Summary
열 도전 중 심박수를 측정하면 급성 환경 변화의 결과로 생물의 생리적 반응에 대한 통찰력을 제공합니다. 모델 유기체로 미국 랍스터(Homarus americanus)를사용하여,이 프로토콜은 후기 무척추 동물에서 심장 박동을 측정하기 위해 상대적으로 비 침습적이고 비치명적인 접근법으로 임피던스 폐포의 사용을 설명합니다.
Abstract
바다의 온도는 세계 기후의 광범위한 변화의 결과로 급속하게 증가하고 있습니다. 생물 생리학은 환경 온도에 의해 크게 영향을, 이것은 해양 생물의 다양한 열 생리적 성능을 변경할 수있는 잠재력을 가지고있다. 모델 유기체로 미국 랍스터(Homarus americanus)를사용하여,이 프로토콜은 급성 열 스트레스에서 후기 무척추 동물의 심장 성능이 어떻게 변경되는지 이해하기 위해 임피던스 폐렴의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 온도 램핑 실험 중에 심박수를 실시간으로 수집할 수 있는 최소 침습 기술을 제공합니다. 데이터를 쉽게 조작하여 아레니우스 브레이크 온도(ABT)를 계산하는 데 사용되는 아레니우스 플롯을 생성하며, 이는 온도가 증가함에 따라 심박수가 감소하기 시작하는 온도입니다. 이 기술은 다양한 후기 무척추 동물 (즉, 게, 홍합 또는 새우)에서 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 온도가 심장 성능에 미치는 영향에만 초점을 맞추고 있지만, 생리적 성능에 영향을 미치기 위해 온도와 상호 작용하는 추가 스트레스(예: 저산소증 또는 과다증)의 가능성을 이해하도록 수정할 수 있습니다. 따라서, 이 방법은 해양 무척추 동물이 환경의 급격한 변화에 어떻게 반응하는지 더 잘 이해할 수 있는 광범위한 응용 분야에 대한 잠재력을 가지고 있다.
Introduction
최근 수십 년 동안 온실 가스(즉, 이산화탄소, 메탄 및 아산화질소)가 대기중으로 투입되면서 환경 변화의 광범위한 패턴이 발생했습니다1. 세계의 바다는 급속하게 온난화2,,3,생물 생리학에 심각한 영향을 미칠 수있는 추세. 온도는 생리적 속도에 크게 영향을 미치며, 유기체는 성능4,,5,,6에대한 최적의 온도 범위를 가지고 있습니다. 이와 같이, 개인 온도이 범위를 벗어난 조직에 적절 한 산소 전달을 유지 에 어려움을 발생할 수 있습니다. 이는 온난화된 해양 온도5,,7에직면하여 호기성 성능 저하로 이어질 가능성이 있다.
실험실 환경에서 환경 변화의 생리적 영향을 이해하는 방법은 열 스트레스의 맥락에서 심장 성능을 검사하는 것입니다. 이것은 예측 된 온난화 조건에 노출이 성능 곡선5,,6뿐만 아니라 적응 가소성8에대한 가능성을 변경할 수있는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다. 해양 무척추 동물의 심박수를 측정하기 위해 다양한 방법이 성공적으로 구현되었습니다. 그러나, 이러한 기술의 대부분은 외과 적 제거 또는 외골격의 주요9조작 및 측정 장치의 장기간 이식을 포함9,10,,11,이는 시험 대상에 추가 스트레스를 도입하고 실험 전에 성공적인 복구에 필요한 시간을 증가. 더욱이, 덜 침습적인 기술(예를 들어, 시각 관찰, 비디오그래피)은 유기체가 완전하거나 반투명할 수 있는 초기 생활 역사 단계로 제한될 수 있다12. 더욱이, 추가 도전은 더 기술적으로 진보된 방법론에 정통한 연구자에게 제시될 수 있습니다 (예를 들면, 적외선 트랜스듀서 또는 도플러관류를통한 관측8,11).
이 프로토콜은 온도 램핑 실험 동안 심박수의 변화를 평가하기 위한 임피던스 폐렴의 사용을 입증하기 위해 후기 해양 무척추 동물 모델로 미국 랍스터(Homarus americanus)를사용합니다. 임피던스 폐렴법은 심장이 수축하고13,,14를이완함에 따라 전압의 변화를 측정하기 위해 심낭의 양쪽에 위치한 두 개의 전극을 가로 질러 진동 전류 (AC)를 전달하는 것을 포함합니다. 이 기술은 외골격 바로 아래에 부드럽게 이식되는 작은 전극 (즉, 0.10-0.12 mm 직경)을 사용하기 때문에 최소 침습적입니다. 마지막으로, 데이터 로거를 사용하여 램프 동안 심박수와 수온을 실시간으로 평가합니다.
이 프로토콜은 또한 아레니우스 브레이크 온도(ABT)를 계산하기 위한 지침을 제공하며, 온도가13,,15증가함에 따라 심박수가 감소하기 시작하는 온도입니다. ABT는 치명적인 한계가 종종 극단적이고 자연환경에서거의 발생하지 않는 경우로서 임계 열 최대치(CTmax,심장 기능의 상한5,,6)를측정하는 데 선호될 수 있는 시험 대상자의 열 한계에 대한 비치명적인 지표로서 작용한다 5.
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Protocol
1. 장비 설정
- 직경 약 8-10cm, 길이 40-70cm의 열 교환 코일을 만들기 위해 투명하고 가단성 튜브를 감싸십시오. 전기 테이프를 사용하여 코일을 고정합니다.
- 열 교환 코일을 외부 공급 장치에 부착하고 냉각/가열 순환 수조의 반품 피팅을 부착합니다. 호스 클램프를 사용하여 연결이 안전한지 확인합니다.
- 역삼투(RO) 물로 냉각/가열 순환 수조의 우물을 채우고 전원 코드를 콘센트에 연결합니다. 수조를 켜고 열 교환 코일과 관련하여 누출이 없는지 확인하십시오.
- 블랙 BNC 케이블을 장치의 AC 출력에 연결하고 채널 1 포트를 사용하여 데이터 로거(재료표)에연결하여 임피던스 컨버터를 설정합니다.
- 열전대 프로브(온도 레코더)를 T 형 포드에 연결한 다음 T 형 포드를 데이터 로거의 채널 2 포트에 연결합니다.
- 데이터 로거의 전원 코드를 전원 공급 장치에 연결하고 USB 케이블 커넥터를 사용하여 데이터 로거를 PC 컴퓨터에 연결합니다.
- 인공 해수 7.5 L로 적응 챔버 및 실험 경기장을 채웁니다 (염분 = 35 ppt, pH = 8.1, 온도 = ~ 12 °C).
참고: 시험장의 적응 챔버및 시작 조건에 필요한 물의 부피, 온도 및 화학은 실험 설계에 따라 달라집니다. 중요한 것은, 이러한 용기는 시험 대상을 편안하게 잠수할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다.
2. 전극의 이식
- 랍스터를 실험 무대에 쉽게 들어갈 수 있는 플라스틱 화격자위에 놓아 몸이 직사각형의 한쪽 끝에 Y자모양을 편안하게 만들 수 있도록 합니다.
- 작은 케이블 타이를 사용하여 랍스터의 발톱과 복부를 플라스틱 화격자에 조심스럽게 고정시다. 케이블 타이는 움직임을 방지할 수 있을 만큼 단단해야 하지만 실험이 완료되면 수술용 가위를 제거할 수 있는 공간이 있어야 합니다.
- 종이 타월로 갑피를 말리고 70 % 에탄올에 담근 면봉으로 청소하십시오.
- 전극의 구멍을 만듭니다.
- 작은 드릴 비트(예: 1.6mm)를 사용하여 심낭 양쪽의 갑피를 통해 두 개의 작은 구멍(거의)을 천천히 조심스럽게 손으로 드릴링합니다.
- 멸균 해부 바늘을 부드럽게 삽입하여 각 구멍을 마무리합니다.
- 바늘이 갑피를 쉽게 통과하지 못하면 바늘을 다시 시도하기 전에 천천히 손으로 드릴링하십시오.
참고: 실험 동물의 스트레스를 최소화하려면 실험 전에 이 기술을 연습하는 것이 좋습니다. 시간이 지남에 따라 사용자는 드릴 비트가 갑피에 거의 다가 니야인 때를 느끼고 바늘로 전환하여 쉽게 결정할 수 있습니다. 수작업 드릴링은 랍스터와 게에 적합하며, 특히 외골격이 부드럽다면(즉, 동물이 최근에 몰드한 경우). 그러나 시험 대상체에 두꺼운 외골격 또는 쉘(즉, 바이밸브)이 있는 경우 Dremel 도구가 더 적합합니다.
- 전극(36-38G 자기 선, 직경 0.10-0.12mm)을 확보하고 해부 칼날을 사용하여 와이어 팁에서 약간의 절연을 긁어냅니다. 각 와이어의 끝을 집게를 사용하여 작은 후크에 조심스럽게 구부리고 새로 뚫은 구멍각각에 하나씩 삽입합니다.
- 작은 샤노아크릴레이트 접착제를 사용하여 각 와이어 리드를 고정하고 5-10분 동안 건조시도록 하십시오.
참고: 접착제를 너무 많이 추가하면 와이어가 재절연되고 신호가 기록되지 않도록 하기 때문에 접착제를 아껴서 사용하는 것이 중요합니다. - 접착제가 건조되면 와이어를 임피던스 컨버터에 연결하고 켭니다. 랍스터를 적응 챔버에 넣고 이식된 전극에 15-20분 동안 적응시키십시오.
참고: 빠르거나 비틀거리는 움직임과 불완전하게 말린 접착제로 인해 전극이 갑피에서 분리될 수 있습니다. 이 경우 2.6단계로 돌아갑니다. - 데이터 로거를 켜고 컴퓨터에서 LabChart 소프트웨어를 엽니다. 새 실험을 클릭하고 차트 보기 화면을 열어 둡니다.
- 차트 보기에서화면의 오른쪽 섹션에서 채널 1의 채널 기능 메뉴를 찾습니다. 메뉴에서 입력 증폭기를 선택하고 AC 커플링을 선택합니다. 이제 시험 대상에서 들어오는 신호가 화면에 실시간으로 표시됩니다.
참고: 범위 팝업 메뉴를 선택하여 채널의 민감도를 조정할 수 있습니다. 신호 피크가 전체 눈금의 25%-75%가 될 때까지 범위를 조정합니다. 확인을클릭하여 입력 증폭기 닫기. - 임피던스 컨버터에서 데이터 로거 출력에서 강한 신호가 관찰될 때까지 게인(크기) 및 균형을 조정하여 균형을 0에 가깝게 유지합니다.
- 채널 2에서 T-Type 포드를 선택하여 실시간 온도 데이터를 기록합니다.
- 두 채널이 제대로 설정되면 시작 단추를 클릭하면 데이터 로거가 데이터 로깅을 시작합니다.
3. 온도 램핑
- 적응 기간이 끝나면 부착된 랍스터와 함께 플라스틱 화격자를 조심스럽게 실험 무대에 놓고 열 교환 코일을 화격자 위에 놓습니다.
- 열전대 프로브를 랍스터 근처에 놓고 실험 무대에 뚜껑을 놓기 전에 완전히 잠기도록 하여 실험 대상에게 시각적 스트레스를 줄입니다.
- 필요에 따라 잔액을 조정하고 평가판에 평가판에 주석을 달수 있습니다.
- 출력은 실험 전반에 걸쳐 주기적으로 저장될 수 있고 저장되어야 합니다.
- 파일을 클릭하고 As 저장을 선택하여 처음에 출력을 컴퓨터에 저장합니다.
- 실험 중에 저장할 때 파일 저장을 클릭하고 을선택합니다.
참고: LabChart 소프트웨어는 우발적인 프로그램 종료(예: 정전)의 경우 파일을 복구할 수 있지만 데이터 손실을 방지하기 위해 실험 중에 15~20분마다 활성 파일을 저장하는 것이 좋습니다.
- 실험 경기장의 수온을 15분마다 ~1.5°C의 속도로 증가시켜 재순환 수조의 온도를 조절하여 2.5시간 동안 12°C에서 30°C로 경사로를 달성한다.
참고 : 미국 랍스터의 지리적 분포는 25 ° C 열 구배에 걸쳐 있으며, 개인은 최대 30 ° C16의온도에서 적응하고 생존 할 수 있습니다. 따라서 30°C는 랍스터가 임계 열 최대13에도달하지 못하는 스트레스가 많은 시나리오를 경험할 수 있도록 하기 때문에 이 온도 램프의 상한으로 선택되어 사망률을 초래할 수 있습니다. 온난화의 특이적 속도는 미국 랍스터13,,27에대한 이전 연구뿐만 아니라 다른 종8,,14를 이용한 연구에서 구현된 온난화 속도의 범위 내에 있기 때문에 선택되었다. 이 프로토콜을 구현하기 전에, 1) 주어진 실험에 대한 온도의 적절한 범위를 결정하고 2) 빈 실험 경기장과 예심 온도 램프를 실시하는 것이 중요하다, 이것은 원하는 램프를 달성하기 위해 수조의 필요한 온도 조정을 결정하는 데 도움이 될 것입니다. 이것은 또한 경기장에서 물의 양에 따라 다를 수 있습니다. - 온도 램프 전체에 걸쳐 출력에 영향을 줄 수 있는 조정이 발생할 때마다 기록합니다.
- 임피던스 컨버터의 밸런스는 실험 전체에서 조정해야 하며 이렇게 하면 출력이 의도하지 않게 급증할 수 있습니다.
- 실험 경기장의 온도가 시험 대상체의 바람직한 열 범위 밖의 수준에 도달하기 시작하면, 무의식적인 근육 수축은 출력에 잘못된 "스파이크"를 초래할 수 있습니다. 이 경우 주석을 작성하여 데이터 변환 프로세스 중에 제거해야 하는 출력 영역을 식별합니다.
- 경사로가 완료되면 실험 경기장에서 랍스터를 제거하고 ~ 20 분 동안 회복 욕조 (12 °C)에 놓습니다. 원하는 경우, 바닷가재가 기초 수준으로 돌아올 때까지 계속 모니터링하십시오.
- 20분 후 PowerLab 출력의 중지 버튼을 누르고 파일을 저장합니다. 조심스럽게 전극을 제거하고 수술 용 가위로 케이블 타이를 잘라 시험 대상을 홀딩 탱크로 반환하십시오.
참고: 랍스터를 회수 욕조에 직접 넣는 대신 실험 경기장을 천천히 시작 온도로 되돌리는 것입니다. 이는 추가2.5시간의 과정을 통해 15분마다 ~1.5°C씩 실험 경기장을 냉각시킴으로써 달성된다.
4. 데이터 변환
- 데이터 패드를엽니 다. 열 A를 두 번 클릭하고 데이터 패드 열 A 설정 메뉴의 왼쪽에 있는 선택 및 활성 점을 클릭하여 열 A를 시간으로 설정합니다. 메뉴의 오른쪽에서 시간을 선택하고 확인을클릭하여 창을 닫습니다.
- 열 B를 두 번 클릭하고 데이터 패드 열 B 설정 메뉴의 왼쪽에서 통계 옵션을 선택하여 열 B를 평균 온도로 설정합니다. 메뉴의 오른쪽에서 평균을 선택하고 채널 2는 메뉴 창 하단의 계산 소스로 선택합니다. 확인을 클릭하여 창을 닫습니다.
- 분당 비트로 기록된 전압 변환
- 열 C를 두 번 클릭하고 메뉴의 왼쪽에 있는 선택 및 활성 점을 선택합니다. 메뉴의 오른쪽에서 선택 기간을 선택하고 확인을 클릭하여 창을 닫습니다.
- 열 D를 두 번 클릭하고 메뉴의 왼쪽에서 주기 측정을 선택합니다. 메뉴의 오른쪽에서 이벤트 수를 선택하고 채널 1을 계산 소스로선택합니다. 확인을 클릭하여 창을 닫습니다. 이렇게 하면 데이터의 피크를 계산하여 선택한 데이터 부분에서 심박수를 결정합니다.
참고: 필요한 경우 메뉴 하단에서 옵션 버튼을 선택하고 감지 설정을 조정하여 데이터를 보다 정확하게 읽습니다. 데이터 파일을 스캔하고 "Sine" 또는 "Spikey" 모양 옵션이 하트비트 출력의 주요 피크수만 계산하는지 확인합니다. 또한 메뉴의 오른쪽에 있는 감지 조정 임계값을 조정하여 출력 파일의 노이즈를 무시합니다. - 열 E를 두 번 클릭하고 메뉴의 왼쪽에서 주기 측정을 선택합니다. 평균 순환 속도및 채널 1을 계산 소스로선택합니다. 열 D의 설정과 일치하도록 감지 설정 및 감지 조정을 조정합니다(4.4.2단계에서 조작된 경우). 확인을 클릭하여 창을 닫습니다. 이렇게 하면 선택한 데이터 부분에 대해 심박수(분당 비트)의 최종 추정값을 제공합니다.
- 열이 설정되면 데이터 파일로 돌아가서 출력의 원하는 섹션을 강조 표시하여 섹션 3.6의 주석으로 식별된 잘못된 데이터의 영역을 생략합니다.
- 명령 및 데이터 패드에 여러 추가를 선택합니다.
- 드롭다운 메뉴를 사용하여 찾기에서 시간을 선택하고 모든 상자를 선택하고 선택 메뉴에서 "30"을 입력하여 30s마다 데이터를 가져옵니다.
- 단계 에서 현재 선택 옵션을 클릭하고 추가를 클릭합니다.
- 데이터 패드 화면으로 돌아가서 파일 및 저장을 선택하여 출력을 Excel 파일로 저장합니다.
참고 : 여기, 심박수는 이전 연구8,,27에기초하여 매 분마다 반대로 30 초마다 (분당 박동)로 보고됩니다. 또한 실시간으로 수집된 전압 데이터의 변화를 보다 정확하게 캡처할 수 있습니다. 개별 선호도에 따라 더 짧거나 더 긴 시간 간격으로 데이터를 선택할 수 있습니다.
5. 아레니우스 브레이크 온도 계산
- Excel에서 데이터 파일을 열고 LabChart 소프트웨어의 출력을 조작합니다.
- 다음 방정식을 사용하여 섭씨에서 켈빈의 왕복 온도로 온도를 변환합니다: [온도 °C + 273.15 K].
- 심박수의 자연 로그를 구합니다: ln(BPM).
- 온도 함수로 심박수를 플로팅하여 아레니우스 플롯을 생성하고, ln(BPM) 대 상호(K)13,,15로표현한다.
- SigmaPlot에서 데이터를 조각적인 회귀로 맞추고 ABT인 교차점을 결정합니다.
- 변환된 데이터를 복사하여 새 통합 문서로 붙여넣습니다. 주 메뉴에서 통계 옵션을 선택하고 드롭다운 목록에서 회귀 마법사를 선택합니다.
- 수식 창에서 방정식 범주 메뉴에서 조각으로 선택하고 방정식 이름 상자 아래에 있는 2개의 세그먼트 선형을 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
- 변수 창에서 변형된 온도 데이터를 t 변수로 선택하고 변형된 심박수 데이터를 변수 열 메뉴의 드롭다운 옵션을 사용하여 y 변수로 선택합니다. 다음을클릭하기 전에 데이터 에서 데이터 에서 XY 쌍을 선택했는지 확인합니다.
- 결과 맞춤 창을 검토한 후 다음을 클릭하고 숫자 출력 옵션 창에서 보고서 만들기확인란을 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
- 그래프 옵션 창에서 결과 맞춤 섹션 아래의 새 그래프 만들기 옵션을 확인하고 그래프 특징 섹션 아래에 있는 그래프 제목에 방정식 추가를 확인합니다. 완료를 클릭합니다.
- 결과 출력 페이지에서 조각 회귀의 두 영역에 대한 방정식 및 매개 변수 값과 회귀에 대한 통계 출력(예:R2,F-통계 및 p-값)을 검색합니다.
- 생성된 매개변수 값과 방정식을 사용하여 두 세그먼트를 서로 동일하게 설정하고 변수 "t"에 대해 해석하여 ABT를 결정합니다.
참고: ABT는 프로그램 SAS18에서패키지 "분할"17을 사용하거나 프리즘819에서"세그먼트 선형 회귀" 루틴을 사용하여 R 통계 컴퓨팅 환경에서도 계산할 수 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 임피던스 폐포를 사용하여 온도 램핑 실험 중에 심박수(전압) 및 온도에 대한 실시간 데이터를 얻는 방법을 설명합니다. 이 기술을 천공할 때 기록된 전압 및 온도의 진폭은 실험 설계 및 초점 종에 따라 달라집니다. 그러나 실시간으로 표시되는 전압 출력은 프로토콜이 올바르게 구현될 때 일반 사위 분포를 따릅니다(그림1A). 경기장의 온도가 증가함에 따라 전압 피크의 증가 된 주파수 (즉, 심장 박동)를 반영하기 위해 전압 변화의 실시간 분포; 그림 1B)를참조하십시오. 경기장 온도가 시험 대상자의 최적 성능 창 외부 수준으로 계속 증가함에 따라 분포는 산발적 피크 및/또는 "플랫 라이닝"(그림1C)의모멘트에 의해 중단된 사위 모양의 전압 피크의 감소된 주파수를 묘사하는 분포를 변화시바꿉니다.
LabChart 소프트웨어의 데이터 패드 구성 요소를 사용하여 원시 데이터를 변환하면 온도 램프 의 과정에 걸쳐 심박수(분당 비트)의 결과 분포는 실험이 성공하면 포물선 분포를 따릅니다(그림2). 경기장의 온도가 증가함에 따라, 시험 대상자의 심박수는 따뜻한 온도와 관련된 높은 에너지 요구를 충족시키기 위해 증가합니다. 그러나 온도가 계속 증가하고 시험 대상이 중등도에서 극단적인 열 스트레스를 경험하기 시작하면, 피험자가 수동적인 열 내성을 나타내기 시작할 때 심박수가 감소하거나 불규칙해지기 시작합니다(예: 혐기성 호흡의 발병, 신진대사 율 억제 및 감소된 활동5,,7). 심박수 및 온도 데이터가 변형되고 아레니우스 플롯이 생성되면 심박수가 감소하기 시작하는 지점(ABT)을 계산할 수있습니다(그림 3). 그런 다음 Arrhenius 플롯은 두 선의 교차가 ABT를 나타내는 통계 소프트웨어를 사용하여 조각적인 회귀에 맞습니다.
그림 1: LabChart 데이터 로거에서 대표 출력. 시험 대상의 전극에 걸친 전압의 실시간 변화가 빨간색으로 표시되고, 아레나 온도(°C)의 수반되는 실시간 출력이 파란색으로 표시됩니다. 냉각온도(예: 13.1°C)에서 실험을 시작할 때, 전압은 일반적인 사네형분포(A)를따라야 한다. 온도가 증가함에 따라(예: 23°C), 전압 피크의 주파수는 증가해야 하지만 분포는사네(B)와같이 유지되어야 합니다. 마지막으로, 시험 대상체가 최적의 열 성능 창(예: 28.5°C)의 외부로 밀려나면 주파수가 감소함에 따라 전압 피크가 불규칙해져야합니다(C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 온도 램프 코스에 대한 예상 심박수 분포입니다. 데이터 로거에 의해 수집된 전압 데이터는 소프트웨어의 데이터 패드 구성 요소를 사용하여 분당 비트(BPM)의 심박수로 변환됩니다. 램프가 올바르게 수행되면 테스트된 온도 범위에 걸쳐 심박수의 포물선 분포가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 아레니우스 플롯의 예. 데이터 패드에서 데이터를 변환하고 내보내면 아레니우스 플롯을 생성하도록 변환됩니다. 이 예제에서 데이터는 SigmaPlot의 조각별 비선형 회귀와 일치하며, 회귀 선의 왼쪽 및 오른쪽 세그먼트(영역 1 및 영역 2)에 대한 방정식과 적합도 메트릭을 생성합니다. 두 회귀 선의 교차점은 ABT(빨간색 별)로 해결됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 온도 램핑 실험 동안 후기 무척추 동물의 심박수 변화를 측정하기 위해 임피던스 폐포를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 주요 이점은 다른 실험실 기반9접근법9,10,,11에 비해 최소 침습적이며 외골격의 주요 외과 적 조작을 포함하지 않으므로 실험 전에 필요한 회복 시간의 양을 줄이는 것입니다. 또한 장비는 사용하기 쉽고 결과 데이터는 제안 된 소프트웨어 프로그램에서 간단하게 조작하고 해석 할 수 있습니다. 미국 산 랍스터는 여기에서 모델 주제로 사용되지만,이 기술은 청홍합(Mytilus spp.14)에서성공적으로 구현되었으며 다른 후기 무척추 동물 (즉, 게, 새우 및 기타 바이 밸브)에서 사용하기 위해 쉽게 변형 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 또 다른 이점은 ABT를 열 한계의 치명적이지 않은 지표로 계산하는 데 중점을 두고 있다는 것입니다. 수많은 연구가 열 생리적 성능을 결정할 때 중요한 종점으로 CTmax를 제시하지만5,8,20,,21,,22,,22,23,유기체는 거의 자연 환경에서이 범위에서 온도를 발생하지않습니다 5. 더욱이, CTmax는 종종 치명적인 온도이기 때문에, 바람직한 종점으로 이 메트릭을 사용하여 추가 또는 후속 실험 후 열응력(23)에서시험 대상자의 사용을 배제한다. 이 프로토콜을 사용하여 ABT를 계산하는 것을 목표로 할 때, 죽음을 유도하지 않고 시험 대상을 생리적 한계로 밀어 내는 지점까지 실험 분야의 온도를 높이는 것이 중요합니다. 따라서 실험 온도 램프의 전체 범위를 결정하기 전에 파일럿 스터디(가능한 경우)를 통해 초점 종의 잠재적열 한계를 결정하는 것이 좋습니다.
또한 실험 분야의 온도가 램핑 실험 전에 일정하고 스트레스가 없는 수준으로 유지될 때 연구원은 초점 종의 기저 심박수의 자연적인 변화를 결정하고 관찰하는 것이 좋습니다. 이것은 휴식 심박수 정보가 간행된 문헌에서 유효하지 않은 초점 종에 특히 유용합니다. 그것은 또한 전극 이식 기술의 충분한 연습으로 봉사합니다. 이것은 또한 연구원이 심박수에 있는 거짓 스파이크가 실험의 시작에 응력 처리 때문이 없다는 것을 확인하기 위하여 요구된 적당한 적응 시간을 결정하는 것을 도울 수 있습니다.
이 프로토콜은 열 스트레스의 맥락에서 임피던스 폐렴의 사용에 대해 논의하지만, 열 생리학에 대한 다른 스트레스기의 잠재적인 대화형 효과를 탐구하는 데에도 활용할 수 있습니다. 유기체 성능은 환경 스트레스 요인 (즉, 저산소증, 과식증, 오염 물질 및 / 또는 음의 변화)의 존재에서 감소 될 수있다, 이는 또한 성능7,,24,,25,,26에대한 최적의 온도 범위를 압축 할 수있다. 따라서 이 프로토콜은 온도 램핑 전에 다양한 스트레스에 대한 노출이 성능에 어떤 영향을 미치는지 탐색하기 위해 수정할 수 있습니다.
예를 들어, 해링턴과 Hamlin27은 온도 램프 동안 심장 성능을 평가하기 전에 2 개월 동안 현재 또는 예측 된 종말 세기 pH 조건 (각각 8.0 및 7.6)에 청소년 H. americanus를 노출했습니다. 더 많은 산성 환경에 미리 노출된 랍스터는 현재 pH 조건 하에서 유지된 것과 비교하여 평균 ABT에서 현저한 감소를 나타내었다. 이는 낮은 pH 환경이 열 성능을 감소시키고 낮은 온도27에서열 스트레스로 인한 세포 손상의 위험을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 향후 노력은 이 프로토콜을 따르기 전에 환경 스트레스 요인으로 의한 사전 노출을 포함하도록 여기에 제시된 방법에 확장될 수 있습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 바이오틱 스트레스에 노출되는 동안 심장 성능의 변화를 측정하기 위해 수정될 수 있을 뿐만 아니라 온토제니4,,5에따라 열 한계가 어떻게 변화할 수 있는지를 측정할 수 있다.
이 프로토콜의 주요 제한사항은 설명된 장비가 실험실 설정에서 사용하도록 제한되어 보다 전문화된 장비가 필요한 현장 기반 실험에 대한 적용가능성을 제한할 수 있다는 것입니다8. 이 기술은 또한 비 심장 근육 운동으로 인한 거짓 데이터 포인트의 생산을 줄이기 위해 매우 운동성 시험 대상자 (예 : 랍스터 및 게)의 구속을 요구합니다. 이것은 온도 램프 동안 자연 적인 행동을 제한할 수 있지만, 구속의 영향은 모든 실험 대상에 걸쳐 일관. 가장 중요한 것은, 전극 이식 중에 공격적이거나 부주의한 드릴링이 구현되는 경우 시험 대상에서 조직 손상 또는 사망가능성이 있다. 이것은 적외선 광전도, 외부 적외선 트랜스듀서를 사용하여 심낭을 통해 빛을 전달하고 반사 된 빛 에너지를 전압8,,28로변환하여 심장 기능을 기록하는 진정한 비 침습적 기술과 극명하게 대조됩니다.
적외선 광전도 는 임피던스 폐렴에 비해 응력 처리의 위험을 감소시킵니다, 설명된 방법을 사용하여 전극을 정확하게 이식하면 최소한의 외상을 초래하고, 빠른 적응 시간을 허용하고, 램핑 실험27에따른 실험 대상자의 사망률을 유도하지 않고 신속한 회복을 유도한다. 두방법(28)에의해 기록된 심장 출력에 유의한 차이가 없기 때문에, 임피던스 폐렴은 심장 성능을 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 최소침습적인 기술이라는 결론을 내린다. 마지막으로, 프로토콜의 수많은 이점과 유연성은 다양한 환경 요인이 후기 갑각류의 생리적 성능에 영향을 미치는 온도와 상호 작용하는 방법을 설명 할 수있는 잠재력을 가지고있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 실험실 지원과 국립 과학 재단 상 IIA-1355457 장비를 구입하는 자금메인 대학에서 메인 EPSCoR에 폴 로슨 감사. 이 프로젝트는 USDA 국립 식량 농업 연구소, 해치 프로젝트 번호 MEO-21811 메인 농업 및 산림 실험 스테이션뿐만 아니라 NOAA 국립 해양 수산 서비스 살톤스톨 케네디 그랜트 #18GAR039-136에 의해 지원되었다. 저자는 또한이 원고의 이전 버전에 대한 자신의 의견에 대한 세 익명의 검토자에게 감사드립니다. 메인 농업 및 산림 실험 역 출판 번호 3733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
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