion auf die Thrombozytenaktivierung beeinflussen, da es einen Zusammenhang zwischen Thrombozytenaktivierung und Wandsteifigkeit39gibt. Trotz dieser Anpassungen an Kulturkunststoffe behalten Zellen krankheitsspezifische Eigenschaften bei, die im direkten Vergleich mit ECs identifiziert werden können, die von gesunden Spendern abgeleitet wurden, wie mit Kontrolle, CTEPH-PAEC und HUVEC gezeigt, die nach 5 min Blutdurchblutung unterschiedliche Muster der Thrombozytenhaftung und Fibrinablagerung ausübten.
Im Gegensatz zu anderen Protokollen verwendet dieses System Vollblut, während andere die EG-Interaktion mit einer einzigen Blutkomponente wie Blutplättchen und Leukozyten19,20,21untersuchen. Es wurden fortschrittlichere mikrofluidische Modelle entwickelt, die die Untersuchung der endotheliaalen Funktion in einem Gefäßmodell mit einer runden Gefäßgeometrie und weicher extrazellulärer Matrix ermöglichen. Diese sind jedoch mit HUVECs40,41,42optimiert. Die Neuheit des beschriebenen Protokolls ist die Verwendung von primären ECs in Kombination mit Vollblut, die die Modellierung der In-situ-Thrombose einen Schritt näher an in vivo-Bedingungen bringt. Das Protokoll für den Einsatz von patientenabgeleiteten ECs und patientenabgeleitetem Blut optimiert die Krankheitsmodellierung in vitround ermöglicht die Beurteilung der personalisierten Thrombusbildung und medikamentösen Behandlung.
Das beschriebene Protokoll kann angewendet werden, um die Wirkung von Antikoagulationstherapien auf patientenabgeleitete Zellen zu untersuchen. Während wir Dabigatran verwendet haben, um die Thrombusbildung zu hemmen, ist es möglich, andere Antikoagulanzien wie Rivaroxaban zu verwenden, das den Faktor Xa in der Gerinnungskaskade direkt hemmt. Auch Direktplättchenhemmer wie Clopidogrel oder Aspirin können untersucht werden, da diese auf die primäre Phase der Hämostase wirken, in der Thrombozyten an ECs binden. Letztlich können die thrombogenen Kapazitäten patientenspezifischer ECs in Wechselwirkung mit dem eigenen Blut des Patienten genutzt werden, um die persönliche Wirkung der Antikoagulationstherapie auf den einzelnen Patienten vorherzusagen. Darüber hinaus kann ein Knockdown spezifischer Proteine zusätzliche funktionelle Informationen liefern.
Es gibt einige Schritte im beschriebenen Protokoll, die für ein erfolgreiches Perfusionsexperiment entscheidend sind. Erstens ist es bei der Isolierung von Primärzellen notwendig, eine hochreine EG-Kultur zu erhalten. Zweitens ist es wichtig, dass die ECs eine stabile konfluente Monoschicht bilden. Ist dies nicht der Fall, kann eine leichte Änderung der Scherspannung zu Endothelschäden und Aktivierung der Gerinnungskaskade führen, oder Thrombozyten können mit der Bindung an die Kellermembran beginnen, was zu falschen positiven Ergebnissen führt. Drittens ist es wichtig, Luftblasen zu verhindern, da diese das Endothel schädigen und dadurch die Ergebnisse beeinflussen können.
Nach der Verkalkung des citrated Blutes mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid ist es wichtig, sofort mit dem Perfusionsexperiment zu beginnen. Die Verkalkung induziert eine schnelle Reaktion bei der Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung, was zu einer schnellen Gerinnung in der Probe führt.
Abschließend beschreiben wir ein sehr vielseitiges Protokoll zur Untersuchung von Wechselwirkungen mit Blut-endotheliaalen Zellen während der Thrombose.
Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir danken Jan Voorberg vom Department of Plasma Proteins, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Niederlande, für seinen Beitrag zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde von der Niederländischen CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] unterstützt, die an das Phaedra- und das Reconnect-Konsortium vergeben wurde, sowie vom Impulse-Stipendium 2018, das dem Phaedra IMPACT-Konsortium gewährt wurde. Diese Stipendien umfassen die kollektive Finanzierung durch die Niederländische Herzstiftung, die Niederländische Föderation der Universitätskliniken, die niederländische Organisation für Gesundheitsforschung und -entwicklung und die Königlich Niederländische Akademie der Wissenschaften. Darüber hinaus wurde diese Arbeit vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Advanced Grant 'VESCEL'-Programms (Grant-Nummer: 669768) finanziert. XDM wird durch ein Forschungsstipendium des Instituts für Kardiovaskuläre Forschung (ICaR-VU) am VU University Medical Center, Amsterdam, Niederlande, gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| 20 mL syringe | BD | 300613 | |
| 20X objective | Olympus | N1492900 | LUCPLFLN20XPH/0.45 |
| 2-Propanol (IPA) | Boom | 760514555000 | |
| Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
| Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
| Alexa647-Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 1:100 |
| Biopsy punch 1 mm diameter | Ted Pella | 15110-10 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
| CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
| Citric Acid | Merck | 100244 | |
| Collagen Type I, rat tail | Corning | 354249 | 0.1 mg/mL |
| Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
| Cross-flow hood | Basan | ||
| Desiccator | Duran | 2478269 | |
| D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
| Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Flow tubing | ibidi | 10831, 10841 | |
| Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
| micron-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
| ImageJ | NIH | v1.49 | |
| KCl | Merck | 7447-40-7 | |
| Lab oven | Quincy | 10GC | |
| LS720 Fluorescent microscope | Etaluma | LS720 | |
| Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, Female tube connectors |
| MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
| Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | no calcium or magnesium |
| Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
| sodium citrate blood collection tubes | BD | 363048 | |
| trisodium citrate | Merck | 106448 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
| VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |
References
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