Summary
Måling af puls under en termisk udfordring giver indsigt i organismers fysiologiske reaktioner som følge af akutte miljøændringer. Ved hjælp af den amerikanske hummer (Homarus americanus) som en model organisme, denne protokol beskriver brugen af impedans pneumografi som en relativt noninvasive og nonlethal tilgang til at måle puls i sene fase hvirvelløse dyr.
Abstract
Temperaturerne i havene stiger hurtigt som følge af omfattende ændringer i verdens klima. Da organismefysiologi er stærkt påvirket af miljøtemperatur, har dette potentiale til at ændre termisk fysiologisk ydeevne i en række marine organismer. Ved hjælp af den amerikanske hummer (Homarus americanus) som model organisme, denne protokol beskriver brugen af impedans pneumografi at forstå, hvordan hjerte ydeevne i den sene fase hvirvelløse dyr ændringer under akut termisk stress. Protokollen præsenterer en minimalt invasiv teknik, der giver mulighed for real-time indsamling af puls under en temperatur ramping eksperiment. Data er let manipuleres til at generere en Arrhenius plot, der bruges til at beregne Arrhenius pause temperatur (ABT), den temperatur, hvor pulsen begynder at falde med stigende temperaturer. Denne teknik kan anvendes i en række sene stadier hvirvelløse dyr (dvs. krabber, muslinger eller rejer). Selv om protokollen udelukkende fokuserer på temperaturens indvirkning på hjertets ydeevne, kan den ændres for at forstå potentialet for yderligere stressorer (f.eks. hypoxi eller hyperkapni) til at interagere med temperaturen for at påvirke fysiologiske præstationer. Metoden har således potentiale til vidtrækkende anvendelser for yderligere at forstå, hvordan hvirvelløse havdyr reagerer på akutte ændringer i miljøet.
Introduction
I de seneste årtier har øget tilførsel af drivhusgasser (dvs. kuldioxid, metan og lattergas) i atmosfæren resulteret i udbredte mønstre for miljøændringer1. Verdenshavene er hurtigt opvarmning2,3, en tendens, der kan have alvorlige konsekvenser for organisme fysiologi. Temperaturen har stor indflydelse på fysiologiske hastigheder, og organismer har et optimalt temperaturområde for ydeevne4,5,6. Som sådan, enkeltpersoner kan støde på vanskeligheder med at opretholde ordentlig ilt levering til væv som temperaturer omstrejfende uden for dette interval. Dette har potentiale til at føre til fald i aerob ydeevne i lyset af opvarmning havtemperaturer5,7.
I et laboratorium indstilling, en metode til at forstå de fysiologiske virkninger af miljømæssige forandringer er at undersøge hjerte ydeevne i forbindelse med termisk stress. Dette giver indsigt i , hvordan eksponering for forudsagte opvarmningsforhold kan ændre præstationskurverne5,6 samt potentialet for akklimatiseringsplasticitet8. En række forskellige metoder er blevet gennemført med succes til tidligere at måle puls i marine hvirvelløse dyr. Men mange af disse teknikker indebærer kirurgisk fjernelse eller større manipulation af exoskelet og langvarig implantation af måleudstyr9,10,11, som indfører yderligere stress til forsøgspersonen og øger den nødvendige tid til en vellykket genopretning før eksperimenter. Desuden kan mindre invasive teknikker (f.eks. visuel observation, videografi) begrænses til tidlige livshistoriske stadier, hvor organismer kan være fuldstændig ellerhalvgennemsigtige 12. Desuden kan der præsenteres yderligere udfordringer for forskere, der ikke er velbevandret i mere teknologisk avancerede metoder (f.eks. observationer via infrarøde transducers eller Doppler perfusion8,11).
Denne protokol bruger den amerikanske hummer (Homarus americanus) som en sen fase marine hvirvelløse model til at demonstrere brugen af impedans pneumografi til at vurdere ændringer i puls under en temperatur ramping eksperiment. Impedanspnomografi indebærer passage af en oscillerende elektrisk strøm (AC) på tværs af to elektroder placeret på hver side af hjertesækken til at måle ændringer i spænding som hjertet kontrakter og slapper13,14. Denne teknik er minimalt invasiv, da den anvender små elektroder (dvs. 0,10-0,12 mm diameter), der forsigtigt implanteres lige under exoskeletet. Endelig giver det real-time vurderinger af både puls og vandtemperatur under rampen ved hjælp af en datalogger.
Protokollen indeholder også instruktioner til beregning af Arrhenius-pausetemperatur (ABT), den temperatur, hvor pulsen begynder at falde med stigende temperaturer13,15. ABT fungerer som en ikke-dødelig indikator for den termiske grænse for kapaciteten hos forsøgspersoner, der kan være begunstiget frem for at måle det kritiske termiske maksimum (CTmax, den øvre grænse for hjertefunktion5,6), da dødbringende grænser ofte er ekstreme og sjældent forekommende i det naturlige miljø5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opsætning af udstyr
- Wrap klar, formbar slange omkring sig selv for at skabe en varme-udveksling spole, der er ca 8-10 cm i diameter og har udvidelser 40-70 cm lang. Fastgør spolen ved hjælp af elektrisk tape.
- Fastgør varmevekslende spole til den eksterne forsyning og returbeslag af et køle-/varmecirkulerende vandbad. Sørg for, at forbindelsen er sikker ved hjælp af slangeklemmer.
- Fyld brønden af køle-/varmecirkulerende vandbad med omvendt osmose (RO) vand og sæt ledningen i en stikkontakt. Tænd for vandbadet og sørg for, at der ikke er utætheder i forbindelse med varmevekslende spole.
- Konfigurer impedanskonverteren ved at tilslutte det sorte BNC-kabel til vekselstrømsudgangen på enheden og tilslutte den til dataloggeren (Materialstabel) ved hjælp af Kanal 1-porten.
- Sæt termoelementsonden (temperaturoptageren) i T-typenpod'en, og sæt derefter T-typenpod'en i Kanal 2-porten til dataloggeren.
- Tilslut dataloggerens strømledning til en strømforsyning, og tilslut dataloggeren til en pc-computer ved hjælp af USB-kabelstikket.
- Fyld akklimatiseringskammeret og forsøgsarenaen med 7,5 L kunstigt havvand (saltholdighed = 35 ppt, pH = 8,1, temperatur = ~12 °C).
BEMÆRK: Mængden, temperaturen og kemien i det vand, der er nødvendigt for akklimatiseringskammeret og startforholdene i forsøgsområdet, afhænger af forsøgsdesign. Det er vigtigt, at disse beholdere skal være store nok til, at forsøgspersonen kan nedsænkes.
2. Implantation af elektroder
- Placer hummer på en plastik rist, der passer let ind i den eksperimentelle arena, således at kroppen komfortabelt gør en Y-form i den ene ende af rektanglet.
- Fastgør forsigtigt hummerens kløer og mave til plastristen ved hjælp af små kabelbindere. Kabelbåndene skal være stramme nok til at forhindre bevægelse, men give plads til kirurgisk saks til at fjerne dem efter afslutningen af forsøget.
- Tør skjoldet af med en køkkenrulle og rengør det med en vat dyppet i 70% ethanol.
- Skab hullerne til elektroderne.
- Ved hjælp af et lille bor (f.eks. 1,6 mm) skal der langsomt og forsigtigt bores to små huller (næsten) gennem skjoldet på hver side af hjertesækken.
- Afslut hvert hul ved forsigtigt at indsætte en steril dissekere nål.
- Hvis nålen ikke let går gennem skjoldet, skal du fortsætte med langsomt at håndbore, før nålen prøves igen.
BEMÆRK: For at minimere stress hos forsøgsdyr anbefales det stærkt at praktisere denne teknik før forsøg. Over tid kan brugerne nemt bestemme ved at føle, hvornår boret er næsten selvom skjoldet og skifte til nålen. Håndboring er velegnet til hummere og krabber, især hvis exoskelet er blødt (dvs. dyret har for nylig smeltet). Hvis forsøgspersonen imidlertid har et tykkere exoskelet eller en skal (dvs. en toskallet), er et Dremel-værktøj mere hensigtsmæssigt.
- Anskaf elektroderne (36-38 G magnetisk ledning, 0,10-0,12 mm i diameter) og skrab en lille smule isolering af på trådens spids ved hjælp af en dissekeret knivblad. Bøj forsigtigt spidsen af hver ledning ind i en lille krog ved hjælp af pincet og indsæt en i hver af de nyligt borede huller.
- Fastgør hver ledning bly ved hjælp af en lille dråbe cyanoacrylat lim og lad det tørre i 5-10 min.
BEMÆRK: Det er afgørende at bruge limen sparsomt, da tilsætning for meget vil reisolere ledningen og forhindre signalet i at blive optaget. - Når limen er tør, fastgør ledningen fører til impedans konverter og tænde den. Placer hummer i akklimatiseringkammer og lad det akklimatisere til de implanterede elektroder i 15-20 min.
BEMÆRK: Hurtige eller disharmoniske bevægelser samt ufuldstændigt tørret lim kan medføre, at elektroderne løsner sig fra skjoldet. Hvis dette sker, skal du vende tilbage til trin 2.6. - Tænd for dataloggeren, og åbn LabChart-softwaren på computeren. Klik på Nyt eksperiment, og lad skærmbilledet Diagramvisning være åbent.
- Find Chart View kanalfunktionsmenuen for Kanal 1 i diagramvisning fra højre del af skærmen. Vælg Indgangsforstærker i menuen, og vælg AC-kobling. Det indgående signal fra testmotivet vises nu på skærmen i realtid.
BEMÆRK: Kanalens følsomhed kan justeres ved at vælge pop op-menuen Område. Juster området, indtil signalspidserne er 25%-75 % af den fulde skala. Luk indgangsforstærkeren ved at klikke på OK. - På impedanskonverteren skal du justere Gain (størrelse) og Balance, indtil der observeres et stærkt signal på dataloggerens output med det formål at holde balancen tæt på nul.
- På Kanal 2 skal du vælge T-Type-sensor for at registrere temperaturdata i realtid.
- Når begge kanaler er konfigureret korrekt, skal du klikke på knappen Start, hvorefter dataloggeren begynder at logge data.
3. Temperatur ramping
- Efter akklimatiseringsperioden placeres plastristen med den påsatte hummer omhyggeligt i den eksperimentelle arena, og den varmeudvekslende spole indstilles oven på risten.
- Placer termoelementsonden i nærheden af hummeren, så den er helt nedsænket, før låget lægges på forsøgsarenaen for at reducere den visuelle belastning af testpersonen.
- Juster balancen efter behov, og anbring en kommentar til resultatet med angivelse af, at forsøget er begyndt.
- Outputtet kan og bør gemmes med jævne mellemrum i løbet af eksperimentet.
- Klik på Filer, og vælg Gem som for i første omgang at gemme outputtet på computeren.
- Når du gemmer under eksperimentet, skal du klikke på Filer og vælge Gem.
BEMÆRK: Selvom LabChart-softwaren kan gendanne filer i tilfælde af en utilsigtet lukning af programmet (f.eks. et strømsvigt), anbefales det at gemme aktive filer hver 15-20 min under eksperimentet for at forhindre tab af data.
- Vandtemperaturen på forsøgsområdet øges med ~1,5 °C hvert 15.
BEMÆRK: Den geografiske fordeling af den amerikanske hummer strækker sig over en 25 °C termisk gradient, og enkeltpersoner kan akklimatisere sig til og overleve ved temperaturer på op til 30 °C16. Som sådan blev 30 °C valgt som den øvre grænse for denne temperaturrampe, da det sikrer, at hummere oplever et stressende scenario, der ikke når det kritiske termiske maksimum13, hvilket kan føre til dødelighed. Den specifikke opvarmningshastighed blev valgt , fordi den falder inden for en række opvarmningsrater , der er gennemført i undersøgelser , der anvender andre arter8,14 samt tidligere forskning i den amerikanske hummer13,27 . Forud for gennemførelsen af denne protokol, er det vigtigt at 1) bestemme det passende temperaturområde for et givet eksperiment og 2) gennemføre en pretrial temperaturrampe med en tom eksperimentel arena, da dette vil bidrage til at bestemme den nødvendige temperaturjustering af vandbadet for at opnå den ønskede rampe. Dette kan også variere afhængigt af mængden af vand i arenaen. - Under hele temperaturrampen registreres, når der foretages en justering, der kan påvirke outputtet.
- Bemærk, at vægten på impedanskonverteren sandsynligvis vil skulle justeres under hele eksperimentet, og dette kan medføre en utilsigtet stigning i outputtet.
- Da temperaturen i forsøgsarenaen begynder at nå niveauer uden for forsøgspersonens foretrukne termiske område, kan ufrivillige muskelsammentrækninger resultere i en fejlagtig "spike" i outputtet. Hvis dette sker, skal du skrive en kommentar for at identificere de områder af outputtet, der skal fjernes under datakonverteringsprocessen.
- Når rampen er færdig, fjernes hummeren fra forsøgsarenaen, og den anbringes i et bjærgningsbad (12 °C) i ~20 min. Hvis det ønskes, fortsætte med at overvåge hummer puls, indtil det vender tilbage til basale niveauer.
- Efter 20 min, skal du trykke på Stop-knappen på PowerLab output og gemme filen. Fjern forsigtigt elektroderne, og skær kabelbåndene med kirurgisk saks, før forsøgspersonen returneres til sin holdetank.
BEMÆRK: I stedet for at placere en hummer direkte i recovery bad, en anden mulighed er langsomt at vende tilbage den eksperimentelle arena til sin starttemperatur. Dette opnås ved afkøling af den eksperimentelle arena med ~ 1,5 °C hver 15 min i løbet af en yderligere 2,5 timer.
4. Datakonvertering
- Åbn datablok. Angiv kolonne A til tid ved at dobbeltklikke på Kolonne A og klikke på Markering og aktivt punkt i venstre side af menuen Kolonne A i datablok A. Vælg Tid i menuens højre side, og luk vinduet ved at klikke på OK.
- Angiv kolonne B til gennemsnitstemperaturen ved at dobbeltklikke på kolonne B og vælge indstillingen Statistik i venstre side af menuen Opsætning af datablok kolonne B. Vælg Mean fra menuens højre side og Kanal 2 som beregningskilde nederst i menuens vindue. Klik på OK for at lukke vinduet.
- Konvertering af den registrerede spænding til slag pr. minut
- Dobbeltklik på kolonne C, og vælg Markering og aktivt punkt i menuens venstre side. Vælg Markeringsvarighed i menuens højre side, og klik på OK for at lukke vinduet.
- Dobbeltklik på kolonne D, og vælg Cykliske mål i menuens venstre side. Vælg Hændelsesantal i menuens højre side og Kanal 1 som beregningskilde. Klik på OK for at lukke vinduet. Dette vil tælle toppene af dataene for at bestemme pulsen på tværs af en udvalgt del af data.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, skal du vælge knappen Indstillinger nederst i menuen og justere registreringsindstillingerne for at læse dataene mere nøjagtigt. Scan gennem datafilen og afgøre, om "Sine" eller "Spikey" form muligheder resulterer i optællinger af kun de store toppe af hjerteslag output. Juster desuden grænsen for justering af registrering i højre side af menuen for at ignorere støj i outputfilen. - Dobbeltklik på kolonne E, og vælg Cykliske mål i menuens venstre side. Vælg Gennemsnitlig cyklisk hastighedog Kanal 1 som beregningskilde. Juster registreringsindstillinger og registreringsjustering, så de svarer til indstillingerne for kolonne D (hvis de manipuleres i trin 4.4.2). Klik på OK for at lukke vinduet. Dette giver den endelige vurdering af puls (som slag i minuttet) over en udvalgt del af data.
- Når kolonnerne er konfigureret, skal du vende tilbage til datafilen og fremhæve de ønskede sektioner i outputtet og udelade områder med fejlagtige data som identificeret af kommentarer i afsnit 3.6.
- Vælg Kommandoer og Flere Føj til datablok.
- Vælg Tid i rullemenuen Søg ved hjælp af, og træk data hver 30 s ved at markere feltet Hver og skrive "30" under menuen Vælg.
- Klik på indstillingen Aktuel markering i menuen Trin gennem , og klik på Tilføj.
- Gå tilbage til skærmbilledet Datablok, og vælg Filer og Gem som for at gemme outputtet som en Excel-fil.
BEMÆRK: Her rapporteres puls (i slag i minuttet) hver 30 s i modsætning til hvert minut baseret på tidligere forskning8,27. Dette hjælper også til mere præcist at fange ændringer i de indsamlede spændingsdata i realtid. Det er muligt at vælge data med kortere eller længere tidsintervaller baseret på individuelle præferencer.
5. Beregning af Arrhenius pause temperatur
- Åbn datafilen i Excel, og manipuler outputtet fra LabChart-softwaren.
- Temperaturen omregnes fra Celsius til den gensidige Kelvin ved hjælp af følgende ligning: [1000/(temperatur °C + 273,15 K)].
- Anskaf den naturlige log over puls: ln(BPM).
- Generer et Arrhenius-plot ved at plotte puls som en funktion af temperaturen, udtrykt som ln(BPM) vs. gensidig (K)13,15.
- I SigmaPlot skal du tilpasse dataene med en stykkevis regression og bestemme skæringspunktet, som er ABT.
- Kopiere og indsætte de transformerede data til en ny projektmappe. Vælg indstillingen Statistik i hovedmenuen og guiden Regression på rullelisten.
- Vælg med stykkevis i menuen Ligningskategori og 2 segmentlineærunder feltet Ligningsnavn i vinduet Ligning. Klik på Næste.
- I vinduet Variabler skal du vælge de transformerede temperaturdata, der skal være t-variablen, og de transformerede pulsdata, der skal være y-variablen, ved hjælp af rullemenuerne i menuen Variable kolonner. t Sørg for, at XY Pair er markeret i menuen Data fra, før du klikker på Næste.
- Når du har gennemgået vinduet Tilpas resultater, skal du klikke på Næste og markere afkrydsningsfeltet Opret rapport i vinduet Numeriske outputindstillinger. Klik på Næste.
- I vinduet Diagramindstillinger skal du markere indstillingen Opret ny graf under afsnittet Tilpas resultatgraf og Føje ligning til graftitel under sektionen Diagramfunktioner. Klik på Udfør.
- På outputsiden for resultater skal du hente ligninger og parameterværdier for de to områder af den stykkevise regression2samt det statistiske output for regressionen (f.eks.
- Ved hjælp af de genererede parameterværdier og ligninger skal du indstille de to segmenter, der er lig med hinanden, og løse variablen "t" for at bestemme ABT. Konverter denne værdi tilbage til Celsius ved hjælp af følgende ligning: °C = (1000/t) - 273,15.
BEMÆRK: ABT kan også beregnes i det statistiske R-computermiljø ved hjælp af pakken "segmenteret"17 i programmet SAS18eller ved hjælp af rutinen "Segmental lineær regression" i Prism819.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver brugen af impedanspnumografi til at opnå realtidsdata for puls (i spænding) og temperatur under et temperaturrampingseksperiment. Ved perforering af denne teknik vil amplituden af de registrerede spændinger og temperaturer variere baseret på eksperimentelt design og brændvidde arter. Den spændingseffekt, der vises i realtid, følger imidlertid en generisk sinusfordeling, når protokollen gennemføres korrekt (figur 1A). Efterhånden som temperaturen i arenaen øges, ændres realtidsfordelingen af spænding for at afspejle en øget frekvens af spændingsspidser (dvs. hjerteslag; Figur 1B). Da arenatemperaturen fortsætter med at stige til niveauer uden for forsøgspersonens optimale ydelsesvindue, ændres fordelingen for at vise en reduceret frekvens af spændingsspidser med en sinuslignende form afbrudt af sporadiske toppe og/eller øjeblikke med "flad foring" (figur 1C).
Når rådata konverteres ved hjælp af Data Pad-komponenten i LabChart-softwaren, følger den resulterende fordeling af pulsen (i slag pr. minut) i løbet af temperaturrampen en parabolsk fordeling, hvis forsøget lykkes (Figur 2). Da temperaturen i arenaen er øget, stiger pulsen for testpersonen også for at imødekomme forhøjede energiske krav forbundet med varmere temperaturer. Men som temperaturen fortsætter med at stige, og testpersonen begynder at opleve moderat til ekstrem termisk stress, puls begynder at falde eller bliver uregelmæssig som emnet begynder at udvise passiv termisk tolerance (f.eks debut af anaerob respiration, stofskifte undertrykkelse, og nedsat aktivitet5,7). Når puls- og temperaturdata transformeres, og der genereres et Arrhenius-plot, kan det punkt, hvor pulsen begynder at falde (ABT), beregnes (figur 3). Arrhenius-plottet passer derefter med en stykkevis regression ved hjælp af statistisk software, hvor skæringspunktet mellem de to linjer repræsenterer ABT.
Figur 1: Repræsentativt output fra LabChart-datalogger. Tidsændring i spænding på tværs af testpersonens elektroder vises med rødt, og den samtidige realtidseffekt af arenatemperaturen (°C) vises med blåt. I begyndelsen af forsøget under køligere temperaturer (f.eks. 13,1 °C) bør spændingen følge en generisk sinuslignende fordeling (A). Efterhånden som temperaturen øges (f.eks. 23 °C), bør frekvensen af spændingsspidser øges, men fordelingen bør forblive sinusagtig (B). Endelig, da testpersonen skubbes uden for det optimale termiske ydelsesvindue (f.eks. 28,5 °C), skal spændingsspidserne blive uregelmæssige, efterhånden som frekvensen falder (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Forventet fordeling af pulsen over temperaturrampens bane. Spændingsdata, der indsamles af dataloggeren, konverteres til puls i slag pr. minut (BPM) ved hjælp af datapad-komponenten i softwaren. Når rampen udføres korrekt, vises en parabolsk fordeling af pulsen over det testede temperaturområde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Eksempel på et Arrhenius-plot. Når data er blevet konverteret i Data Pad og eksporteret, omdannes de til at generere et Arrhenius-plot. I dette eksempel passer data med en stykkevis ikke-lineær regression i SigmaPlot, der genererer ligninger for henholdsvis venstre- og højresegmenter (henholdsvis område 1 og region 2) af regressionslinjen samt godhed-of-fit-målinger. Skæringspunktet mellem de to regressionslinjer løses som ABT (rød stjerne). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver brugen af impedanspneumografi til at måle ændringer i hjertefrekvensen for sene stadier hvirvelløse dyr under et temperaturrampingseksperiment. Den primære fordel ved denne teknik i forhold til andre laboratoriebaserede tilgange9,10,11 er, at det er minimalt invasiv og ikke indebærer større kirurgisk manipulation af exoskelet, hvilket reducerer mængden af restitutionstid, der er nødvendig før eksperimenter. Desuden er udstyret let at bruge, og resulterende data kan simpelthen manipuleres og fortolkes i det foreslåede softwareprogram. Mens den amerikanske hummer bruges her som en model emne, denne teknik er blevet gennemført med succes i blåmuslinger (Mytilus spp.14) og kan let ændres til brug i andre sene fase hvirvelløse dyr (dvs. krabber, rejer og andre toskallede).
En yderligere fordel ved protokollen er, at den fokuserer på at beregne ABT som en ikke-dødelig indikator for termiske grænser. Selv om talrige undersøgelser præsenterer CTmax som det signifikante endepunkt ved bestemmelse af termisk fysiologisk ydeevne5,8,20,21,22,23, organismer sjældent støder på temperaturer i dette område i det naturlige miljø5. Desuden, da CTmax er ofte en dødelig temperatur, ved hjælp af denne metriske som det foretrukne endepunkt udelukker brugen af forsøgspersoner i yderligere eller opfølgende eksperimenter post-termisk stress23. Når det drejer sig om at beregne ABT ved hjælp af denne protokol, er det afgørende at øge temperaturen i forsøgsarenaen til det punkt, hvor testpersonen skubbes til dens fysiologiske grænse uden at fremkalde død. Det anbefales derfor at bestemme de potentielle termiske grænser for brændarten via en pilotundersøgelse (når det er muligt), før hele området for forsøgstemperaturrampen bestemmes.
Det anbefales også, at forskerne bestemme og observere naturlige variationer i basal puls af en fokale arter, når temperaturen i den eksperimentelle arena opretholdes på et konstant og ikke-stressende niveau forud for ramping eksperiment. Dette er især nyttigt for fokale arter, hvor hvilepulsoplysninger ikke er tilgængelige i den offentliggjorte litteratur. Det tjener også som rigelig praksis elektrode implantation teknikker. Dette kan også hjælpe forskerne med at bestemme den passende akklimatiseringstid, der kræves for at sikre, at ingen falske stigninger i pulsen skyldes håndtering af stress i begyndelsen af et eksperiment.
Selv om protokollen diskuterer brugen af impedans pneumografi i forbindelse med termisk stress alene, kan det også bruges til at udforske de potentielle interaktive virkninger af andre stressfaktorer på termisk fysiologi. Organismens ydeevne kan reduceres ved tilstedeværelse af miljøstressfaktorer (dvs. hypoxi, hyperkapni, forurenende stoffer og/eller ændringer i saltholdighed), som også kan komprimere optimale temperaturområder for ydeevne7,24,25,26. Som sådan kan denne protokol ændres for at undersøge, hvordan eksponering for forskellige stressfaktorer før temperaturramping kan påvirke ydeevnen.
For eksempel, Harrington og Hamlin27 udsat unge H. americanus til nuværende eller forudsagt slutningen af århundredet pH betingelser (8,0 og 7,6, henholdsvis) i 2 måneder før vurdering af hjerte-ydeevne under en temperatur rampe. Hummere, der var præeksponeret for mere sure miljøer, udviste en betydelig reduktion i gennemsnitlig ABT sammenlignet med dem, der blev holdt under de nuværende pH-betingelser. Dette tyder på, at et lavt pH-miljø reducerer den termiske ydeevne og kan øge risikoen for cellulære skader på grund af varmestress ved lavere temperaturer27. Den fremtidige indsats kunne udvide den metode, der præsenteres her, til at omfatte præeksponering for enhver kombination af miljøstressfaktorer, inden denne protokol følges. Desuden kan denne protokol ændres for at måle ændringer i hjerteydelsen under eksponering for biotiske stressfaktorer samt hvordan termiske grænser kan ændre sig i henhold til ontogeni4,5.
En væsentlig begrænsning af denne protokol er, at udstyret som beskrevet er begrænset til brug i et laboratorium indstilling, potentielt begrænse dets anvendelighed for felt-baserede eksperimenter, der kræver mere specialiseret udstyr8. Denne teknik kræver også tilbageholdenhed af meget motile forsøgspersoner (f.eks hummere og krabber) for at reducere produktionen af falske datapunkter som følge af ikke-hjertemusklen bevægelser. Selv om dette kan begrænse naturlige adfærd under en temperatur rampe, virkningen af begrænsninger er konsekvent på tværs af alle forsøgspersoner. Vigtigst er det, at der er potentiale for vævsskader eller død hos forsøgspersoner, hvis aggressiv eller skødesløs boring under elektrodeimplantation er gennemført. Dette står i skarp kontrast til infrarød fotoplethysmografi, en virkelig noninvasive teknik, der udnytter en ekstern infrarød transducer til at passere lys gennem hjertesækken og optage hjertefunktion ved at konvertere reflekteret lys energi til spænding8,28.
Selv om infrarød fotoplethysmografi reducerer risikoen for håndtering af stress i forhold til impedanspnatografi, resulterer korrekt implantering af elektroder ved hjælp af den beskrevne metode i minimaltraume, giver mulighed for en hurtig akklimatiseringstid og fører til hurtig genopretning uden at fremkalde dødelighed hos forsøgspersoner efter rampeforsøget27. Da der ikke er nogen signifikant forskel i det hjerteoutput, der registreres ved begge metoder28, konkluderes det, at impedanspnatografi er en pålidelig og minimalt invasiv teknik til vurdering af hjertepræstation. Endelig har de mange fordele og fleksibilitet i protokollen potentiale til at belyse, hvordan forskellige miljømæssige faktorer interagerer med temperaturen for at påvirke fysiologiske præstationer i sene stadier krebsdyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Paul Rawson for laboratoriebistand og National Science Foundation tildeling IIA-1355457 til Maine EPSCoR ved University of Maine for midler til at købe udstyr. Dette projekt blev støttet af USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch projektnummer MEO-21811 gennem Maine Agricultural and Forest Experiment Station, samt NOAA National Marine Fisheries Service Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. Forfatterne takker også tre anonyme anmeldere for deres kommentarer til en tidligere version af dette manuskript. Maine Landbrugs- og Skovforsøgsstation Offentliggørelse nummer 3733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK, and New York, NY, USA. (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P.
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life's origins to the Anthropocene. , Sinauer Associates, Incorporated Publishers. Sunderland, MA, USA. (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. Biology of the Lobster: Homarus americanus. , Academic Press. Boston, MA, USA. (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , US Department of Agriculture, Forest Service, . Rocky Mountain Research Station, Fort Collins, CO, USA. (2007).
- Prism8 Statistics Guide. , GraphPad Software, Inc. San Diego, California, USA. www.graphpad.com (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist's view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography - a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
