Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Flypub å studere etanol indusert atferdshemming og sensitoring

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/61123
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Texas at El Paso
* These authors contributed equally

Summary

Flypub-analysen måler oppførselen som fruktfluen Drosophila melanogaster viser under påvirkning av etanol. Analysen kan lett mestres av eksperimenterere på alle nivåer og brukes på ulike fordampede stimuli, noe som letter rusmisbruk og avhengighetsstudier.

Abstract

Alkoholbruklidelse (AUD) er fortsatt et alvorlig problem i samfunnet vårt. For å utvikle effektive intervensjoner for avhengighet, er det viktig å forstå de underliggende nevrobiologiske mekanismene, som ulike eksperimentelle tilnærminger og modellsystemer er nødvendig for. Hovedingrediensen i alkoholholdige drikkevarer er etanol, noe som forårsaker adaptive endringer i sentralnervesystemet og atferd ved kronisk inntak. Atferdssensistikk (dvs. eskalerte svar) representerer spesielt en viktig adaptiv endring underliggende avhengighet. De fleste etanol-indusert atferdssensibiliseringsstudier i dyremodeller har blitt utført på den lokomotoriserende effekten av etanol. En fremtredende effekt av etanol er atferdshemming. Atferdssensistikk til disinhibition effekten av etanol er imidlertid underrepresentert. For å løse dette problemet utviklet vi Flypub-analysen som gjør det mulig å måle den eskalerte økningen i disinhibited frieri aktiviteter ved tilbakevendende etanoleksponering i Drosophila melanogaster. Her rapporterer vi den trinnvise Flypub-analysen, inkludert montering av etanoleksponeringskamre, oppsett av analysestasjonen, kriterier for flypleie og innsamling, etanollevering, kvantifisering av disinhibited frieriaktiviteter, databehandling og statistisk analyse. Også gitt er hvordan du feilsøker kritiske trinn, overvinne begrensninger og utvide sitt verktøy for å vurdere ekstra etanol-indusert atferd. Flypub-analysen i kombinasjon med kraftige genetiske verktøy i Drosophila melanogaster vil lette oppgaven med å oppdage mekanismen underliggende etanol-indusert atferdssensitorisering.

Introduction

Alkohol er en av de mest lett tilgjengelige og mye konsumerte stoffene i verden. Den har høyt potensial for misbruk og avhengighet; Mekanismen som ligger til grunn for denne prosessen, forblir imidlertid ufullstendig forstått. Etanol induserer disinhibition, eufori, kognitiv svekkelse, hyperaktivitet, tap av motorkontroll og sedasjon i ormer1, frukt fluer1,2,3, mus4, rotter5 og mennesker6, indikerer vanlige nevrobiologiske komponenter mediering etanol effekter fra virvelløse dyr til pattedyr inkludert mennesker. Kronisk etanolinntak forårsaker nevrale tilpasninger og atferdsmodifikasjoner som ligger til grunn for AUD. En av tilpasningene er atferdssensifilisering definert som utvidet respons med gjentatte erfaringer med etanol7,,8,,9 eller andre vanedannende stoffer10,11,12.

I løpet av tiårene har studiene på etanol-indusert atferdssensibilisering (EIBS) fokusert på den lokomotorstimulerende effekten, som brukes som proxy for en euforisk respons7,,8,9,13. For eksempel viser rotter eller mus ved gjentatt (hver 24, 48 eller 72 h) etanoladministrasjon den utvidede lokomotoriske aktiviteten målt ved ganghastighet8,,14,,15,16,17,18,19,20,21. På samme måte er fruktfluene utsatt for den andre eksponeringen for etanoldamp 4 timer etter den første eksponeringen viser forbedret lokomotorrespons målt ved ganghastighet samt22. Mens ingen informasjon er tilgjengelig på mekanismen underliggende EIBS til lokomotorstimulerende effekt i fruktfluer, har studier på rotter og mus avdekket molekylære og signalkomponenter (for eksempel dopamin, glutamat og GABA-systemer) samt nevrale substrater og krets (for eksempel ventral tegmental området, nucleus accumbens, amygdala og prefrontal cortex) som spiller store roller for EIBS6,93, 23 , 23 ,23.

Disinhibition er en stor effekt av etanol og fører til manifestasjon av atferd som vanligvis er begrenset. Disinhibiting effekten utøves på motoriske, emosjonelle, sosiale, seksuelle og kognitive funksjoner, noe som kan føre til upassende seksuell atferd, verbal eller fysisk aggresjon og impulsive handlinger hos mennesker og dyremodeller24,25,26,27,28,29. Etanol-indusert disinhibition har blitt undersøkt i dyremodeller for mekanistiske studier, og de inkluderer motorimpulsivitet og aggresjon hos gnagere og aper samt foraging disinhibition i ormer6,,9,24,28,29,30. Vi har vist at fruktfluer viser disinhibited seksuell oppførsel under påvirkning av etanol31. Spesielt, vill-type menn flyr sjelden domstol andre menn uten etanol31 og når de gjør det, courtees aktivt avvise frierføtter menn. Under påvirkning av etanol viser imidlertid mannlige fluer mer frieri mot andre menn og frierier viser mindre avvisning, noe som resulterer i samlet forbedret intermannlig frieri. Spesielt utvikler fluer atferdssensitoring til disinhibitioneffekten ved tilbakevendende etanoleksponering, som fungerer som et unikt system for å studere EIBS31,32.

I denne rapporten beskriver vi hvordan du setter opp, utfører, feilsøker og analyserer Flypub-analysen og data for å studere etanolindusert disinhibition og sensifilisering i fruktfluen Drosophila melanogaster. For å gi sin nytte og effektivitet testet vi wild-type Canton-S (CS; kontrollflystamme) sammen med fluene mangelfull i tyramin β hydroksylase (tβh) som syntetiserer octopamin (OA). OA er en stor neuromodulator i virvelløse dyr33,34 og spiller en nøkkelrolle i utviklingen av etanoltoleranse i fluer22. Vi rapporterer her for første gang at OA er viktig for EIBS.

Protocol

MERK: Protokollseksjonen beskriver forberedende, Flypub-analyse- og analysetrinn som inkluderer (1) montering av kammeret, (2) flypleie og innsamling, (3) analysestasjonsoppsett, (4) etanoleksponering, (5) frieri og dataanalyse, og (6) statistisk analyse. De viktigste trinnene for å gjennomføre Flypub-analysen og analysen er avbildet i en arbeidsflyt (figur 1).

1. Montering av kammeret (Figur 2)

  1. Klipp av den nederste delen av den runde Drosophila flasken på 25 ml ved hjelp av et barberblad.
  2. Lag et hull, 5 mm i diameter, ved 50 ml merket av flasken ved hjelp av et varmt loddejern.
    MERK: Dette er tilgangspunktet hvor fluene skal overføres til kammeret.
  3. Skjær et nettingark i en sirkel, 54 mm i diameter, for å passe i Drosophila-flasken ved 75 ml-merket.
  4. Fest nettet på 75 ml merket på flasken ved hjelp av varmt lim.
  5. Skjær polykarbonatplastarket i en sirkel, 70 mm i diameter.
  6. Fest polykarbonatplastplaten til flasken ved 25 ml merket (nederste åpne område laget i trinn 1.1) ved hjelp av varmt lim.
  7. Trykk ned ved hjelp av vekter for å sikre at polykarbonatrunden er godt festet til bunnen.
  8. Vask puber med etanol for å fjerne lukt og skyll dem voldsomt flere ganger under rennende destillert vann. Rist pubene kraftig for å fjerne overflødig vann.
  9. Tørk pubene ved å legge dem ned horisontalt på papirhåndklær ved romtemperatur.

2. Fly pleie og samling

  1. Vedlikehold fluene på en standard maismel / agar / sukker / gjær mat medium (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html).
  2. Samle en- til to-dagers gammel mann flyr inn i en gruppe på 33, som representerer ett datapunkt, under karbondioksid (CO2)anestesi. Pass på å velge fluene med intakt morfologi og legg dem i et mathetteglass for å gjenopprette.
    MERK: To flere eller tre færre fluer per gruppe er utholdelige. Atferd kan være følsom for eksperimentelle innstillinger, og det kan hende at et totalt flynummer per pub må justeres med en kontrollflylinje.
    MERK: Pass på at hetteglasset med mat legges ned på siden slik at de bedøvede fluene ikke sitter fast i maten.
  3. Hold fluene i 25 °C inkubatoren med minst 50% relativ fuktighet og en 12 h lys / 12 timer mørk syklus i 2 dager før etanoleksponering.
    MERK: CO2-clearance er avgjørende for å eliminere eventuelle CO2-indusertefysiologiske eller atferdsmessige effekter som kan endre etanolinduserte responser.
  4. Bruk koder til blind fly genotyper eller behandlingsforhold til eksperimentererne som utfører etanoleksponering og scoring frieri atferd.
    MERK: Blindtester bidrar til å eliminere eksperimentell bias.

3. Assay stasjon satt opp (Figur 3A)

  1. Sett opp et kopistativ med en festet midtarm på en benkeplate i et godt ventilert rom.
    MERK: Kopistativet er ikke obligatorisk. Alle oppsamlingsenheter som gir en nivåplattform er tilstrekkelig.
  2. Klem de to laterale armene til stativet, med hver arm ca. 18 cm ut fra midten av stativet.
  3. Plasser et fluorescerende lys på hver arm av stativet og en i midten.
  4. Fest videoopptakeren til midtarmen, ca. 38 cm over midten av sokkelen. Dette vil registrere puber fra en toppvisning.
  5. Dekk bunnen av stativet med hvitt papir, noe som bidrar til å visualisere mørke fluer for å skape kontrast.
  6. I løpet av eksponeringsdagen slår du på lysrørene og datamaskinen som er koblet til videokameraet som er festet til kopistativet (Figur 3A).
    MERK: Lysintensiteten 2100-2200 lux gir god kvalitet på registrert atferd for scoring. Men omgivelseslysforholdene i laboratoriet er tilstrekkelige til å observere etanol-indusert frieri aktiviteter.
  7. Forbered elementene som skal brukes til etanoleksponering avbildet i figur 3B.
  8. Samle seks rene, sammensatte puber for et sett med eksperimenter og merk dem med koden 1 til 6.
    MERK: Sørg for å plassere randomiserte koder på flygenotyper eller behandlingsforhold.

4. Eksponering for etanol (Figur 3)

  1. Overfør forsiktig en gruppe på 33 menn til et Flypub-kammer gjennom hullet ved 50 ml-merket ved hjelp av en liten trakt.
    MERK: For å minimere mekanisk stress til fluene, plasser en musematte eller noe dempingsmateriale under puben under overføringen.
  2. Dekk hullet med et tape.
    MERK: Båndet brukes til å lukke hullet, og hindrer fluer i å rømme ut av puben.
  3. Juster pubene på scenen fra 1 til 6.
  4. Akklimatiser fluene til kammeret i 10 min (Figur 3D).
  5. Juster kamerainnstillingene, inkludert fokus, zoom og lysstyrke, og ta opp de siste 5 minuttene med akklimatisering for å måle et baal frierinivå.
    MERK: For å eliminere gjenskinn generert av lysrefleksjon fra en pub, plasser laboratorieservietter (vanligvis 4 lag eller mindre enn 1 mm tykkelse) nederst på puben for å justere vinkelen.
  6. Forbered bomullsputer for etanollevering ved å kutte en pute i fire like kvadranter med ren saks og deretter trimme hjørnene for å få den til å passe inn i en petriskål under akklimatisering (figur 3C).
    MERK: Ikke bruk bare hender til å håndtere bomullsputene. Bruk tang til å håndtere bomullsputene for å unngå potensiell overføring av lukt.
  7. Legg til en bomullsdott i hver petriskål.
  8. Tilsett 1 ml 95% etanol til hver bomullsdott, sørg for at etanolløsningen skal fordeles jevnt på hele området av puten.
  9. Dekk med tolags lab kluter for å unngå rask etanol fordampning.
  10. Plasser den lille petriskålen som inneholder den etanol-gjennomvåt bomullsdott og de tolags lab servietter gjennom den nederste åpningen av puben etter akklimatisering.
  11. Juster pubene på scenen, begynn å spille inn og start samtidig en tidtaker.
  12. Registrer pubene som inneholder fluer under etanoleksponering til fluene slutter å frieri eller beveger seg på grunn av sedasjon.
  13. Fjern petriskålen som inneholder etanol fra hver pub med en slikkepott når over 90% av fluene er bedøvet.
  14. Overfør forsiktig fluer tilbake til de tildelte hetteglassene gjennom hullet på 50 ml-merket i puben.
    MERK: Plasser en trakt på toppen av hetteglassene for å hjelpe til med overføringen. Sørg for å plassere bedøvede fluer på siden av mathetteglassene for å hindre at de blir sittende fast i maten.
  15. Rengjør puber med etanol for å fjerne lukt og skyll dem voldsomt flere ganger under rennende destillert vann. Rist pubene kraftig for å fjerne overflødig vann.
  16. Tørk pubene ved å legge dem ned horisontalt på papirhåndklær ved romtemperatur.
  17. Hold fluene i 25 °C inkubatoren med minst 50% relativ fuktighet og en 12 timer lys / 12 timer mørk syklus.
  18. Gjenta trinnene 4,1-4,17 hver 24 timer i seks påfølgende dager, og sørg for å gjennomføre etanoleksponeringen samtidig på dagen for å unngå circadian effekter.
    MERK: Endre mathetteglass hver 2 – 3 dager for å opprettholde sunne fluer.

5. Frieriscoring og dataanalyse (Figur 4-6)

  1. Åpne de innspilte videoene ved hjelp av en mediespiller (f.eks. VLC) og zoom inn videoen for å tydelig observere fluer som skal score (Figur 4A).
  2. Legg ved tidskoden til videoen (Figur 4B).
  3. Telle antall menn engasjert i frieri aktiviteter inkludert følgende, ensidig vinge forlengelse, frieri kjede, frieri sirkel, abdominal bøying og montering for hver 10 s tid blokk31 (Figur 5).
  4. Skriv inn antall menn som viser frieri for hver 10 s tidsblokk i et regneark (Figur 6A).
  5. Bruk maksimalt antall frieri menn i de tre påfølgende 10-talls tidsblokkene som et representativt datapunkt (figur 6B).
  6. Beregn gjennomsnittet av 10 påfølgende datapunkter med høyest verdi (figur 6C), og dette representerer prosentandelen intermale frieri per pub (figur 6A).

6. Statistisk analyse (tilleggstall 1)

  1. Åpne statistisk analyseprogramvare (f.eks. Minitab 17) og legg til frieridata i regnearket.
    MERK: Enhver statistisk analyseprogramvare kan brukes.
  2. Hvis du vil fastslå distribusjonen av dataene (enten normal Stat eller ikke-normal distribusjon), går du til Stat-fanen, velger Grunnleggende statistikk og klikker på alternativet Normalitetstest (Tilleggsfigur 1Ai). Basic Statistics
  3. I Variabelvelger du individuelle kolonner (hver kolonne som representerer et datasett med genotype eller behandling under studien), velger Anderson-Darling-testen, og klikker OK (Tilleggsfigur 1Aii).
    MERK: Normalitetssannsynlighetsplottet viser den beregnede P-verdien: Hvis P-verdien er større enn 0,05, distribueres dataene vanligvis. Hvis P-verdien er mindre enn 0,05, distribueres ikke dataene(tilleggstall 1Aiii).
  4. For sammenligning av flere grupper, stable kolonnene for å sammenligne ved å klikke kategorien Data, velg Stable, og deretter Kolonner (Tilleggsfigur 1Bi).
  5. I vinduet Stablekolonner velger du datakolonnene som skal stables, velger du stablingen som er gjort enten i Nytt regneark eller Kolonne i gjeldende regneark, med neste kolonne som er angitt for å betegne senket skrift (f.eks. datagruppeidentitet; Tilleggstall 1Bii-1Biii).
  6. Klikk kategorien Stat, velg ANOVA-testen, velg den generelle lineære modellen og klikk deretter tilpass generell lineær modell (tilleggsfigur 1Ci).
  7. I vinduet Generell lineær modell velger du kolonnene som skal sammenlignes i Svar-boksen, velger kolonnen med senket skrift i Faktorer-boksen og klikker OK, noe som fører til de statistiske analyseresultatene (Tilleggsfigur 1Cii-1Ciii).
  8. Til sammenligning av to grupper med normalt distribuerte data klikker du kategorien Stat, velger Grunnleggende statistikkog velger 2-Sample t-test (Tilleggsfigur 1Di).
  9. I vinduet 2-Eksempel for gjennomsnittsvinduet velger du Hvert utvalg er i sin egen kolonne, fra en rullegardinliste, velger de to gruppene du vil sammenligne i boksene Eksempel 1 og Eksempel 2, og deretter klikker du OK, noe som fører til de statistiske analyseresultatene (Tilleggsfigur 1Dii-1Diii).
  10. For sammenligning av to grupper med ikke-normalt distribuerte data, gå til Stat-fanen, velg Ikke-parametri og klikk Mann-Whitney (Tilleggsfigur 1Ei)
  11. I Mann-Whitney-vinduet velger du de to gruppene du vil sammenligne i boksene Første utvalg og Andre utvalg, og deretter klikker du OK, noe som fører til de statistiske analyseresultatene (Tilleggsfigur 1Eii-1Eiii).
  12. For sammenligning av tre eller flere grupper av ikke-normalt Stat distribuerte data, gå til Stat-fanen, velg Ikke-parametri, og klikk deretter Kruskal-Wallis-testen (Tilleggsfigur 1Fi).
  13. I Kruskal-Wallis-vinduet velger du kolonnene som skal sammenlignes i Svar-boksen, velg kolonnen med senket skrift i Faktor-boksen og klikker OK, noe som fører til de statistiske analyseresultatene (Tilleggsfigur 1Fii-1Fiii).

Representative Results

Denne delen demonstrerer resultatene av et representativt Flypub-eksperiment. Drosophila menn sjelden domstol andre menn35,36. Under den første etanoleksponeringen viste de ville typen Canton-S (CS) menn en liten, men ubetydelig økning i det disinhibited intermale frieri31 (Figur 7A). CS-menn viste imidlertid de eskalerte økningene i disinhibited frieri aktivitet i påfølgende etanol eksponeringer (ANOVA GLM, CS: R2= 0,83, F(5,66) = 65,21, p < 0,0001; n = 12; Figur 7A), som indikerer atferdssensidisering til disinhibitioneffekten av etanol. Vi har tidligere vist at denne typen EIBS krever dopamin og dopaminreseptoren DopEcR i soppnevronene31,32.

For å identifisere om flere nevromodulatorer er involvert i EIBS, undersøkte vi OAs rolle ved å teste fluene (tβh; nM18 null allele)37,38 mangler tyramin β hydroksylase, det ratebegrensende enzymet i OA-biosyntesen, og dermed mangelfull i OA. T tβh menn i CS genetisk bakgrunn (en snill gave fra Dr. Andreas Thum, Universitetet i Leipzig , Tyskland) viste sensid disinhibited frieri respons på daglig etanol eksponeringer (ANOVA GLM, tβh: R2= 0,67, F(5,66) = 27,60, p < 0,0001; n = 12; Figur 7B) men på redusert nivå sammenlignet med CS (ANOVA GLM, interaksjoneffekt: F = 2,50, p <0,034). Ved post hoc-analyse viste tβh menn lavere nivåer av intermannlig frieri ved hver eksponering som er mest tydelig under fjerde til sjette etanoleksponeringsammenlignet med CS (To-sample t-test: p < 0.002 i EXP4, p < 0.004 i EXP5, p < 0.021 i EXP6; n = 12; Figur 7C). Sammen indikerer disse resultatene at OA kan spille en rolle i EIBS til disinhibition effekten av etanol. Enda viktigere, disse datasettene viser tydelig verktøyet og effektiviteten til Flypub-analysen ved å studere etanolindusert disinhibition og sensibilisering.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt for Flypub-analyse. Et arbeidsflytdiagram som fremhever de viktigste trinnene for å utføre Flypub-analysen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Flypub kammermaterialer og montering. (A) Materialer som kreves for å bygge et Flypub kammer inkluderer (i) varmt lim pistol lim pinne, (ii) varmt lim pistol, (iii) barberblad, (iv) loddejern, (v) linjal, (vi) mesh, (vii) polykarbonat plast ark, og (viii) rund bunn Drosophila flaske. (B) Skjematisk representasjon av Flypub kammermontering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Etanoleksponering. (A) En ferdig montert Flypub stasjon. (B) Materialer som kreves for etanoleksponering inkluderer (i) P1000 mikropipette, (ii) tape, (iii) bomullspute, (iv) Petriskål, (v) labservietter, (vi) liten trakt, (vii) timer, (viii) mellomstore trakt, (ix) musematte, (x) saks, (xi) 95% etanol, (xii) tang og (xiii) spatula. (C) Trinn på hvordan å kutte bomullpads. (D) Toppbilde av pubene justert på scenen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Videooppsett for atferdspoenging. Vist er den trinnvise veiledningen på (A) hvordan du zoomer inn på videoen og (B) hvordan du setter inn tidskodefilen i VLC-mediespilleren for atferdsmessig poengsetting. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Mannlig frieri atferd. Representative bilder illustrerer Drosophila mannlige frieri atferd inkludert følgende og ensidig vinge forlengelse for (A) frieri sang, (B) frieri sirkel (C) frieri sirkel (D) abdominal bøying og (E) montering som brukes for atferdsmessig scoring. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Datainndata og analyse. (A) Antall menn engasjert i frieri i hver 10 s tidblokk er transkribert til et regneark. Det høyeste antallet frieri menn på tre påfølgende 10 s tidsblokker (grønn pil) brukes som et representativt datapunkt. Gjennomsnittet av 10 påfølgende datapunkter (blå eller oransje brakett) som har maksimal verdi representerer prosentandelen av inter-mannlig frieri per pub [oransje brakett; MAX (gjennomsnitt), svart pil]. - Jeg har ikke noe åsi. Regnearkformlene som brukes til å beregne det maksimale representative datapunktet og maksimalt gjennomsnitt på 10 påfølgende representative datapunkter per pub. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Etanolindusert atferdshemming og sensitoring i CS og tβh. - Jeg har ikkenoe å si. CS og tβh menn viste sensisosiisert frieri disinhibition med gjentatte etanol eksponeringer (ANOVA GLM, CS: R2= 0,83, F(5,66)= 65,21, p < 0,0001; tβh: R2=0.67, F(5,66)=27,60, p < 0.0001; n = 12). (C) Tβh menn viste mindre disinhibited frieri sammenlignet med CS (n = 12). P-verdiene for post hoc-analysene vises over linjen. Intermale frieri aktivitet ble analysert fra videoene generert for hver etanol eksponering. Alle data rapporteres som midler ± standardfeil i gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstall 1: Statistisk analyse. Trinnene i Minitab 17 programvare om hvordan du utfører (A) Normalitet test, (B) stabling dataene, (C) Generell lineær modell ANOVA test, (D) To-sample t-test, (E) Mann-Whitney test og (F) Kruskal-Wallis test. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

I denne rapporten har vi beskrevet oppsettet og detaljert protokoll for Flypub-analysen; en ny metode for å måle hvordan tilbakevendende etanoleksponering utløser disinhibited frieri og atferdssensitoring. Selv om Flypub-analysen er relativt grei, krever flere trinn omsorg og oppmerksomhet for å sikre pålitelige resultater. For det første må fluene for testing være fullt pigmentert (dvs. fullt utviklede voksne fluer), sunne og intakte. Deformiteter eller skader spesielt i vingene eller bena kan påvirke hannens evne til retten. For det andre er flyalderen viktig og må matches mellom kontroll og eksperimentelle grupper (optimal alder: 3-5 dager gammel ved etanoleksponering 1). To uker og eldre vill-type mannlige fluer har en tendens til å vise forhøyede nivåer av disinhibited frieri31. Dermed er riktig alderssamsvar av fluer under studien avgjørende for å unngå variable resultater. For det tredje er flynummeret per pub viktig (optimal: 33 per pub). De lavere eller høyere flytallene per pub kan i stor grad forvrenge frieriscore (data vises ikke). For det fjerde må Flypub-kamrene ha identiske volumer som vist i figur 2B. Dette sikrer at fluer mottar etanoldamp synkront og den fremkalte atferden er konsistent. For det femte er det viktig med klar videoopptak og presis frieriscoring. Denne protokollen avhenger sterkt av atferdsobservasjoner, så omhyggelig overholdelse av standardisert frieri scoring protokollen er grunnleggende for å minimere inkonsekvente resultater. Til slutt anbefales det sterkt at både etanoleksponering og frieriscorende trinn utføres blindt, hvor en eksperimenterer ikke er klar over flygenotyper eller eksperimentelle behandlinger, og dermed forhindrer eksperimentell bias.

Flypub-analysen har flere fordeler. For det første kan flere grupper av fluer testes og sammenlignes samtidig. For det andre er det billig, enkelt å sette opp og lett å lære, noe som gjør det svært mottagelig for eksperimenterere på alle nivåer, inkludert grunnskole gjennom videregående skole, lavere og høyere studenter, postdoktorer og fakultet, samt undervisning laboratorier med begrenset plass og budsjetter. For det tredje kan det benyttes til å måle ytterligere atferd som disinhibited frieri av kvinnelige fluer og beroligende effekt av etanol eller andre beroligende midler for å vurdere innledende følsomhet og toleranseutvikling og vedlikehold31,32. Sammen er Flypub en allsidig metode for å studere ulike funksjoner i AUD.

Den store begrensningen av Flypub-analysen er det strenge og arbeidskrevende frieriet scoring diett. Frieriatferden under påvirkning av etanol er svært dynamisk på en måte som frierivarigheten varierer fra mindre enn ett sekund til mange minutter, og fluene som er engasjert i frieri, er ganske ofte i endring. Scoringsregimet som presenteres her ble utviklet for å innlemme denne dynamiske naturen og for å gi konsistente score på individuelle etanoleksponeringer for en gitt genotype31,32. Som nevnt i protokollen, er frieri aktiviteten manuelt scoret, noe som er tidkrevende. Flere automatiserte scoringsprogrammer er utviklet for å lette objektiv høy gjennomstrømning atferdsscreening og som alle er avhengige av individuelle fluers bevegelser og steder39,,40,41,42,43,44,45. Vi forsøkte også å utvikle en dataprogramvare for å automatisk telle frieriaktiviteten, men klarte ikke å oppnå konsistente og pålitelige resultater. Dette kan skyldes det faktum at atferdsscore inkluderer flere frieritrinn (dvs. etter, ensidig vingeforlengelse, abdominal bøying og montering)35,36,46 av flere fluer samtidig. Selv med denne begrensningen bør en eksperimenterer med tilstrekkelig opplæring kunne kvantifisere etanolindusert frieri atferd med konsistens og nøyaktighet. Likevel ville det være til stor hjelp og betydning å vedta maskinlæring eller andre avanserte algoritmer som en oppfølging.

I likhet med gnagermodeller har studiene på etanol i flymodellen i stor grad fokusert på etanolens lokomotorstimulerende og beroligende effekter. Flypub-analysen måler imidlertid disinhibited frieri, en type kognitiv disinhibition som er roman31,32. Derfor kan Flypub hjelpe til med å belyse molekylære spillere, cellulære veier og nevrale kretser, samt risikofaktorer (f.eks alder, søvn, kosthold eller sosialt miljø) kritisk for atferdsmessig disinhibition og sensitoring. Vi har tidligere vist at dopaminsignalering er nødvendig for EIBS, som er i tråd med funnene i gnagermodeller og menneskelige6,,9,31. Også som et konseptbevis undersøkte vi tβh mutant mangler OA (virvelløse motstykke av noradrenalin) og fant at OA er også viktig for atferdsmessig sensibilisering til etanol disinhibition effekt selv om bidraget er relativt liten i forhold til dopamin31. Dette funnet er i motsetning til observasjonen av Scholz47 at tβh mutant fluer viser ingen åpenbare svekkelser i sensibilisering til etanolens lokomotor aktiverende effekt47. Dette antyder distinktmolekylære, cellulære og nevrale veier som medierer atferdssensibilisering til disinhibition versus lokotorisk aktivering. Oppfølgingsstudier bør samarbeide videre om denne fristende forestillingen.

Oppsummert er Flypub en rimelig, mangefasettert og effektiv metode for å undersøke atferdsresponsen på etanol, spesielt disinhibition og atferdssensifilisering, som kan bidra til å fremme vår forståelse av AUD og gi innsikt i effektive intervensjoner for denne kroniske lidelsen.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Brain & Behavior Research Foundation NARSAD og NIMHD 2G12MD007592 NMD Cluster tilskudd. Vi er også takknemlige for det NIH-finansierte RISE-programmet (NIGMS 5R25GM069621) for å støtte NMD og CMS, UTEP COURI-SURPASS-programmet for å støtte NMD, det NIH-finansierte MARC-programmet (NIGMS 2T34GM008048-31) for å støtte AA, og Dr. Keelung Hong Graduate Fellowship for å støtte EBS. Vi setter stor pris på UTEP kommunikasjonsavdelingen: Darlene Barajas, Christian Rivera, Karina Moreno, Jose Loya Fernandez og musikkavdelingen: Stephen A. Haddad for deres hjelp i video- og voice-over-produksjonen. Til slutt er vi veldig takknemlige til Dr. Andreas Thum for å dele tβh mutant i Canton-S bakgrunn sammen med kontrollen Canton-S fluer; og Jessica Burciaga for hennes verdifulle bidrag til de første studiene på octopamin og Han lab medlemmer for diskusjon og støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
95 % Ethanol VWR Chemicals BDH1158-4LP
Canton-S - - wild-type strain used as a control
Copy stand with arms Kaiser 205411 model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station
Cotton rounds Swisspers COT-027 to deliver ethanol
Excel Microsoft - to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used
Fluorescent light bulb Lights of America 7108N maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station
Microsoft LifeCam software Microsoft - version 3.60; to videotape flypubs
Microsoft LifeCam Studio Microsoft Q2F-00013 1080P HD sensor; to videotape flypubs
Minitab 17 Minitab - version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used
Nylon mesh sheet Sefar Nitex - model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub
Petri dishes Falcon 08-757-100A 35 x 10 mm; to deliever ethanol
Plastic funnel - mid size Fisher scientific 10-348A 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial
Plastic funnel - small Fisher scientific 07-202-121 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub
Polycarbonate sheet Lexan - 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub
Round-bottom bottle Fisher scientific AS115 polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub
Soldering iron Weller WES51 to make a hole in a flypub
Time code - - .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used
Tyramine β hydroxylase (tβh) - - mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany)
VLC media player VideoLAN - version 3.0.8; any media player can be used to score courtship

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scholz, H. Unraveling the Mechanisms of Behaviors Associated With AUDs Using Flies and Worms. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (11), 2274-2284 (2010).
  2. Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual Review of Neuroscience. 36, 121-138 (2013).
  3. Park, A., Ghezzi, A., Wijesekera, T. P., Atkinson, N. S. Genetics and genomics of alcohol responses in Drosophila. Neuropharmacology. 122, 22-35 (2017).
  4. Kippin, T. E. Adaptations underlying the development of excessive alcohol intake in selectively bred mice. Alcoholism: Clinical Experimental Research. 38 (1), 36-39 (2014).
  5. Bell, R. L., et al. Rat animal models for screening medications to treat alcohol use disorders. Neuropharmacology. 122, 201-243 (2017).
  6. Nona, C. N., Hendershot, C. S., Le, A. D. Behavioural sensitization to alcohol: Bridging the gap between preclinical research and human models. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 173, 15-26 (2018).
  7. Robinson, T. E., Berridge, K. C. The neural basis of drug craving: an incentive-sensitization theory of addiction. Brain Research Reviews. 18 (3), 247-291 (1993).
  8. Masur, J., Boerngen, R. The excitatory component of ethanol in mice: a chronic study. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 13 (6), 777-780 (1980).
  9. Camarini, R., Pautassi, R. M. Behavioral sensitization to ethanol: Neural basis and factors that influence its acquisition and expression. Brain Research Bulletin. 125, 53-78 (2016).
  10. Shuster, L., Yu, G., Bates, A. Sensitization to cocaine stimulation in mice. Psychopharmacology (Berl). 52 (2), 185-191 (1977).
  11. Short, P. H., Shuster, L. Changes in brain norepinephrine associated with sensitization to d-amphetamine. Psychopharmacology (Berl). 48 (1), 59-67 (1976).
  12. Vanderschuren, L. J., Pierce, R. C. Sensitization processes in drug addiction. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 3, 179-195 (2010).
  13. Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5 (4), 9954 (2010).
  14. Broadbent, J., Harless, W. E. Differential effects of GABA(A) and GABA(B) agonists on sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in DBA/2 J mice. Psychopharmacology (Berl). 141 (2), 197-205 (1999).
  15. Camarini, R., Andreatini, R., Monteiro, M. G. Prolonged treatment with carbamazepine increases the stimulatory effects of ethanol in mice. Alcohol. 12 (4), 305-308 (1995).
  16. Camarini, R., Hodge, C. W. Ethanol preexposure increases ethanol self-administration in C57BL/6J and DBA/2J mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 79 (4), 623-632 (2004).
  17. Hoshaw, B. A., Lewis, M. J. Behavioral sensitization to ethanol in rats: evidence from the Sprague-Dawley strain. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 68 (4), 685-690 (2001).
  18. Kawakami, S. E., Quadros, I. M., Takahashi, S., Suchecki, D. Long maternal separation accelerates behavioural sensitization to ethanol in female, but not in male mice. Behavioural Brain Research. 184 (2), 109-116 (2007).
  19. Lessov, C. N., Phillips, T. J. Duration of sensitization to the locomotor stimulant effects of ethanol in mice. Psychopharmacology (Berl). 135 (4), 374-382 (1998).
  20. Melon, L. C., Boehm, S. L. Role of genotype in the development of locomotor sensitization to alcohol in adult and adolescent mice: comparison of the DBA/2J and C57BL/6J inbred mouse strains. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (7), 1351-1360 (2011).
  21. Pastor, R., Aragon, C. M. The role of opioid receptor subtypes in the development of behavioral sensitization to ethanol. Neuropsychopharmacology. 31 (7), 1489-1499 (2006).
  22. Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).
  23. Cofresi, R. U., Bartholow, B. D., Piasecki, T. M. Evidence for incentive salience sensitization as a pathway to alcohol use disorder. Neuroscience & Biobehavrioal Reviews. 107, 897-926 (2019).
  24. Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. Plos One. (93), 92965 (2014).
  25. Stoner, S. A., George, W. H., Peters, L. M., Norris, J. Liquid courage: alcohol fosters risky sexual decision-making in individuals with sexual fears. AIDS and Behavior. 11 (2), 227-237 (2007).
  26. Marinkovic, K., Halgren, E., Klopp, J., Maltzman, I. Alcohol effects on movement-related potentials: a measure of impulsivity. Journal of Studies on Alcohol and Drugs. 61 (1), 24-31 (2000).
  27. Prause, N., Staley, C., Finn, P. The effects of acute ethanol consumption on sexual response and sexual risk-taking intent. Archives of Sexual Behavior. 40 (2), 373-384 (2011).
  28. Miczek, K. A., DeBold, J. F., Hwa, L. S., Newman, E. L., de Almeida, R. M. Alcohol and violence: neuropeptidergic modulation of monoamine systems. Annals of the New York Academy of Sciences. 1349, 96-118 (2015).
  29. Heinz, A. J., Beck, A., Meyer-Lindenberg, A., Sterzer, P., Heinz, A. Cognitive and neurobiological mechanisms of alcohol-related aggression. Nature Reviews Neuroscience. 12 (7), 400-413 (2011).
  30. Schwandt, M. L., Higley, J. D., Suomi, S. J., Heilig, M., Barr, C. S. Rapid tolerance and locomotor sensitization in ethanol-naive adolescent rhesus macaques. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 32 (7), 1217-1228 (2008).
  31. Lee, H. G., Kim, Y. C., Dunning, J. S., Han, K. A. Recurring ethanol exposure induces disinhibited courtship in Drosophila. Plos One. 3 (1), 1391 (2008).
  32. Aranda, G. P., Hinojos, S. J., Sabandal, P. R., Evans, P. D., Han, K. A. Behavioral Sensitization to the Disinhibition Effect of Ethanol Requires the Dopamine/Ecdysone Receptor in Drosophila. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, 56 (2017).
  33. Roeder, T. Octopamine in invertebrates. Progress in Neurobiology. 59 (5), 533-561 (1999).
  34. Gallo, V. P., Accordi, F., Chimenti, C., Civinini, A., Crivellato, E. Catecholaminergic System of Invertebrates: Comparative and Evolutionary Aspects in Comparison With the Octopaminergic System. International Review of Cell Molecular Biology. 322, 363-394 (2016).
  35. Curcillo, P. G., Tompkins, L. The ontogeny of sex appeal in Drosophila melanogaster males. Behavior Genetics. 17 (1), 81-86 (1987).
  36. Spieth, H. T. Courtship behavior in Drosophila. Annual Review of Entomology. 19, 385-405 (1974).
  37. Monastirioti, M., Linn, C. E., White, K. Characterization of Drosophila tyramine beta-hydroxylase gene and isolation of mutant flies lacking octopamine. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3900-3911 (1996).
  38. Certel, S. J., Savella, M. G., Schlegel, D. C., Kravitz, E. A. Modulation of Drosophila male behavioral choice. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 104 (11), 4706-4711 (2007).
  39. Kido, A., Ito, K. Mushroom bodies are not required for courtship behavior by normal and sexually mosaic Drosophila. Journal of Neurobiology. 52 (4), 302-311 (2002).
  40. Winbush, A., et al. Identification of gene expression changes associated with long-term memory of courtship rejection in Drosophila males. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 2 (11), 1437-1445 (2012).
  41. Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neuroscience. 10 (12), 1587-1593 (2007).
  42. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nature Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  43. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  44. Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (2), 105-111 (2013).
  45. Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 10 (10), 20140749 (2014).
  46. Greenspan, R. J., Ferveur, J. F. Courtship in Drosophila. Annual Reviews of Genetics. 34, 205-232 (2000).
  47. Scholz, H. Influence of the biogenic amine tyramine on ethanol-induced behaviors in Drosophila. Journal of Neurobiology. 63 (3), 199-214 (2005).

Tags

Atferd Problem 159 Etanol Drosophila melanogaster Fruktfly Atferdssensifilisering Disinhibition Frieri Octopamine Alkoholbruklidelse
Flypub å studere etanol indusert atferdshemming og sensitoring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delgado, N. M., Sierra, C. M.,… More

Delgado, N. M., Sierra, C. M., Arzola, A., Saldes, E. B., Han, K. A., Sabandal, P. R. Flypub To Study Ethanol Induced Behavioral Disinhibition and Sensitization. J. Vis. Exp. (159), e61123, doi:10.3791/61123 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter