Summary
La misurazione della frequenza cardiaca durante una sfida termica fornisce informazioni sulle risposte fisiologiche degli organismi come conseguenza del cambiamento ambientale acuto. Utilizzando l'aragosta americana (Homarus americanus) come organismo modello, questo protocollo descrive l'uso della peografia impedibile come un approccio relativamente non invasivo e non letale per misurare la frequenza cardiaca negli invertebrati in fase avanzata.
Abstract
Le temperature negli oceani stanno aumentando rapidamente a causa dei cambiamenti diffusi nei climi mondiali. Poiché la fisiologia dell'organismo è fortemente influenzata dalla temperatura ambientale, questo ha il potenziale per alterare le prestazioni fisiologiche termiche in una varietà di organismi marini. Utilizzando l'aragosta americana (Homarus americanus) come organismo modello, questo protocollo descrive l'uso della pneografia impedibile per capire come le prestazioni cardiache negli invertebrati in fase avanzata cambiano sotto stress termico acuto. Il protocollo presenta una tecnica minimamente invasiva che consente la raccolta in tempo reale della frequenza cardiaca durante un esperimento di rampa della temperatura. I dati sono facilmente manipolabili per generare un grafico Arrhenius che viene utilizzato per calcolare la temperatura di rottura di Arrhenius (ABT), la temperatura alla quale la frequenza cardiaca inizia a diminuire con l'aumentare delle temperature. Questa tecnica può essere utilizzata in una varietà di invertebrati in fase avanzata (ad esempio, granchi, cozze o gamberetti). Anche se il protocollo si concentra esclusivamente sull'impatto della temperatura sulle prestazioni cardiache, può essere modificato per comprendere il potenziale per ulteriori fattori di stress (ad esempio, ipossia o ipercapnia) per interagire con la temperatura per influenzare le prestazioni fisiologiche. Pertanto, il metodo ha il potenziale per applicazioni ad ampio raggio per comprendere ulteriormente come gli invertebrati marini rispondono ai cambiamenti acuti nell'ambiente.
Introduction
Negli ultimi decenni, l'aumento dell'apporto di gas a effetto serra (ad esempio anidride carbonica, metano e protossido di azoto) nell'atmosfera ha portato a modelli diffusi di cambiamento ambientale1. Gli oceani del mondo stanno rapidamente riscaldando2,3, una tendenza che può avere gravi impatti sulla fisiologia dell'organismo. La temperatura influenza pesantemente i tassi fisiologici e gli organismi hanno un intervallo di temperatura ottimale per le prestazioni4,5,6. Come tale, gli individui possono incontrare difficoltà nel mantenere la corretta consegna di ossigeno ai tessuti come temperature allontanarsi al di fuori di questo intervallo. Questo ha il potenziale per portare a cali delle prestazioni aerobiche di fronte al riscaldamento delle temperature oceaniche5,7.
In un ambiente di laboratorio, un metodo per comprendere gli impatti fisiologici del cambiamento ambientale consiste nell'esaminare le prestazioni cardiache nel contesto dello stress termico. Questo fornisce informazioni su come l'esposizione alle condizioni di riscaldamento previste può alterare le curve di prestazioni5,6 così come il potenziale di plasticità di acclimatazione8. Una varietà di metodi sono stati implementati con successo per misurare in precedenza la frequenza cardiaca negli invertebrati marini. Tuttavia, molte di queste tecniche comportano la rimozione chirurgica o la manipolazione importante dell'esoscheletro e l'impianto prolungato dei dispositivi di misura9,10,11, che introduce ulteriore stress al soggetto del test e aumenta il tempo necessario per un recupero di successo prima della sperimentazione. Inoltre, le tecniche meno invasive (ad esempio, l'osservazione visiva, la videografia) possono essere limitate alle fasi della storia della vita precoce quando gli organismi possono essere completamente o semi-trasparenti12. Inoltre, ulteriori sfide possono essere presentate ai ricercatori che non sono esperti in metodologie più tecnologicamente avanzate (ad esempio, osservazioni tramite trasduttori a infrarossi o perfusione Doppler8,11).
Questo protocollo utilizza l'aragosta americana (Homarus americanus) come modello di invertebrato marino in fase avanzata per dimostrare l'uso della pemiografia impedibile per valutare i cambiamenti della frequenza cardiaca durante un esperimento di rampa della temperatura. La pneografia impedibile comporta il passaggio di una corrente elettrica oscillante (AC) attraverso due elettrodi posizionati su entrambi i lati del pericardio per misurare i cambiamenti di tensione come il cuore si contrae e si rilassa13,14. Questa tecnica è minimamente invasiva, in quanto impiega l'uso di piccoli elettrodi (cioè 0,10–0,12 mm di diametro) che vengono impiantati delicatamente appena sotto l'esoscheletro. Infine, fornisce valutazioni in tempo reale della frequenza cardiaca e della temperatura dell'acqua durante la rampa attraverso l'uso di un data logger.
Il protocollo fornisce anche istruzioni per il calcolo della temperatura di rottura di Arrhenius (ABT), la temperatura alla quale la frequenza cardiaca inizia a diminuire con l'aumento delle temperature13,15. L'ABT funge da indicatore non letale del limite termico di capacità nei soggetti che possono essere favoriti rispetto alla misurazione del massimo termico critico (CTmax, il limite superiore della funzione cardiaca5,6), poiché i limiti letali sono spesso estremi e raramente incontrati nell'ambiente naturale 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Configurazione dell'attrezzatura
- Avvolgere tubi chiari e malleabili intorno a sé per creare una bobina che si scambia il calore che è di circa 8-10 cm di diametro e ha estensioni 40-70 cm di lunghezza. Fissare la bobina con nastro elettrico.
- Attaccare la bobina di scambio di calore all'alimentazione esterna e restituire i raccordi di un bagno d'acqua che si trova a temperatura e in uscita. Assicurarsi che la connessione sia sicura utilizzando morsetti flessibili.
- Riempire il pozzo del bagno d'acqua circolante di raffreddamento/riscaldamento con acqua osmosi inversa (RO) e collegare il cavo di alimentazione in una presa. Accendere il bagno d'acqua e assicurarsi che non ci siano perdite nella sua connessione con la bobina di scambio di calore.
- Impostare il convertitore di impedazione collegando il cavo BNC nero all'uscita AC sull'unità e collegandolo al data logger (Tabella dei materiali) utilizzando la porta Canale 1.
- Collegare la sonda termocoppia (registratore di temperatura) al pod di tipo T, quindi collegare il pod di tipo T alla porta Canale 2 del registratore di dati.
- Collegare il cavo di alimentazione del data logger a un alimentatore e collegare il data logger a un computer PC utilizzando il connettore cavo USB.
- Riempire la camera di acclimatazione e l'arena sperimentale con 7,5 L di acqua di mare artificiale (salinità 35 ppt, pH - 8,1, temperatura .
NOTA: il volume, la temperatura e la chimica dell'acqua necessaria per la camera di acclimatazione e le condizioni di partenza nell'arena sperimentale dipendono dalla progettazione sperimentale. È importante sottolineare che questi contenitori devono essere abbastanza grandi da sommergere comodamente il soggetto del test.
2. Impianto di elettrodi
- Posizionare l'aragosta su una griglia di plastica che si inserisce facilmente nell'arena sperimentale in modo che il corpo faccia comodamente una forma Y ad un'estremità del rettangolo.
- Fissare con cura gli artigli e l'addome dell'aragosta alla griglia di plastica utilizzando piccole cravatte. Le cravatte devono essere sufficientemente strette da impedire il movimento, ma lasciare spazio alle forbici chirurgiche per rimuoverle al termine dell'esperimento.
- Asciugare il carapace con un tovagliolo di carta e pulirlo con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo del 70%.
- Creare i fori per gli elettrodi.
- Utilizzando una piccola punta di perforazione (ad esempio, 1,6 mm), lentamente e con attenzione forano a mano due piccoli fori (quasi) attraverso il carapace su entrambi i lati del pericardio.
- Finire ogni foro inserendo delicatamente un ago sterile di dissezione.
- Se l'ago non passa facilmente attraverso il carapace, continuare a tirare lentamente a mano prima di provare di nuovo l'ago.
NOTA: Per ridurre al minimo lo stress negli animali sperimentali, è altamente consigliabile praticare questa tecnica prima della sperimentazione. Nel corso del tempo, gli utenti possono facilmente determinare sentendosi quando la punta di perforazione è quasi attraverso il carapace e passare all'ago. La perforazione a mano è appropriata per aragoste e granchi, soprattutto se l'esoscheletro è morbido (cioè, l'animale si è recentemente fuso). Tuttavia, se il soggetto del test ha un esoscheletro o un guscio più spesso (cioè un bivalvolo), uno strumento Dremel è più appropriato.
- Ottenere gli elettrodi (36-38 G filo magnetico, 0,10–0,12 mm di diametro) e raschiare un po 'di isolamento sulla punta del filo utilizzando una lama di serpeggente coltello. Piegare con attenzione la punta di ogni filo in un piccolo gancio utilizzando pinze e inserirne una in ciascuno dei fori appena forati.
- Fissare ogni piombo di filo utilizzando una piccola goccia di colla cianoacrilata e lasciarlo asciugare per 5-10 min.
NOTA: È fondamentale utilizzare la colla con parsimonia, poiché l'aggiunta di troppo reincrola il filo e impedisce la registrazione del segnale. - Una volta che la colla è asciutta, fissare il filo conduce al convertitore impedibile e accenderlo. Mettere l'aragosta nella camera di acclimatazione e lasciarla acclimatare agli elettrodi impiantati per 15-20 min.
NOTA: movimenti rapidi o stridenti, nonché colla incompletamente essiccata, possono causare l'staccamento degli elettrodi dal carapace. In questo caso, tornare al passaggio 2.6. - Attivare il data logger e aprire il software LabChart sul computer. Fai clic su Nuovo esperimento e lascia aperta la schermata Vista grafico.
- In Visualizzazione grafico, individuare il menu Funzione canale per il canale 1 dalla sezione destra dello schermo. Scegliere Amplificatore di input dal menu e selezionare Accoppiamento AC. Il segnale in arrivo dal soggetto del test verrà ora visualizzato sullo schermo in tempo reale.
NOTA: la sensibilità del canale può essere regolata selezionando il menu a comparsa Intervallo. Regolare l'intervallo fino a quando i picchi del segnale sono 25%–75% della scala completa. Chiudere l'amplificatore di input facendo clic su OK. - Sul convertitore impedimento, regolare il guadagno (dimensione) e l'equilibrio fino a quando non viene osservato un segnale forte sull'uscita del data logger, con l'obiettivo di mantenere il saldo vicino allo zero.
- Sul canale 2, selezionate il contenitore Tipo T per registrare i dati della temperatura in tempo reale.
- Quando entrambi i canali sono impostati correttamente, fare clic sul pulsante Start e il data logger inizierà a registrare i dati.
3. Appendenza della temperatura
- Dopo il periodo di acclimatazione, posizionare la griglia di plastica con l'aragosta attaccata con attenzione nell'arena sperimentale e mettere la bobina di scambio di calore sulla parte superiore della griglia.
- Posizionare la sonda termocoppia vicino all'aragosta, assicurandosi che sia completamente sommersa prima di posizionare il coperchio sull'arena sperimentale per ridurre lo stress visivo al soggetto di prova.
- Regolare l'equilibrio in base alle esigenze e inserire un commento sull'output indicando che la prova è iniziata.
- L'output può e deve essere salvato periodicamente durante l'esperimento.
- Fare clic su File e selezionare Salva con nome per salvare inizialmente l'output nel computer.
- Durante il salvataggio durante l'esperimento, fare clic su File e selezionare Salva.
NOTA: anche se il software LabChart è in grado di recuperare i file in caso di arresto accidentale del programma (ad esempio, un'interruzione dell'alimentazione), si consiglia di salvare i file attivi ogni 15-20 min durante l'esperimento per evitare la perdita di dati.
- Aumentare la temperatura dell'acqua dell'arena sperimentale ad una velocità di 1,5 gradi centigradi ogni 15 min per ottenere una rampa da 12 a 30 gradi centigradi in un periodo di 2,5 ore regolando la temperatura del bagno d'acqua ricircolante.
NOTA: La distribuzione geografica dell'aragosta americana si estende su un gradiente termico di 25 gradi centigradi, e gli individui possono acclimatarsi e sopravvivere a temperature fino a 30 c16. Come tale, 30 S è stato scelto come limite superiore per questa rampa di temperatura, in quanto assicura che le aragoste sperimentano uno scenario stressante che non raggiunge il massimo termico critico13, che potrebbe portare alla mortalità. Il tasso specifico di riscaldamento è stato selezionato perché rientra in una serie di tassi di riscaldamento implementati in studi che utilizzano altre specie8,14 così come precedenti ricerche sull'aragosta americana13,27. Prima di implementare questo protocollo, è importante 1) determinare l'intervallo appropriato di temperature per un dato esperimento e 2) condurre una rampa di temperatura pre-prova con un'arena sperimentale vuota, in quanto ciò contribuirà a determinare la regolazione della temperatura necessaria del bagno d'acqua per ottenere la rampa desiderata. Questo può anche variare a seconda del volume di acqua nell'arena. - In tutta la rampa di temperatura, registrare ogni volta che si verifica una regolazione che può influire sull'uscita.
- Si noti che l'equilibrio sull'impetobiglio convertibile dovrà probabilmente essere regolato durante l'esperimento, e così facendo potrebbe causare un picco involontario nell'output.
- Quando la temperatura nell'arena sperimentale inizia a raggiungere livelli al di fuori dell'intervallo termico preferito del soggetto del test, le contrazioni muscolari involontarie possono provocare un "spike" errato nell'uscita. In questo caso, fare un commento per identificare le aree dell'output che devono essere rimosse durante il processo di conversione dei dati.
- Una volta completata la rampa, togliere l'aragosta dall'arena sperimentale e metterla in un bagno di recupero (12 gradi centigradi) per 20 min. Se lo si desidera, continuare a monitorare la frequenza cardiaca dell'aragosta fino a quando non ritorna ai livelli basali.
- Dopo 20 min, premi il pulsante Stop sull'output di PowerLab e salva il file. Rimuovere con attenzione gli elettrodi e tagliare i cavi con le forbici chirurgiche prima di restituire il soggetto del test al suo serbatoio di tenuta.
NOTA: Piuttosto che mettere un'aragosta direttamente nel bagno di recupero, un'altra opzione è quella di riportare lentamente l'arena sperimentale alla sua temperatura iniziale. Ciò si ottiene raffreddando l'arena sperimentale di 1,5 gradi centigradi ogni 15 min nel corso di ulteriori 2,5 h.
4. Conversione dei dati
- Apri Data Pad. Impostare la colonna A sul tempo facendo doppio clic sulla colonna A e facendo clic su Selezione & Punto attivo sul lato sinistro del menu Impostazione colonna blocco dati A. Selezionare Ora sul lato destro del menu e chiudere la finestra facendo clic su OK.
- Impostare la colonna B sulla temperatura media facendo doppio clic sulla colonna B e selezionando l'opzione Statistiche dal lato sinistro del menu Impostazione colonna blocco dati B. Selezionare Media sul lato destro del menu e Canale 2 come origine del calcolo nella parte inferiore della finestra del menu. Fare clic su OK per chiudere la finestra.
- Conversione della tensione registrata in battiti al minuto
- Fare doppio clic sulla colonna C e selezionare Selezione e punto attivo sul lato sinistro del menu. Selezionare Durata selezione sul lato destro del menu e fare clic su OK per chiudere la finestra.
- Fare doppio clic sulla colonna D e selezionare Misure cicliche sul lato sinistro del menu. Selezionare Conteggio eventi sul lato destro del menu e Canale 1 come origine del calcolo. Fare clic su OK per chiudere la finestra. Questo conterà i picchi dei dati per determinare la frequenza cardiaca in una porzione di dati selezionata.
NOTA: se necessario, selezionare il pulsante Opzioni nella parte inferiore del menu e regolare le impostazioni di rilevamento per leggere i dati in modo più accurato. Eseguire la scansione del file di dati e determinare se le opzioni di forma "Sine" o "Spikey" determinano conteggi solo dei picchi principali dell'output dell'heartbeat. Inoltre, regolare la soglia di regolazione del rilevamento sul lato destro del menu per ignorare il rumore nel file di output. - Fare doppio clic sulla colonna E e selezionare Misure cicliche sul lato sinistro del menu. Selezionare Tasso ciclico medioe Canale 1 come Origine calcolo. Regolare le impostazioni di rilevamento e la regolazione del rilevamento in modo che corrispondano alle impostazioni della colonna D (se manipolato nel passaggio 4.4.2). Fare clic su OK per chiudere la finestra. Questo fornisce la stima finale della frequenza cardiaca (come battiti al minuto) su una porzione di dati selezionata.
- Quando le colonne sono impostate, tornare al file di dati ed evidenziare le sezioni desiderate dell'output, omettendo le aree di dati errati identificati dai commenti nella sezione 3.6.
- Selezionare Comandi e aggiunta multipla al riquadro dati.
- Selezionare Tempo dal menu a discesa Trova utilizzando e tirare i dati ogni 30 s selezionando la casella Ogni e immettendo "30" nel menu Seleziona.
- Fare clic sull'opzione Selezione corrente dal menu Esegui passo a punto e scegliere Aggiungi.
- Tornare alla schermata Data Pad e selezionare File e Salva con nome per salvare l'output come file Excel.
NOTA: Qui, la frequenza cardiaca è segnalata (in battiti al minuto) ogni 30 s al contrario di ogni minuto sulla base di ricerche precedenti8,27. Questo aiuta anche a catturare con maggiore precisione i cambiamenti nei dati di tensione raccolti in tempo reale. È possibile selezionare i dati a intervalli di tempo più brevi o più lunghi in base alle preferenze individuali.
5. Calcolo della temperatura di rottura di Arrhenius
- Aprire il file di dati in Excel e modificare l'output del software LabChart.
- Convertire la temperatura da Celsius al reciproco di Kelvin utilizzando la seguente equazione: [1000/(temperatura : 273.15 K)].
- Ottenere il registro naturale della frequenza cardiaca: ln(BPM).
- Generare un grafico Arrhenius tracciando la frequenza cardiaca in funzione della temperatura, espressa13,15come ln(BPM) vs.
- In SigmaPlot, inserire i dati con una regressione a pezzi e determinare il punto di intersezione, ovvero l'ABT.
- Copiare e incollare i dati trasformati in una nuova cartella di lavoro. Selezionare l'opzione Statistiche dal menu principale e dalla procedura guidata di regressione dall'elenco a discesa.
- Nella finestra Equazione, selezionare a pezzi dal menu Categoria equazione e 2 segmenti lineari sotto la casella Nome equazione. Fare clic su Avanti.
- Nella finestra Variabili, selezionare i dati di temperatura trasformati in variabile t e i dati della frequenza cardiaca trasformati in variabile y, utilizzando le opzioni a discesa nel menu Colonne variabili. Assicurarsi che coppia XY sia selezionata nel menu Dati da prima di fare clic su Avanti.
- Dopo aver esaminato la finestra Adatta risultati, fare clic su Avanti e selezionare la casella Crea report nella finestra Opzioni di output numerico. Fare clic su Avanti.
- Nella finestra Opzioni grafico, selezionare l'opzione Crea nuovo grafico nella sezione Adatta grafico risultati e Aggiungi equazione al titolo del grafico nella sezione Caratteristiche grafico. Fare clic su Fine.
- Nella pagina di output Risultati recuperare le equazioni e i valori dei parametri per le due aree della regressione a pezzi, nonché l'output statistico per la regressione (ad esempio, R2, F-statistica e p-value).
- Utilizzando i valori dei parametri e le equazioni generate, impostare i due segmenti uguali l'uno all'altro e risolvere la variabile "t" per determinare l'ABT. Converti questo valore in Celsius utilizzando la seguente equazione: .
NOTA: l'ABT può essere calcolato anche nell'ambiente di calcolo statistico R utilizzando il pacchetto "segmentato"17 nel programma SAS18, o utilizzando la routine di "regressione lineare segmentale" in Prism819.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questo protocollo descrive l'uso della pneografia impeditrice per ottenere dati in tempo reale per la frequenza cardiaca (in tensione) e la temperatura durante un esperimento di rampa della temperatura. Quando si prevede questa tecnica, l'ampiezza delle tensioni e delle temperature registrate varierà in base alla progettazione sperimentale e alle specie focali. Tuttavia, l'output di tensione visualizzato in tempo reale segue una distribuzione del sinarea generica quando il protocollo viene implementato correttamente (Figura 1A). Con l'aumentare della temperatura nell'arena, la distribuzione in tempo reale della tensione cambia per riflettere una maggiore frequenza dei picchi di tensione (cioè battiti cardiaci; Figura 1B). Mentre la temperatura dell'arena continua ad aumentare a livelli al di fuori della finestra delle prestazioni ottimali del soggetto di prova, la distribuzione cambia per rappresentare una frequenza ridotta di picchi di tensione con una forma simile a un sinusoidale interrotta da picchi sporadici e/o momenti di "flat-lining" (Figura 1C).
Una volta che i dati grezzi vengono convertiti utilizzando il componente Data Pad del software LabChart, la distribuzione risultante della frequenza cardiaca (in battiti al minuto) nel corso della rampa di temperatura segue una distribuzione parabolica se l'esperimento ha esito positivo (Figura 2). Con l'aumentare della temperatura nell'arena, aumenta anche la frequenza cardiaca del soggetto del test per soddisfare elevate esigenze energetiche associate a temperature più calde. Tuttavia, mentre la temperatura continua ad aumentare e il soggetto del test inizia a sperimentare stress termico da moderato a estremo, la frequenza cardiaca inizia a diminuire o diventa irregolare quando il soggetto inizia a mostrare tolleranza termica passiva (ad esempio, l'insorgenza di respirazione anaerobica, la soppressione del tasso metabolico e la ridotta attività5,7). Quando i dati della frequenza cardiaca e della temperatura vengono trasformati e viene generato un grafico Arrhenius, il punto in cui la frequenza cardiaca inizia a diminuire (ABT) può essere calcolato (Figura 3). Il grafico di Arrhenius si adatta quindi a una regressione a pezzi utilizzando un software statistico in cui l'intersezione delle due linee rappresenta l'ABT.
Figura 1: Output rappresentativo dal logger di dati LabChart. Il cambiamento di tensione in tempo reale tra gli elettrodi del soggetto del test viene visualizzato in rosso e la concomitante uscita in tempo reale della temperatura dell'arena (C) viene visualizzata in blu. All'inizio dell'esperimento a temperature più fredde (ad es., 13,1 gradi centigradi), la tensione dovrebbe seguire una distribuzione generica simile al sinocco (A). Con l'aumentare della temperatura (ad es., 23 gradi centigradi), la frequenza dei picchi di tensione dovrebbe aumentare, ma la distribuzione dovrebbe rimanere simile al sine(B). Infine, poiché il soggetto del test viene spinto all'esterno della finestra delle prestazioni termiche ottimali (ad esempio, 28,5 gradi centigradi), i picchi di tensione dovrebbero diventare irregolari man mano che la frequenza diminuisce (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Distribuzione prevista della frequenza cardiaca sulla scala della rampa di temperatura. I dati di tensione raccolti dal data logger vengono convertiti in battiti cardiaci al minuto (BPM) utilizzando il componente Data Pad del software. Quando la rampa è condotta correttamente, viene visualizzata una distribuzione parabolica della frequenza cardiaca sull'intervallo di temperatura testato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempio di un grafico Arrhenius. Una volta che i dati sono stati convertiti nel Data Pad ed esportati, vengono trasformati per generare un grafico Arrhenius. In questo esempio, i dati sono adattati a una regressione non lineare a pezzi in SigmaPlot, generando equazioni per i segmenti sinistro e destro (rispettivamente regione 1 e regione 2) della linea di regressione, nonché metriche di bontà di adattamento. L'intersezione delle due linee di regressione viene risolta come ABT (stella rossa). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo descrive l'uso della pneografia impeditrice per misurare i cambiamenti nella frequenza cardiaca degli invertebrati in fase avanzata durante un esperimento di rampa della temperatura. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri approcci di laboratorio9,10,11 è che è minimamente invasiva e non comporta una grande manipolazione chirurgica dell'esoscheletro, riducendo così la quantità di tempo di recupero necessaria prima della sperimentazione. Inoltre, l'apparecchiatura è facile da usare e i dati risultanti possono essere semplicemente manipolati e interpretati nel programma software suggerito. Mentre l'aragosta americana viene utilizzata qui come soggetto modello, questa tecnica è stata implementata con successo nelle cozze blu (Mytilus spp.14) e può essere facilmente modificata per l'uso in altri invertebrati in fase avanzata (ad esempio, granchi, gamberetti e altri bivalvi).
Un ulteriore vantaggio del protocollo è che si concentra sul calcolo dell'ABT come indicatore non letale dei limiti termici. Sebbene numerosi studi presentino il CTmax come punto finale significativo nel determinare le prestazioni fisiologiche termiche5,8 ,208,21 ,,21,,23, gli organismi raramente incontrano temperature in questo intervallo nell'ambiente naturale5.22 Inoltre, poiché il CTmax è spesso una temperatura letale, l'utilizzo di questa metrica come endpoint preferito preclude l'uso di soggetti di prova in ulteriori o successive sperimentazioni post-termiche23. Quando si mira a calcolare l'ABT utilizzando questo protocollo, è fondamentale aumentare la temperatura nell'arena sperimentale al punto di spingere il soggetto di prova al suo limite fisiologico senza indurre la morte. Pertanto, si raccomanda di determinare i potenziali limiti termici della specie focale attraverso uno studio pilota (quando possibile) prima di determinare l'intera gamma della rampa di temperatura sperimentale.
Si raccomanda inoltre che i ricercatori determinino e osservino le variazioni naturali della frequenza cardiaca basale di una specie focale quando la temperatura nell'arena sperimentale viene mantenuta a un livello costante e non stressante prima dell'esperimento di rampa. Ciò è particolarmente utile per le specie focali in cui le informazioni sulla frequenza cardiaca a riposo non sono disponibili nella letteratura pubblicata. Serve anche come ampia pratica delle tecniche di impianto degli elettrodi. Questo può anche aiutare i ricercatori a determinare il tempo di acclimatazione appropriato necessario per garantire che nessun falso spike nella frequenza cardiaca sia dovuto alla gestione dello stress all'inizio di un esperimento.
Anche se il protocollo discute l'uso della pneografia impedibile solo nel contesto dello stress termico, può anche essere utilizzato per esplorare i potenziali effetti interattivi di altri fattori di stress sulla fisiologia termica. Le prestazioni dell'organismo possono essere ridotte in presenza di fattori di stress ambientali (ad esempio ipossia, ipercapnia, inquinanti e/o variazioni di salinità), che possono anche comprimere intervalli di temperatura ottimali per le prestazioni7,24,25,26. Come tale, questo protocollo può essere modificato per esplorare come l'esposizione a vari fattori di stress prima della rampa di temperatura può influire sulle prestazioni.
Ad esempio, Harrington e Hamlin27 hanno esposto h. americanus giovanile alle condizioni di pH di fine secolo attuali o previste (8,0 e 7,6, rispettivamente) per 2 mesi prima di valutare le prestazioni cardiache durante una rampa di temperatura. Le aragoste preesposte ad ambienti più acidi hanno mostrato una significativa riduzione dell'ABT medio rispetto a quelle tenute nelle attuali condizioni di pH. Ciò suggerisce che un ambiente a basso pH riduce le prestazioni termiche e può aumentare il rischio di danni cellulari a causa di stress termico a temperature più basse27. Gli sforzi futuri potrebbero ampliare il metodo qui presentato per includere la pre-esposizione a qualsiasi combinazione di fattori di stress ambientale prima di seguire questo protocollo. Inoltre, questo protocollo può essere modificato per misurare i cambiamenti nelle prestazioni cardiache durante l'esposizione a fattori di stress biotici e come i limiti termici possono cambiare a seconda dell'ontogenesi4,5.
Una delle principali limitazioni di questo protocollo è che l'apparecchiatura come descritto è limitata per l'uso in un ambiente di laboratorio, limitando potenzialmente la sua applicabilità per esperimenti sul campo che richiedono attrezzature più specializzate8. Questa tecnica richiede anche il contenimento di soggetti di prova altamente motile (ad esempio, aragoste e granchi) per ridurre la produzione di falsi punti dati derivanti da movimenti muscolari non cardiaci. Anche se questo può limitare i comportamenti naturali durante una rampa di temperatura, l'impatto dei vincoli è costante in tutti i soggetti del test. Ancora più importante, c'è il potenziale per danni ai tessuti o morte in soggetti di prova se viene implementata la perforazione aggressiva o incurante durante l'impianto dell'elettrodo. Questo contrasta nettamente con la fotopletismografia a infrarossi, una tecnica veramente non invasiva che utilizza un trasduttore infrarosso esterno per far passare la luce attraverso il pericardio e registrare la funzione cardiaca convertendo l'energia luminosa riflessa in tensione8,28.
Anche se la fotopletagrafia a infrarossi riduce il rischio di gestire lo stress rispetto all'impetografia, impiantare correttamente gli elettrodi utilizzando il metodo descritto produce un trauma minimo, consente un rapido tempo di acclimatamento e porta a un rapido recupero senza indurre mortalità nei soggetti a seguito dell'esperimento di rampa27. Poiché non vi è alcuna differenza significativa nella produzione cardiaca registrata con entrambi i metodi28, si conclude che la pneografia impedibile è una tecnica affidabile e minimamente invasiva per valutare le prestazioni cardiache. Infine, i numerosi benefici e la flessibilità del protocollo hanno il potenziale per chiarire come i vari fattori ambientali interagiscono con la temperatura per influire sulle prestazioni fisiologiche nei crostacei in fase avanzata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Paul Rawson per l'assistenza di laboratorio e il premio IIA-1355457 della National Science Foundation al Maine EPSCoR presso l'Università del Maine per i fondi per l'acquisto di attrezzature. Questo progetto è stato sostenuto dall'USDA National Institute of Food and Agriculture, numero di progetto Hatch MEO-21811 attraverso la Maine Agricultural and Forest Experiment Station, così come NOAA National Marine Fisheries Service Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. Gli autori ringraziano anche tre recensori anonimi per i loro commenti su una versione precedente di questo manoscritto. Maine Agricultural and Forest Experiment Station Numero di pubblicazione 3733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK, and New York, NY, USA. (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P.
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life's origins to the Anthropocene. , Sinauer Associates, Incorporated Publishers. Sunderland, MA, USA. (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. Biology of the Lobster: Homarus americanus. , Academic Press. Boston, MA, USA. (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , US Department of Agriculture, Forest Service, . Rocky Mountain Research Station, Fort Collins, CO, USA. (2007).
- Prism8 Statistics Guide. , GraphPad Software, Inc. San Diego, California, USA. www.graphpad.com (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist's view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography - a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
