Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/61068
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 1, 3, 1, 1,5,6
1Department of Pulmonary Diseases, Amsterdam UMC, VU University Medical Center, Amsterdam Cardiovascular Sciences (ACS), 2BIOS Lab-on-a-Chip group, University of Twente, 3Applied Stem Cell Technologies Group, University of Twente, 4Department of Cardio-thoracic Surgery, Amsterdam UMC, VU University Medical Center, 5Institute of Physiology, Charité-Universitätsmedizin, 6German Heart Center

Summary

אנו מציגים מודל מחלת כלי דם במבחנה לחקור אינטראקציות דם שלם עם אנדותל נגזר המטופל. מערכת זו מאפשרת לחקור תכונות טרומבוגניות של תאי אנדותל ראשוניים בנסיבות שונות. השיטה מתאימה במיוחד להעריך את הטיפול situ thrombogenicity ונוגדי קרישה בשלבים שונים של קרישה.

Abstract

היווצרות קרישי דם כרוכה באינטראקציות מורכבות בין תאי אנדותל, המטריצה הבסיסית שלהם, תאי דם שונים, וחלבונים. ה אנדותל הוא המקור העיקרי של רבים של מולקולות המוסטטיות העיקריות לשלוט צבירת טסיות דם, קרישה, פיברינוליזה. למרות מנגנון הפקקת נחקר במשך עשרות שנים, במבחנה מחקרים מתמקדים בעיקר במצבים של נזק לכלי דם שבו מטריקס subendothelial נחשף, או על אינטראקציות בין תאים עם רכיבי דם יחיד. השיטה שלנו מאפשרת לימוד אינטראקציות בין דם שלם לרשת תאי כלי דם שלמים וקופלריים.

על ידי ניצול תאי אנדותל אנושיים ראשוניים, פרוטוקול זה מספק את ההזדמנות הייחודית ללמוד את ההשפעה של תאים אנדותל על דינמיקת תרומבוס ונותן תובנות יקרות ערך על הפתופיזיולוגיה של מחלה טרומבוטית. השימוש בערוצים מותאמים אישית של זרימה מיקרו-נוזלים מאפשר יישום של גיאומטריות וסקולרי ספציפיות למחלה ושינויים מורפולוגיים ספציפיים בכלי הדם. התפתחות הטרומבוס נרשמת בזמן אמת וכמותית המאופיינת בהדבקת טסיות דם ותצהיר פיברין. ההשפעה של תפקוד אנדותל בדינמיקה טרומבוס שונה נקבעת על ידי postanalysis באמצעות כתמי חיסון של מולקולות ספציפיות.

התוצאות המייצגות מתארות את ההתקנה הניסיונית, איסוף הנתונים וניתוח הנתונים. בהתאם לשאלת המחקר, ניתן להתאים פרמטרים לכל מקטע, כולל סוג תא, שיעורי גיזה, גאומטריית ערוצים, טיפול תרופתי והליכי ניתוח שלאחר ניתוח. הפרוטוקול מאומת על ידי כימות היווצרות טרומבוס על אנדותל עורק ריאתי של חולים עם מחלה טרומבואמבולית כרונית.

Introduction

ה אנדותל יוצר את השכבה התאית הפנימית של כלי הדם ומפריד דם מן הרקמה שמסביב. הוא תואר כאיבר דינמי המסדיר באופן פעיל את המיקרו-סביבה שלו ומגיב לגירויים חיצוניים1. בשל הקשר הישיר שלה עם דם זורם, אנדותל הוא מרכזי בשליטה של המוסטאזיס ופקקת והוא המקור העיקרי של רבים של מולקולות רגולטוריות העיקריות כי שליטה צבירה טסיות דם, קרישה, פיברינוליזיס2. בריא, תאים אנדותל לא פעיל (EC) לייצר מספר מולקולות המנטרלות את הפעלת טסיות דם ולמנוע קרישה היווצרות תרומבוס כדי לשמור על זרימת הדם, כגון פרוסטציקלין, טרוממודולין, או מעכב מסלול גורם רקמות (TFPI)2,,3. פעולה זו מונעת הדבקה של טסיות דם, צבירת טסיות דם, היווצרות טרומבוס. פציעה או הפעלה של קיר כלי השיט גורמת לפנוטיפ אנדותל פרו-קריאגולי הנויז הידבקות טסיות דם מקומיות ומבנהקריש 2,,4. על טסיות דם של הפעלת אנדותל לדבוק פון Willebrand פקטור (VWF), חלבון רב מרי שוחרר ECs, או לאתרים מחייבים חשופים של מטריצת subendothel הבסיסית. לאחר מכן, שינויים מולקולריים טסיות דם ואת החשיפה לגורם רקמות (TF) ליזום את ההפעלה של מערכת קרישה, אשר גורם היווצרות טרומבוס על ידי פולימריזציהפיברין 5,,6. יחד, קריש הדם שנוצר מספק את הבסיס לסגירת הפצע על ידי אנדותל מחדש7. סטיות של מערכת קרישה עלול לגרום להפרעות דימום, כגון מחלת פון Willebrand, המופיליה, או פקקת, הנובעים לעתים קרובות מאיזון פרו-ואנטי-טרומבוטי dysregulated של מסלול ההמוסטטי אנדותל2,3.

תהליך ההמוסטאזיס מתרחש הן במחזור העורקי והן במחזור הדם הארסי. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים פקקת עורקים ורידים שונים במהותם. בעוד פקקת עורקים, כפי שניתן לראות במחלת לב איסכמית, מונע בעיקר על ידי קרע של פלאק טרשת עורקים בתנאים של מתח גיצה גבוהה, פקקת ורידים מתפתחת בעיקר בהיעדר פציעה אנדותל במצבשל קיפאון 8,9,10. תרומבוס ורתי עמוק עלול לתסחיף ולנוע לכיוון עורקי הריאה, שם הוא גורם לתסחיף ריאתי. זה יכול לגרום לחסימה כרונית של כלי דם המובילים ליכולות תפקודיות לקויות משמעותיות שעשויות לטפח את התפתחותן של מחלות ריאות chonic כולל התפתחות של יתרלחץ דםריאתי טרומבומבולי כרוני (CTEPH)11,12,13,14 . CTEPH מאופיין בלחץ ריאתי גבוה בשל חסימות של עורקי הריאה על ידי חומר טרומבואמבולי לאחר לפחות שלושה חודשים של טיפול קרישה15. בנוסף תסחיף ריאות, הוא הניח כי אנדותל ריאתי מספק סביבה פרותרומבוטית ב CTEPH המאפשר פקקת סיטו וחסימות כרוניות של עורקי הריאה, גורם לעלייה בלחץ הדם כי בסופו של דבר יכול לגרום לאי ספיקת לב, אםלא מטופל 16,17.

בשנים האחרונות, מחקרים שונים הובילו לפיתוח של אסמים לבחון היווצרות טרומבוס על ידי מדידת תפקוד טסיות דם קרישה18. עם זאת, רובם גם ללמוד את האינטראקציה של דם שלם עם רכיבי מטריצה חוץ תאית אחת כמו collagens או פיברינס, או תפקוד אנדותל באינטראקציה עם רכיבי דם יחיד, כגון טסיות אנדותל או אינטראקציה אנדותל-leukocyte19,,20,,21,,22. בדיקות אלה מבוצעות בדרך כלל עם תאי אנדותל טבור אנושיים (HUVEC), כמו תאים אלה מתקבלים בקלות. עם זאת, גנים המוסאטיים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי על פני עץ כליהדם, סוגי כלי דם, ומערכות איברים 23,24, מה שהופך את השימוש HUVECs לייצג תאים אנדותל מעורב פקקת עורקי או תסחיףריאתי בעייתי 23.

בנוסף פלסטיות EC, שינויים המודינמיים ספציפיים למחלה ושינויים מורפולוגיה כלי דם יכול לקדם היווצרות טרומבוס באאנדותל נורמלי25. שיעורי גימה גבוהים יותר, בשל תכונת כלי דם מקומית או שינויים בגיאומטריית כלי הדם, למשל, עלול לגרום להיווצרות טרומבוס חריפה, ולגרום להיצרות המאיצה את הפסקת זרימת הדם26. השימוש בערוצים מותאמים אישית של זרימה מיקרו-מהנונדסת מאפשר לעצב באופן ספציפי גיאומטריות כלי דם המייצגות את הביולוגיה (פתו). בדרך זו, ניתן ללמוד את ההשפעה של כוחות ביומכניים מקומיים על EC בריא אוחולים 27.

ישנם טיפולים נגד קרישה זמינים עבור מיקוד שלבים ומולקולות שונים במפל קרישה, אשר כל מהווים סיכונים ויתרונות מסוימים שיכולים להיות ספציפיים להפרעות מסוימות. הגישה של מידול מחלה המתוארת במאמר זה מתאימה במיוחד כדי לבדוק את ההשפעות של טיפולים אנטי קרישה ואנטי פלטה שונים על דינמיקת תרומבוס.

המטרה היא להציג מודל של פקקת הכולל ECs ראשי, מניב מודל רב-תכליתי מתאים לניתוח של צורות שונות של פקקת בהתאם לסוג של ECs הראשי בשימוש. כהמחשה, השתמשנו בתאי אנדותל עורקים ריאתיים מחולי CTEPH באינטראקציה עם דם אנושי שלם המכיל את כל הרכיבים המעורבים במבנה טרומבוס (טסיות דם, לוקוציטים, אריתרושיטים, חלבוני קרישת דם, וקופאקטורים). גישה זו יכולה להיות מיושמת בערוצים מסחריים מקבילים זרימה או בערוצים זרימה microfluidic בהזמנה אישית עם עיצוב כלי דם ספציפי. ככזה, המודל יכול לשמש בסופו של דבר במחקר של היווצרות טרומבוס ורזולוציה, להערכת תגובות דלקתיות במודלים מחלה, לטיפול נגד פלסטראט או נוגד קרישה, ובסופו של דבר לרפואה מותאמת אישית.

מחקר זה מתאר את הבידוד של תאי אנדותל עורק ריאתי אנושי ראשי. לבידוד של סוגי תאים אנדותל אנושיים עיקריים אחרים, אנו מתייחסים לשיטות שפורסמו בעבר, כולל תאי אנדותלמיקרו-וסקולריים ריתיים 25, תאי אנדותל טבוראנושיים 28, ודם במחזור מושבת אנדותל ויוצרים תאים איור 1A29.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי המועצה המוסדית לביקורת אתית רפואית של המרכז הרפואי VU אמסטרדם, הולנד (METC VUmc, NL69167.029.19). בידוד תאים ראשי ואיסוף דם של נבדקים אנושיים בוצעו לאחר הסכמה מושכלת בכתב הושגה בהתאם להצהרת הלסינקי.

1. בידוד ותרבות של תאי אנדותל עורקיים אנושיים עיקריים (PAEC)

  1. חם מלא אנדותל תא בינוני (cECM) בתוספת עם 5% סרום שור עוברי (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S), 1% תוספי צמיחה של תאים אנדותל (ECGS), ו 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), באמבט מים ב 37 °C. לחטא מספריים כירורגיים, מפסים, ואזמל עם 120 מעלות צלזיוס מחטא חום או 70% אתנול. לבצע את הבידוד של PAEC בארונות זרימה למינאר בתנאים סטריליים.
  2. מעיל תא זיקה גבוהה מחייב 60 מ"מ תא תרבות צלחת (ראה טבלת חומרים)עם 2 מ"ל של 5 μg / מ"ל פיברונטין דגירה ב 37 ° C לפחות 15 דקות.
  3. להשיג רקמת עורק ריאתי (הרשות הפלסטינית)מניתוח( למשל. כריתת אונה או כריתת קצה ריאתית), לאחסן 4 מעלות C מאגר כבל קר (4 mM אשלגן כלורי, 140 mM נתרן כלורי, 10 mM HEPES, 11 mM D-גלוקוז, ו 1% P/S, pH = 7.3), ולשמור על קרח עד בידוד.,
  4. לבודד תאים אנדותל מן הרשות הפלסטינית בתוך 2 שעות לאחר הסרת רקמות. קח את הרשות הפלסטינית עם מפסים ולשים אותו בצלחת פטרי 10 ס"מ לשטוף עם PBS. אם הרשות הפלסטינית היא עדיין טבעת, לחתוך את עורק הריאה פתוח עם מספריים. היזהרו מאוד לא לגעת בשכבה הפנימית ביותר של הכלי עם הכלים, כמו אנדותל פגום בקלות ו / או הוסר.
  5. מוציאים את הפיברונקטין מצלחת תרבות התא ומוסיפים 4 מ"ל של cECM בינוני.
  6. קח את רקמת הרשות הפלסטינית עם מפלצות ולמקם אותו במדיום. בינתיים, בזהירות לגרד את השכבה הפנימית של הכלי לתוך המדיום עם אזמל. לעתים קרובות, הצטברויות שומנים ניתן לראות בקיר כלי השיט. נסה להשמיט אלה, כפי שהם ישפיעו על התא outgrowth.
  7. לשמור את התאים בתרבות עד מושבות קטנות של תאים אנדותל להתחיל להופיע.
  8. החלף את המדיום כל יומיים. אם פיברובלסטים מזהמים את התרבות, טהרו אותה עם הפרדת תאי זיקה מגנטית עבור CD144 עם ערכה, בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). השתמש בשיטת שתי העמודות לטיהור הראשוני ולשיטת עמודה אחת עבור כל טיהור עוקב. בדרך כלל, תרבות מוגדרת טהורה כאשר ציתימת זרימה מזהה ≤10% תאים מזהמים.
  9. פיצול תאים ביחסים של 1:3 עד 1:4 עד ש- PAECs מספיק גדלים לשימוש ניסיוני. כאשר PAECs מוכנים לשימוש, המשך בשלב הבא.
  10. לאחר הטיהור, תאים אנדותל ראשוני צריך להיות מאופיין לנוכחות של סמנים ספציפיים EC(למשל,VE-cadherin, CD31, TIE2) והיעדר תאי שריר חלקים (α-SMA), פיברובלסט (vimentin), ו אפטיתל (ציטוקראטין)סמנים (איור 1B).

2. הכנת תאי זרימה ומונושכבות PAEC

הערה: בהתאם להשערה, השתמש בתאי הזרימה הזמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים ואיור 1C אפשרות א',שלב 2.1 של הפרוטוקול) או בתא זרימה מיקרו-נוזלים בהזמנה אישית(איור 1C OptionB, שלב 2.2 של הפרוטוקול).

  1. זריעת תאים של מונושכבות אנדותל במפולות מיקרו זמינות מסחרית
    הערה: תאי זרימה זמינים מבחינה מסחרית קלים לשימוש ומספקים תבנית זרימה למינאר בכל הערוץ שניתן להשתמש בה בשיעורי גימה גבוהים. מפולות מיקרו אלה נועדו לאפשר ריצות מקבילות רב ערוציות ולספק פרופיל זרימה מדויק ותו לא. מכיוון שהם ממוטבים למיקרוסקופ הפוך, ניתן ללכוד תמונות פלורסנט באיכות גבוהה. יתר על כן, ממדים שונים של תאי זרימה זמינים בגדלים שונים של ערוץ או גיאומטריות. ערוצי זרימה 6-well עדיפים על כך כי אלה microslides יש ממדים קטנים ולאפשר ריצות מרובות אלים.
    1. כדי לכסות ערוץ אחד של שקופית זרימה 6-באר (3.5 מ"מ רוחב x 0.4 מ"מ גובה x 17 מ"מ אורך) להשתמש 30 μL של 0.1% ג'לטין לכל ערוץ דגירה ב 37 ° C לפחות 15 דקות.
    2. כדי לזרוע ערוץ אחד, trypsinize 10ס"מ 2 של PAECs confluent וספין למטה ב 300 x g עבור 7 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. להשעות PAECs ב 600 μL של cECM ופיפטה 100 μL (1.5ס"מ 2) של מתלה תא בערוץ אחד. זה מכסה את המיקרו-מפולת באמצעות פעולת ניים. אם זה הולך לאט מדי, בועות אוויר ייווצרו. להימנע היווצרות של בועות אוויר באמצעות קצת יותר כוח בעת pipetting.
      הערה: צפיפות התא משפיעה על פנוטיפ אנדותל. בסך הכל 1.5ס"מ 2 של תאים confluent לכל ערוץ הוא overconluent, כי הערוץ יש שטח פנים של 0.6 ס"מ2. לפני תחילת הניסוי, תרבות תאים אלה במשך 6 ימים נוספים בתוך הערוצים עד שהם מגיעים confluency המרבי.
    4. הוסף 50 μL נוספים של cECM לערוץ כדי לספק מספיק מדיום עבור דגירה לילה ב 37 °C, 5% CO2. שנה את המדיום למחרת כדי לשטוף תאים לא מאוגדים.
    5. שמור את התאים בתרבות במשך 6 ימים ב 37 °C, 5% CO2 כדי לאפשר PAEC ליצור מוצק, conluent חד שכבתית. לשנות את המדיום כל יומיים עם 150 μL של cECM.
    6. ביום 7, לטפל PAEC עם 100 μL של 1 μM היסטמין ב ECM ו 1% FBS ללא כל תוספים אחרים במשך 30 דקות לפני ההסכם. ניתן לבחור את הגירוי עד libitum. לדוגמה, TNF-α נעשה שימוש נפוץ כמופעל דלקתי.
  2. הכנת תאי זרימה מיקרו-נוזלים בהתאמה אישית
    הערה: תאי זרימה מותאמים אישית מותאמים לצרכי המשתמש מכיוון שניתן לשנות בקלות את הממדים והגיאומטריות להעדפה. לדוגמה, כדי לחקות כלי רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית, ניתן להציג היצרות(איור 1D). גישה זו מאפשרת שימוש בנפחי דם קטנים מאוד כפי שניתן לראות במחלות מיקרווסקולריות.
    1. ליתוגרפיה רכה של פולידימתילסילוקסן (PDMS) באמצעות וופלים מעוטרים
      1. שלב סוכן ריפוי PDMS וprepolymer על מיקרו איזון ביחס 1:10 ולערבב ביסודיות עם מערבל מעבדה מטרה כללית.
      2. כדי להסיר את בועות האוויר המתוברות, degas PDMS בהי desiccator במשך כ 1 שעה.
      3. מסדרים צלחת פטרי מזכוכית בנייר אלומיניום ומוסיפים כמה טיפות מים לפני מניחים את הוופל בצלחת פטרי מרופדת. הוופל משמש כתבנית לערוץ בהזמנה אישית.
        שימו לב: הוופלים או התבניות מסופקים על ידי מתקני החדר הנקי. פוטרסיסט שלילי הוא בדוגמת על וופלים כדי ליצור תכונות בולטות כמו ערוץ עם הממדים האופייניים הבאים: 300 μm רוחב x 270 μm גובה x 14 מ"מ אורך.
      4. יוצקים את PDMS degassed על הוופל הניח בצלחת פטרי זכוכית.
      5. דגה PDMS שפך על הוופל במתיבש במשך 15 דקות נוספות כדי להסיר את כל הבועות שאולי נוצרו במהלך הליהוק.
      6. מוציאים את צלחת הפטרי המכילה את התבנית וה-PDMS מהמיבש וממקמים אותה בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות כדי להצליב את ה-PDMS.
    2. הכנת PDMS מקושרת למליטה לשקופיות זכוכית
      1. הסר עובש ו- PDMS מקושר מהתנור והתקדם למכסה מנוע בזרימה צולבת לטיפול ללא אבק של PDMS.
      2. הסר את כל PDMS מתחתית התבנית באמצעות אזמל ולהסיר את הלוח העליון של PDMS מקושר מהתבנית.
      3. בשורה לוח PDMS בדוגמת חשוף עם סרט דבק כדי למנוע כל חלקיקי אבק לבוא במגע עם ערוצי PDMS.
      4. חותכים את שבבי ה-PDMS לגודל ותוכות במפרצון בקוטר 1 מ"מ ובשקעים באמצעות פונץ' ביופסיה.
    3. עיקור ומליטה של ערוצים מיקרו-נוזלים PDMS ושקופיות זכוכית
      1. שקופיות מיקרוסקופיות זכוכית נקיות על ידי שטיפה יסודית עם אתנול ואחריו שטיפה של אלכוהול isopropyl. לאחר כל שטיפה, לייבש ביסודיות את השקופיות עם אקדח חנקן.
        הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בתלושי כיסוי אם הניתוח מתבצע באמצעות מיקרוסקופ confocal.
      2. פתח את תא הפלזמה וטען את שקופיות המיקרוסקופניקיון ואת השבבים המיקרו-נוזלים ללא סרט ההדבקה.
      3. סגור את התא, טהר עם חנקן במשך 1 דקות, ולמלא את התא עם אוויר מסונן עד לחץ של 500 mTorr מגיע.
      4. לחשוף את שקופיות הזכוכית ואת שבבי PDMS לפלזמה עבור 40 s באמצעות כוח של 50 W ותדירות של 5 kHz.
      5. לאחר חשיפה לפלזמה, מיד קשרו את שקופיות הזכוכית ואת שבבי המיקרו-נוזלים. אחסן את המכשירים במנות פטרי סטריליות.
  3. זריעת תאים של מונושכבות אנדותל בערוצים מיקרופלויד
    1. ציפוי המיקרו-ערוץ בהזמנה אישית על ידי pipetting 10 μL של 0.1 מ"ג / מ"ל קולגן סוג I או 0.1% ג'לטין לכל ערוץ דגירה ב 37 ° C במשך 30 דקות.
    2. כדי לזרוע ארבעה מיקרו-תכננים, נסה 25 ס"מ2 של PAECs confluent וספין למטה ב 300 x g עבור 7 דקות ב RT.
      הערה: רק אחוז קטן של תאים ידבקו לפני השטח. לכן, יש צורך להשתמש בעודף של תאים כדי להשיג מונו-שכבת confluent.
    3. להשעות PAECs ב 20 μL של cECM ולהשתמש 5 μL של מתלה תא עבור כל ערוץ. בגלל ממדי הערוץ הקטן, כוחות הניים ימלאו את המיקרו-מפולת וימנעו היווצרות בועת אוויר.
    4. שנה מדיום לאחר 3-4 שעות כדי לשטוף תאים לא מאוגדים.
    5. לשמור את התאים בתרבות במשך 6 ימים כדי לאפשר PAEC להקים מוצק, confluent מונו-שכבתי. בגלל נפח קטן, לשנות את המדיום כל יום עם 150 μL של cECM. השאר את קצה הפיפטה מלא במדיום בכניסת והכנס קצה ריק לשקע. זה ישמש כמאגר המספק מספיק חומרים מזינים וגדילה לתאים ולמנוע את השקופית מתייבש.
    6. ביום 7, להכתים את הגרעין בתאים החיים עם Hoechst (1:5,000 ב cECM) ודגירה לכל היותר 10 דקות ב 37 °C ו 5% CO2.
    7. לשטוף בזהירות 3x עם cECM ולטפל עם 1 μM היסטמין ב ECM + 1% FBS במשך 30 דקות לפני ההסבר. ניתן לבחור את הגירוי עד libitum. לדוגמה, TNF-α נעשה שימוש נפוץ כמופעל דלקתי.
    8. השתמש במחברי נירוסטה בקוטר 1.27 מ"מ בקוטר 90° כדי לחבר את השקע של שבבי PDMS לצינורות.

3. הכנת דם שלם אנושי

  1. לשאוב דם ורדי מהנבדקים ב 0.109 M נתרן ציטראט נוגד קרישה. זה יכול להיות מנבדקים בריאים או חולים שלא מקבלים טיפול נגד קרישה. הפוך בעדינות את הצינורות לערבב. הכמות הכוללת של הדם הנדרש לניסוי תלויה בעיקר בקצב הזרימה שנבחר. עם קצב זרימה של 25 מ"ל /h, ב ibidi 6-well שקופיות, נפח כולל של 2 מ"ל עם עודף קטן כדי למלא אמבטיות ערוץ זרימה מספיק.
  2. להעביר את הדם צינור 50 מ"ל ולהוסיף Calcein AM (1:10,000) לתאי דם תווית פלורסנטית Alexa488-fibrinogen (15 μg / mL) כדי להציף פיברינוגן אוטולוגי. תן לדם לדגור ב-37°C למשך 15 דקות כדי לאפשר ספיגה מלאה.
  3. לדלל את הדם 1:1 עם מאגר חישוב מחדש (154 mM נתרן כלוריד, 10.8 mM trisodium ציטראט, 2.5 mM סידן כלוריד, ו 2 mm מגנזיום כלוריד) ממש לפני תחילת הניסוי.
    הערה: Hemodilution עם מקסימום של 50% לא השפיע על זמן התגובה קרישה30. יתר על כן, דם אנושי יכול להכיל וירוסים וסוכנים אחרים. עבודה עם דגימות דם, לכן, נושאת סיכון לזיהום. מומלץ מאוד להשתמש באמצעי בטיחות מתאימים ולטפל בחומר בזהירות.

4. הרכבת מערכת הזרימה

  1. לפני חיבור הצינורות, לשטוף את צינורות הזרימה עם מזרק 20 מ"ל מלא מאגר כביסה (36 mM חומצת לימון, 103 mM נתרן כלוריד, 5 mM אשלגן כלורי, 5 mM EDTA, ו 0.35% wt / vol סרום סרום אלבומין [BSA], pH = 6.5) כדי למנוע קרישת הדם בצינורות.
  2. השתמש במזרק חדש כדי למלא את צינורות הזרימה במאגר HEPES (132 mM נתרן כלוריד, 20 מ', HEPES, 6 מ"מ אשלגן כלורי, מגנזיום כלוריד 1 מ', 1% BSA, ו-5.5 מ"מ D-גלוקוז, pH = 7.4) ולחבר אותו בזהירות עם מחבר Luer בצורת מרפק למיקרו-מפולת מלאה EC במדיום. בעת חיבור המחברים למיקרו-תכנים, נסה למנוע היווצרות של בועות אוויר בשקופית. בועות יפגעו אנדותל ולהשפיע על התוצאות של הניסוי שלך. הסר מאגר כביסה לחלוטין ואל תיתן למאגר ליצור קשר עם התאים, מכיוון שפעולה זו תעכב את קרישה.
  3. הגדר את מערכת הזרימה כפיצג באיון 1E. קח 2 מ"ל של חוצץ כביסה במזרק 20 מ"ל ולשטוף כדי למנוע קרישה כאשר הדם נכנס למזרק. הכנס את המזרק הריק במשאבת המזרק וחבר את צינור השקע עם מחבר Luer נקבה למזרק זה. שים את צינור הפתיר במיכל המכיל את הדם האנושי המוכן.
  4. הפעל את משאבת המזרק וחשב את קצב הזרימה. פרופילי זרימה עוקבים אחר תבנית פרבולית בגובה. בהנחה שהדם פועל כנוזל ניוטוני, השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את קצב הזרימה.
    Equation 1 (משוואה 1)
    איפה
    τ = גיה מתח Equation 2
    η = צמיגות דינמית Equation 3
    Q = קצב זרימה רב-נפחי Equation 4
    h = גובה ערוץ Equation 5
    w = רוחב ערוץ Equation 5
    הערה: עבור זרימת עורקים ריאתיים עם דם במיקרו מפולות מסחריות 6 ערוץ עם ממדים מלבניים עם גובה 0.4 מ"מ ו 3.5 מ"מ רוחב, קצב זרימה נפחית של 25 מ"ל / שעה שימש במשך 5 דקות. בשל ההבדלים בממדים של ערוצי הזרימה המותאמים אישית, דינמיקות אלה ישתנו גם הן. כוונן את המשתנים כדי לוודא שהלחץ על גיה שווה.
  5. הגדר את הקוטר של מזרק 20 מ"ל ל- 19.05 מ"מ והגדר את התוכנית לסגת. משיכת הדם דרך הערוץ מצופה התא על ידי יישום של לחץ שלילי יבטיח שיעורי גהה קבועים ונזק מינימלי לשכבת התא.

5. הגדרת המיקרוסקופ לרכישת תמונה

  1. השתמש במטרה של פי 20 והניחת המיקרוסקופ על השלב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניגודיות של פאזה הפוכה. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ כדי להזיז את השלב בכיוון Z כדי להתמקד במונו-שכבת התא.
  2. בחר אזור עניין (ROI) בהתחלה, באמצע ובסוף של כל ערוץ זרימה. ההתחלה והסוף צריכים להיות במרחק של לפחות 3 מ"מ מההיכנס והשקע של הערוץ. הגדר את מסנני הפלואורסצנט הכחול, הירוק והאדום עם עוצמת לייזר ואור המציגה רקע מינימלי.

6. שזור דם שלם על PAECs

  1. לאחר שהכל מחובר כמו איור 1E והמיקרוסקופ מוכן להקלטה, לחץ על Start כדי להקליט וידאו. לחץ התחל על משאבת המזרק כדי להזרים את הדם מעל ה אנדותל.
  2. ברגע שהדם מתחיל לזרום מעל ה אנדותל, לרכוש תמונות עם הערוצים הפעילים שנבחרו מראש ועמדות ROI כל 15 s במשך 5 דקות.
  3. לאחר 5 דקות של עירוי, סיים את ההקלטה ועצור את משאבת המזרק. לפרק את תא הזרימה ולהסיר בזהירות רבה את הצינורות. לעתים קרובות, בועת אוויר תיווצר אם זה נעשה עם יותר מדי כוח. נסה למנוע את זה, כי זה יהיה לשטוף את ה אנדותל.

7. קיבעון ופוסט-אנליזה

הערה: כדי לא לכלול הידבקות טסיות דם חיובית כוזבת על ידי נזק אנדותל בשל ניסוי התזת, יש לאפיין את תאי אנדותל עבור היווצרות הפער שלהם מונו-שכבתית. זה יכול להיעשות על ידי כתמי חיסון רגיל עבור VE-cadherin.

  1. לאחר התזת ופירוק הצינורות, שטפו את הערוץ המיקרו-נוזל עם HEPES. פיפט HEPES לתוך הערוץ כך שהוא ידחוף את הדם לשקע. הסר את העודף עם פיפטה אחרת.
    1. לחלופין, לשטוף את הערוץ עם PBS++ (עם 0.5 mM מגנזיום כלוריד ו 0.9 mM סידן כלוריד) כדי למנוע משקעים של חלבון supernatant. פעולה זו מפחיתה את הרקע. עם זאת, שלב כביסה נוסף יכול לשנות את ההתנהגות התאית ומורפולוגיה שיכול להשפיע על הדמיה שלאחר ניתוח.
  2. הסר את HEPES ולתקן את ה אנדותל עם טסיות דם דבק פיברין שהופקדו על ידי pipetting 37 °C חימם 4% paraformaldehyde (PFA) לתוך הערוץ דגירה במשך 15 דקות ב RT.
    הערה: היה זהיר במיוחד בעת תיקון המיקרו-נוזלים בהתאמה אישית מכיוון שערוצים אלה קטנים אף יותר, מה שגורם לכוחות גזוז גבוהים יותר בערוץ במהלך כל שלב טיפול.
  3. הסר את ה-PFA מהערוץ ושטוף פי 3 באמצעות PBS. המפולות הזעירות מוכנות כעת לפרוטוקול כתמים סטנדרטי כדי לאפיין סמני תא אנדותל כגון VE-cadherin, CD31, P-selectin או integrins, CD42b עבור טסיות דם דבק, או CD45 עבור לוקוציטים.
  4. לאחר הכתמה, לצלם לפחות חמש תמונות עם מיקרוסקופ קונפוקלי רגיל לאפיין colocalization.

8. ניתוח תמונה

  1. פתח תמונת אחסון זרימה המכילה טסיות דם עם תווית פלואורסצנט או פיברין פלורסנט ב- ImageJ. גרור תמונה של בחירה ל- ImageJ.
  2. התמונה צולמה בצבע RGB. לצורך ניתוח, תמונה של 8 סיביות מועדפת, לכן הפוך את התמונה ל- 8 סיביות: תמונה | סוג | שמונה סיביות.
  3. כדי למזער את הרקע, הפחת באמצעות פרבולואיד הזזה, שבו כדור מתגלגל מחשב ומחסר פיקסלי רקע מהתמונה המקורית: Process | חיסור רקע | רדיוס כדור מתגלגל = 50 פיקסלים | הזזה פרבולואיד.
    הערה: גודל התמונה מוגדר בפיקסלים. עם זאת, כדי למדוד את האזור, יש צורך להגדיר את קנה המידה. כאשר התמונות נלקחות עם מטרה 20x עם צמצם מספרי של 0.45, המיקרוסקופ יש קנה מידה של 2 פיקסלים לμm. רוב הזמן המידע הדרוש כדי להגדיר את קנה המידה מאוחסן במטא-נתונים של התמונה ותו לא ניתן להשתמש בו באופן אוטומטי על-ידי ImageJ: נתח | הגדר קנה מידה.
  4. הגדר סף להגדרת טסיות דם דבקות או פיברין שהופקד. השתמש בשיטה משולש והסף יותאם באופן אוטומטי: תמונה | כוונן | סף.
  5. נתח את האזור המכוסה על ידי טסיות הדם או fibrin באמצעות הפקודה נתח חלקיקים. הגדר גודל ב- 2 אינסוף, כמו הגודל המינימלי של טסיות דם הוא 2 μm: נתח | נתח חלקיקים.
  6. התוצאות יספקו את האזור הכולל ב- μm2, עם הגודל הממוצע של הצבירה ב- μm2 ואת אחוז האזור המכוסה.

Representative Results

ניתן לחלק את התוצאות המייצגות לשלושה חלקים, שכל אחד מהם מייצג את השלבים המתאימים של התקנה ניסיונית, איסוף נתונים וניתוח נתונים. בהתאם לשאלת המחקר, ניתן לשנות פרמטרים עבור כל שלב. הנתונים המוצגים מוחלים כדי ללמוד את ההשפעה של אנדותל על היווצרות תרומבוס.

התקנה ניסיונית
זה מבוסס היטב כי תאים אנדותל הם הטרוגניים מאוד במבנה ותפקוד, בהתאם למיקום וזמן, במהלך בריאות ומחלה23. מקורות שונים של תאים אנדותל יכול לשמש כדי ללמוד אינטראקציה אנדותל-דם, אשר במקרה זה היו זמינים מסחרית HUVECs ו PAECs(איור 1A). HUVECs היו הנפוצים ביותר במודלים מעבדה, בעוד PAECs הם תאים מבודדים נגזר המטופל מעורקי הריאות. יתר על כן, ישנם פרוטוקולים מבוססים היטב זמינים לבודד תאים אנדותל microvascular (MVEC) ממחזור הדם או דם במחזור מושבת אנדותל ויוצרים תאים (ECFC)25,28,29.

לאחר הבידוד, תאי אנדותל היו מאופיינים VE-cadherin, CD31, ו TIE2 כתמימה כדי לאשר פנוטיפ אנדותל. אפיון לנוכחות של αSMA וציטוקראטין הצביע על היעדרו של פנוטיפ פיברובלסט או אפיתל כמו(איור 1B). לאחר קבלת אוכלוסייה טהורה מאוד של ECs, מעבר 3-5 תאים שימשו זרעים או microslide מסחרי או ערוצי זרימה microfluidic בהתאמה אישית(איור 1C). בעוד microslides זמין מסחרית הם בעיקר תאי זרימה מקבילים, או ערוצים בצורת Y עם פרמטרים מוגדרים במיוחד בגובה או זווית bifurcation, השימוש שקופיות microfluidic מאפשר להתאים את הפרמטרים הניסיוניים בגיאומטריה כלי vivo ודינמיקת זרימת דם 31. עם זאת, גדלים מיקרו-נוזלים בהתאמה אישית הם קטנים יותר נוטים להגביל את התפשטות התאים לגרום למוות תאיםיותר 32,33. שימוש בעודף של תאים מפצה על העובדה שרק אחוז קטן של תאים יהיה לדבוק. זה נצפתה כאשר היצרות הוצגה, שם תאים אנדותל הראו פנוטיפ מוארך יותר בהשוואה לערוץ מיקרופלויד מקביל(איור 1D). לתאי זרימה מסחריים יש שטח פנים גדול יותר שתאים יכולים להיקשר לו. פעולה זו דורשת פחות מספרי תאים עבור זריעה.

כדי ללמוד אינטראקציה אנדותל תא-דם, דם שלם היה perfused על מונולת אנדותל. דם ציטוט נאסף ביום הניסוי ומיד לפני שזבר התזתות הוחזר. תאים היו מגורה עם היסטמין כדי לגרום לשחרור VWF והדבקת טסיות דם 30 דקות לפני עירוי (איור 1E)34,35. בשל הממדים הקטנים, הערוצים המיקרו-נוזלים בהתאמה אישית אפשרו שימוש בנפחי דם קטנים יותר.

איסוף נתונים
כדי לחקור היווצרות תרומבוס על PAECs, Calcein AM-אדום פלואורסצנט תיוג תאי דם Alexa488-conjugated fibrin היו pered במשך 5 דקות ב 2.5 dyne/cm2 (איור 2A–C). תאי דם דבקים ופיברין שהופקדו היו מכמתים. התמונות נרכשו כל 30 שניות וכמתו עם ImageJ. היה חשוב להפחית את הרקע כדי לחסל את הפלואורסצינציה האוטומטית של טסיות דם לא הפרעות. האלגוריתם המשולש לסף נעשה שימוש להגדרת רקע מינימלי. היא אפשרה מדידה של אגרגטים טסיות דם קטנות (איור 2D).

כצפוי, בתנאים לא מגורה, לא היה איגוד של טסיות דם ופיברין לא אנדותל. כדי לקדם שחרור VWF ואיגוד טסיות דם, PAECs היו מגורה עם היסטמין, אשר הביא לעלייה מיידית של הדבקת טסיות דם להגיע לרמה לאחר 2.5 דקות. בשלב זה, טסיות דם החלו הפרשת גורמים autocrine כי גרם צבירת טסיות דם מחשוף פיברינוגן לתוך פיברין. פיברין הופקד לאחר 3 דקות ויצר צבירה יציבה עם טסיות דם לאחר 4 דקות(איור 2E).

כדי לחקור אם השפעה זו יכולה להיות מעוכבת על ידי נוגד קרישה אוראלי ישיר (DOAC), הדם טופל עם 10 nM dabigatran. Dabigatran נוספה לדלול הדם, שם הוא מעכב פקטור IIa במסלול קרישה, ומנע את המחשוף של פיברינוגן כדי ליצור סיבים פיברין. כאשר דם dabigatran שטופלו היה perfused על PAECs מגורה, היווצרות קריש יכול להיות מעוכב ישירות בעיקר על ידי עיכוב תצהיר פיברין(איור 2F).

ניתוח נתונים
כדי ללמוד את ההשפעה של מקורות אנדותל שונים על היווצרות טרומבוס, השינויים התאיים על 5 דקות זרימת דם נותחו. ה אנדותל תוקן ותזיות דם דבקות סומנו עם CD42b לפני הדמיה תחת מיקרוסקופ confocal. זה סיפק ניתוח מפורט עבור colocalization של טסיות דם ופיברין שיכול להצביע על גורמי קרישה לקויים בדם. ההשפעה של EC בהתהוות קריש נקבעה על ידי כתמי חיסון סטנדרטיים. מגעים תא אנדותל נשמרו, כפי שאושר על ידי כתמי VE-cadherin,המציין כי קרישי הדם שנוצרו על גבי מונוטל ה אנדותל ולא על המטריצה הבסיסית בין פערים אנדותל(איור 3). יתר על כן, השימוש במקורות תאים שונים הביא דפוסים שונים של thrombi יוצרים על אנדותל. HUVECs הם תאים אנדותל ורידים והראה הדבקה טסיות דם מוגבלת ותצהיר פיברין, בעוד PAEC ראשוני מחלה מחולים CTEPH הראה הדבקת טסיות דם בשפע ותצהיר פיברי יותר על גירוי היסטמין בהשוואה PAEC בריא. זה מצביע על כך אנדותל של חולי CTEPH להראות תגובתיות גבוהה יותר vasoactivation שתוצאות היווצרות תרומבוס מוגברת.

Figure 1
איור 1: סקירה סכמטית של הפרוטוקול. (א)מקורות שונים וסוגים שונים של תאי אנדותל היו מבודדים ותרבותיים לשימוש בערוץ זרימה מיקרופלויד לניסויים בזב. תמונות ברייטפילד מייצגות סוגים שונים של תאי אנדותל. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ב)תאים מבודדים היו מאופיינים בכתמים חיסוניים כדי לאשר פנוטיפ אנדותל. סרגל קנה מידה = 50 μm. (C) תאים ניתן לזרוע או שקופיות זרימה מסחרית או ערוץ microfluidic בהתאמה אישית. (ד)תמונות ברייטפילד מייצגות של HUVEC גדלו בגיאומטריות ערוץ שונות. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ה) התקנהניסיונית של ניסויי עירוי דם. דם נציטר נאסף, מדולל עם חיץ מלוח, ומוטבר על תאי אנדותל עם משאבת מזרק. וריד הריאה והטבור בנתון זה שונו מן אמנות רפואית סרויר, מורשה תחת רישיון גנרי ייחוס משותף יצירתי 3.0. http://smart.servier.com/ לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: רכישת תמונה וכמת של היווצרות טרומבוס. (א)הדמיית זמן-לשגות מייצג של קלצ'ין AM-אדום דבק טסיות דם תויג והפקיד Alexa488-התרועע fibrin ב 1, 3, ו 5 דקות לאחר כל זרימת דם על PAECs לאמגורה( B ) ועל paECs מגורה היסטמין. (ג)תמונות מייצגות של הדבקת טסיות דם ותצהיר פיברין ב- 1, 3, ו-5 דקות של עירוי עם דם שלם עם דגדגן דה-ביגטרן מנוון על PAECs מגורה היסטמין. סרגל קנה מידה = 50 μm. (D) סקירה סכמטית של כימות תמונה ב- ImageJ. (ה)כימות של הדבקת טסיות דם ותצהיר פיברין לכל 30 שניות על אנדותל לא מגורה והיסטמין מגורה. (ו)כימות ההשפעה של dabigatran על היווצרות תרומבוס מכמת על ידי הדבקת טסיות דם ותצהיר פיברין. הנתונים מיוצגים כ-± SD, n = 3. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תמונות קונפוקליות מייצגות של ניסויי זרימה לאפיון היווצרות טרומבוס בהדבקת טסיות דם ותצהיר פיברין על תאי אנדותל. Endothelial cell-cell contacts were characterized by VE-cadherin and measured in control PAECs, patient-derived CTEPH PAECs, and HUVEC. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

קרישה היא תוצאה של יחסי הגומלין המורכבים והמבוקרים באופן זמני בין אנדותל לרכיבי הדם. זה במבחנה שיטה מציגה שיטה לחקור תכונות טרומבוגניות של תאים אנדותל בזמן אמת. סוגים שונים של תאי אנדותל אנושיים עיקריים ניתן להשתמש, להקל על פקקת סיטו באופן ספציפי למטופל. במחקר זה, אנו המחישנו את השימוש בפרוטוקול זה השוואת תכונות ת'ומבוגניות של PAECs מבודד מתורמים בריאים לעומת חולי CTEPH. היווצרות תרומבוס חי נחקר על ידי שאיפה של דם שלם מנבדקים בריאים על אנדותל היסטמין מופעל, בעוד ההשפעה של DOAC נבדק כסוכן אנטי טרומבוטיק.

מלבד השימוש במיקרו-ערוצים הזמינים מסחרית, כפי שמופף בתוצאות המייצגות, המבוא של הערוצים המיקרו-נוזלים בהתאמה אישית מאפשר לחקור את ההשפעה של שינויים בגיאומטריה של כלי הדם על היווצרות טרומבוס. לדוגמה, הזרימה פוחתת בנקודת ענף או היצרות גורמת לעלייה בלחץ גיזר והפעלת טסיות דם נוספות36. עם זאת, מגבלה משמעותית של ערוצים אלה microfluidic בהתאמה אישית היא הדרישה של מספרי תאים גבוהים כדי ליצור שכבת מונו-שכבה יציבה של ECs כמתואר בשלב 2.3.2. זה עשוי להציג גורם מגביל כאשר תאים נגזרים המטופל הם נדירים. החוזקות של המפולות המיקרו-מפולות הזמינות מבחינה מסחרית הן ששטחי הפנים משתנים עבור תרבות תאים ושטחי צמיחה גדולים יותר, ובכך מאפשרים ל-ECs ליצור מונו-שכבת-שכבה מסוגמת ויציבה. מצד שני, שטח פנים גדול יותר יגרום ללומן גדול יותר. על פי Equation 1, זה דורש נפחי דם גבוהים יותר כדי להגיע שיעורי זרימה דומים כמו במיקרו-נוזלים בהזמנה אישית.

שיפור בפרוטוקול זה יכול להיות לחקור אובדן EC חי או שינויים בתקינות מחסום. נזק EC בפרוטוקול זה נמדד רק בסוף הניסוי. למעקב חי, ניתן לתייג את ה- ECs באמצעות mCherry VE-cadherin,לדוגמה 37. עם זאת, כמו זה היה צריך פרוטוקול אופטימיזציה מאוד עם תחליף וירוס יעיל, תא חשמלי-substrate חישת מכשול (ECIS) יכול לשמש כחלופה ללמוד שלמות אנדותלופונקציית מחסום 38. התזת ערוצים מיוחדים של ECIS מאפשרת ניטור אורכי של תקינות מחסום אנדותל תחת זרימה. תכונות ECIS ספציפיות אלה מאפשרות מדידות מקבילות של מאפייני מחסום אנדותל והיווצרות טרומבוס. דרכים חלופיות למדידות מקבילות של מחסום EC, במיוחד במערכים המותאמים אישית, כוללות שימוש ב-dextrans פלורסנט ב-perfusate, המפזר את הלומן, בהתאם למאפייני מחסום ה-EC.

מגבלה של הפרוטוקול המתואר היא כי ECs מוסרים מגוף האדם ותרבות על פלסטיק תרבות רקמות, שהוא נוקשה, שקוע מלאכותי. תאים להסתגל לסביבה הביופיזית שלהם. זה יכול להשפיע על תגובת אנדותל להפעלת טסיות דם, כפי שיש קשר בין הפעלת טסיות דם ונוקשות קיר39. למרות התאמות אלה לפלסטיק תרבות, תאים לשמור על מאפיינים ספציפיים למחלה שניתן לזהות בהשוואה ישירה עם ECs נגזר תורמים בריאים כפי שמוצג עם שליטה, CTEPH-PAEC, ו HUVEC שהפעיל דפוסים שונים של הדבקת טסיות דם ותצהיר פיברין לאחר 5 דקות של דם עירוי.

בניגוד לפרוטוקולים אחרים, מערכת זו משתמשת בדם שלם בעוד שאחרים חוקרים אינטראקציה EC עם רכיב דם יחיד כגון טסיות דם ולוקוציטים19,20,21. פותחו מודלים מיקרו-נוזלים מתקדמים יותר המאפשרים את חקר תפקוד אנדותל במודל כלי דם עם גאומטריית כלי עגולה ומטריצה חוץ-תאית רכה. עם זאת, אלה ממוטבים עם HUVECs40,41,42. החידוש של הפרוטוקול המתואר הוא השימוש ECs הראשי בשילוב עם דם שלם להביא את הדוגמנות של פקקת סיטו צעד אחד קרוב יותר בתנאי vivo. לאחר אופטימיזציה של הפרוטוקול לשימוש ב-ECs הנגזר ממטופל ודם הנגזר ממטופל ממטב עוד יותר את מידול המחלהבמבחנה , ומאפשר הערכה של היווצרות טרומבוס מותאמת אישית וטיפול תרופתי.

הפרוטוקול המתואר יכול להיות מיושם כדי ללמוד את ההשפעה של טיפולים נגד קרישה על תאים נגזרים ממטופל. בעוד שהשתמשנו dabigatran לעכב היווצרות טרומבוס, ניתן להשתמש נוגדי קרישה אחרים, כגון rivaroxaban, אשר מעכב ישירות פקטור Xa במפל קרישה. מעכבי טסיות דם ישיר כמו clopidogrel או אספירין ניתן ללמוד גם כן, כמו אלה לפעול על השלב העיקרי של hemostasis שבו טסיות דם לאגד ECs. בסופו של דבר, היכולות הטרמבוגניות של ECs ספציפי למטופל באינטראקציה עם הדם של המטופל עצמו יכול לשמש כדי לחזות את ההשפעה האישית של טיפול קרישה על המטופל הבודד. יתר על כן, נוק-דאון של חלבונים ספציפיים יכול לספק מידע פונקציונלי נוסף.

ישנם כמה שלבים בפרוטוקול המתואר שהם קריטיים לניסוי סבר מוצלח. ראשית, במהלך הבידוד של תאים ראשוניים, יש צורך להשיג תרבות EC טהורה מאוד. שנית, חשוב שה-ECs ירכיבו שכבת מונו-שכבתית יציבה. אם זה לא המקרה, שינוי קל בלחץ גיה יכול לגרום נזק אנדותל והפעלה של מפל קרישה, או טסיות דם יכול להתחיל לקשור לקרום המרתף, אשר יספק תוצאות חיוביות כוזבות. שלישית, חיוני למנוע בועות אוויר, כמו אלה יכולים לפגוע אנדותל ובכך להשפיע על התוצאות.

לאחר חישוב מחדש של הדם הקלוע עם סידן כלוריד ומגנזיום כלוריד, חשוב להתחיל מיד את ניסוי התזת. חישוב מחדש גורם לתגובה מהירה בהפעלת טסיות דם והיווצרות טרומבוס, וכתוצאה מכך קרישה מהירה בדגימה.

לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול רב-תכליתי מאוד כדי ללמוד אינטראקציות שלמים של תאי אנדותל בדם במהלך פקקת.

Disclosures

המחברים לא מצהירים על ניגוד עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים יאן Voorberg מהמחלקה של חלבוני פלזמה, מחקר Sanquin ומעבדה Landsteiner, אמסטרדם UMC, המרכז הרפואי האקדמי, אמסטרדם, הולנד, על הקלט שלו בכתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי הברית ההולנדית CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] הוענק Phaedra וקונסורציום חיבור מחדש, כמו גם מענק דחף 2018 הוענק קונסורציום Phaedra IMPACT. מענקים אלה כוללים מימון קולקטיבי של קרן הלב ההולנדית, הפדרציה ההולנדית של המרכזים הרפואיים האוניברסיטאיים, הארגון ההולנדי למחקר ופיתוח בריאות, והאקדמיה המלכותית למדעים של הולנד. יתר על כן, עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר האירופית במסגרת תוכנית המענק המתקדם 'VESCEL' (מספר מענק: 669768). XDM ממומן על ידי מענק מחקר של המכון למחקר לב וכלי רכב (ICaR-VU) במרכז הרפואי של אוניברסיטת VU, אמסטרדם, הולנד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Merck 106404
20 mL syringe BD 300613
20X objective Olympus N1492900 LUCPLFLN20XPH/0.45
2-Propanol (IPA) Boom 760514555000
Aladdin Syringe Pump Word Precision Instruments AL-4000
Alexa488-Fibrinogen Invitrogen F13191 15 ug/mL
Alexa647-Goat anti Rabbit Invitrogen A21245 1:100
Biopsy punch 1 mm diameter Ted Pella 15110-10
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647
CaCl2 Sigma-Aldrich 21115
Calcein AM-Red Invitrogen C3099 1:1000
CD42b-APC Miltenyi Biotec 130-100-208 1:100
Citric Acid Merck 100244
Collagen Type I, rat tail Corning 354249 0.1 mg/mL
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish Corning 3295
Cross-flow hood Basan
Desiccator Duran 2478269
D-Glucose Merck 14431-43-7
EDTA Invitrogen 15575020
Endothelial Cell Medium (ECM) ScienCell 1001
Fibronectin Human Plasma Sigma-Aldrich F0895
Flow tubing ibidi 10831, 10841
Gelatin Merck 104070 0.1%
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Hoechst 33342 Invitrogen H1399 1:1000
micron-Slide VI 0.4 flow chambers ibidi 80606
ImageJ NIH v1.49
KCl Merck 7447-40-7
Lab oven Quincy 10GC
LS720 Fluorescent microscope Etaluma LS720
Luer connector ibidi 10802, 10825 Male elbow connectors, Female tube connectors
MACS magnetic beads (anti-CD144) Miltenyi Biotec 130-097-857 1:5
MgCl2 Sigma-Aldrich M1028
Microscopy slides, 76 x 26 mm Thermo Scientific AAAA000001##12E
Negative photoresist, SU-8 Microchem
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Lonza 13-114E
Paraformaldehyde (PFA) Merck 818715 4% PFA in PBS
Penicillin/streptomycin (P/S) Gibco 15140-122 1%
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-094 no calcium or magnesium
Plasma chamber, CUTE Femto Science
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 Dow 101697
sodium citrate blood collection tubes BD 363048
trisodium citrate Merck 106448
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-045
VE-Cadherin (D87F2)-XP Cell Signaling 2500 1:300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S. Endothelial cell control of thrombosis. BMC Cardiovascular Disorders. 15, 130 (2015).
  2. Pearson, J. D. Endothelial cell function and thrombosis. Best Practice & Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).
  3. Bochenek, M. L., Schafer, K. Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis. Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).
  4. Swieringa, F., et al. Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).
  5. Macfarlane, R. G. An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier. Nature. 202, 498-499 (1964).
  6. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiological Reviews. 93 (1), 327-358 (2013).
  7. Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing. Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).
  8. Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis. Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).
  9. Karino, T., Motomiya, M. Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation. Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).
  10. ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).
  11. Witkin, A. S. Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team. Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).
  12. Kim, N. H., et al. Chronic thromboembolic pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 53 (1), 1801915 (2019).
  13. Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480 (2019).
  14. Giri, J., et al. Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).
  15. Sharma, S., Lang, I. M. Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).
  16. Eisenberg, P. R., et al. Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension. Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).
  17. Bochenek, M. L., et al. From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).
  18. Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation. Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).
  19. Barendrecht, A. D., et al. Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow. Journal of Visualized Experiments. (125), e55658 (2017).
  20. Vajen, T., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), e57009 (2018).
  21. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. (126), e55917 (2017).
  22. Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).
  23. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429 (2012).
  24. Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).
  25. Szulcek, R., et al. Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).
  26. Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. Role of high shear rate in thrombosis. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).
  27. Jain, A., et al. Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium. Biomedical Microdevices. 18 (4), 73 (2016).
  28. van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA. Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).
  29. Smits, J., et al. Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763 (2018).
  30. Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation. Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).
  31. Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  32. Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays. Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).
  33. Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces. Journal of Nanobiotechnology. 12, 54 (2014).
  34. McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. Weibel-Palade bodies at a glance. Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).
  35. Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis. Frontiers in Immunology. 8, 846 (2017).
  36. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  37. Huveneers, S., et al. Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling. Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).
  38. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  39. Yamasaki, F., et al. Association between arterial stiffness and platelet activation. Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).
  40. Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).
  41. Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).
  42. Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. Journal of Visualized Experiments. (64), e3958 (2012).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 159 פקקת יתר לחץ דם ריאתי טרומבואמבולי כרוני תאי אנדותל טסיות דם פיברין קרישה דם
במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manz, X. D., Albers, H. J.,… More

Manz, X. D., Albers, H. J., Symersky, P., Aman, J., van der Meer, A. D., Bogaard, H. J., Szulcek, R. In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time. J. Vis. Exp. (159), e61068, doi:10.3791/61068 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter