Summary
Die Messung der Herzfrequenz während einer thermischen Herausforderung gibt Einblick in physiologische Reaktionen von Organismen als Folge akuter Umweltveränderungen. Mit dem amerikanischen Hummer (Homarus americanus) als Modellorganismus beschreibt dieses Protokoll die Verwendung der Impedanz-Pneumographie als einen relativ nichtinvasiven und nichttödlichen Ansatz zur Messung der Herzfrequenz bei wirbellosen Wirbellosen im späten Stadium.
Abstract
Die Temperaturen in den Ozeanen steigen infolge der weitverbreiteten Veränderungen des Weltklimas rapide an. Da die Physiologie des Organismus stark von der Umgebungstemperatur beeinflusst wird, hat dies das Potenzial, die thermische physiologische Leistungsfähigkeit in einer Vielzahl von Meeresorganismen zu verändern. Mit dem amerikanischen Hummer (Homarus americanus) als Modellorganismus beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von Impedanz-Pneumographie, um zu verstehen, wie sich die Kardialleistung in Wirbellosen im späten Stadium unter akutem thermischem Stress verändert. Das Protokoll stellt eine minimal-invasive Technik dar, die eine Echtzeit-Erfassung der Herzfrequenz während eines Temperatur-Ramping-Experiments ermöglicht. Daten können leicht manipuliert werden, um ein Arrhenius-Diagramm zu erzeugen, das verwendet wird, um arrhenius Bruchtemperatur (ABT) zu berechnen, die Temperatur, bei der die Herzfrequenz beginnt, mit steigenden Temperaturen zu sinken. Diese Technik kann in einer Vielzahl von Wirbellosen im späten Stadium (z. B. Krebse, Muscheln oder Garnelen) eingesetzt werden. Obwohl sich das Protokoll ausschließlich auf die Auswirkungen der Temperatur auf die Herzleistung konzentriert, kann es modifiziert werden, um das Potenzial für zusätzliche Stressoren (z. B. Hypoxie oder Hyperkapnie) zu verstehen, um mit der Temperatur zu interagieren, um die physiologische Leistung zu beeinflussen. Daher hat die Methode das Potenzial für weitreichende Anwendungen, um besser zu verstehen, wie wirbellose Meerestiere auf akute Veränderungen in der Umwelt reagieren.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten hat die zunehmende Initigung von Treibhausgasen (d. h. Kohlendioxid, Methan und Lachgas) in die Atmosphäre zu weit verbreiteten Mustern der Umweltveränderung geführt1. Die Weltmeere erwärmen sich schnell2,3, ein Trend, der schwerwiegende Auswirkungen auf die Physiologie des Organismus haben kann. Die Temperatur beeinflusst stark die physiologischen Raten, und Organismen haben einen optimalen Temperaturbereich für Leistung4,5,6. Als solche, Einzelpersonen können Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung der richtigen Sauerstoffversorgung geweben auftreten, da Temperaturen außerhalb dieses Bereichs streunen. Dies hat das Potenzial, zu einem Rückgang der aeroben Leistung angesichts der Erwärmung der Ozeantemperaturenführen 5,7.
In einem Labor ist eine Methode, um die physiologischen Auswirkungen von Umweltveränderungen zu verstehen, die Herzleistung im Kontext von thermischem Stress zu untersuchen. Dies gibt einen Einblick, wie die Exposition gegenüber vorhergesagten Erwärmungsbedingungen Leistungskurven5,6 sowie das Potenzial für Akklimatität simponizität8verändern kann. Eine Vielzahl von Methoden wurden erfolgreich implementiert, um zuvor die Herzfrequenz bei wirbellosen Meerestieren zu messen. Viele dieser Techniken beinhalten jedoch eine chirurgische Entfernung oder größere Manipulation des Exoskeletts und eine längere Implantation von Messgeräten9,10,11, was zusätzliche Belastung für den Testgegenstand mit sich bringt und die Zeit erhöht, die für eine erfolgreiche Genesung vor dem Experimentieren benötigt wird. Darüber hinaus können weniger invasive Techniken (z. B. visuelle Beobachtung, Videographie) auf frühe Lebensverlaufsstadien beschränkt werden, wenn Organismen vollständig oder halbtransparent sein können12. Darüber hinaus können Forscher, die sich nicht mit technologisch fortschrittlicheren Methoden auskennen (z. B. Beobachtungen über Infrarot-Wandler oder Dopplerperfusion8,11), zusätzliche Herausforderungen stellen.
Dieses Protokoll verwendet den amerikanischen Hummer (Homarus americanus) als spätes Marine-Wirbellosenmodell, um die Verwendung von Impedanz-Pneumographie zur Beurteilung von Veränderungen der Herzfrequenz während eines Temperatur-Ramping-Experiments zu demonstrieren. Die Impedanz-Pneumographie beinhaltet die Weitergabe eines oszillierenden elektrischen Stroms (AC) über zwei Elektroden, die auf beiden Seiten des Perikards positioniert sind, um Spannungsänderungen zu messen, wenn sich das Herz zusammenzieht und entspannt13,14. Diese Technik ist minimal invasiv, da sie die Verwendung von kleinen Elektroden (d. h. 0,10–0,12 mm Durchmesser) verwendet, die sanft unter dem Exoskelett implantiert werden. Schließlich bietet es Echtzeit-Bewertungen der Herzfrequenz und Der Wassertemperatur während der Rampe durch den Einsatz eines Datenloggers.
Das Protokoll enthält auch Anweisungen zur Berechnung der Arrhenius Bruchtemperatur (ABT), die Temperatur, bei der die Herzfrequenz beginnt, mit steigenden Temperaturen13,15zu sinken. Die ABT dient als nicht-tödlicher Indikator für die thermische Kapazitätsgrenze bei Probanden, die gegenüber der Messung des kritischen thermischen Maximums (CTmax, die Obergrenze der Herzfunktion5,6) bevorzugt werden können, da tödliche Grenzwerte oft extrem und in der natürlichen Umgebung selten anzutreffen sind5.
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Protocol
1. Ausrüstungsaufbau
- Wrap klare, formbare Schläuche um sich selbst, um eine wärmeaustauschende Spule zu schaffen, die etwa 8–10 cm im Durchmesser ist und Verlängerungen von 40–70 cm Länge hat. Sichern Sie die Spule mit elektrischem Klebeband.
- Befestigen Sie die Wärmeaustauschspule an der externen Zufuhr und den Rücklaufarmaturen eines Kühl-/Heizwasserbades. Stellen Sie sicher, dass die Verbindung mit Schlauchklemmen sicher ist.
- Füllen Sie den Brunnen des kühl-/heizzirkulierenden Wasserbades mit Umkehrosmose (RO) Wasser und schließen Sie das Netzkabel an einen Ausgang an. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie sicher, dass es keine Leckagen in der Verbindung mit der Wärmeaustauschspule gibt.
- Richten Sie den Impedanz-Convertor ein, indem Sie das schwarze BNC-Kabel an den AC-Ausgang des Geräts anschließen und es über den Kanal 1-Port mit dem Datenlogger (Tabelle der Materialien) verbinden.
- Schließen Sie den Thermoelement-Sonden (Temperaturschreiber) an den T-Typ-Pod an, und schließen Sie dann den T-Typ-Pod an den Kanal 2-Port des Datenloggers an.
- Schließen Sie das Netzkabel des Datenloggers an ein Netzteil an und schließen Sie den Datenlogger über den USB-Kabelanschluss an einen PC-Computer an.
- Füllen Sie die Akklimatisierungskammer und Versuchsarena mit 7,5 l künstlichem Meerwasser (Salzgehalt = 35 ppt, pH = 8,1, Temperatur = 12 °C).
HINWEIS: Volumen, Temperatur und Chemie des Wassers, das für die Akklimatisierungskammer und die Startbedingungen in der Versuchsarena benötigt wird, hängen von der experimentellen Konstruktion ab. Wichtig ist, dass diese Behälter groß genug sein müssen, um den Testgegenstand bequem unter Wasser zu setzen.
2. Implantation von Elektroden
- Legen Sie den Hummer auf einen Kunststoffrost, der leicht in die Experimentierarena passt, so dass der Körper bequem eine Y-Form an einem Ende des Rechtecks macht.
- Sichern Sie die Krallen und den Bauch des Hummers vorsichtig mit kleinen Kabelbindern am Kunststoffrost. Die Kabelbinder sollten fest genug sein, um Bewegung zu verhindern, aber Raum für chirurgische Scheren lassen, um sie nach Abschluss des Experiments zu entfernen.
- Trocknen Sie den Panzer mit einem Papiertuch ab und reinigen Sie ihn mit einer In 70% Ethanol getränkten Baumwollkugel.
- Erstellen Sie die Löcher für die Elektroden.
- Mit einem kleinen Bohrer (z.B. 1,6 mm) bohren Sie langsam und vorsichtig zwei kleine Löcher (fast) durch den Panzer auf beiden Seiten des Perikards.
- Beenden Sie jedes Loch, indem Sie vorsichtig eine sterile Sezierender Nadel einsetzen.
- Wenn die Nadel nicht leicht durch den Panzer geht, fahren Sie fort, langsam von Hand zu bohren, bevor Sie die Nadel erneut versuchen.
HINWEIS: Um Stress bei Versuchstieren zu minimieren, wird dringend empfohlen, diese Technik vor dem Experimentieren zu praktizieren. Im Laufe der Zeit können Benutzer leicht bestimmen, indem sie fühlen, wann der Bohrer fast durch den Panzer ist und auf die Nadel umschalten. Handbohren eignet sich für Hummer und Krebse, besonders wenn das Exoskelett weich ist (d.h. das Tier hat sich vor kurzem geschmolzen). Wenn der Testgegenstand jedoch über ein dickeres Exoskelett oder eine dickere Schale (d. h. eine Muschel) verfügt, ist ein Dremel-Werkzeug besser geeignet.
- Besorgen Sie sich die Elektroden (36–38 G Magnetdraht, 0,10–0,12 mm Durchmesser) und kratzen Sie mit einer sezierenden Messerklinge ein kleines Stück Isolierung an der Drahtspitze ab. Biegen Sie vorsichtig die Spitze jedes Drahtes in einen kleinen Haken mit Zangen und legen Sie einen in jede der neu gebohrten Löcher.
- Sichern Sie jede Drahtleitung mit einem kleinen Tropfen Cyanoacrylatkleber und lassen Sie es 5–10 min trocknen.
HINWEIS: Es ist wichtig, den Kleber sparsam zu verwenden, da das Hinzufügen zu viel den Draht wieder isoliert und verhindert, dass das Signal aufgezeichnet wird. - Sobald der Kleber trocken ist, befestigen Sie den Draht führt an der Impedanz Konverter und schalten Sie es ein. Legen Sie den Hummer in die Akklimatisierungskammer und lassen Sie ihn 15–20 min an die implantierten Elektroden gewöhnen.
HINWEIS: Schnelle oder störende Bewegungen sowie unvollständig getrockneter Leim können dazu führen, dass sich die Elektroden vom Panzer lösen. Wenn dies der Fall ist, kehren Sie zu Schritt 2.6 zurück. - Schalten Sie den Datenlogger ein, und öffnen Sie die LabChart-Software auf dem Computer. Klicken Sie auf Neues Experiment, und lassen Sie den Bildschirm Diagrammansicht geöffnet.
- Suchen Sie in der Diagrammansichtdas Menü Kanalfunktion für Kanal 1 im rechten Bereich des Bildschirms. Wählen Sie Eingangsverstärker aus dem Menü und wählen Ac Coupling. Das eingehende Signal des Testsubjekts wird nun in Echtzeit auf dem Bildschirm angezeigt.
HINWEIS: Die Empfindlichkeit des Kanals kann durch Auswahl des Popup-Menüs Bereich eingestellt werden. Passen Sie den Bereich an, bis die Signalspitzen 25 %–75 % der gesamten Skala betragen. Schließen Sie den Eingabeverstärker, indem Sie auf OKklicken. - Passen Sie am Impedanzkonverter die Gain (Größe) und Balance an, bis ein starkes Signal am Datenloggerausgang beobachtet wird, um den Saldo nahe Null zu halten.
- Wählen Sie auf Kanal 2 den T-Type-Pod aus, um Echtzeit-Temperaturdaten aufzuzeichnen.
- Wenn beide Kanäle richtig eingerichtet sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Start, und der Datenlogger beginnt mit der Protokollierung der Daten.
3. Temperatur-Ramping
- Nach der Akklimatisierungszeit den Kunststoffrost mit dem befestigten Hummer vorsichtig in die Versuchsarena legen und die wärmeaustauschende Spule auf den Rost stellen.
- Stellen Sie die Thermoelementsonde in die Nähe des Hummers, um sicherzustellen, dass sie vollständig untergetaucht ist, bevor Sie den Deckel auf die Versuchsarena legen, um die Sehbelastung des Versuchsgegenstands zu reduzieren.
- Passen Sie das Gleichgewicht nach Bedarf an, und geben Sie einen Kommentar zur Ausgabe ab, in dem angegeben wird, dass die Studie begonnen hat.
- Die Ausgabe kann und sollte während des gesamten Experiments periodisch gespeichert werden.
- Klicken Sie auf Datei, und wählen Sie Speichern unter aus, um die Ausgabe zunächst auf dem Computer zu speichern.
- Wenn Sie während des Experiments speichern, klicken Sie auf Datei, und wählen Sie Speichernaus.
HINWEIS: Obwohl die LabChart-Software Dateien im Falle eines versehentlichen Herunterfahrens des Programms wiederherstellen kann (z. B. einen Stromausfall), wird empfohlen, aktive Dateien alle 15 bis 20 min während des Experiments zu speichern, um Datenverlust zu verhindern.
- Erhöhen Sie die Wassertemperatur der Versuchsarena mit einer Geschwindigkeit von 1,5 °C alle 15 min, um eine Rampe von 12 °C auf 30 °C über einen Zeitraum von 2,5 h zu erreichen, indem Sie die Temperatur des Umwälzwasserbades anpassen.
HINWEIS: Die geografische Verteilung des amerikanischen Hummers erstreckt sich über einen thermischen Gradienten von 25 °C, und Einzelpersonen können sich bei Temperaturen von bis zu 30 °C16an klimatischen und überleben. Als Obergrenze für diese Temperaturrampe wurden 30 °C gewählt, da sie dafür sorgt, dass Hummer ein stressiges Szenario erleben, das nicht das kritische thermische Maximum13erreicht, was zur Sterblichkeit führen könnte. Die spezifische Rate der Erwärmung wurde ausgewählt, weil sie innerhalb einer Reihe von Erwärmungsraten fällt, die in Studien mit anderen Arten8,14 sowie früheren Forschungen über den amerikanischen Hummer13,27durchgeführt wurden. Vor der Umsetzung dieses Protokolls ist es wichtig, 1) den geeigneten Temperaturbereich für ein bestimmtes Experiment zu bestimmen und 2) eine vorgerichtliche Temperaturrampe mit einer leeren Versuchsarena durchzuführen, da dies dazu beitragen wird, die notwendige Temperaturanpassung des Wasserbades zu bestimmen, um die gewünschte Rampe zu erreichen. Dies kann auch je nach Wassermenge in der Arena variieren. - Zeichnen Sie während des gesamten Temperaturrampen auf, wann immer eine Anpassung auftritt, die sich auf die Ausgabe auswirken kann.
- Beachten Sie, dass die Waage auf dem Impedanzkonverter wahrscheinlich während des gesamten Experiments angepasst werden muss, und dies kann zu einer unbeabsichtigten Spitze der Ausgabe führen.
- Da die Temperatur in der Versuchsarena beginnt, Werte außerhalb des bevorzugten thermischen Bereichs des Probanden zu erreichen, können unwillkürliche Muskelkontraktionen zu einer fehlerhaften "Spitze" in der Ausgabe führen. Wenn dies der Fall ist, geben Sie einen Kommentar ab, um Bereiche der Ausgabe zu identifizieren, die während des Datenkonvertierungsprozesses entfernt werden sollen.
- Wenn die Rampe fertig ist, entfernen Sie den Hummer aus der Versuchsarena und legen Sie ihn für 20 min in ein Erholungsbad (12 °C). Wenn gewünscht, weiterhin die Herzfrequenz des Hummers zu überwachen, bis er wieder auf Basalniveau zurückkehrt.
- Nach 20 min drücken Sie die Stop-Taste am PowerLab-Ausgang und speichern Sie die Datei. Entfernen Sie vorsichtig die Elektroden und schneiden Sie die Kabelbinder mit einer chirurgischen Schere, bevor Sie den Testgegenstand in seinen Haltetank zurückgeben.
HINWEIS: Anstatt einen Hummer direkt in das Erholungsbad zu legen, besteht eine andere Möglichkeit darin, die Versuchsarena langsam wieder auf ihre Ausgangstemperatur zu bringen. Dies wird erreicht, indem die Versuchsarena alle 15 min um 1,5 °C im Laufe von zusätzlichen 2,5 h abgekühlt wird.
4. Datenkonvertierung
- Öffnen Sie Das Datenpad. Legen Sie Spalte A auf Zeit fest, indem Sie auf Spalte A doppelklicken und auf Auswahl & Aktivpunkt auf der linken Seite des Menüs Data Pad Column A Setup klicken. Wählen Sie Zeit auf der rechten Seite des Menüs und schließen Sie das Fenster, indem Sie auf OKklicken.
- Legen Sie Spalte B auf die Durchschnittstemperatur fest, indem Sie auf Spalte B doppelklicken und die Option Statistik auf der linken Seite des Setupmenüs Data Pad Column B auswählen. Wählen Sie Mittelwert auf der rechten Seite des Menüs und Kanal 2 als Berechnungsquelle am unteren Rand des Menüfensters aus. Klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen.
- Konvertieren der aufgezeichneten Spannung in Beats pro Minute
- Doppelklicken Sie auf Spalte C und wählen Sie Auswahl & Aktivpunkt auf der linken Seite des Menüs aus. Wählen Sie Auswahldauer auf der rechten Seite des Menüs aus, und klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen.
- Doppelklicken Sie auf Spalte D und wählen Sie zyklische Messungen auf der linken Seite des Menüs aus. Wählen Sie die Ereignisanzahl auf der rechten Seite des Menüs und Kanal 1 als Berechnungsquelleaus. Klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen. Dadurch werden die Spitzen der Daten gezählt, um die Herzfrequenz über einen ausgewählten Teil der Daten zu bestimmen.
HINWEIS: Wählen Sie bei Bedarf die Schaltfläche Optionen unten im Menü aus, und passen Sie die Erkennungseinstellungen an, um die Daten genauer zu lesen. Scannen Sie die Datendatei durch und ermitteln Sie, ob die Formoptionen "Sine" oder "Spikey" nur zu den Hauptspitzen der Taktausgabe führen. Passen Sie außerdem den Schwellenwert für die Erkennungsanpassung auf der rechten Seite des Menüs an, um Rauschen in der Ausgabedatei zu ignorieren. - Doppelklicken Sie auf Spalte E und wählen Sie zyklische Messungen auf der linken Seite des Menüs aus. Wählen Sie Durchschnittliche zyklische Rateund Kanal 1 als Berechnungsquelleaus. Passen Sie die Erkennungseinstellungen und die Erkennungsanpassung an die Einstellungen für Spalte D an (falls in Schritt 4.4.2 bearbeitet). Klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen. Dies liefert die endgültige Schätzung der Herzfrequenz (als Schläge pro Minute) über einen ausgewählten Teil der Daten.
- Wenn die Spalten eingerichtet sind, kehren Sie zur Datendatei zurück und markieren Sie die gewünschten Abschnitte der Ausgabe, indem Sie Bereiche mit fehlerhaften Daten auslassen, wie sie durch Kommentare in Abschnitt 3.6 gekennzeichnet sind.
- Wählen Sie Befehle und Mehrfachhinzufügen zum Datenpad aus.
- Wählen Sie Zeit aus dem Dropdown-Menü Suchen und ziehen Sie Daten alle 30 s ab, indem Sie das Kontrollkästchen Alle aktivieren und "30" im Menü Auswählen eingeben.
- Klicken Sie im Menü Schritt durch auf die Option Aktuelle Auswahl, und klicken Sie auf Hinzufügen.
- Kehren Sie zum Bildschirm Datenblock zurück, und wählen Sie Datei und Speichern unter aus, um die Ausgabe als Excel-Datei zu speichern.
HINWEIS: Hier wird die Herzfrequenz (in Schlägen pro Minute) alle 30 s im Gegensatz zu jeder Minute auf der Grundlage frühererForschung8,27gemeldet. Dies hilft auch, Änderungen in den in Echtzeit erfassten Spannungsdaten genauer zu erfassen. Es ist möglich, Daten in kürzeren oder längeren Zeitintervallen basierend auf individuellen Präferenzen auszuwählen.
5. Berechnung der Arrhenius Bruchtemperatur
- Öffnen Sie die Datendatei in Excel, und bearbeiten Sie die Ausgabe der LabChart-Software.
- Konvertieren Sie die Temperatur von Celsius in die Gegenseitigkeit von Kelvin mit der folgenden Gleichung: [1000/(Temperatur °C + 273.15 K)].
- Erhalten Sie das natürliche Protokoll der Herzfrequenz: ln(BPM).
- Generieren Sie ein Arrhenius-Diagramm, indem Sie die Herzfrequenz als Funktion der Temperatur, ausgedrückt als ln(BPM) vs. reziprok (K)13,15.
- Passen Sie in SigmaPlot die Daten mit einer stückweisen Regression an und bestimmen Sie den Schnittpunkt, den ABT.
- Kopieren sie die transformierten Daten, und fügen Sie sie in eine neue Arbeitsmappe ein. Wählen Sie die Option Statistik aus dem Hauptmenü und den Regressions-Assistenten aus der Dropdown-Liste aus.
- Wählen Sie im Fenster Gleichung stückweise aus dem Menü Gleichungskategorie und 2 Segment linear unter dem Feld Gleichungsname aus. Klicken Sie auf Weiter.
- Wählen Sie im Fenster Variablen die transformierten Temperaturdaten als t-Variable und die transformierten Herzfrequenzdaten als y-Variable aus, indem Sie die Dropdown-Optionen im Menü Variablenspalten verwenden. Stellen Sie sicher, dass XY Pair im Menü Daten von ausgewählt ist, bevor Sie auf Weiterklicken.
- Nachdem Sie das Fenster Ergebnisse anpassen überprüft haben, klicken Sie auf Weiter, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bericht erstellen im Fenster Numerische Ausgabeoptionen. Klicken Sie auf Weiter.
- Aktivieren Sie im Fenster Diagrammoptionen die Option Neues Diagramm erstellen unter dem Abschnitt Ergebnisdiagramm anpassen, und fügen Sie dem Diagrammtitel unter dem Abschnitt Diagramm-Features eine Gleichung hinzu. Klicken Sie auf Fertigstellen .
- Rufen Sie auf der Ausgabeseite Ergebnisse die Gleichungen und Parameterwerte für die beiden Regionen der stückweisen Regression sowie die statistische Ausgabe für die Regression ab (z. B. R2, F-Statistik und p-Wert).
- Mit den erzeugten Parameterwerten und Gleichungen stellen Sie die beiden Segmente gleich auf und lösen sie für die Variable "t", um die ABT zu bestimmen. Konvertieren Sie diesen Wert mit der folgenden Gleichung zurück in Celsius: °C = (1000/t) - 273.15.
HINWEIS: Das ABT kann auch in der statistischen Computerumgebung R mit dem Paket "segmentiert"17 im Programm SAS18oder mit der Routine "Segmentale lineare Regression" in Prism819berechnet werden.
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Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Impedanz-Pneumographie, um Echtzeitdaten für Herzfrequenz (in Spannung) und Temperatur während eines Temperatur-Ramping-Experiments zu erhalten. Bei der Perforierung dieser Technik variiert die Amplitude der gemessenen Spannungen und Temperaturen je nach experimentellem Design und fokalen Arten. Der in Echtzeit angezeigte Spannungsausgang folgt jedoch einer generischen Sinusverteilung, wenn das Protokoll korrekt implementiert wird (Abbildung 1A). Mit erhöhter Temperatur in der Arena ändert sich die Echtzeitverteilung der Spannung, um eine erhöhte Frequenz von Spannungsspitzen (d. h. Herzschläge; Abbildung 1B). Da die Arenatemperatur weiterhin auf ein Niveau außerhalb des optimalen Leistungsfensters des Probanden ansteigt, ändert sich die Verteilung, um eine reduzierte Frequenz von Spannungsspitzen mit einer sinusähnlichen Form darzustellen, die durch sporadische Spitzen und/oder Momente von "Flachfutter" unterbrochen wird (Abbildung 1C).
Sobald Rohdaten mit der Data Pad-Komponente der LabChart-Software konvertiert werden, folgt die resultierende Verteilung der Herzfrequenz (in Schlägen pro Minute) über den Verlauf des Temperaturrampes einer parabolischen Verteilung, wenn das Experiment erfolgreich ist (Abbildung 2). Mit der Erhöhung der Temperatur in der Arena steigt auch die Herzfrequenz des Probanden, um den erhöhten energetischen Anforderungen im Zusammenhang mit wärmeren Temperaturen gerecht zu werden. Da jedoch die Temperatur weiter steigt und der Testgegenstand moderate bis extreme thermische Belastungen zu erleben beginnt, beginnt die Herzfrequenz zu sinken oder wird unregelmäßig, wenn das Subjekt beginnt, passive thermische Toleranz zu zeigen (z. B. Beginn der anaeroben Atmung, Metabolische Rate Unterdrückung, und reduzierte Aktivität5,7). Wenn Herzfrequenz- und Temperaturdaten transformiert und ein Arrhenius-Diagramm erzeugt wird, kann der Punkt berechnet werden, an dem die Herzfrequenz zu sinken beginnt (ABT)(Abbildung 3). Das Arrhenius-Diagramm passt dann mit einer stückweisen Regression mit statistischer Software, in der der Schnittpunkt der beiden Linien die ABT darstellt.
Abbildung 1: Repräsentative Ausgabe aus dem LabChart-Datenlogger. Die Echtzeit-Spannungsänderung über die Elektroden des Probanden wird rot dargestellt, und die gleichzeitige Echtzeitausgabe der Arenatemperatur (°C) wird blau dargestellt. Zu Beginn des Experiments sollte die Spannung bei kühleren Temperaturen (z.B. 13,1 °C) einer generischen Sinusverteilung (A )folgen. Wenn die Temperatur erhöht wird (z. B. 23 °C), sollte die Frequenz der Spannungsspitzen steigen, aber die Verteilung sollte sinusarthaft bleiben (B). Da der Prüfstand außerhalb seines optimalen thermischen Leistungsfensters (z. B. 28,5 °C) geschoben wird, sollten die Spannungsspitzen bei abnehmender Frequenz (C) unregelmäßig werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Erwartete Verteilung der Herzfrequenz über den Temperaturrampenkurs. Die vom Datenlogger erfassten Spannungsdaten werden mit der Data Pad-Komponente der Software in Takte pro Minute (BPM) in die Herzfrequenz konvertiert. Wenn die Rampe korrekt durchgeführt wird, wird eine parabolische Verteilung der Herzfrequenz über den getesteten Temperaturbereich angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beispiel für ein Arrhenius-Diagramm. Nachdem Daten im Datenpad konvertiert und exportiert wurden, werden sie transformiert, um ein Arrhenius-Diagramm zu generieren. In diesem Beispiel passen Daten zu einer stückweisen nichtlinearen Regression in SigmaPlot, die Gleichungen für die links- und rechten Segmente (Region 1 bzw. Bereich 2) der Regressionslinie sowie Die Richtigefürst-Metriken generiert. Der Schnittpunkt der beiden Regressionslinien wird als ABT (roter Stern) gelöst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Impedanz-Pneumographie, um Veränderungen der Herzfrequenz von Wirbellosen im späten Stadium während eines Temperatur-Ramping-Experiments zu messen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Labor-basierten Ansätzen9,10,11 ist, dass es minimal-invasiv ist und keine größere chirurgische Manipulation des Exoskeletts beinhaltet, wodurch die Menge der Erholungszeit vor dem Experimentieren reduziert wird. Darüber hinaus ist das Gerät einfach zu bedienen, und die resultierenden Daten können einfach manipuliert und im vorgeschlagenen Softwareprogramm interpretiert werden. Während der amerikanische Hummer hier als Musterfach verwendet wird, wurde diese Technik erfolgreich in blauen Muscheln (Mytilus spp.14) implementiert und kann leicht für den Einsatz in anderen Wirbellosen im späten Stadium (z.B. Krebse, Garnelen und andere Muscheln) modifiziert werden.
Ein weiterer Vorteil des Protokolls besteht darin, dass es sich auf die Berechnung des ABT als nichttödlichen Indikator für thermische Grenzwerte konzentriert. Obwohl zahlreiche Studien den CTmax als signifikanten Endpunkt bei der Bestimmung der thermischen physiologischen Leistung5,8,20,21,22,23, Organismen selten Temperaturen in diesem Bereich in der natürlichen Umgebung5. Da der CTmax häufig eine tödliche Temperatur ist, schließt die Verwendung dieser Metrik als bevorzugter Endpunkt die Verwendung von Probanden in zusätzlichen oder Folgeexperimenten nach der thermischen Spannungaus 23. Wenn die ABT mit diesem Protokoll berechnet werden soll, ist es entscheidend, die Temperatur in der Versuchsarena so zu erhöhen, dass der Test an seine physiologische Grenze gebracht wird, ohne den Tod zu verursachen. Daher wird empfohlen, die potenziellen thermischen Grenzwerte der brennfähigen Arten über eine Pilotstudie (wenn möglich) zu bestimmen, bevor der gesamte Bereich der experimentellen Temperaturrampe bestimmt wird.
Es wird den Forschern auch empfohlen, natürliche Schwankungen der Basalherzfrequenz einer fokalen Art zu bestimmen und zu beobachten, wenn die Temperatur in der Versuchsarena vor dem Rampenexperiment konstant und nicht stressig gehalten wird. Dies ist besonders hilfreich für brenne Arten, bei denen ruhende Herzfrequenzinformationen in der veröffentlichten Literatur nicht verfügbar sind. Es dient auch als reichliche Praxis der Elektrodenimplantationstechniken. Dies kann den Forschern auch helfen, die geeignete Akklimatisierungszeit zu bestimmen, die erforderlich ist, um sicherzustellen, dass keine falschen Spitzen der Herzfrequenz auf den Umgang mit Stress zu Beginn eines Experiments zurückzuführen sind.
Obwohl das Protokoll die Verwendung von Impedanz-Pneumographie allein im Zusammenhang mit thermischer Belastung diskutiert, kann es auch genutzt werden, um die möglichen interaktiven Auswirkungen anderer Stressoren auf die thermische Physiologie zu erforschen. Die Leistung des Organismus kann in Gegenwart von Umweltstressoren (d. h. Hypoxie, Hyperkapnie, Schadstoffe und/oder Veränderungen des Salzgehalts) reduziert werden, die auch optimale Temperaturbereiche für Leistung7,24,25,26komprimieren können. Daher kann dieses Protokoll geändert werden, um zu untersuchen, wie sich die Exposition gegenüber verschiedenen Stressoren vor dem Temperaturanstieg auf die Leistung auswirken kann.
Zum Beispiel setzten Harrington und Hamlin27 den Jugendlichen H. americanus 2 Monate lang aktuellen oder vorhergesagten pH-Bedingungen (8,0 bzw. 7,6) ausgesetzt, bevor sie die Herzleistung während einer Temperaturrampe beurteilten. Hummer, die vor saureren Umgebungen ausgesetzt waren, zeigten eine signifikante Verringerung der mittleren ABT im Vergleich zu den unter aktuellen pH-Bedingungen. Dies deutet darauf hin, dass eine niedrige pH-Umgebung die thermische Leistung reduziert und das Risiko von Zellschäden durch Hitzebelastung bei niedrigeren Temperaturen27erhöhen kann. Künftige Bemühungen könnten die hier vorgestellte Methode auf eine Vorexposition gegenüber einer beliebigen Kombination von Umweltstressoren vor der Befolgung dieses Protokolls ausdehnen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll geändert werden, um Veränderungen der Herzleistung während der Exposition gegenüber biotischen Stressoren zu messen, sowie wie sich die thermischen Grenzwerte gemäß Ontogeny4,5ändern können.
Eine wesentliche Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die beschriebene Ausrüstung für den Einsatz in einer Laborumgebung eingeschränkt ist, wodurch ihre Anwendbarkeit für feldbasierte Experimente, die eine speziellere Ausrüstung erfordern, eingeschränkt wird8. Diese Technik erfordert auch die Zurückhaltung von hochmotilen Probanden (z. B. Hummer und Krebse), um die Produktion von falschen Datenpunkten zu reduzieren, die durch nicht-kardiale Muskelbewegungen entstehen. Obwohl dies das natürliche Verhalten während einer Temperaturrampe einschränken kann, sind die Auswirkungen von Beschränkungen bei allen Probanden konsistent. Am wichtigsten ist, dass bei Probanden das Potenzial für Gewebeschäden oder Tod besteht, wenn aggressives oder nachlässiges Bohren während der Elektrodenimplantation umgesetzt wird. Dies steht in scharfem Kontrast zur Infrarot-Photoplethysmographie, einer wirklich nichtinvasiven Technik, die einen externen Infrarot-Wandler nutzt, um Licht durch das Perikard zu leiten und die Herzfunktion aufzuzeichnen, indem reflektierte Lichtenergie in Spannung8,28umgewandelt wird.
Obwohl die Infrarot-Photoplethysmographie das Risiko des Umgangs mit Stress im Vergleich zur Impedanz-Pneumographie reduziert, führt die korrekte Implantation von Elektroden mit der beschriebenen Methode zu minimalen Traumata, ermöglicht eine schnelle Akklimatisierungszeit und führt zu einer schnellen Genesung, ohne die Sterblichkeit bei Probanden nach dem Ramping-Experiment27zu verursachen. Da es keinen signifikanten Unterschied in der Herzleistung gibt, die mit beiden Methoden aufgezeichnet wird28, wird der Schluss gezogen, dass die Impedanz-Pneumographie eine zuverlässige und minimalinvasive Technik zur Beurteilung der Herzleistung ist. Schließlich haben die zahlreichen Vorteile und die Flexibilität des Protokolls das Potenzial aufzuklären, wie verschiedene Umweltfaktoren mit der Temperatur interagieren, um die physiologische Leistung bei Krebstieren im späten Stadium zu beeinflussen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Paul Rawson für die Laborunterstützung und dem Preis der National Science Foundation IIA-1355457 an Maine EPSCoR an der University of Maine für die Mittel für den Kauf von Geräten. Dieses Projekt wurde vom USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Projektnummer MEO-21811 durch die Maine Agricultural and Forest Experiment Station sowie dem NOAA National Marine Fisheries Service Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136 unterstützt. Die Autoren danken auch drei anonymen Rezensenten für ihre Kommentare zu einer früheren Version dieses Manuskripts. Maine Agricultural and Forest Experiment Station Publikation Nummer 3733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
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