Summary
플라이펍 분석은 과일이 에탄올의 영향으로 드로소필라 멜라노가스터가 표시하는 행동을 측정합니다. 이 분석은 모든 수준에서 실험자에 의해 쉽게 마스터되고 다양한 기화 자극에 적용되어 약물 남용 및 중독 연구를 용이하게 할 수 있습니다.
Abstract
알코올 사용 장애 (AUD)는 우리 사회에서 심각한 문제로 남아 있습니다. 중독에 대한 효과적인 개입을 개발하려면 다양한 실험 적 접근 및 모델 시스템이 필요한 근본적인 신경 생물학적 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 알코올 음료의 주요 성분은 에탄올, 만성 섭취 시 중추 신 경계와 행동에 적응 변화를 일으키는. 행동 감작 (즉, 에스컬레이션 된 응답)은 특히 중독의 근본적인 주요 적응 변화를 나타냅니다. 동물 모델에서 대부분의 에탄올 유도 행동 감작 연구는 에탄올의 운동 활성화 효과에 대해 수행되었다. 에탄올의 눈에 띄는 효과는 행동 억제입니다. 그러나 에탄올의 억제 효과에 대한 행동 감작은 과소 대표됩니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 Drosophila melanogaster에있는 되풀이에 에탄올 노출에 있는 억제되지 않는 구애 활동의 에스컬레이션된 증가를 측정하는 것을 허용하는 Flypub 분석소를 개발했습니다. 여기서, 우리는 에탄올 노출 챔버의 조립, 분석 스테이션의 설정, 플라이 케어 및 수집 기준, 에탄올 전달, 억제 된 구애 활동의 정량화, 데이터 처리 및 통계 분석을 포함한 단계별 Flypub 분석을보고합니다. 또한 중요한 단계를 해결하고 한계를 극복하며 유틸리티를 확장하여 추가 적인 에탄올 로 인한 동작을 평가하는 방법도 제공됩니다. 플라이펍 분석과 드로소필라 멜라노가스터의 강력한 유전 적 도구와 결합된 플라이펍 은 에탄올 유발 행동 감작의 근본적인 메커니즘을 발견하는 작업을 용이하게 할 것입니다.
Introduction
알코올은 세계에서 가장 쉽게 사용할 수 있고 널리 소비 되는 약물 중 하나입니다. 그것은 오용 및 중독에 대 한 높은 잠재력을 가지고; 그러나 이 프로세스의 기본 메커니즘은 불완전하게 이해됩니다. 에탄올은 억제, 행복감, 인지 장애, 과잉 행동, 벌레1,과일 파리1,2,3,마우스4,쥐5 및 인간6의운동 조절 의 손실을 유도하며, 인간을 포함한 무척추 동물에서 에탄올의 효과를 중재하는 일반적인 신경 생물학적 성분을 나타낸다.,3 만성 에탄올 섭취는 AUD의 근간이 되는 신경 적응 및 행동 수정을 일으킵니다. 적응 중 하나는 에탄올7,,8,,9 또는 기타 중독성 물질10,,11,,12의반복된 경험과 함께 증강 된 반응으로 정의 된 행동 감작이다.
수십 년 동안, 에탄올 유도 행동 감작에 대한 연구는 (EIBS) 약이 반응7,,8,,9,,13에대한 프록시로 사용되는 운동 자극 효과에 초점을 맞추고있다. 예를 들어, 쥐 또는 마우스는 반복시(매 24, 48 또는 72시간) 에탄올 투여로 보행 속도8,,14,,15,16,,17,,18,,19,,20,,21로측정된 증강 된 운동 활성을 나타낸다., 유사하게, 과일 파리는 제1 노출 후 4시간 동안 에탄올 증기에 대한 제2 노출을 실시하여 보행 속도뿐만 아니라22로측정된 향상된 운동 반응을 나타낸다. 과일 파리의 운동 자극 효과에 대한 EIBS의 기본 메커니즘에 대한 정보는 없지만, 쥐와 마우스에 대한 연구는 EIBS,6,9,923에대한 주요 역할을 하는 분자 및 신호 성분(예를 들어, 도파민, 글루타메이트 및 GABA 시스템)뿐만 아니라 신경 기질 및 회로(예를 들어, 복부 테그멘탈 영역, 핵 accumbens, 편도체 및 전두엽 피질)를 발견했다.
억제는 에탄올의 주요 효과이며 일반적으로 제한되는 행동의 징후로 이어집니다. 억제 효과는 운동, 정서적, 사회적, 성적 및 인지 기능에 가해지는데, 이는 인간과 동물 모델에서 부적절한 성적 행동, 언어적 또는 신체적 침략 및 충동적인 행위로 이어질 수 있는24,,25,,26,27,,,28,,29. 에탄올 유도 억제는 기계론적 연구를 위한 동물 모델에서 조사되었으며, 이들은 설치류 및 원숭이의 운동 충동성 및 침략뿐만 아니라 벌레6,9,24,,28,,29,,30의억제를 용이하는 것을 포함한다.28, 우리는 과일 파리가 에탄올31의영향으로 억제 된 성적 행동을 보여 보여 주었다는 것을 입증했습니다. 특히, 야생 형 남성은 거의 에탄올없이 다른 남성을 법원비행 31 그들이 할 때, 구애적극적으로 구애 남성을 거부합니다. 에탄올의 영향하에, 그러나, 남성 파리는 그밖 남성에 대한 더 많은 구애를 보여주고 예의는 더 적은 거부를 전시합니다, 전반적인 강화된 남성 간 구애의 결과로. 특히, 파리는 EIBS31,,32를연구하는 독특한 시스템으로 작용하는 반복적인 에탄올 노출시 억제 효과에 대한 행동 감작을 개발한다.
이 보고서에서는, 우리는 과일 플라이 드로소필라 멜라노가스터에서에탄올 유도 억제 및 감작을 연구하기 위해 Flypub 분석 및 데이터를 설정, 수행, 트러블슈팅 및 분석하는 방법을 설명합니다. 그 유용성과 효과를 제공하기 위해, 우리는 옥토파민 (OA)을 합성 하는 티라민 β 하이드록실라제 (tβh)에 결핍 파리와 함께 야생 형 캔톤-S (CS; 제어 플라이 스트레인)를 테스트했습니다. OA는 무척추동물33,,34의 주요 신경조절제이며 파리22에서에탄올 내성 개발에 핵심적인 역할을 한다. 우리는 OA가 EIBS에 중요하다는 것을 처음으로 보고합니다.
Protocol
참고 : 프로토콜 섹션은 (1) 챔버의 조립, (2) 플라이 케어 및 수집, (3) 분석 스테이션 설정, (4) 에탄올 노출, (5) 구애 점수 및 데이터 분석 및 (6) 통계 분석을 포함하는 준비, Flypub 분석 및 분석 단계를 자세히 설명합니다. Flypub 분석 및 분석을 수행하기 위한 주요 단계는 워크플로우에 설명되어있습니다(그림 1).
1. 챔버의 조립(그림 2)
- 면도날을 사용하여 25 mL 마크에서 둥근 초파리 병의 바닥 부분을 잘라냅니다.
- 뜨거운 납땜 인두를 사용하여 병의 50mL 마크에서 직경 5mm의 구멍을 만듭니다.
참고 : 이것은 파리가 챔버로 전송됩니다 액세스 포인트입니다. - 메쉬 시트를 직경 54mm의 원으로 자르고 75 mL 마크의 드로소필라 병에 맞춥습니다.
- 뜨거운 접착제를 사용하여 병의 75mL 마크에서 메쉬를 고정합니다.
- 폴리 카보네이트 플라스틱 시트를 직경 70mm의 원으로 자른다.
- 폴리 카보네이트 플라스틱 시트를 뜨거운 접착제를 사용하여 25 mL 마크 (1.1 단계에서 만든 바닥 개방 영역)에서 병에 부착하십시오.
- 폴리 카보네이트 라운드가 바닥에 단단히 부착되도록 무게를 사용하여 아래로 압력.
- 술집을 에탄올로 씻어 냄새를 제거하고 흐르는 증류수에서 여러 번 헹구십시오. 여분의 물을 제거하기 위해 적극적으로 술집을 흔들어.
- 실온에서 종이 타월에 수평으로 누워 술집을 건조.
2. 플라이 케어 및 컬렉션
- 표준 옥수수 가루 / 한천 / 설탕 / 효모 식품 매체 (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html)에 파리를 유지합니다.
- 이산화탄소(CO2)마취 하에 1~2일 된 수컷파리를 하나의 데이터 포인트를 나타내는 33개의 그룹으로 수집합니다. 그대로 형태와 파리를 선택하고 복구 할 수있는 음식 유리병에 넣어 있는지 확인하십시오.
참고: 그룹당 2개 또는 3마리 의 파리가 허용됩니다. 동작은 실험 설정에 민감할 수 있으므로 컨트롤 플라이 라인으로 펍당 총 플라이 수를 조정해야 할 수 있습니다.
참고 : 마취 된 파리가 음식에 달라 붙지 않도록 음식 유리병이 측면에 놓여 있는지 확인하십시오. - 에탄올 노출 전 2일 동안 적어도 50% 상대 습도 및 12시간 빛/12시간 암흑 주기로 25°C 인큐베이터에 파리를 보관한다.
참고:CO2 클리어런스는 에탄올 로 인한 반응을 변화시킬 수 있는CO2-유도생리적 또는 행동적 효과를 제거하는 데 매우 중요합니다. - 에탄올 노출을 수행하고 구애 행동을 채점하는 실험자에게 유전자형 또는 치료 조건을 블라인드 플라이하는 코드를 사용합니다.
참고: 블라인드 테스트는 실험적 편견을 제거하는 데 도움이 됩니다.
3. 분석 스테이션 설정(그림 3A)
- 통풍이 잘되는 방에 벤치 탑에 중앙 팔이 부착된 카피 스탠드를 설치합니다.
참고: 복사 스탠드는 필수가 아닙니다. 수준 플랫폼을 제공하는 모든 스테이징 장치로 충분합니다. - 두 개의 측면 팔을 스탠드중앙에서 약 18cm 떨어진 스탠드에 고정시면 됩니다.
- 스탠드의 각 팔에 형광등을 비추고 중간에 하나씩 놓습니다.
- 비디오 레코더를 베이스 중앙에서 약 38cm 위에 있는 가운데 암에 부착합니다. 이렇게 하면 상단 보기에서 펍이 기록됩니다.
- 스탠드 의 밑면을 흰색 종이로 덮어 어두운 색의 파리를 시각화하여 대비를 만듭니다.
- 노출 당일에는 형광등과 복사 스탠드에 연결된 비디오 카메라에 연결된 컴퓨터를 켭니다(그림3A).
참고 : 빛 강도 2100-2200 럭스는 득점에 대한 기록 된 동작의 좋은 품질을 제공합니다. 그러나 실험실의 주변 조명 조건은 에탄올로 인한 구애 활동을 관찰하기에 충분합니다. - 도 3B에도시된 에탄올 노출에 사용할 항목을 준비합니다.
- 실험 세트를 위해 6 개의 깨끗하고 조립 된 술집을 수집하고 코드 1에서 6으로 레이블을 지정하십시오.
참고 : 비행 유전자 형 또는 치료 조건에 무작위 코드를 배치해야합니다.
4. 에탄올 노출(그림 3)
- 작은 깔때기를 사용하여 50 mL 마크의 구멍을 통해 플라이 펍 챔버에 33 남성의 그룹을 부드럽게 전송합니다.
참고: 파리에 대한 기계적 스트레스를 최소화하려면 이동 중에 마우스 패드 또는 쿠션 재료를 펍 아래에 놓습니다. - 테이프로 구멍을 덮습니다.
참고: 테이프는 구멍을 닫는 데 사용되어 파리가 술집밖으로 빠져나가는 것을 방지합니다. - 1에서 6까지 무대에 술집을 정렬합니다.
- 10 분 동안 챔버에 파리를 적응(그림 3D).
- 초점, 줌 및 밝기를 포함한 카메라 설정을 조정하고 마지막 5분 동안 의 적응을 기록하여 기초 구애 수준을 측정합니다.
참고: 펍의 빛 반사로 인해 발생하는 눈부심을 제거하려면 실험실 와이프(일반적으로 4층 또는 두께 1mm 미만)를 펍 하단에 배치하여 각도를 조정합니다. - 깨끗한 가위로 패드를 4 개의 동등한 사분면으로 절단하여 에탄올 전달을위한 면 패드를 준비한 다음 모서리를 다듬어 적응 중에 페트리 접시에 맞도록합니다(그림 3C).
참고: 면 패드를 다루기 위해 맨손으로 사용하지 마십시오. 집게를 사용하여 면패드를 처리하여 악취가 전염되지 않도록 하십시오. - 각 페트리 접시에 면 패드를 넣습니다.
- 각 면 패드에 95% 에탄올 1mL를 추가하고 에탄올 용액이 패드 의 전체 영역에 고르게 분포되도록 하십시오.
- 빠른 에탄올 증발을 방지하기 위해 이중 층 실험실 와이프로 덮으하십시오.
- 에탄올에 담근 면 패드가 들어있는 작은 페트리 접시와 응고 후 술집 의 바닥 구멍을 통해 이중 층 실험실 와이프를 놓습니다.
- 무대에서 술집을 정렬, 녹음을 시작하고 동시에 타이머를 시작합니다.
- 에탄올 노출 중에 파리가 포함된 술집을 기록하여 파리가 침전으로 인해 구애또는 이동을 멈출 때까지 기록합니다.
- 파리의 90% 이상이 진정될 때 주걱으로 각 펍에서 에탄올이 함유된 페트리 접시를 제거합니다.
- 부드럽게 전송은 술집에서 50mL 마크의 구멍을 통해 할당 된 유리병으로 다시 날아갑니다.
참고: 음식 바이알 위에 깔때기를 놓아 옮기세요. 진정된 파리를 음식 바이알 의 측면에 놓아 음식에 갇히지 않도록하십시오. - 에탄올로 술집을 청소하여 냄새를 제거하고 흐르는 증류수에서 여러 번 헹구십시오. 여분의 물을 제거하기 위해 적극적으로 술집을 흔들어.
- 실온에서 종이 타월에 수평으로 누워 술집을 건조.
- 적어도 50% 상대 습도 및 12 시간 빛 / 12 시간 어두운 주기로 25 °C 인큐베이터에 파리를 유지합니다.
- 6일 연속 으로 24시간마다 4.1-4.17단계를 반복하고 일주기 효과를 피하기 위해 하루 중 동시에 에탄올 노출을 수행해야 합니다.
참고: 건강한 파리를 유지하기 위해 2-3일마다 음식 바이알을 교체하십시오.
5. 구애 점수 및 데이터 분석(그림 4-6)
- 미디어 플레이어(예: VLC)를 사용하여 녹화된 비디오를 열고 비디오를 확대하여 스코어를 명확하게 관찰합니다(그림4A).
- 비디오(그림 4B)에시간 코드를 첨부합니다.
- 다음과 같은, 일방적 인 날개 연장, 구애 체인, 구애 원, 복부 굽힘 및 매 10 s 시간 블록31 (그림 5)에대한 장착을 포함하여 구애 활동에 종사하는 남성의 수를 계산합니다.
- 10s 시간 블록마다 구애를 표시하는 남성 수를 워크시트에입력합니다(그림 6A).
- 3회 연속 10s 타임 블록에서 최대 구애 수의 남성을 대표 데이터 포인트로사용합니다(그림 6B).
- 가장 높은 값을 갖는 10개의 연속된 데이터 포인트의 평균을 계산하고(그림6C)이는 펍당 남성 간 구애의 백분율을 나타낸다(그림6A).
6. 통계 분석 (보충 그림 1)
- 통계 분석 소프트웨어(예: Minitab 17)를 열고 워크시트에 구애 데이터를 추가합니다.
참고: 모든 통계 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. - 데이터의 분포를 확인하려면(정상 또는 비정규 분포) 통계 탭으로 이동하여 기본 통계를선택하고 정규성 테스트 옵션(추가 그림1Ai)을클릭합니다.
- 변수에서개별 열(연구 중인 유전자형 또는 치료의 데이터 집합을 나타내는 각 열)을 선택하고 앤더슨-달링 테스트를 선택하고 확인(추가 그림 1Aii)을 클릭합니다.
참고: 정규확률 플롯은 계산된 P-값을 표시합니다: P 값이 0.05보다 크면 데이터가 일반적으로 분산됩니다. P-값이 0.05 미만이면 데이터는 일반적으로 분포되지않습니다(보충 도 1Aiii). - 여러 그룹을 비교하려면 데이터 탭을 클릭하여 비교할 열을 쌓은 다음 스택을선택한 다음 열(추가그림 1Bi)을 선택합니다.
- 스택 열 창에서 누적할 데이터 열을 선택하고, 새 워크시트 또는 현재 워크시트의 열에서 수행된 스태킹을 선택하고, 서브스크립트를 표시하도록 지정된 다음 열(예: 데이터 그룹 ID) 보조 도 1Bii-1Biii).
- 통계 탭을 클릭하고 ANOVA 테스트를 선택하고 일반 선형 모델을 선택한 다음 일반 선형 모델 맞춤(보조 그림 1Ci)을클릭합니다.
- 일반 선형 모델 창에서 응답 상자에서 비교할 열을 선택하고 요인 상자에서 하위 스크립트가 있는 열을 선택하고 확인을클릭하여 통계 분석 결과(추가그림 1Cii-1Ciii)를클릭합니다.
- 일반적으로 분산된 데이터가 있는 두 그룹을 비교하려면 통계 탭을 클릭하고 기본 통계를선택하고2-샘플 t 검정(추가 그림 1Di)을선택합니다.
- 평균 창에 대한 2-샘플 t에서 각 샘플이 자체 열에 있는경우 드롭다운 상자에서 선택하여 샘플 1 및 샘플 2 상자에서 비교할 두 그룹을 선택한 다음 확인을클릭하면 통계 분석 결과가 표시됩니다(보충그림 1Dii-1Diii).
- 일반적으로 분산되지 않은 데이터와 두 그룹을 비교하려면 통계 탭으로 이동하여 비모의를 선택하고 Mann-Whitney (추가 그림 1Ei)를클릭합니다.
- Mann-Whitney 창에서 두 그룹을 선택하여 첫 번째 샘플 및 두 번째 샘플 상자에서 비교한 다음 확인을클릭하면 통계 분석 결과가 생성됩니다(보충그림 1Eii-1Eiii).
- 일반적으로 분포되지 않은 데이터의 세 개 이상의 그룹을 비교하려면 통계 탭으로 이동하여 비모력 측정을선택한 다음 Kruskal-Wallis 테스트(추가 그림 1Fi)를클릭합니다.
- Kruskal-Wallis 창에서 응답 상자에서 비교할 열을 선택하고 요인 상자에 하위 스크립트가 있는 열을 선택하고 확인을클릭하면 통계 분석 결과가 표시됩니다(보충그림 1Fii-1Fiii).
Representative Results
이 섹션에서는 대표플라이펍 실험의 결과를 보여 줍니다. 초파리 남성은 드물게 다른 남성35,36. 제1 에탄올 노출 동안, 야생형 캔톤-S(CS) 수컷은 억제된 남성간 구애(31)에서 작지만 미미한 증가를 나타내었다(도CS7A).31 그러나, CS 남성은 후속 에탄올 노출에서 억제된 구애 활동의 에스컬레이션 된 증가를 보였다 (ANOVA GLM, CS: R2= 0.83, F(5,66) = 65.21, p < 0.0001; n = 12; 도 7A)는에탄올의 억제 효과에 대한 행동 민감성을 나타낸다. 우리는 이전에 EIBS의 이 모형이 버섯 뉴런에 있는 도파민 과 도파민 수용체 DopEcR를 요구한다는 것을보여주었습니다 31,,32.
추가 신경 조절기가 EIBS에 관여하는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 파리(tβh; nM18 null allele)37,,38 결여 된 티라민 β 하이드록실라제, OA 생합성에서 속도 제한 효소를 테스트하여 OA의 역할을 조사하여 OA가 결핍되었습니다. CS 유전 적 배경에서 tβh 남성 (박사 안드레아스 Thum, 라이프 치히 대학에서 종류 선물, 독일) 매일 에탄올 노출에 감작 억제 구애 응답을 표시 (ANOVA GLM, tβh: R2= 0.67, F(5,66) = 27.60, p & lt; 0.00; n = 12; 그림 7B) 그러나 CS (ANOVAGLM, 상호 작용 효과 : F = 2.50, p <0.034)에 비해 감소 된 수준에서. 포스트 혹 분석시, tβh 남성CS에 비해 네 번째에서 여섯 번째 에탄올 노출 동안 가장 분명 CS 각 노출에서 남성 간 구애의 낮은 수준을 전시 (두 샘플 t-테스트: p < 0.002 EXP4에서, p & 0.004 EXP5에서, p & 0.004 EXP6에서; p n = 12; 그림 7C). 함께, 이러한 결과는 OA가 에탄올의 억제 효과에 EIBS에서 역할을 할 수 있음을 나타낸다. 더 중요한 것은, 이러한 데이터 세트는 에탄올유도 억제 및 감작을 연구하는 플라이펍 분석의 유용성과 효과를 명확하게 입증한다.
그림 1: 플라이펍 분석 워크플로우. Flypub 분석 수행을 위한 주요 단계를 강조하는 워크플로 우표 다이어그램입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 플라이펍 챔버 재료 및 조립. (A)플라이펍 챔버를 구축하는 데 필요한 재료는(i)핫 글루 건 접착제 스틱,(ii)핫 글루 건,(iii)면도날,(iv)납땜 철,(v)눈금자,(vii)메쉬,(vii)폴리카보네이트 플라스틱 시트 및(viii)둥근 바닥 드로소필라 병을 포함한다. (B)플라이펍 챔버 어셈블리의 개략적 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 에탄올 노출. (A)완전히 조립된 플라이펍 스테이션. (B)에탄올 노출에 필요한 물질에는(i)P1000 마이크로파이펫,(ii)테이프,(iii)면 패드,(iv)페트리 접시,(v)실험실 물티슈 ,(vii)작은 깔때기,(vii)타이머,(viii)중간 크기의 깔때기,(ix)마우스 패드,(x)가위,(xi)95 % 에탄올,(xii)집게 및(xiii)주걱. (C)면 패드를 잘라 내는 방법에 대 한 단계입니다. (D)무대에 정렬 된 술집의 상단보기 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 행동 점수 매기기용 비디오 설정. 도시된 단계별 가이드는(A)비디오 및(B)행동 점수를 위해 VLC 미디어 플레이어에 타임코드 파일을 삽입하는 방법에 대한 단계별 가이드이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 남성 구애 행동. 대표적인 이미지는(A)구애노래,(B)구애의 연속,(C)구애원(D) 복부 굽힘 및(E)행동 점수매기기용에 사용되는 장착에 대한 다음과 같은 일방적 날개 확장을 포함하는 드로소필라 남성의 구애 행동을 보여준다.D 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 데이터 입력 및 분석. (A)매 10s 시간 블록에서 구애에 종사하는 남성의 수는 워크 시트에 기록됩니다. 3회 연속 10s 타임 블록(녹색 화살표)의 구애 남성이 가장 많은 수의 구애를 대표적인 데이터 포인트로 사용합니다. 최대 값을 갖는 10개의 연속적인 데이터 포인트(파란색 또는 주황색 브래킷)의 평균은 펍당 남성 간 구애비율을 나타낸다[주황색 브래킷; MAX(평균), 검은색 화살표]. (B, C) 최대 대표 데이터 포인트와 펍당 연속 10개의 연속 대표 데이터 포인트의 최대 평균을 계산하는 데 사용되는 워크시트 수식입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: CS 및 tβ h에서 에탄올 유도 행동 억제 및 과민화.h. (A, B) CS 및 tβh 수컷은 반복된 에탄올 노출로 과민화된 구애 억제를 나타냈다(ANOVA GLM, CS: R2=0.83, F(5,66)=65.21, p< 0.0001; tβh: R2=0.67, F(5,66)=27.60, p & 0.0001; n = 12). (C) tβh 수컷은 CS(n=12)에 비해 덜 억제된 구애를 보였다. CS 사후 hoc 해석의 p 값은 선 위에 표시됩니다. 남성 간 구애 활동은 각 에탄올 노출에 대해 생성된 비디오에서 분석되었다. 모든 데이터는 평균의 ±표준 오차를 의미로 보고된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 1: 통계 분석. Minitab 17 소프트웨어의 단계는(A)정상성 테스트를 수행하는 방법에 대한,(B)데이터를 적층하고,(C)일반 선형 모델 ANOVA 테스트,(D)2-샘플 t-검정,(E)Mann-Whitney 검정 및(F)크루스칼-월리스 검정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 보고서에서는 Flypub 분석의 설정 및 자세한 프로토콜을 설명했습니다. 재발하는 에탄올 노출이 구애와 행동 감작을 억제하는 방법을 측정하는 새로운 방법. Flypub 분석법은 비교적 간단하지만 신뢰할 수 있는 결과를 보장하기 위해 몇 가지 단계에 주의와 주의가 필요합니다. 첫째, 테스트를 위한 파리는 완전 색소(즉, 완전히 발달된 성인 파리)가 건강하고 손상되지 않아야 합니다. 특히 날개나 다리의 기형이나 손상은 남성의 법정 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 비행 연령은 중요하며 대조군과 실험 군(최적 연령: 에탄올 노출 1에서 3-5일)과 일치해야 합니다. 2 주 이상 야생 형 남성 파리는 억제 구애의 높은 수준을 표시하는 경향이31. 따라서, 연구 하에 파리의 적절한 연령 일치는 변수 결과를 피하기 위해 필수적이다. 셋째, 펍당 플라이 넘버가 필수적입니다(최적: 펍당 33개). 펍당 플라이 수치가 낮거나 높면 구애 점수가 크게 왜곡될 수 있습니다(표시되지 않은 데이터). 넷째, Flypub 챔버는 그림 2B에나와 있는 것과 동일한 볼륨을 가져야 합니다. 이를 통해 파리가 에탄올 증기를 동기적으로 수신하고 유도된 동작이 일관되게 유지됩니다. 다섯째, 명확한 비디오 녹화와 정확한 구애 점수가 필수적입니다. 이 프로토콜은 행동 관찰에 크게 의존하므로 표준화된 구애 점수 매기기 프로토콜을 세심하게 준수하는 것은 일관성없는 결과를 최소화하는 데 매우 기본적입니다. 마지막으로, 실험자가 비행 유전자형 이나 실험 적 치료를 인식하지 못하는 경우 에탄올 노출과 구애 점수 매기기 단계를 모두 맹목적으로 수행하여 실험 적 편향을 방지하는 것이 좋습니다.
플라이펍 분석에는 여러 가지 장점이 있습니다. 첫째, 파리의 여러 그룹을 동시에 테스트하고 비교할 수 있습니다. 둘째, 저렴하고 설치가 간단하고 배우기 쉬우므로 초등학교부터 고등학교까지, 학부 및 대학원생, postdocs 및 교수진을 포함한 모든 수준에서 실험자에게 매우 적합하며 제한된 공간과 예산으로 실험실을 가르치십시오. 셋째, 초기 민감도 및 내성 개발 및 유지 관리를 평가하기 위해 여성 파리의 억제된 구애 및 에탄올 또는 다른 진정제의 진정 효과와 같은 추가적인 행동을 측정하는 데 활용될 수있다 31,,32. 플라이펍은 함께 AUD의 다양한 특징을 연구할 수 있는 다목적 방법입니다.
Flypub 분석의 주요 제한은 엄격하고 힘든 구애 점수 처방입니다. 에탄올의 영향을 받는 구애 행위는 구애 기간이 1초 미만에서 몇 분까지 이며 구애에 종사하는 파리가 자주 변화하는 방식으로 매우 역동적입니다. 여기에 제시된 점수 정권은 이러한 동적 성질을 통합하고 주어진 유전자형31,,32에대한 개별 에탄올 노출에 대한 일관된 점수를 제공하기 위해 개발되었다. 프로토콜에서 설명한 것처럼 구애 활동은 수동으로 점수를 매겨 시간이 많이 걸립니다. 몇몇 자동화된 점수 매기기 프로그램은 편견없는 높은 처리량 행동 검열을 용이하게 하기 위하여 개발되고 모든 개별 적인 파리의 움직임 및 위치39,,40,,41,,42,,43,,44,,45에의존합니다. 또한 구애 활동을 자동으로 계산하는 컴퓨터 소프트웨어를 개발하려고 시도했지만 일관되고 신뢰할 수있는 결과를 얻을 수 없었습니다. 이것은 행동 점수가 여러 구애 단계 (즉, 다음, 일방적 인 날개 확장, 복부 굽힘 및 장착)를 포함한다는 사실에 기인 할 수있다35,,36,,46 한 번에 여러 파리의. 이러한 제한에도 불구하고 적절한 교육을 받는 실험자는 에탄올로 인한 구애 행동을 일관성과 정확성으로 정량화할 수 있어야 합니다. 그럼에도 불구하고 기계 학습 이나 다른 고급 알고리즘을 후속 조치로 채택하는 것은 큰 도움과 중요성이 될 것입니다.
설치류 모델과 유사하게, 플라이 모델의 에탄올에 대한 연구는 주로 에탄올의 운동 자극 및 진정 제 효과에 초점을 맞추고있다. 그러나 Flypub 분석, 측정 억제 구애, 소설 인인지 억제의 유형31,,32. 따라서 Flypub은 행동 억제 및 과민화에 중요한 위험 요소 (예 : 연령, 수면, 식이 요법 또는 사회 환경)뿐만 아니라 분자 플레이어, 세포 경로 및 신경 회로를 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 이전에 설치류 모형 및 인간 적인 과목에 있는 사실 인정과 일치하는 EIBS를 위해 도파민 신호가 요구된다는 것을 설명했습니다6,,9,,31. 또한 개념의 증거로서, 우리는 OA가 결여된 tβh 돌연변이체(노르에피네프린의 무척추 동물 대응)를 조사하고, 그 기여도가 도파민31에비해 상대적으로 작지만 에탄올의 억제 효과에 대한 행동 감작에도 중요하다는 것을 발견하였다. 이러한 발견은 tβh 돌연변이가 에탄올의 운동 활성화효과(47)에대한 감작에 명백한 손상을 나타내지 않는다는 Scholz47에 의한 관찰과는 대조적이다. 이것은 운동 성 활성화 대 억제에 행동 감작을 중재하는 명백한 분자, 세포 및 신경 통로를 건의합니다. 후속 연구는 더이 짜릿한 개념을 협력 한다.
요약하자면, Flypub은 AUD에 대한 이해를 높이고 이 만성 질환에 대한 효과적인 개입에 대한 통찰력을 제공하는 데 도움이 될 수 있는 에탄올에 대한 행동 반응, 특히 억제 및 행동 감작을 조사하는 저비용의 다각적이며 효과적인 방법입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, 뇌 및 행동 연구 재단 NARSAD, NIMHD 2G12MD007592 NMD 클러스터 보조금에 의해 지원되었다. 또한 NMD 및 CMS 를 지원하는 NIH 지원 RISE 프로그램(NIGMS 5R25GM069621), NMD 지원을 위한 UTEP COURI-SURPASS 프로그램, NIH 가 지원하는 MARC 프로그램(NIGMS 2T34GM008048-31) 및 EbS 지원에 대한 박사 지룽 홍 대학원 펠로우십에 감사드립니다. 우리는 UTEP 커뮤니케이션 부서에 크게 감사드립니다: 달린 바라하스, 크리스티안 리베라, 카리나 모레노, 호세 로야 페르난데스와 음악 부서: 스티븐 A. 하다드 비디오 및 음성 해설 제작에 대한 그들의 도움. 마지막으로, 우리는 제어 캔톤-S 파리와 함께 캔톤-S 배경에서 tβh 돌연변이를 공유한 안드레아스 툼 박사에게 매우 감사드립니다. 제시카 부르시아가는 옥토파민에 대한 초기 연구에 대한 귀중한 공헌을 하고 있으며, 한연구위원은 토론과 지원을 위해 연구를 하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 95 % Ethanol | VWR Chemicals | BDH1158-4LP | |
| Canton-S | - | - | wild-type strain used as a control |
| Copy stand with arms | Kaiser | 205411 | model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station |
| Cotton rounds | Swisspers | COT-027 | to deliver ethanol |
| Excel | Microsoft | - | to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used |
| Fluorescent light bulb | Lights of America | 7108N | maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station |
| Microsoft LifeCam software | Microsoft | - | version 3.60; to videotape flypubs |
| Microsoft LifeCam Studio | Microsoft | Q2F-00013 | 1080P HD sensor; to videotape flypubs |
| Minitab 17 | Minitab | - | version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used |
| Nylon mesh sheet | Sefar Nitex | - | model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub |
| Petri dishes | Falcon | 08-757-100A | 35 x 10 mm; to deliever ethanol |
| Plastic funnel - mid size | Fisher scientific | 10-348A | 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial |
| Plastic funnel - small | Fisher scientific | 07-202-121 | 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub |
| Polycarbonate sheet | Lexan | - | 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub |
| Round-bottom bottle | Fisher scientific | AS115 | polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub |
| Soldering iron | Weller | WES51 | to make a hole in a flypub |
| Time code | - | - | .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used |
| Tyramine β hydroxylase (tβh) | - | - | mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany) |
| VLC media player | VideoLAN | - | version 3.0.8; any media player can be used to score courtship |
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