Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro Microfluidic Disease Model for å studere fullblods-endotelinteraksjoner og blodproppdynamikk i sanntid

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/61068
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 1, 3, 1, 1,5,6
1Department of Pulmonary Diseases, Amsterdam UMC, VU University Medical Center, Amsterdam Cardiovascular Sciences (ACS), 2BIOS Lab-on-a-Chip group, University of Twente, 3Applied Stem Cell Technologies Group, University of Twente, 4Department of Cardio-thoracic Surgery, Amsterdam UMC, VU University Medical Center, 5Institute of Physiology, Charité-Universitätsmedizin, 6German Heart Center

Summary

Vi presenterer en in vitro vaskulær sykdom modell for å undersøke fullblods interaksjoner med pasient-avledet endotel. Dette systemet tillater studiet av trombogene egenskaper av primære endotelceller under ulike omstendigheter. Metoden er spesielt egnet til å evaluere in situ trombogenitet og antikoagulasjonsbehandling i ulike faser av koagulasjon.

Abstract

Dannelsen av blodpropper innebærer komplekse interaksjoner mellom endotelceller, deres underliggende matrise, ulike blodceller og proteiner. Endotelet er den primære kilden til mange av de store hemostatiske molekylene som kontrollerer blodplateaggregasjon, koagulasjon og fibrinolyse. Selv om mekanismen for trombose har blitt undersøkt i flere tiår, fokuserer in vitro-studier hovedsakelig på situasjoner med vaskulær skade der subendothelial matrise blir utsatt, eller på interaksjoner mellom celler med enkeltblodkomponenter. Vår metode gjør det mulig å studere interaksjoner mellom fullblod og et intakt, sammenføyd vaskulært cellenettverk.

Ved å bruke primære humane endotelceller gir denne protokollen den unike muligheten til å studere påvirkning av endotelceller på trombusdynamikk og gir verdifull innsikt i patofysiologien til trombotisk sykdom. Bruken av skreddersydde mikrofluidiske strømningskanaler gjør det mulig å bruke sykdomsspesifikke vaskulære geometrier og modellspesifikke morfologiske vaskulære endringer. Utviklingen av en trombe registreres i sanntid og kvantitativt preget av blodplateadhesjon og fibrin deponering. Effekten av endotelfunksjon i endret trombedynamikk bestemmes av postanalyse gjennom immunofluorescence farging av spesifikke molekyler.

De representative resultatene beskriver eksperimentelt oppsett, datainnsamling og dataanalyse. Avhengig av forskningsspørsmålet kan parametere for hver seksjon justeres, inkludert celletype, skjærhastigheter, kanalgeometri, medisinering og postanalyseprosedyrer. Protokollen valideres ved å kvantifisere trombedannelse på lungearterien endotelet til pasienter med kronisk tromboembolisk sykdom.

Introduction

Endotelet danner det indre cellulære laget av blodkar og skiller blod fra det omkringliggende vevet. Det har blitt beskrevet som et dynamisk organ som aktivt regulerer mikromiljøet og reagerer på ytre stimuli1. På grunn av sin direkte kontakt med rennende blod, er endotelet avgjørende i kontroll av hemostase og trombose og er den primære kilden til mange av de store regulatoriske molekylene som kontrollerer blodplateaggregasjon, koagulasjon og fibrinolyse2. Friske, ikke-aktiverte endotelceller (EC) produserer flere molekyler som motvirker blodplateaktivering og forhindrer koagulasjons- og trombedannelse for å opprettholde blodstrømmen, for eksempel prostacyklin, trombomodulin eller vevsfaktorveihemmer (TFPI)2,,3. Dette forhindrer vedheft av blodplater, blodplateaggregasjon og trombedannelse. Skade eller aktivering av karveggen resulterer i en prokoagulant endotelfenotype som initierer lokalisert blodplate vedheft og koagulasjon2,,4. Ved endotelaktivering holder blodplater seg til von Willebrand Factor (VWF), et multimerisk protein som frigjøres fra EC-er, eller til eksponerte bindingssteder i den underliggende subendothelialmatrisen. Deretter starter molekylære endringer i blodplater og eksponering for vevsfaktor (TF) aktiveringen av koagulasjonssystemet, noe som induserer trombedannelse ved fibrinpolymerisering5,6. Sammen gir den resulterende blodpropp grunnlaget for sårlukking ved re-endotelialisering7. Perturbasjoner i koagulasjonssystemet kan føre til blødningsforstyrrelser, som von Willebrands sykdom, hemofili eller trombose, som ofte skyldes en dysregulert pro- og antitrombotisk balanse i endotelhemotisk vei2,3.

Prosessen med hemostase forekommer i både arteriell og venøs sirkulasjon. Mekanismene underliggende arterielle og venøse trombose er imidlertid fundamentalt forskjellige. Mens arteriell trombose, som sett i iskemisk hjertesykdom, for det meste er drevet av brudd på en aterosklerotisk plakk under forhold med høyt skjærstress, utvikler venøs trombose for det meste i fravær av endotelskade i en tilstand av stasis8,9,10. En dyp venetrombus kan embolisere og reise mot lungearteriene, hvor det forårsaker lungeemboli. Dette kan føre til kroniske vaskulære hindringer som fører til betydelig nedsatt funksjonsevne som kan fremme utviklingen av klotoniske lungesykdommer, inkludert utvikling av kronisk tromboembolisk pulmonal hypertensjon (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH er preget av forhøyet lungetrykk på grunn av hindringer i lungearteriene av tromboembolisk materiale etter minst tre måneder med antikoagulasjonsbehandling15. I tillegg til lunge emboli, er det postulert at lunge endotelet gir et protrombotisk miljø i CTEPH som letter in situ tromboseogkroniske hindringer i lungearteriene, forårsaker økningen i blodtrykket som til slutt kan føre til hjertesvikt, hvisubehandlet 16,17.

I løpet av de siste årene har ulike studier ført til utvikling av analyser for å undersøke trombedannelse ved å måle blodplatefunksjon og koagulasjon18. Men de fleste av dem enten studere samspillet mellom fullblod med enkelt ekstracellulære matrisekomponenter som kollagen eller fibrins, eller endotelfunksjon i samspill med enkeltblodkomponenter, for eksempel endotelplatelet eller endotel-leukocyttinteraksjon 19,,20,,21,,22. Disse analysene utføres oftest med humane navlestrengendende celler (HUVEC), da disse cellene lett oppnås. Imidlertid er hemostatiske gener differensialt uttrykt over vaskulært tre, kartyper og organsystemer23,24, noe som gjør bruk av HUVECs for å representere endotelceller involvert i arteriell trombose eller lungeemboli problematisk23.

I tillegg til EC plastisitet, kan sykdomsspesifikke heodynamiske endringer og endringer i vaskulær morfologi fremme trombedannelse ved normal endotel25. Høyere skjærpriser, på grunn av lokal vasokonstriksjon eller endringer i kargeometri, for eksempel, kan føre til akutt trombedannelse, noe som forårsaker en stenose som akselererer opphør av blodstrømmen26. Bruken av skreddersydde mikroengineerte strømningskanaler gjør det mulig å spesifikt designe vaskulære geometrier som er representative for (pato)biologi. På denne måten er det mulig å studere effekten av lokale biomekaniske krefter på sunne eller syke EC27.

Det er antikoagulasjonsterapi er tilgjengelig for målretting av ulike faser og molekyler i koagulasjonskaskaden, som alle utgjør spesielle risikoer og fordeler som kan være spesifikke for visse lidelser. Tilnærmingen til sykdomsmodellering beskrevet i dette papiret er spesielt egnet til å teste effekten av ulike antikoagulasjons- og platehemmerbehandlinger på trombedynamikk.

Målet er å presentere en modell av trombose som inkluderer primære ECer, noe som gir en allsidig modell egnet for analyse av ulike former for trombose avhengig av hvilken type primære ECer som brukes. Som en illustrasjon brukte vi lungearterie endotelceller fra CTEPH-pasienter i samspill med hele humant blod som inneholder alle komponenter som er involvert i trombedannelse (blodplater, leukocytter, erytrocytter, koagulasjonsproteiner og kofaktorer). Denne tilnærmingen kan brukes i kommersielle parallelle strømningskanaler eller i skreddersydde mikrofluidiske strømningskanaler med en bestemt vaskulær design. Som sådan kan modellen til slutt brukes i studiet av trombedannelse og oppløsning, for vurdering av inflammatoriske responser i sykdomsmodellering, for platehemmende eller antikoagulasjonsterapi, og til slutt for personlig medisin.

Denne studien beskriver isoleringen av primære humane lungearterie endotelceller. For isolering av andre primære humane endotelceller refererer vi til tidligere publiserte metoder, inkludert lungemikrovaskulære endotelceller25,humane navlestrengende urinceller28, og blodsirkulasjonsende endotelkolonidannende celler Figur 1A29.

Protocol

Denne studien ble godkjent av det institusjonelle Medisinske etiske gjennomgangsrådet i VU Medical Center Amsterdam, Nederland (METC VUmc, NL69167.029.19). Primær celleisolasjon og blodinnsamling av mennesker ble utført etter skriftlig informert samtykke ble innhentet i samsvar med Helsingfors-erklæringen.

1. Isolasjon og kultur av primære humane lungearteriale endotelceller (PAEC)

  1. Varm komplett endotelcelle medium (cECM) supplert med 5% føtal storfe serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin (P / S), 1% endotelcellevekst kosttilskudd (ECGS), og 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), i et vannbad ved 37 °C. Steriliser kirurgisk saks, tang og en skalpell med enten en 120 °C varmesterilisator eller 70% etanol. Utfør isolering av PAEC i et laminært strømningskabinett under sterile forhold.
  2. Coat en høy affinitet celle binding 60 mm celle kultur parabolen (se Table of Materials) med 2 ml på 5 μg / ml fibronectin og inkubere ved 37 ° C i minst 15 min.
  3. Få lungearterie (PA) vev fra kirurgi (f.eks., lobektomi eller lungeendearterektomi), oppbevares i 4 °C kaldledningsbuffer (4 mM kaliumklorid, 140 mM natriumklorid, 10 mM HEPES, 11 mM D-glukose og 1% P/S, pH = 7,3), og hold på is til isolasjon.
  4. Isoler endotelceller fra PA innen 2 timer etter fjerning av vev. Ta PA med tang og legg den i en 10 cm petriskål for å vaske med PBS. Hvis PA fortsatt er en ring, kutt lungearterien åpen med saks. Vær veldig forsiktig med å ikke berøre det innerste laget av fartøyet med verktøyene, da endotelet lett skades og/ eller fjernes.
  5. Fjern fibronectin fra cellekulturfatet og tilsett 4 ml cECM medium.
  6. Ta PA-vevet med tang og legg det i mediet. I mellomtiden skrap forsiktig det indre laget av fartøyet inn i mediet med en skalpell. Ofte kan lipidakkumuleringer ses i karveggen. Prøv å utelate disse, da de vil påvirke celleutveksten.
  7. Hold cellene i kultur til små kolonier av endotelceller begynner å vises.
  8. Bytt medium annenhver dag. Hvis fibroblaster forurenser kulturen, bør du rense den med magnetisk affinitetscelleseparasjon for CD144 med et sett, i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialse tabell). Bruk metoden med to kolonner for den første rensingen og én kolonne-metoden for hver etterfølgende rensing. Vanligvis er en kultur definert ren når strømningscytometri oppdager ≤ 10% forurensende celler.
  9. Del celler i forholdstall på 1:3 til 1:4 til tilstrekkelige PAECer dyrkes for eksperimentell bruk. Når PAECer er klare til bruk, fortsetter du med neste trinn.
  10. Etter rensing må primære endotelceller karakteriseres for tilstedeværelse av EC-spesifikke markører (f.eks.VE-kadherin, CD31, TIE2) og for fravær av glatte muskelceller (α-SMA), fibroblast (vimentin) og epitelmarkører (cytokeratin) markører (figur 1B).

2. Fremstilling av strømningskamre og PAEC-monolag

MERK: Avhengig av hypotesen, bruk enten de kommersielt tilgjengelige strømningskamrene (se Materialtabell og figur 1C Alternativ A, trinn 2.1 i protokollen) eller et skreddersydd mikrofluidisk strømningskammer ( figur1C Alternativ B, trinn 2.2 i protokollen).

  1. Cellesåing av endotelmonolag i kommersielt tilgjengelige mikrosklier
    MERK: Kommersielt tilgjengelige strømningskamre er enkle å bruke og gir et laminært strømningsmønster i hele kanalen som kan brukes med høye skjærhastigheter. Disse mikroskliene er utformet for å tillate flerkanals parallelle løp og gi en nøyaktig og reproduserbar strømningsprofil. Fordi de er optimalisert for invertert mikroskopi, er det mulig å fange lysstoffbilder av høy kvalitet. Videre er ulike dimensjoner av strømningskamre tilgjengelig i forskjellige kanalstørrelser eller geometrier. 6-brønnsflytkanalene foretrekkes for denne analysen fordi disse mikroskliene har små dimensjoner og tillater multiparallelkjøringer.
    1. For å belegge en kanal med en 6-brønns strømningsglidning (3,5 mm bredde x 0,4 mm høyde x 17 mm lengde) bruk 30 μL på 0,1 % gelatin per kanal og inkuber ved 37 °C i minst 15 min.
    2. For å så en kanal, prøv 10 cm2 av samtidige PAECer og spinn ned på 300 x g i 7 min ved romtemperatur (RT).
    3. Suspender PAECer i 600 μL cECM og pipette 100 μL (1,5 cm2 ) cellefjæring i én kanal. Dette dekker mikroraset gjennom kapillærhandling. Hvis det går for sakte, vil luftbobler dannes. Unngå dannelse av luftbobler ved å bruke litt mer kraft ved pipettering.
      MERK: Celletetthet påvirker endotelfenotype. Totalt 1,5 cm2 av samtidige celler per kanal er overkonfluent, fordi kanalen har et overflateareal på 0, 6 cm2. Før du starter eksperimentet, kultur disse cellene i ytterligere 6 dager i kanalene til de når maksimal samløpet.
    4. Tilsett ytterligere 50 μL cECM til kanalen for å gi tilstrekkelig medium for inkubasjon over natten ved 37 °C, 5 % CO2. Endre mediet neste dag for å vaske bort ubundne celler.
    5. Hold cellene i kultur i 6 dager ved 37 °C, 5 % CO2 slik at PAEC kan danne et fast, sammenføyd monolag. Bytt medium annenhver dag med 150 μL cECM.
    6. Ved dag 7 må PAEC behandle PAEC med 100 μL 1 μM histamin i ECM og 1 % FBS uten andre tilsetningsstoffer i 30 minutter før analysen. Stimulansen kan velges ad libitum. For eksempel har TNF-α blitt brukt som en inflammatorisk aktivator.
  2. Utarbeidelse av skreddersydde mikrofluidiske strømningskamre
    MERK: Skreddersydde strømningskamre tilpasses brukerens behov fordi dimensjonene og geometriene enkelt kan endres til preferanse. For eksempel, for å etterligne et mer fysiologisk relevant fartøy, kan en stenose innføres (figur 1D). Denne tilnærmingen tillater bruk av svært små blodvolumer sett i mikrovaskulær sykdom.
    1. Myk litografi av polydimetylsiloxane (PDMS) ved hjelp av mønstrede wafers
      1. Kombiner PDMS herdingsmiddel og prepolymer på en mikrobalanse på et 1:10-forhold og bland godt med en generell laboratoriemikser.
      2. For å fjerne de resulterende luftboblene, degas PDMS i en desiccator i ca 1 time.
      3. Linje en glass Petri skål med aluminiumsfolie og tilsett noen dråper vann før du plasserer wafer i foret Petri parabolen. Wafer fungerer som formen for den skreddersydde kanalen.
        MERK: Wafers eller mugg er levert av de rene rommene. Negativ fotoresist er mønstret på wafers for å skape utstående kanallignende funksjoner med følgende typiske dimensjoner: 300 μm bredde x 270 μm høyde x 14 mm lengde.
      4. Hell de avgassede PDMS på wafer plassert i et glass Petri parabolen.
      5. Degas PDMS strømmet på wafer i en desiccator for en ekstra 15 min for å fjerne eventuelle bobler som kan ha dannet under støping.
      6. Fjern petriskålen som inneholder formen og PDMS fra desiccatoren og legg den i en 60 °C ovn i minst 4 timer for å kryss-koble PDMS.
    2. Utarbeidelse av krysskoblede PDMS for liming til glasslyser
      1. Fjern mugg og krysskoblede PDMS fra ovnen og flytt til en tverrstrømningshette for støvfri håndtering av PDMS.
      2. Fjern eventuelle PDMS fra bunnen av formen ved hjelp av en skalpell og fjern den øverste skive av krysskoblet PDMS fra formen.
      3. Linje utsatt mønstret PDMS skive med tape for å hindre at støvpartikler kommer i kontakt med PDMS-kanalene.
      4. Skjær PDMS-brikkene til størrelse og punch 1 mm diameter innløp og uttak ved hjelp av en biopsi punch.
    3. Sterilisering og binding av PDMS mikrofluidiske kanaler og glasssklier
      1. Rengjør glassmikroskopi glir ved grundig skylling med etanol etterfulgt av en isopropylalkoholskylling. Etter hver skylling, tørk lysbildene grundig med en nitrogenpistol.
        MERK: Alternativt kan dekselslipper brukes hvis analysen utføres ved hjelp av et konfokalmikroskop.
      2. Åpne plasmakammeret og last de rengjorte mikroskopiskliene og mikrofluidiske chips uten beskyttelsestape.
      3. Lukk kammeret, tøm med nitrogen i 1 min, og fyll kammeret med filtrert luft til et trykk på 500 mTorr er nådd.
      4. Utsett glassskliene og PDMS-brikkene til plasmaet i 40 s med en effekt på 50 W og en frekvens på 5 kHz.
      5. Etter eksponering for plasma, umiddelbart binde glasssklier og mikrofluidic chips. Oppbevar enhetene i sterile Petri-retter.
  3. Cellesåing av endotelmonolag i mikrofluidiske kanaler
    1. Coat den skreddersydde mikrokanal ved å pipettering 10 μL på 0,1 mg / ml kollagen Type I eller 0,1% gelatin per kanal og inkuber ved 37 ° C i 30 min.
    2. For å så fire mikrokanaler, trypsinize 25 cm2 av samtidige PAECer og spinn ned på 300 x g for 7 min ved RT.
      MERK: Bare en liten prosentandel av cellene vil holde seg til overflaten. Derfor er det nødvendig å bruke et overskudd av celler for å oppnå et samtidig monolag.
    3. Suspender PAECer i 20 μL cECM og bruk 5 μL cellefjæring for hver kanal. På grunn av de små kanaldimensjonene vil kapillærkreftene fylle mikroraset og forhindre luftbobledannelse.
    4. Bytt medium etter 3–4 timer for å vaske ubundne celler.
    5. Hold cellene i kultur i 6 dager for å tillate PAEC å danne en fast, samtidig monolayer. På grunn av det lille volumet, endre mediet hver dag med 150 μL cECM. La pipettespissen være fylt med medium i innløpet og sett en tom spiss i stikkontakten. Dette vil tjene som et reservoar som gir tilstrekkelige næringsstoffer og vekstfaktorer til cellene og hindre lysbildet fra å tørke ut.
    6. På dag 7, beis kjernene i de levende cellene med Hoechst (1:5,000 i cECM) og inkubere i maksimalt 10 min ved 37 °C og 5% CO2.
    7. Vask forsiktig 3x med cECM og behandle med 1 μM histamin i ECM + 1% FBS i 30 min før analysen. Stimulansen kan velges ad libitum. For eksempel har TNF-α blitt brukt som en inflammatorisk aktivator.
    8. Bruk 1,27 mm diameter 90° vinklede kontakter i rustfritt stål for å koble utløpet av PDMS-sjetongene til rør.

3. Fremstilling av menneskelig fullblod

  1. Trekk venøst blod fra forsøkspersoner i 0,109 M natriumsitrat antikoagulant. Dette kan være fra friske eller syke personer som ikke får antikoagulasjonsbehandling. Snu forsiktig rørene for å blande. Den totale mengden blod som kreves for et eksperiment, avhenger hovedsakelig av den valgte strømningshastigheten. Med en strømningshastighet på 25 ml/t, i ibidi 6-brønnslys, er et totalt volum på 2 ml med litt overskudd for å fylle opp kar og strømningskanal tilstrekkelig.
  2. Overfør blodet til et 50 ml rør og tilsett Calcein AM (1:10,000) for å fluorescerende merke blodceller og Alexa488-fibrinogen (15 μg / ml) for å konjugere autolog fibrinogen. La blodet inkubere ved 37 °C i 15 min for å tillate fullstendig absorpsjon.
  3. Fortynn blodet 1:1 med rekalsifiseringsbuffer (154 mM natriumklorid, 10,8 mM trinatriumsitrat, 2,5 mM kalsiumklorid og 2 mM magnesiumklorid) umiddelbart før forsøksstart.
    MERK: Hemodilution med maksimalt 50% påvirket ikke koagulasjonsreaksjonstiden30. Videre kan menneskelig blod inneholde virus og andre midler. Arbeid med blodprøver medfører derfor risiko for infeksjon. Det anbefales sterkt å bruke egnede sikkerhetstiltak og å håndtere materialet med forsiktighet.

4. Montering av strømningssystemet

  1. Før du kobler slangen, må du skyll strømningsrørene med en 20 ml sprøyte fylt med vaskebuffer (36 mM sitronsyre, 103 m Natriumklorid, 5 mM kaliumklorid, 5 mM EDTA og 0,35 % wt/storfe serumalbumin [BSA], pH = 6,5) for å hindre koagulering av blodet i rørene.
  2. Bruk en ny sprøyte til å fylle strømningsrørene med HEPES-buffer (132 mM natriumklorid, 20 mM HEPES, 6 mM kaliumklorid, 1 mM magnesiumklorid, 1% BSA og 5,5 mM D-glukose, pH = 7,4) og koble den forsiktig til en albueformet Luer-kontakt til mikroskliet fylt med EC i medium. Mens du fester kontaktene til mikrokanaler, prøv å forhindre dannelse av luftbobler i lysbildet. Bobler vil skade endotelet og påvirke resultatene av eksperimentet. Fjern vaskebufferen helt og ikke la bufferen komme i kontakt med cellene, da dette vil hemme koagulasjon.
  3. Konfigurer strømningssystemet som vist i figur 1E. Ta opp 2 ml vaskebuffer i en 20 ml sprøyte og skyll for å hindre koagulering når blodet kommer inn i sprøyten. Sett den tomme sprøyten inn i sprøytepumpen og koble utløpsrøret til en hunnluerkontakt til denne sprøyten. Sett innløpsrøret i en beholder som inneholder det tilberedte menneskelige blodet.
  4. Slå på sprøytepumpen og beregn strømningshastigheten. Strømningsprofiler følger et parabolsk mønster i høyden. Forutsatt at blodet fungerer som en newtonsk væske, bruk følgende formel til å beregne strømningshastighet.
    Equation 1 (Ligning 1)
    Hvor
    τ = skjærstress Equation 2
    η = dynamisk viskositet Equation 3
    Q = volumetrisk strømningshastighet Equation 4
    h = kanalhøyde Equation 5
    w = kanalbredde Equation 5
    MERK: For lungearterial strøm med blod i de kommersielle 6-kanals mikroskliene med rektangulære dimensjoner med 0,4 mm høyde og 3,5 mm bredde, ble en volumetrisk strømningshastighet på 25 ml/t brukt i 5 min. På grunn av forskjellene i dimensjonene til de skreddersydde flytkanalene, endres også disse dynamikkene. Juster variablene for å sikre at skjærstresset er likt.
  5. Definer diameteren på 20 ml sprøyten til 19,05 mm og sett programmet til Uttak. Å trekke blodet gjennom den cellebelagte kanalen ved påføring av et negativt trykk vil garantere konstant skjærhastighet og minimal skade på cellelaget.

5. Sette opp mikroskopet for bildeanskaffelse

  1. Bruk et 20x mål og plasser mikrosklien på scenen av det inverterte fasekontrasten fluorescerende mikroskopet. Start mikroskopprogramvaren for å flytte scenen i Z-retningen for å fokusere på cellemonolaget.
  2. Velg et interesseområde (ROI) i begynnelsen, midten og slutten av hver flytkanal. Begynnelsen og slutten skal være minst 3 mm unna innløpet og uttaket på kanalen. Still inn de blå, grønne og røde fluorescerende filtrene med laserkraft og lysintensitet som viser minimal bakgrunn.

6. Perfusjon av fullblod over PAECer

  1. Når alt er koblet til som i figur 1E og mikroskopet er klart for opptak, trykker du på Start for å spille inn en video. Skyv Start på sprøytepumpen for å perfusere blodet over endotelet.
  2. Så snart blodet begynner å strømme over endotelet, få bilder med forhåndsvalgte aktive kanaler og ROI-posisjoner hver 15 s i 5 min.
  3. Etter 5 min perfusjon, fullfør opptaket og stopp sprøytepumpen. Demonter strømningskammeret og fjern slangen nøye. Ofte vil en luftboble dannes hvis dette gjøres med for mye kraft. Prøv å forhindre dette, fordi dette vil skylle bort endotelet.

7. Fiksering og etter analyse

MERK: For å utelukke falsk positiv blodplate vedheft ved endotelskade på grunn av perfusjonseksperimentet, er det nødvendig å karakterisere endotelcellene for deres gapdannelse og monolayer. Dette kan gjøres ved regelmessig immunofluorescence farging for VE-cadherin.

  1. Etter perfusjon og demontering av slangen, vask mikrofluidisk kanal med HEPES. Pipette HEPES inn i kanalen slik at den vil presse blodet til uttaket. Fjern overflødig med en annen pipette.
    1. Eventuelt vaske kanalen med PBS++ (med 0,5 mM magnesiumklorid og 0,9 mM kalsiumklorid) for å hindre utfelling av protein supernatant. Dette reduserer bakgrunnen. Et ekstra vasketrinn kan imidlertid endre cellulær atferd og morfologi som kan påvirke bildebehandling etter analyse.
  2. Fjern HEPES og fest endotelet med tilslødede blodplater og deponert fibrin ved å pipettering 37 °C varmet 4 % paraformaldehyd (PFA) inn i kanalen og inkuber i 15 min ved RT.
    MERK: Vær ekstra forsiktig når du fester de skreddersydde mikrofluidiene, da disse kanalene er enda mindre, noe som fører til høyere skjærkrefter i kanalen under hvert håndteringstrinn.
  3. Fjern PFA fra kanalen og vask 3x med PBS. Mikroskliene er nå klare for en standard fargeprotokoll for å karakterisere endotelcellemarkører som VE-cadherin, CD31, P-selectin eller integrins, CD42b for tilhengerplater eller CD45 for leukocytter.
  4. Etter farging, ta minst fem bilder med et vanlig konfokal mikroskop for å karakterisere colocalization.

8. Bildeanalyse

  1. Åpne et flytanalysebilde som inneholder enten fluorescerende merkede blodplater eller fluorescerende fibrin i ImageJ. Dra det du yter du vil bruke bildet av, til ImageJ.
  2. Bildet er tatt i RGB-farge. For analyse foretrekkes et 8-biters bilde, så forvandle bildet til 8-biters: Bilde | Type | 8-biters.
  3. For å minimere bakgrunnen, trekk med en glidende paraboloid, hvor en rullende ball lokalt beregner og trekker bakgrunnspiksler fra det opprinnelige bildet: Prosess | Trekk fra bakgrunn | Rolling Ball Radius = 50 piksler | Skyve Paraboloid.
    MERK: Bildestørrelsen er definert i piksler. Men for å måle området, er det nødvendig å sette skalaen. Når bildene er tatt med et 20x mål med en numerisk blenderåpning på 0,45, har mikroskopet en skala på 2 piksler per μm. Mesteparten av tiden lagres den nødvendige informasjonen for å angi skalaen i metadataene til bildet og kan automatisk brukes av ImageJ: Analyser | Angi skala.
  4. Angi en terskel for å definere vedslutne blodplater eller deponerte fibrin. Bruk Trekant-metoden, og terskelen justeres automatisk: Bilde | Juster | Terskel.
  5. Analyser området som dekkes av blodplatene eller fibrin med kommandoen Analyser partikler. Sett størrelse på 2-Infinity, da den minimale størrelsen på en blodplate er 2 μm: Analyser | Analyser partikler.
  6. Resultatene vil gi det totale arealet i μm2, med gjennomsnittlig størrelse på aggregatene i μm2 og prosentandelen av dekket areal.

Representative Results

De representative resultatene kan deles inn i tre deler, som hver representerer de respektive trinnene i eksperimentelt oppsett, datainnsamling og dataanalyse. Avhengig av forskningsspørsmålet kan parametere for hvert trinn endres. De presenterte dataene brukes for å studere påvirkningen av endotelet på trombedannelse.

Eksperimentelt oppsett
Det er veletablert at endotelceller er svært heterogene i struktur og funksjon, avhengig av plassering og tid, under helse og sykdom23. Ulike kilder til endotelceller kan brukes til å studere endotel-blod interaksjon, som i dette tilfellet var kommersielt tilgjengelige HUVECs og PAECs (Figur 1A). HUVECs har vært den mest brukte i laboratoriemodeller, mens PAECer er pasientavledede isolerte celler fra lungearteriene. Videre er det veletablerte protokoller tilgjengelig for å isolere mikrovaskulære endotelceller (MVEC) fra lungesirkulasjonen eller blodsirkulasjonen som sirkulerer endotelkolonidannende celler (ECFC)25,,28,,29.

Etter isolasjon var endotelceller preget av VE-cadherin, CD31 og TIE2-farging for å bekrefte en endotelfenotype. Karakterisering for tilstedeværelse av αSMA og cytokeratin indikerte fravær av fibroblast eller epitellignende fenotype (figur 1B). Etter å ha fått en svært ren populasjon av EC, ble passasje 3-5 celler brukt til å så enten et kommersielt mikroras eller skreddersydde mikrofluidiske strømningskanaler (figur 1C). Mens de kommersielt tilgjengelige mikroskliene primært er parallelle strømningskamre, eller Y-formede kanaler med spesielt definerte parametere i høyde eller bifurcation vinkel, gjør bruk av mikrofluidiske lysbilder det mulig å tilpasse eksperimentelle parametere til in vivo fartøygeometri og blodstrømdynamikk31. Imidlertid er skreddersydde mikrofluidiske størrelser mindre og har en tendens til å begrense cellespredning og indusere mercelledød 32,33. Ved hjelp av et overskudd av celler kompenserer for det faktum at bare en liten prosentandel av celler vil følge. Dette ble observert da en stenose ble introdusert, hvor endotelceller viste en mer langstrakt fenotype sammenlignet med en parallell mikrofluidisk kanal (figur 1D). Kommersielle strømningskamre har et større overflateareal som cellene kan binde seg til. Dette krever færre celletall for såing.

For å studere endotelcelleblodinteraksjon, ble fullblod perfundert over et endotelmonolag. Citrated blod ble samlet på dagen for eksperimentet og umiddelbart før perfusjon recalcified. Cellene ble stimulert med histamin for å indusere VWF-frigjøring og blodplate vedheft 30 min før perfusjon (figur 1E)34,35. På grunn av de små dimensjonene tillot de skreddersydde mikrofluidiske kanalene bruk av mindre blodvolumer.

Datainnsamling
For å undersøke trombedannelse på PAECer, ble Calcein AM-Red fluorescerende merkede blodceller og Alexa488-konjugert fibrin perfused i 5 min ved 2,5 dyne / cm2 (figur 2A-C). Vedlevende blodceller og deponerte fibrin ble kvantifisert. Bilder ble kjøpt hver 30 s og kvantifisert med ImageJ. Det var viktig å trekke bakgrunnen for å eliminere autofluorescence av ikke-adhered blodplater. Trekantalgoritmen for tersklering har blitt brukt til å definere minimal bakgrunn. Det tillatt for måling av små blodplateaggregater (figur 2D).

Forventet, under ikke-stimulerte forhold, var det ingen binding av blodplater og fibrin til endotelet. For å fremme VWF-frigjøring og blodplatebinding ble PAECer stimulert med histamin, noe som resulterte i en umiddelbar økning av blodplateadhesjon som nådde et platå etter 2,5 min. På denne tiden begynte blodplater å skille ut autocrine faktorer som induserte blodplateaggregasjon og fibrinogen cleavage i fibrin. Fibrin ble deponert etter 3 min og dannet en stabil mengde med blodplater etter 4 min (Figur 2E).

For å undersøke om denne effekten kunne hemmes av et direkte oralt antikoagulant (DOAC), ble blodet behandlet med 10 nM dabigatran. Dabigatran ble tilsatt til blodfortynningen, hvor det hemmer faktor IIa i koagulasjonsveien, og forhindret spaltning av fibrinogen for å danne fibrinfibre. Når dabigatranbehandlet blod ble perfundert over stimulerte PAECer, kan koagulasjonsdannelse hemmes direkte hovedsakelig ved å forsinke fibrin deponering (figur 2F).

Dataanalyse
For å studere påvirkning av ulike endotelkilder på trombusdannelse, ble cellulære endringer ved 5 min blodperfusjon analysert. Endotelet ble fikset og tilbesende blodplater ble merket med CD42b før avbildning under et konfokalt mikroskop. Dette ga en detaljert analyse for colocalization av blodplater og fibrin som kan indikere dysfunksjonelle koagulasjonsfaktorer i blodet. Påvirkningen av EC i blodproppdannelse ble bestemt av standard immunofluorescerende farging. Endotelcellekontakter ble opprettholdt, som bekreftet av VE-cadherinfarging,noe som indikerer at blodproppene dannet på toppen av endeotelmonolaget i stedet for på den underliggende matrisen mellom endotelhullene (figur 3). Videre resulterte bruk av forskjellige cellekilder i forskjellige mønstre av trombi forming på endotelet. HUVECs er venøse endotelceller og viste begrenset blodplateadhesjon og fibrin deponering, mens syke primære PAEC fra CTEPH-pasienter viste rikelig blodplateadhesjon og mer fibrin deponering ved histaminstimulering sammenlignet med sunn PAEC. Dette tyder på at endotelet til CTEPH-pasienter viser høyere respons på vasoaktivering som resulterer i økt trombedannelse.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over protokollen. (A)Ulike kilder og ulike typer endotelceller ble isolert og kultivert for bruk i en mikrofluidisk strømningskanal for perfusjonseksperimenter. Representative brightfield bilder av ulike typer endotelceller. Vektstangen = 50 μm. (B) Isolerte celler var preget av immunofluorescerende farging for å bekrefte en endotelfenotype. Skalalinje = 50 μm. (C) Celler kan seedes i enten kommersielle strømningslysbilde eller skreddersydd mikrofluidisk kanal. (D) Representative brightfield bilder av HUVEC dyrket i forskjellige kanalgeometrier. Vektstangen = 50 μm. (E) Eksperimentelt oppsett av blodperfusjonseksperimenter. Citrated blod ble samlet, fortynnet med saltvannbuffer, og perfused over endotelceller med en sprøytepumpe. Lungen og navlestrengvenen i dette tallet ble endret fra Servier Medical Art, lisensiert under en Creative Common Attribution 3.0 Generic License. http://smart.servier.com/ Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bildeoppkjøp og kvantifisering av trombedannelse. (A) Representativ time-lapse imaging av vedlagt Calcein AM-Red merkede blodplater og deponert Alexa488-konjugert fibrin på 1, 3, og 5 min etter fullblodperfusjon over ustimulerte PAECs (B) og over histamin stimulert PAECs. (C) Representative time-lapse bilder av blodplate vedheft og fibrin deponering på 1, 3, og 5 min perfusjon med fullblod inkubert med dabigatran perfused over histamin-stimulert PAECs. Skalalinje = 50 μm. (D) Skjematisk oversikt over bildekvantifisering i ImageJ. (E) Kvantifisering av blodplate vedheft og fibrin deponering for hver 30 s på en uforstimulert og histamin stimulert endotel. (F)Kvantifisering av effekten av dabigatran på trombedannelse kvantifisert ved blodplateadhesjon og fibrin deponering. Data representeres som gjennomsnitt ± SD, n = 3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative konfokale bilder av strømningseksperimenter for å karakterisere trombedannelse i blodplateadhesjon og fibrin deponering på endotelceller. Endotelcellecellekontakter var preget av VE-kadherin og målt i kontroll-PAECer, pasientavledede CTEPH-PAECer og HUVEC. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Koagulasjon er et resultat av det komplekse og timelig kontrollerte samspillet mellom endotelet og blodkomponentene. Denne in vitro-analysen presenterer en metode for å undersøke trombogene egenskaper av endotelceller i sanntid. Ulike typer primære humane endotelceller kan brukes, noe som letter in situtrombose på en orgel og pasientspesifikk måte. I denne studien illustrerte vi bruken av denne protokollen som sammenlignet trombogene egenskaper av PAECer isolert fra friske donorer versus CTEPH-pasienter. Levende trombedannelse ble studert ved perfusjon av fullblod fra friske forsøkspersoner over histaminaktivert endotel, mens effekten av et DOAC ble testet som et antitrombotisk middel.

Foruten bruk av kommersielt tilgjengelige mikrokanaler, som vist i de representative resultatene, gjør innføringen av de skreddersydde mikrofluidiske kanalene studiet av påvirkning av vaskulære geometriendringer på trombedannelse. For eksempel reduseres strømmen på et grenspunkt eller stenose resulterer i en økning i skjærstress og mer blodplateaktivering36. En betydelig begrensning av disse skreddersydde mikrofluidiske kanalene er imidlertid kravet om høye celletall for å danne et stabilt monolag av ECer som beskrevet i trinn 2.3.2. Dette kan presentere en begrensende faktor når pasientavledede celler er knappe. Styrkene til de kommersielt tilgjengelige mikroskliene er at overflatearealer er modifisert for cellekultur og vekstområder er større, og dermed tillater ECer å danne et samløpet og stabilt monolag. På den annen side vil et større overflateareal resultere i en større lumen. Ifølge Equation 1 kreverdette høyere blodvolumer for å nå lignende strømningshastigheter som i de skreddersydde mikrofluidiene.

En forbedring av denne protokollen kan være å undersøke live EC tap eller endringer i barriere integritet. EC-skader i denne protokollen måles bare på slutten av eksperimentet. For live sporing kan ECer merkes med mCherry VE-cadherin, for eksempel37. Men da dette ville trenge en svært optimalisert protokoll med effektiv virustransfeksjon, kan Electric Cell-substrat Impedance Sensing (ECIS) brukes som et alternativ til å studere endotelintegritet og barrierefunksjon38. Perfusjon over spesielle ECIS-strømningskanaler muliggjør langsgående overvåking av endotelbarriereintegritet under strømning. Disse spesifikke ECIS-funksjonene tillater parallelle målinger av endotelbarriereegenskaper og trombedannelse. Alternative måter for parallelle EC-barrieremålinger, spesielt i de skreddersydde arrayene, inkluderer bruk av fluorescerende dextrans i perfusatet, som sprer seg ut av lumen, avhengig av EC-barriereegenskapene.

En begrensning av den beskrevne protokollen er at ECer fjernes fra menneskekroppen og dyrkes på vevskulturplast, som er et stivt, kunstig substrat. Celler tilpasser seg deres biofysiske miljø. Dette kan muligens påvirke endotelresponsen på blodplateaktivering, da det er en sammenheng mellom blodplateaktivering og veggstivhet39. Til tross for disse tilpasningene til kulturplast, holder cellene sykdomsspesifikke egenskaper som kan identifiseres i direkte sammenligning med ECer avledet fra friske donorer som vist med kontroll, CTEPH-PAEC og HUVEC som utøvet forskjellige mønstre av blodplateadhesjon og fibrin deponering etter 5 min blodperfusjon.

I motsetning til andre protokoller bruker dette systemet fullblod, mens andre studerer EC interaksjon med en enkelt blodkomponent som blodplater og leukocytter19,,20,,21. Det har vært mer avanserte mikrofluidiske modeller utviklet som tillater studiet av endotelfunksjon i en vaskulær modell med en rund kargeometri og myk ekstracellulær matrise. Disse er imidlertid optimalisert med HUVECs40,41,42. Nyheten om den beskrevne protokollen er bruken av primære ECer kombinert med fullblod som bringer modellering av in situ trombose ett skritt nærmere in vivo-forhold. Etter å ha optimalisert protokollen for bruk av pasientavledede ECer og pasientavledet blod optimaliserer ytterligere sykdomsmodellering in vitro, slik at vurderingen av personlig trombedannelse og medikamentbehandling.

Den beskrevne protokollen kan brukes til å studere effekten av antikoagulasjonsbehandlinger på pasientavledede celler. Mens vi brukte dabigatran for å hemme trombedannelse, er det mulig å bruke andre antikoagulantia, som rivaroksaban, som direkte hemmer faktor Xa i koagulasjonskaskaden. Direkte blodplatehemmere som klopidogrel eller aspirin kan studeres også, da disse virker på den primære fasen av hemostase hvor blodplater binder seg til ECer. Til syvende og sist kan tromboogen kapasitet av pasientspesifikke ECer i samspill med pasientens eget blod brukes til å forutsi den personlige effekten av antikoagulasjonsbehandling på den enkelte pasient. Videre kan en knockdown av spesifikke proteiner gi ytterligere funksjonell informasjon.

Det er noen trinn i den beskrevne protokollen som er kritiske for et vellykket perfusjonseksperiment. For det første, under isolering av primære celler, er det nødvendig å få en svært ren EC-kultur. For det andre er det viktig at ECene danner et stabilt sammenføyd monolag. Hvis dette ikke er tilfelle, kan en liten endring i skjærstress forårsake endotelskade og aktivering av koagulasjonskaskaden, eller blodplater kan begynne å binde seg til kjellermembranen, noe som vil gi falske positive resultater. For det tredje er det viktig å forhindre luftbobler, da de kan skade endotelet og dermed påvirke resultatene.

Etter rekalsifisering av det citrated blod med kalsiumklorid og magnesiumklorid, er det viktig å umiddelbart starte perfusjonseksperimentet. Rekalsifisering induserer en rask respons i blodplateaktivering og trombedannelse, noe som resulterer i rask koagulasjon i prøven.

Til slutt beskriver vi en svært allsidig protokoll for å studere fullblods endotelcelleinteraksjoner under trombose.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Jan Voorberg fra Institutt for plasmaproteiner, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Nederland, for hans innspill i dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av den nederlandske CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] tildelt Phaedra og Reconnect-konsortiet, samt Impulse-stipendet 2018 tildelt Phaedra IMPACT-konsortiet. Disse tilskuddene inkluderer kollektiv finansiering av Dutch Heart Foundation, Dutch Federation of University Medical Centers, Nederland Organization for Health Research and Development og Royal Netherlands Academy of Sciences. Videre ble dette arbeidet finansiert av European Research Council under Advanced Grant 'VESCEL'-programmet (Stipendnummer: 669768). XDM er finansiert av et forskningsstipend fra Institute for CardioVascular Research (ICaR-VU) ved VU University Medical Center, Amsterdam, Nederland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Merck 106404
20 mL syringe BD 300613
20X objective Olympus N1492900 LUCPLFLN20XPH/0.45
2-Propanol (IPA) Boom 760514555000
Aladdin Syringe Pump Word Precision Instruments AL-4000
Alexa488-Fibrinogen Invitrogen F13191 15 ug/mL
Alexa647-Goat anti Rabbit Invitrogen A21245 1:100
Biopsy punch 1 mm diameter Ted Pella 15110-10
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647
CaCl2 Sigma-Aldrich 21115
Calcein AM-Red Invitrogen C3099 1:1000
CD42b-APC Miltenyi Biotec 130-100-208 1:100
Citric Acid Merck 100244
Collagen Type I, rat tail Corning 354249 0.1 mg/mL
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish Corning 3295
Cross-flow hood Basan
Desiccator Duran 2478269
D-Glucose Merck 14431-43-7
EDTA Invitrogen 15575020
Endothelial Cell Medium (ECM) ScienCell 1001
Fibronectin Human Plasma Sigma-Aldrich F0895
Flow tubing ibidi 10831, 10841
Gelatin Merck 104070 0.1%
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Hoechst 33342 Invitrogen H1399 1:1000
micron-Slide VI 0.4 flow chambers ibidi 80606
ImageJ NIH v1.49
KCl Merck 7447-40-7
Lab oven Quincy 10GC
LS720 Fluorescent microscope Etaluma LS720
Luer connector ibidi 10802, 10825 Male elbow connectors, Female tube connectors
MACS magnetic beads (anti-CD144) Miltenyi Biotec 130-097-857 1:5
MgCl2 Sigma-Aldrich M1028
Microscopy slides, 76 x 26 mm Thermo Scientific AAAA000001##12E
Negative photoresist, SU-8 Microchem
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Lonza 13-114E
Paraformaldehyde (PFA) Merck 818715 4% PFA in PBS
Penicillin/streptomycin (P/S) Gibco 15140-122 1%
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-094 no calcium or magnesium
Plasma chamber, CUTE Femto Science
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 Dow 101697
sodium citrate blood collection tubes BD 363048
trisodium citrate Merck 106448
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-045
VE-Cadherin (D87F2)-XP Cell Signaling 2500 1:300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S. Endothelial cell control of thrombosis. BMC Cardiovascular Disorders. 15, 130 (2015).
  2. Pearson, J. D. Endothelial cell function and thrombosis. Best Practice & Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).
  3. Bochenek, M. L., Schafer, K. Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis. Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).
  4. Swieringa, F., et al. Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).
  5. Macfarlane, R. G. An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier. Nature. 202, 498-499 (1964).
  6. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiological Reviews. 93 (1), 327-358 (2013).
  7. Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing. Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).
  8. Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis. Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).
  9. Karino, T., Motomiya, M. Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation. Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).
  10. ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).
  11. Witkin, A. S. Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team. Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).
  12. Kim, N. H., et al. Chronic thromboembolic pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 53 (1), 1801915 (2019).
  13. Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480 (2019).
  14. Giri, J., et al. Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).
  15. Sharma, S., Lang, I. M. Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).
  16. Eisenberg, P. R., et al. Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension. Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).
  17. Bochenek, M. L., et al. From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).
  18. Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation. Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).
  19. Barendrecht, A. D., et al. Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow. Journal of Visualized Experiments. (125), e55658 (2017).
  20. Vajen, T., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), e57009 (2018).
  21. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. (126), e55917 (2017).
  22. Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).
  23. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429 (2012).
  24. Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).
  25. Szulcek, R., et al. Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).
  26. Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. Role of high shear rate in thrombosis. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).
  27. Jain, A., et al. Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium. Biomedical Microdevices. 18 (4), 73 (2016).
  28. van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA. Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).
  29. Smits, J., et al. Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763 (2018).
  30. Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation. Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).
  31. Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  32. Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays. Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).
  33. Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces. Journal of Nanobiotechnology. 12, 54 (2014).
  34. McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. Weibel-Palade bodies at a glance. Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).
  35. Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis. Frontiers in Immunology. 8, 846 (2017).
  36. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  37. Huveneers, S., et al. Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling. Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).
  38. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  39. Yamasaki, F., et al. Association between arterial stiffness and platelet activation. Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).
  40. Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).
  41. Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).
  42. Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. Journal of Visualized Experiments. (64), e3958 (2012).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 159 trombose kronisk tromboembolisk pulmonal hypertensjon endotelceller blodplater fibrin koagulasjon blod
In Vitro Microfluidic Disease Model for å studere fullblods-endotelinteraksjoner og blodproppdynamikk i sanntid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manz, X. D., Albers, H. J.,… More

Manz, X. D., Albers, H. J., Symersky, P., Aman, J., van der Meer, A. D., Bogaard, H. J., Szulcek, R. In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time. J. Vis. Exp. (159), e61068, doi:10.3791/61068 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter