Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

عالية الإنتاجية الكمية RT-PCR في عينات C. c.

Published: May 28, 2020 doi: 10.3791/61132
Automatic Translation
*1, *2,3,5, 1, 1, 1, 2,3,4, 1, 1
1Babraham Institute, 2Gurdon Institute, University of Cambridge, 3Department of Genetics, University of Cambridge, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute, 5Laboratory of Virology and Infectious Disease, The Rockefeller University
* These authors contributed equally

Summary

في هذه المقالة يتم وصف بروتوكول عالي الإنتاجية لتحديد سريع وموثوق به لمستويات التعبير الجيني في عينات C. elegans. لا يتطلب هذا البروتوكول عزل RNA وينتج cDNA مباشرة من العينات. ويمكن استخدامه جنبا إلى جنب مع منصات متعددة متعددة nanofluidic في الوقت الحقيقي عالية الإنتاجية.

Abstract

تقدم هذه الورقة نسخة معدلة كمية عالية الإنتاجية من PCR (RT-qPCR) لمقايسة Caenorhabditis elegans سريعة وقوية وحساسة للغاية. يحصل هذا البروتوكول على قياسات دقيقة للتعبير الجيني من الديدان المفردة أو من عينات كبيرة. البروتوكول المعروض هنا يوفر حداثة التكيف من الأساليب القائمة لإعداد الحمض النووي التكميلي (cDNA) مقرونة لمنصة نانوفلوريميك RT-qPCR. الجزء الأول من هذا البروتوكول، المسمى "Worm-to-CT"، يسمح بإنتاج الحمض النووي المباشر من الديدان الخيطية دون الحاجة إلى عزل الحمض النووي الريبي (MRNA) مسبقًا. يزيد من الإنتاجية التجريبية من خلال السماح بإعداد cDNA من 96 ديدان في 3.5 ساعة. ويستخدم الجزء الثاني من البروتوكول التكنولوجيا النانوية الحالية لتشغيل الـ RT-qPCR عالي الإنتاجية على نظام cDNA. هذه الورقة تقيم اثنين من رقائق نانولويديك مختلفة: الأول يدير 96 عينة و 96 هدفا، مما أدى إلى 9216 ردود فعل في ما يقرب من 1.5 أيام من benchwork. يتكون نوع الشريحة الثانية من ستة صفائف 12 × 12 ، مما أدى إلى 864 رد فعل. هنا، يتم إثبات طريقة الدودة إلى المقطعية من خلال قياس مستويات مرنا من الجينات ترميز البروتينات صدمة الحرارة من الديدان واحدة ومن عينات السائبة. المقدمة هي قائمة واسعة من التمهيديات المصممة لتضخيم الحمض النووي الريبي المجهزة لغالبية جينات الترميز داخل جينوم C. elegans.

Introduction

وكشف الأمثل من تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وqPCR أن النبضات النسخي أو رشقات نارية يمكن أن يؤدي إلى تباين هائل في عدد جزيئات الحمض النووي الريبي لكل خلية1. وعلاوة على ذلك، كشفت هذه التكنولوجيات عن عدم تجانس خلوي كبير لم يسبق أن فاتته القياسات القياسية لتكون الكميات الكبيرة. اعتمادا على السياق، بعض الخلية المفردة يحدث تقلب النسخ عن تكوين مختلط الخلوية الأنسجة. ومع ذلك، حتى في مجموعات الخلايا الأيزوجينية التي تزرع في ظل نفس البيئة هناك عدم التجانس النسخي واسع الانتشار2،3. يتم تحديد هذا "التغير البيولوجي" بشكل متزايد كخاصية في كل مكان من الشبكات الخلوية ، من البكتيريا إلى الإنسان. في بعض الحالات، يمكن أن يكون لها عواقب فينونتيبيك في التنمية، وتطور السرطان، الكمون فيروس نقص المناعة البشرية، والاستجابة للعلاج الكيميائي4،5.

الخيطية Caenorhabditis elegans هو كائن حي نموذج فريد مع خصائص مثالية لدراسة أسباب وعواقب التقلبات البيولوجية بين الأفراد. هذه الديدان الخيطية هي كائن حي نموذج بسيط يتكون من 959 خلية ، و بشرة شفافة تجعلها قابلة للتصوير في دراسات التصوير في الجسم الحي6. C. elegans هو نوع من الهرمفروديتيك الذي يتكاثر في الغالب من خلال الإخصاب الذاتي; وأدى ذلك إلى سلالات مختبرية ايزوجينية. على الرغم من الأيزوجينية وظروف الثقافة الخاضعة للرقابة ، فإن العديد من الأنماط الظاهرية والنصوص متغيرة عبر الأفراد ، مما يشير إلى أن الاختلافات العشوائية أو البيئة الدقيقة تساهم في عدم التغايرية عبر الأفراد7،8. مثل هذا التباين في التعبير الجيني له عواقب اللياقة البدنية متعددة، بما في ذلك التباين في البراعة من الطفرات، والبقاء على قيد الحياة، وتوقيت النمو، والتقيّد7،8،9. وبسبب هذه السمات، توفر دراسات الدودة الواحدة فرصة غير مسبوقة لدراسة التقلبات البيولوجية في كائن حي كامل.

هناك حاجة أساسية في هذا المجال لتطوير وتحسين التكنولوجيات للكشف الدقيق عن النصوص على مستوى دودة واحدة. تقنيات جديدة، مثل دودة واحدة RNA تسلسل10، الجيش الملكي النيبالي تسلسل من الأنسجة المعزولة11، وتسلسل وحيد الخلية12 متاحة الآن لC. elegans. ومع ذلك ، يبقى التحدي الرئيسي: عند رصد بينية ، الجينات التي أعرب عنها بشكل ضعيف غالبا ما تقع دون مستويات يمكن اكتشافها13. وهذا أمر ذو صلة خاصة بالنسبة للنصوص النادرة المعزولة عن كميات صغيرة من مواد البداية، حيث توجد علاقة راسخة ومعكوسة بين التعبير المتوسط والتباين التقني، مما يتسبب في كثير من الأحيان في انخفاض النسخ النادرة إلى ما دون القطع الإحصائي13. وقد ثبت أن الأمثل من التكنولوجيات ذات القدرة الإنتاجية عالية متعددة qPCR مفيدة للثدييات دراسات الخلية الواحدة، ولا سيما عند دراسة التعبير عن النصوص النادرة14،15. ويمكن استخدام هذه التكنولوجيا أيضا لأغراض القياس والتحقق من التكنولوجيات الأخرى ذات الديدان الواحدة.

Worm-to-CT هو طريقة سريعة وقوية مقتبسة من مجموعة تستخدم في دراسات بيولوجية الخلية، لإعداد cDNA أحادي الدودة. تم اختيار cDNA التي تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة إلى جانب تقنية qPCR النانوية المتعددة لأنها توفر إنتاجية تجريبية أعلى ، وهي مجموعة ديناميكية أوسع من الكشف وتم التحقق من صحة أغراض الخلية الواحدة14،15. كما أن إعداد نظام CDNA الموصوف ينطبق أيضاً على الاستخدام مع التكنولوجيات القياسية ل PCR. يتم زيادة الإنتاجية بطريقتين: أولاً ، إعداد cDNA أسرع وأكثر موثوقية من استخراج الـ guanidium thiocyanate-phenol-chloroform التقليدي ، لأن الديدان تضاف مباشرة إلى حاجز التحلل ، مما يتخطى العزل المباشر للرنا القابل للتحلل بسهولة. وثانيا، يؤدي استخدام تكنولوجيات النانو فلوريد إلى زيادة كبيرة في عدد العينات والأهداف التي يمكن تشغيلها في وقت واحد. في هذه الورقة، يتم مقارنة ورقتين: شريحة صفيف واحد ورقاقة متعددة الصفيف. يمكن لشريحة صفيف واحد تشغيل 96 ديدان واحدة و 96 مجموعة التمهيدي، مما أدى إلى 9216 ردود فعل لكل تجربة. ولتحقيق إنتاجية مماثلة باستخدام تقنيات qPCR القياسية سيتطلب 96 تجربة QPCR منفصلة، وذلك باستخدام 96 لوحة بئر. أصغر وأكثر مرونة رقاقة متعددة الصفيف يتكون من ستة 12 × 12 صفائف مما أدى إلى 864 ردود فعل. يتم تعزيز موثوقية الأسلوب الفائق وحساسية بواسطة تكنولوجيا النانو فلوريد والبدء في خطوة قبل التضخيم. ومن المفترض أن تستخدم الطريقة المعروضة في هذه الورقة مع خوارزمية إحصائية حديثة لاستخراج التباين البيولوجي. يقدم هذا المقال بروتوكول إعداد cDNA السريعة و qPCR عالي الإنتاجية لكل من دودة مفردة و مجموعة من عينات الفيروس المتنقل; سيتم نشر الخوارزمية في مكان آخر. لهذا البروتوكول، ينبغي إعداد تنظيم كل رقاقة قبل التجربة. يعرض الجدول 1 والجدول 2 أمثلة من هذه الخطط لرقاقة صفيف متعدد و صفائف مفردة، على التوالي. وهناك أيضاً نظرات عامة عن بروتوكول Worm-to-CT المفصل في الشكل 1 وتشغيل الرقاقات متعددة الصفيف والصفيف الواحد في الشكل 2.

Protocol

ملاحظة: في جميع أنحاء هذا البروتوكول يشار إلى elegans Caenorhabditis باسم "دودة" أو "الديدان". يمكن طلب مجموعة متنوعة من سلالات C. elegans من خلال قواعد البيانات عبر الإنترنت أو عن طريق الاتصال مباشرة بالمختبرات التي تستخدم الكائن الحي النموذجي. ويصف الجزء الأول من هذا البروتوكول (الأقسام 1-3) إعداد الـ cDNA من خلال بروتوكول الدودة إلى المقطع المقطعي. يصف الجزء الثاني من هذا البروتوكول (الأقسام 4-13) تشغيل الـ RT-qPCR عالي الإنتاجية باستخدام نانوفليديات، مقتبس من بروتوكول تم تطويره من قبل Fluidigm16. ينطبق هذا البروتوكول على استخدام نوعين من رقائق النانوfluidic المحددة في وقت سابق، رقاقة صفيف واحد، والتي يمكن رصد 96 هدفا في 96 عينة (9216 ردود فعل RT-qPCR المجموع)، أو رقاقة متعددة الصفائف، والتي تعمل كيونيتين فرعيتين من 12 هدفا × 12 عينة. تحتوي كل شريحة صفيف متعددة على ستة صفائف مستقلة يمكن تشغيلها معاً أو بشكل منفصل. على سبيل المثال، يمكن استخدام شريحة متعددة الصفائف بأكملها مراقبة 72 هدفاً × 12 عينة (أو العكس)، أو 36 هدفاً × 24 عينة (أو العكس بالعكس). لمزيد من المعلومات حول أي من المواد المستخدمة في هذا البروتوكول، راجع جدول المواد.

1. التحقق من صحة التمهيدي RT-qPCR

ملاحظة: تم تصميم التمهيديات في الوقت الحقيقي على أساس الخصائص الموصى بها التي تم إصدارها في الأصل بواسطة إرشادات MIQUE17. لجعل التمهيدي محددة لرنا المعالجة، تم تصميم المنتجات بحيث التمهيديين اثنين ملزمة إلى جانبي واحد على الأقل وصلة لصق. وشملت متطلبات التمهيديات المناسبة 20٪ -80٪ من محتوى الجوانين والسيتوسين، ودرجة حرارة ذوبان 58-60 درجة مئوية، واختلاف في درجة حرارة الذوبان بين أزواج التمهيدي من ≤0.5 درجة مئوية وطول المنتج من 70-120 bp. يمكن العثور على تسلسل التمهيديات التي تم إنشاؤها في الجدول الإضافي 1. يمكن العثور على شفرة المصدر المفتوح للبرامج النصية المستخدمة لإنشاء الأحرف الأولية في https://github.com/s-andrews/wormrtpcr. تم تصميم أزواج التمهيدي للنصوص مع مواقع لصق بحيث أنها تقع في اثنين من exons يحيط intron ولكن لم تكن مصممة لتكون لصق البديل محددة، وذلك باستخدام برنامج انفجار NCBI التمهيدي18. لهذه الدراسة، تم تفجير مجموعات التمهيدي ضد الجينوم C. elegans لاختبار أي التكامل خارج الهدف.

  1. استرداد التمهيدي من قاعدة البيانات التمهيديات RT-qPCR (الجدول التكميلي 1). بدلا من ذلك ، تصميم qPCR أزواج التمهيدي باستخدام أدوات على الانترنت مثل NCBI التمهيدي انفجار18.
  2. تنفيذ منحنى معيار qPCR لمراقبة خصوصية وكفاءة PCR لكل زوج من التمهيدي باستخدام معيار الحجم19 qPCR تقنيات واتباع المبادئ التوجيهية MIQUE17،20.
    ملاحظة: يجب استخدام أزواج التمهيدي فقط مع R2 > 0.98 و PCR الكفاءة بين 85٪ و 115٪. وترد تفاصيل التسلسل وكفاءة PCR وR2 للشعيرات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 3.

2. تحلل دودة من خلال دودة إلى CT

  1. اختيار الديدان من الحديقة البكتيرية على لوحة NGM الطازجة وغير المصنفة والسماح للدودة للتحرك حول لوحة لمدة 5 دقائق لإزالة معظم البكتيريا من الدودة من خلال حركتها.
    ملاحظة: سوف تختلف الحديقة البكتيرية وظروف النمو اعتمادا على التصميم التجريبي. التجارب المعروضة هنا تتطلب 6 سم لوحات NGM بذر مع OP50 Escherichia القولونية مع الديدان من الفائدة نمت إلى المرحلة L4.9 في حاضنة 20 درجة مئوية.
  2. في غطاء محرك السيارة الخالية من RNase، قم بإعداد مزيج رئيسي يتكون من 12.5 ميكرولتر من 2x RT buffer، و1.25 ميكرولتر من 20x RT إنزيم العازلة، و0.25 ميكرولتر من المياه الخالية من النوى لكل عينة. أضف 14 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى 11 ميكرولتر من كل عينة من الخطوة 2.8.
  3. ضع غطاء شريط PCR رأسًا على عقب على منصة نطاق التشريح وأضف 10 ميكرولتر من مزيج التحلل إلى أغطية أنابيب PCR المقببة تحت مجهر مركب.
    ملاحظة: مع عينة واحدة أو اثنتين فقط، من الأفضل استخدام شريط PCR يحتوي على أربعة أنابيب على الأقل، لأن هذا يقلل من خطر النفخ قبعات مفتوحة في الخطوات تجميد ذوبان لاحقة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام الأربطة المطاطية لعقد القبعات في مكان. في هذه الحالة ضمان قبعات مغلقة بشكل صحيح في كل مرة يتم نقل الأنابيب.
  4. اختيار الديدان من لوحة في كل فتحة من الغطاء التي تحتوي على مزيج تحلل عن طريق "يغرف" لهم (أي، اصطياد الديدان تحت مع اختيار) لتجنب التلوث البكتيري. إغلاق الأنابيب وتدور عليها لمدة 5 ق باستخدام الطاولة microcentrifuge(جدول المواد)قبل وضعها في قارورة ديوار مليئة النيتروجين السائل.
    ملاحظة: يجب استخدام بين 15 و30 الديدان للتجارب السائبة و دودة واحدة لقياسات دودة واحدة.
    تنبيه: عند التعامل مع النيتروجين السائل ارتداء قفازات كريو وكذلك النظارات الواقية والالتزام بلوائح الملابس القياسية، وذلك لأن الاتصال مع الجلد أو العينين يمكن أن يسبب إصابة قضمة الصقيع خطيرة.
  5. تجميد ذوبان أنابيب PCR 10x عن طريق نقلها بين النيتروجين السائل وحمام الماء ~ 40 درجة مئوية. اترك الأنابيب في النيتروجين السائل لمدة 5 ق كحد أدنى لضمان تجميد العينات تمامًا. ترك الأنابيب في حمام الماء حتى تذوب العينات. لا تترك في لفترة أطول، لأن هذا يؤدي إلى تدهور RNA.
    ملاحظة: يمكن ترك الأنابيب في النيتروجين السائل لفترة طويلة من الزمن، حيث يتم تجميد العينات إلى حوالي -200 درجة مئوية، مما يقلل من تدهور الحمض النووي الريبي. ولكن لا ينبغي أن يكون هذا نقطة توقف بروتوكولية، لأن النيتروجين السائل يتبخر بسرعة.
  6. مزيج العينات على خلاط الحرارية (جدول المواد) تعيين في 4 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة بالتناوب في ~ 1800 دورة في الدقيقة.
  7. في حين يتم خلط العينات، ذوبان محلول التوقف على الجليد.
  8. تدور العينات إلى أسفل باستخدام الطاولة microcentrifuge(جدول المواد)وإضافة 1 ميكرولتر من وقف الحل لكل أنبوب.
    ملاحظة: يمكن ترك العينات عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل عكس رنا (القسم 3).

3. النسخ العكسي

ملاحظة: للنسخ العكسي للدودة الواحدة، تم إنشاء النتائج الموضحة هنا باستخدام الكواشف المقدمة مع رقائق النانو فلوريد (الخيار 2 في الشكل 1). كما استُخدمت الكواشف التي تم إبرازها في الخيار 2 من الشكل 1 في النسخ العكسي للعينات المجمّعة. يعمل أسلوب إما تبادل لأنواع مختلفة من العينة.

  1. النسخ العكسي للدودة الواحدة
    1. في غطاء محرك السيارة الخالية من RNase، أضف 1.25 ميكرولتر من مزيج النسخ العكسي(جدول المواد)إلى أنبوب PCR جديد.
      ملاحظة: يمكن استخدام لوحة PCR 96 بشكل جيد وماصة تلقائية إذا كان هناك العديد من العينات. ينص بروتوكول الشركة المصنعة على أنه يمكن استخدام 1 ميكرولتر لكل عينة.
    2. خذ 5 ميكرولتر من محلول التحلل وأوقف مزيج الحل من الخطوة 2.8 وأضفه إلى أنبوب PCR الطازج الذي يحتوي على مزيج النسخ العكسي.
      ملاحظة: ينص بروتوكول الشركة المصنعة على أنه يمكن استخدام 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (2.5 pg/μL-250 ng/μL) لكل تفاعل. ويمكن إضافة التحكم RT السلبية في لوحة عن طريق استبدال مزيج النسخ العكسي مع 5 ميكرولتر من عينة lysed و 1.25 ميكرولتر من المياه RNAse خالية.
    3. تشغيل العينات باستخدام برنامج النسخ العكسي التالي على دراجة الحرارة: 25 °C لمدة 5 دقائق، 42 °C لمدة 30 دقيقة، 85 °C لمدة 5 دقائق و 4 °C (4) ∞.
      ملاحظة: يمكن تخزين الـ cDNA المنتجة عند -20 درجة مئوية قبل الشروع في التضخيم وجمع البيانات باستخدام qPCR عالي الإنتاجية.
  2. النسخ العكسي للعينات السائبة (15−30 ديدان)
    1. في غطاء محرك السيارة الخالية من RNase، قم بإعداد مزيج رئيسي يتكون من 12.5 ميكرولتر من 2x RT buffer، و1.25 ميكرولتر من 20x RT إنزيم العازلة، و0.25 ميكرولتر من المياه الخالية من النوى لكل عينة. أضف 14 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى 11 ميكرولتر من محلول التحلل وتوقف عن مزيج الحل من الخطوة 2.8.
      ملاحظة: عند التعامل مع عدد كبير من العينات يمكن تنفيذ هذا في 96 لوحات جيدا.
    2. تشغيل العينات من خلال thermocycler باستخدام برنامج النسخ العكسي التالي: 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، و 4 درجة مئوية ∞.
    3. تخفيف إنتاج cDNA 1:4 في المياه الخالية من النوى.
      ملاحظة: عموما، تأتي المنتجات إلى حجم النهائي من 25 μL، وفي هذه الحالة ينبغي إضافة 75 μL. ومع ذلك، بسبب التكثيف يمكن أن يتفاوت الحجم النهائي. لذلك، ضبط وفقا لذلك لجعل نسبة 1:4 في الحل النهائي. لا تنطبق خطوة التخفيف هذه إذا كان تنفيذ qPCR على الديدان الفردية. ويمكن تخزين نا ن التي تنتج في -20 درجة مئوية قبل الشروع في التضخيم وجمع البيانات باستخدام qPCR عالية الإنتاجية.

4. إعداد مزيج متعدد التمهيدي

  1. إعداد الأسهم التمهيدية للأمام /العكسي (F/R) لكل زوج من ال التمهيديات بتركيز نهائي 50 ميكرومتر. اخلط نفس حجم ال التمهيديات الأمامية والناية في 100 ميكرومتر لكل من الـ 100 ميكرومتر.
  2. الجمع بين 1 μL من 50 μM F / R التمهيدي الأسهم لكل زوج التمهيدي لاختبارها. أضف مخزن تعليق الحمض النووي يصل إلى حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر.
    ملاحظة: تختلف تركيزات التمهيدي المخزون هنا عن تلك الموضحة في بروتوكول الشركة المصنعة16 ولكنها تحتفظ بنفس التركيز النهائي 500 ن م.

5- استهداف ما قبل التضخيم المحدد

  1. إعداد مزيج رئيسي يحتوي على 1 ميكرولتر من ماجميكس preamplification(جدول المواد)،0.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي المجمع (الخطوة 4.2)، و 2.25 ميكرولتر من المياه الخالية من النوى لكل تفاعل مع حجم فائض إجمالي 10٪.
  2. في 96 بئر لوحة، aliquot 3.75 ميكرولتر من مزيج رئيسي في أكبر عدد من الآبار كما هو مطلوب لعدد العينات التي سيتم تشغيلها.
  3. إضافة 1.25 μL من حلول cDNA من الفائدة التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.1.3 أو 3.2.3 إلى كل بئر.
  4. تغطية لوحة مع 96 جيدا ختم الشريط، دوامة لفترة وجيزة، والطرد المركزي مع الدوار لوحة الطاولة. نقل إلى ثيرموسيفير وتشغيل البرنامج التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 15 دورات من الdenaturation في 95 درجة مئوية لمدة 15 s، الحنيع / التمديد في 60 درجة مئوية لمدة 4 دقائق، و 4 درجة مئوية ∞.
    ملاحظة: توصي الشركة المصنعة من 10−20 دورات لتفاعل الـ preamplification16. يوصي هذا البروتوكول 10 أو 15 دورات اعتمادا على مستويات التعبير للجينات المستهدفة.

6. Exonuclease I العلاج

ملاحظة: هذا لإزالة التمهيديات غير مدمجة من preamplification.

  1. إعداد exonuclease I مزيج يحتوي على 0.2 ميكرولتر من exonuclease I العازلة رد فعل(جدول المواد)،0.4 ميكرولتر من exonuclease I في 20 U/μL(جدول المواد)،و 1.4 ميكرولتر من المياه خالية من النيوكلاز لكل عينة. إبقاء جميع الكواشف على الجليد، وخاصة exonuclease I.
  2. إزالة لوحة 96 جيدا (الخطوة 5.4) من الدراجات الحرارية، والطرد المركزي مع الدوار لوحة الطاولة، وإزالة الختم بعناية. إضافة 2μL من exonuclease أنا مزيج لكل تفاعل preamplification. إعادة السيان، الطرد المركزي، ووضع لوحة 96 جيدا مرة أخرى إلى الدراجات الحرارية باستخدام البرنامج التالي: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، و 4 درجة مئوية ∞.
  3. أخذ العينات من ثيرموسيفير وتمييع لهم 1:5 عن طريق إضافة 18 μL من 1x تريس EDTA العازلة (جدول المواد).
    ملاحظة: من الممكن الاحتفاظ بعينات cDNA عند -20 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق. يقترح بروتوكول الشركة المصنعة التخفيفات المحتملة من 5x أو 10x أو 20x في هذه المرحلة16، اعتمادًا على مستوى التعبير عن أهداف الاهتمام.

7. إعداد خلطات التشايس

ملاحظة: يمكن إعداد خلطات المعايرة في 384 لوحة بئر، حيث أن الآبار لها نفس التباعد مثل رقائق النانولوريديك، مما يجعل التحميل أسهل.

  1. إعداد خلطات فحص لشريحة متعددة الصفيف
    1. إعداد مزيج رئيسي يتكون من 2 ميكرولتر من 2x مُعَشف التحميل(جدول المواد)و 1.6 ميكرولتر من العازلة تعليق الحمض النووي(جدول المواد)لكل بئر وفقا للخطة المعدة. Aliquot 3.6 μL من هذا المزيج الرئيسي في البئر في لوحة 384 جيدا.
    2. إضافة 0.4 ميكرولتر من 50 ميكرومتر F / R التمهيدية المعدة في الخطوة 4.1 إلى الآبار المناسبة وفقا للخطة المعدة.
      ملاحظة: يوفر هذا ما مجموعه 4 ميكرولتر من مزيج المقايسة في البئر، مع فائض 1 ميكرولتر.
  2. إعداد خلطات فحص لشريحة صفيف واحد
    1. إعداد مزيج رئيسي يتكون من 3 ميكرولتر من 2x مُعَد التحميل و 2.4 ميكرولتر من العازلة تعليق الحمض النووي لكل بئر وفقا للخطة المعدة. Aliquot 5.4 μL من هذا المزيج الرئيسي في البئر إلى لوحة 384 ملحوظ.
    2. إضافة 0.6 ميكرولتر من مخزون 50 ميكرومتر F / R التمهيدي إلى الآبار المناسبة وفقا للخطة المعدة.
      ملاحظة: يوفر هذا ما مجموعه 6 ميكرولتر من مزيج المقايسة في البئر، مع فائض 1μL.

8. إعداد خلطات العينة

ملاحظة: يمكن إعداد الخلطات العينية حتى يوم واحد مقدمًا وتخزينها عند 4 درجات مئوية.

  1. إعداد العينات لرقاقة متعددة الصفيف
    1. إعداد مزيج سيد عينة تتكون من 2 ميكرولتر من 2X مسبار الفلورسنت supermix مع ROX منخفضة (جدول المواد)و 0.2 μL من كاشف العينة(جدول المواد)لكل عينة. الاستغناء 2.2 μL من هذا المزيج في لوحة 384 ملحوظ جيدا.
      ملاحظة: توصي الشركة المصنعة بعدم دوامة العينة الكاشف16.
    2. Pipette 1.8 μL من كل preamplified، exonuclease أنا تعامل عينة من الخطوة 3.2.3 إلى الآبار المناسبة وفقا للخطة المعدة.
      ملاحظة: هذا يعطي ما مجموعه 4 ميكرولتر، مع فائض 1μL.
  2. إعداد عينات لرقاقة صفيف واحد
    1. إعداد مزيج سيد عينة تتكون من 3 ميكرولتر من 2x مسبار فلوري supermix مع ROX منخفضة (جدول المواد) و 0.3 ميكرولتر من 20x DNA-صبغة ربط حامل العينة (جدول المواد) لكل عينة. الاستغناء 3.3 μL من هذا المزيج في لوحة 384 ملحوظ جيدا.
    2. Pipette 2.7 μL من كل preamplified و exonuclease أنا تعامل عينة من الخطوة 6.3 إلى الآبار المناسبة وفقا للخطة المعدة.
      ملاحظة: هذا يعطي ما مجموعه 6 ميكرولتر، مع فائض 1μL. إذا كان هناك أي آبار ليتم تشغيلها دون عينة يجب أن تكون محملة هذه مع مزيج سيد عينة و 2.7 μL من الماء بدلا من cDNA. هذا هو الموصى بها لكلا أنواع رقاقة. الجهاز يحتاج إلى ROX منخفضة في كل مدخل من أجل الكشف عن شبكة رقاقة.

9. فتيلة رقاقة nanofluidic

ملاحظة: تحتاج شريحة صفيف متعددة فقط إلى أن تكون معد على تشغيل الأول. إذا كان هناك أشواط لاحقة من نفس الشريحة يمكن تخطي هذه المرحلة. هذه الخطوات هي نفسها لكلا النوعين رقاقة.

  1. ببطء وبعناية، وحقن كامل 150 ميكرولتر من السائل خط التحكم من المحاقن المدرجة في مراكم الرقاقة. تأكد من عدم وجود سائل تحكم يلمس الرقاقة من خلال حمل الشريحة بزاوية 45 درجة وإبعاد طرف الحقنة لتجنب الانسكاب.
  2. إزالة فيلم واقية زرقاء من الجزء السفلي من رقاقة.
  3. ضع الرقاقة في آلة فتيلة NANOFLUIDICS PCR (جدول المواد) ، مع الباركود الذي يواجه الخارج. تشغيل'رئيس الوزراء (153x)' ' البرنامج النصي، الذي يستغرق ~ 15-20 دقيقة.
    ملاحظة: تشغيل الدراجات الحرارية نانوفلوريوديس(جدول المواد)في هذه المرحلة، لأن الكاميرا يستغرق حوالي 10 دقيقة لتبرد إلى أقل من 0 درجة مئوية.

10. تحميل رقاقة nanofluidic

  1. قم بإزالة المقابس الحاجزة بشكل تسلسلي أثناء التحميل. وهذا يقلل من فرصة سوء تحميل الآبار.
  2. نقل إما 3 ميكرولتر لرقاقة متعددة الصفائف أو 5 ميكرولتر لرقاقة صفيف واحد من كل خلطات التمهيدي وخلط العينة إلى المداخل المقابلة من رقاقة nanofluidic وفقا للخطة المعدة. تأكد من عدم إدخال الفقاعات، والتي يمكن أن تسبب حجم الإجمالي نقل لتكون أصغر من المطلوب.
    ملاحظة: إذا كان هناك أي آبار التي سيتم تشغيلها بدون التمهيدي من المهم لهذه أن تكون محملة مع مزيج الرئيسي، والاستعاضة عن حجم التمهيدي مع الماء. ينطبق هذا على كلا النوعين من الشرائح. في هذه المرحلة، يمكن أن يكون من الأسهل وضع رقاقة على سطح مظلم، والتي سوف تسمح للآبار أن ينظر إليه بسهولة أكبر.

11. تشغيل رقاقة nanofluidic

ملاحظة: في المرة الأولى تشغيل شريحة صفيف متعددة إعداد ملف التعقب عن طريق تحديد أدوات | تتبع الاستخدام فليكس ست، انقر فوق جديد، أدخل اسم ملف، وحدد موقعًا قبل النقر فوق تم.

  1. افتح برنامج جمع البيانات. انقر فوق بدء تشغيل جديد. ضع الرقاقة المحملة في ثيرموسل النانولوريديات مع الباركود الذي يواجه الخارج.
  2. اختر إعداد المشروع إذا كان قابلاً للتطبيق، ثم انقر فوق التالي | تحميل. إذا كان تحميل شريحة صفيف متعددة، حدد الأقسام (صفائف) ليتم تشغيلها.
  3. حدد التطبيق المرجعي تحقيقات، ثم تغيير نوع التطبيق إلى تعبير جيني، وتغيير المرجع السلبي إلى ROX. حدد اختبار التحقيق المفرد، ثم غير نوع المسبار إلى إيفا غرين، وانقر فوق التالي.
  4. حدد بروتوكول الدراجات الحرارية GE FLEX ستة PCR سريع + Melt v1 لتشغيل شريحة متعددة الصفيف، أو بروتوكول GE 96.96 سريع PCR + Melt v2 لتشغيل شريحة صفيف واحد.
  5. تأكد من تحديد التعريض الضوئي التلقائي وانقر فوق بدء تشغيل.

12. آخر تشغيل رقاقة

ملاحظة: هذا المقطع ضروري فقط لرقائق متعددة الصفيف عند عدم استخدام الشريحة بأكملها.

  1. اتخاذ رقاقة من الدراجات الحرارية nanofluidics وتحميل في nanofluidics PCR آلة فتيلة وتشغيل آخر تشغيل (153x) النصي، الذي يستمر 5 دقائق.
  2. تسمية المقابس المستخدمة للرجوع إليها الشخصية.
    ملاحظة: يمكن الآن تخزين الشريحة في درجة حرارة الغرفة ويمكن تشغيل الصفائف المتبقية على الشريحة في غضون شهرين.

13- تنظيف البيانات وتحليلها

  1. فتح البيانات في 'في الوقت الحقيقي PCR تحليل' البرمجيات ( جدولالمواد). تحقق من درجة حرارة الذروة ذوبان لكل زوج التمهيدي اختبارها. القضاء على النتائج التي تظهر أكثر من ذروة درجة حرارة ذوبان واحد، لزوج التمهيدي معين.
    ملاحظة: تظهر قمم متعددة فقط في بعض الأحيان، يفترض عندما أشكال أزواج التمهيدي dimers، أو من التفاعلات التمهيدي الهدف مع التمهيديات الأخرى في مزيج التمهيدي المجمعة.
  2. تصدير البيانات كملف جدول بيانات "heatmap" وإزالة العينات الفاشلة أو التمهيدي.
  3. تحليل البيانات باستخدام أسلوب Delta-Ct القياسي21. للتقييم الإحصائي تنفيذ ANOVA في اتجاه واحد على مستويات التعبير النسبي.

Representative Results

التحقق من صحة Worm-to-CT كأسلوب إعداد cDNA

لاختبار ما إذا كان بروتوكول Worm-to-CT هو أسلوب استخراج cDNA صالح، تمت مقارنتها بأساليب استخراج الـ guanidium thiocyanate-phenol-chloroform القياسية. وتظهر النتائج في الشكل 3، حيث تم إعداد cDNA من متوسط 1000 ديدان باستخدامتقنيات استخراج الدودة من الدودة إلى المقطعية القياسية. وكانت العينات الحرارة صدمت في وقت واحد (30 دقيقة في 34 درجة مئوية). وعلى الصعيد العالمي، كانت مستويات التعبير عن الحمض النووي الريبي HSP-70 لكل 100 نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي قابلة للمقارنة باستخدام كلتا الطريقتين. ومع ذلك، في حالة أعلى تعبير hsp-70 (أي، في N2 بعد الصدمة الحرارية) كانت مستويات التعبير أعلى مع طريقة Worm-to-CT، مما يشير إلى حساسية محسنة.

لتحديد ما إذا كان الانخفاض المتوقع في التعبير hsp في hsf-1 (sy441)23، طفرة في المنظم النسخي الرئيسي من المرافقين الجزيئية23،24، يمكن أن تتكرر ، تم مقارنة التعريفي مرافق النسخ بعد صدمة حرارية قصيرة. مع كلا الأسلوبين تم الكشف عن انخفاض في التعريفي hsp-70 في الحيوانات hsf-1 (sy441). وكان هذا متوقعا، لأن الحيوانات المتحولة hsf-1 (sy441) تظهر قدرة أقل على الحث المرافقين بسبب اقتطاع في مجال تنشيط HSF-1. لguanidium thiocyanate-الفينول-الكلوروفورم استخراج hsp70 انخفض بنسبة 82.7٪ مقارنة بالضوابط و 92.3٪ للدودة إلى CT مقارنة بالحيوانات من النوع البري(الشكل 3). وكانت النتائج قابلة للمقارنة بين كلا الأسلوبين وقابلة للمقارنة مع التقارير السابقة23. وتشير هذه النتائج إلى أن الأسلوب Worm-إلى-CT هو بديل صالح لتقنيات التوليف القياسية لـ cDNA.

التحقق من صحة منصة PCR نانوفليديcs المستخدمة لتضخيم أهداف الميرنا

لاختبار اتساق النتائج باستخدام qPCR nanofluidic لتضخيم النص، تم مقارنة نتائج PCR التي تم الحصول عليها من طريقة الدودة إلى المقطعية السائبة على كل من نظام qPCR القياسي(جدول المواد)ونظام qPCR نانوفلوريميك باستخدام شريحة متعددة الصفيف. تم رصد التغيير أضعاف في التعبير عن ثلاثة جينات مختلفة، sma-3 (الشكل 4A)، sma-10 (الشكل 4B)، وdnj-26، فيالحيوانات (الشكل 4C)في الحيوانات التي تحمل أليل فارغة في dbl-1 (dbl-1(nk3))25 مقارنة مع نظرائهم من النوعالبرية. Dbl-1 ترميز الرباط الوحيد للبروتين مورفوجينتيك العظام (BMP) يشير المسار. sma-3 و sma-10 هي الجينات ترميز SMAD orthologues، والمكونات الرئيسية لسلسلة إشارات BMP. Dnj-26 ترميز مرافق الجزيئية، وهو هدف من إشارات BMP. تظهر هذه النتائج القليل أو لا يوجد فرق في تغيير أضعاف مقارنة نتائج الطريقتين، مما أدى إلى قيم P غير كبيرة في 0.3113، 0.2635، و 0.3481 لsma-3، sma-10، وdnj-26،على التوالي. وإجمالاً، تظهر هذه النتائج أن طريقة الدودة إلى التصوير المقطعي المطبقة على العينات السائبة هي طريقة فعالة وسريعة لاستخراج الحمض النووي الريبي من عدد قليل من الديدان وتوفر بيانات موثوقة عندما تقترن إما بأنظمة PCR القياسية أو منصات qPCR القائمة على النانولويديك عالية الإنتاجية.

مقارنة بين مستويات التعبير التي تم الحصول عليها بواسطة عينات مجمعة مع متوسطات تم الحصول عليها من الديدان الفردية

تم حساب مستويات التعبير النسبي باستخدام إما cDNA التي تم الحصول عليها من عينات كبيرة (25 ديدان) أو من متوسط 36 عينة دودة واحدة(الشكل 5). تم الحصول على كل من cDNAs باستخدام طريقة الدودة إلى المقطعية وتضخيمها باستخدام تقنية NANOFLUIDIcs PCR. كما هو ملاحظ في الشكل 5A-C، لجميع المرافقين اختبارها (أي hsp16.1، F44E5.4 ، hsp-70)، الأساليب الكشف عن مستويات التعبير مقارنة. وتشير هذه النتائج إلى أن المعلمات التي تم الحصول عليها من الديدان المفردة موثوقة.

تطبيق Worm-to-CT إلى تكنولوجيا nanofluidics لتقدير معلمات التعبير الجيني أحادي الدودة

لأن شريحة صفيف واحد يسمح رصد ما يصل إلى 96 نسخة الهدف على 96 عينة فردية، وبالتالي فهي مناسبة تماما لرصد التباين الفردية في التعبير عن نسخة بين الديدان واحدة. الشكل 6A يعرض نتيجة تمثيلية تظهر التعبير المتوسط للنصوص hsp متعددة من الديدان واحدة بعد صدمة الحرارة قصيرة. وكما لوحظ في الشكل، فإن التباين في التعبير عن النصوص يختلف بشكل كبير عبر جينات مختلفة(الشكل 6A). للحصول على مزيد من البصيرة، تم حساب معامل التباين (CV) بقسمة الانحراف المعياري على متوسط مستويات التعبير26 (الشكل 6B). ورصدت ثلاث جينات تم تقدير قيم السيرة الذاتية الخاصة بها في السابق بطرق بديلة (بيانات غير منشورة). اثنين من النصوص مستقرة(ife-1 و Y45F10D.4)ومتغير واحد(nlp-2927)أظهرت تقلبها المتوقع. كما أن الرسم البياني يصور بوضوح العلاقة العكسية المعروفة بين قيم التباين ومستويات التعبير26 (الشكل 6B).

وتُعَد النسخ المتماثلة التقنية ذات أهمية قصوى لضمان قابلية التكاثر عند استخدام عينات كبيرة. ومع ذلك، ليس هذا هو الحال بالضرورة بالنسبة للتجارب خلية واحدة14،15،28. ولتحديد ما إذا كان استخدام النسخ المتماثلة التقنية ضرورياً لتقدير المعلمات عند استخدام عينات دودة واحدة، تم حصاد 28 ديدان فردية، بعد صدمة حرارية قصيرة، ومعالجتها باستخدام ثلاث نسخ تقنية. تمت مقارنة قيم السيرة الذاتية المحسوبة من بيانات الدودة الواحدة التي تم الحصول عليها في ثلاث نسخ (النقاط الزرقاء في الشكل 7، السيرة الذاتية التقنية) مقابل تلك لكل نسخة تم الحصول عليها من الديدان الفردية (النقاط الحمراء في الشكل 7، التغير البيولوجي). وبالنسبة لكل نسخة تم اختبارها، كانت السيرة الذاتية التقنية أقل من السير الذاتية البيولوجية، مما يشير إلى أن ثلاث نسخ تقنية غير مطلوبة لتقدير البارامترات. إن عدم الحاجة إلى تكرارات تقنية يزيد من سرعة نقل التجربة دون المساس بالجودة.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول Worm-to-CT.
يظهر هذا الشكل نظرة عامة مختصرة عن الخطوات المختلفة المطلوبة لتشغيل الديدان من خلال بروتوكول Worm-to-CT. يتم عرض طريقتين اختياريتين لخطوة النسخ العكسي; هذه هي أساليب قابلة للتبديل لأي نوع من شرائح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نظرة عامة على إعداد وتشغيل qPCR نانولويديك.
هذا الرقم يصور الاستعدادات لتشغيل نظام qPCR nanofluidic باستخدام رقاقة متعددة الصفيف وشريحة صفيف واحد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يوفر بروتوكول الدودة إلى المقطع المقطعي المحوسب على عينات الكميات الكبيرة نتائج موثوقة.
مقارنة بين بروتوكول Worm-to-CT مقابل استخراج الـ guanidium thiocyanate-الفينول-الكلوروفورم العادي22 على عينات كبيرة. بما يتفق مع النتائج السابقة, في hsf-1(sy441) المسوخ23, انخفضت مستويات النصوص hsp استجابة لصدمة الحرارة. يصور المدرجات أعلاه تحريض hsp-70 في غياب (-)، أو التالية (+) صدمة قصيرة الحرارة من 30 دقيقة عند 34 درجة مئوية. تم الحصول على cDNA باستخدام استخراج ثيوسيانات البكتيريا من الـ guanidium thiocyanate-phenol-chloroform المطبق على 1000 ديدان (إلى اليسار) أو باستخدام طريقة الدودة إلى التصوير المقطعي (Worm-to-CT) المطبقة على 30 ديدان مجمعة (يمين). قورنت مستويات التعبير من hsp-70 لكل 100 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من قبل كل طريقة. كما هو متوقع، في hsf-1 (sy441) الحث النسخي من hsp-70 استجابة لصدمة الحرارة انخفضت بشكل ملحوظ بنسبة 82.7٪ باستخدام ثيوسيانات غوانيديوم-الفينول-الكلوروفورم و 92.3٪ باستخدام طريقة الدودة إلى CT. تم تطبيع مستويات مررنا من الجينات المستهدفة ضد متوسط الجينات التدبير المنزلي الثلاثة CDC-42، pmp-3، وire-1. كل نقطة تمثل تكرار بيولوجي. وقد تم تحويل البيانات إلى التحليل الإحصائي، لأنها لا تفي بالاتفاقيات اللازمة للتحليل البارامتري. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA RM-One-Way باستخدام اختبار المقارنات المتعددة من Sidak. نوع البرية = N2، hsf-1 = hsf-1 (sy441). تشير الأشرطة إلى الخطأ القياسي للـ Mean. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: كانت أنماط التعبير متسقة بين أنظمة qPCR القياسية وأنظمة qPCR النانوية.
(أ) تم تحديد مستوى التعبير من sma-3 (A)، sma-10 (B) أو dnj-26 (C) مرنا من خلال QPCR العادية وqPCR nanofluidic (رقاقة متعددة الصفيف) من ثلاثة يكرر البيولوجية من cDNA ولدت من خلال دودة إلى CT من سلالة نوع البرية (N2) وdbl-1 (nk3) سلالة بالضربة القاضية25. تم تحديد مستويات التعبير النسبية لـ mRNA لكل سلالة باستخدام طريقة Delta-Ct21. ثم تم تحديد تغيير أضعاف عن طريق تقسيم مستويات التعبير التي تم الحصول عليها في الديدان dbl-1(nk3) من قبل مستويات مرنا المقابلة في سلالة N2. وكما هو مبين في الفريق ألف،كانت الأنماط متسقة لكلا الطريقتين في كل عملية استنساخ بيولوجية فردية. (B)و (C) هي نفس (A) لمستويات sma-10 و dnj-26 mRNA، على التوالي. تم تطبيع مستويات الحمض النووي الريبي الهدف ضد الجينات التدبير المنزلي CDC-42 وpmp-3. تم حساب التحليل الإحصائي لكل جين باستخدام اختبار t المقترنة مقارنة نتائج النسخ البيولوجية الثلاثة التي تم إنتاجها من خلال qPCR القياسية وتلك التي تم إنشاؤها من خلال qPCR نانولويدي. قيم P لهذه المقارنات هي 0.3113 و 0.2635 و 0.3481 لـ sma-3و sma-10و dnj-26على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: استخدام طريقة Worm-to-CT على عينات مجمعة أو على الديدان الفردية قدم مستويات مماثلة من التعبير عند تطبيع لكل دودة.
مستويات التعبير من (A) hsp-16.1/11،(B) F44E5.4 ، و (C) hsp-70 (C12C8.1) تم تحليلها في الحيوانات البالغة من الشباب في غياب صدمة الحرارة إما عن طريق تنفيذ الدودة إلى CT على الجزء الأكبر من 25 حيوانًا ، أو على 36 فردًا واحدًا. عندما تم تطبيع البيانات لكل دودة، لم يكن هناك فرق كبير بين المستويات التي تم الحصول عليها لكل دودة لكل نسخة باستخدام كلا الأسلوبين. تم تطبيع مستويات مررنا من الجينات المستهدفة ضد متوسط الجينات التدبير المنزلي الثلاثة CDC-42، pmp-3، وire-1. تمثل الأشرطة الخطأ القياسي للـ الوسط. الإحصائيات = اختبار t المقترن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: يمكن أن ترصد تقنية RT-qPCR عالية الإنتاجية على الديدان المفردة باستخدام طريقة Worm-to-CT التباين بين الأفراد في التعبير الجيني.
(أ) متوسط مستويات التعبير ل 53 نسخة تم الحصول عليها عند التعرض لصدمة حرارة قصيرة (30 دقيقة عند 34 درجة مئوية). تمثل Boxplots توزيع متوسط تعبير مرنا من الديدان الفردية (تم استخدام ما متوسطه ثلاثة تكرارات تقنية لكل دودة فردية). النقاط تمثل مستويات التعبير في 28 الديدان الفردية. تم تطبيع مستويات مررنا من الجينات المستهدفة ضد متوسط الجينات التدبير المنزلي الثلاثة CDC-42، pmp-3، وire-1. (B) معامل الاختلاف26 (CV) كدالة للتعبير MRNA المتوسط ل 53 نسخة بعد التعرض لصدمة حرارة قصيرة تم حسابها من 28 فردي (البيانات الخام المعروضة في اللوحة B). تتضمن مجموعة النصوص نسخة NLP-29 المتغيرة27 ونسختين ثابتتين(ife-1 و Y45F10D.4؛ بيانات غير منشورة). السيرة الذاتية هي نسبة الانحراف المعياري إلى الوسط. وقد استخدمت هذه السيرة الذاتية لتقدير التباين بين الأفراد في التعبير عن النص بين الديدان الفردية. وكما هو متوقع، تم قياس التغير بين الأفراد مع انخفاض مستويات التعبير المتوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: لم تكن النسخ المتماثلة التقنية ضرورية عند تحليل التباين بين الأفراد في التعبير الجيني باستخدام شريحة نانوفلوريميك.
تم الحصول على البيانات المعروضة في هذا الرسم البياني في 28 ديدان فردية بعد صدمة قصيرة في الحرارة (30 دقيقة عند 34 درجة مئوية). كل نقطة حمراء يمثل معامل الاختلاف (السيرة الذاتية) من متوسط مستويات التعبير النص لـ نسخة واحدة مقايسة بين 28 الديدان الفردية (السيرة الذاتية). كل نقطة زرقاء تمثل السيرة الذاتية لمستويات التعبير بين ثلاثة نسخ متماثلة تقنية تم الحصول عليها من دودة واحدة، لكل نسخة مقايسة (السيرة الذاتية الفنية). يوضح هذا الرسم البياني أن التقلبات التقنية (بين النسخ المتماثلة التقنية) كانت أقل بكثير من التغير البيولوجي (بين الديدان الفردية) ، مما يشير إلى أنه من غير الضروري إجراء النسخ المتماثلة التقنية على صفيف التعبير الجيني النانوي الفلوري عند فحص التعبير الجيني في الديدان الفردية ، على غرار دراسات الخلايا المفردة14،15،28. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تخطيط تخطيط شريحة صفيف متعددة. الجدول أعلاه يظهر تخطيط بسيط التي يمكن استخدامها عند التخطيط لشريحة متعددة الصفيف البعيد. على اليسار هي المساحات التي ينبغي أن تكون مليئة أهداف التمهيدي من الفائدة وعلى اليمين هي المساحات التي ينبغي أن تكون مليئة عينات من الفائدة. كل مُقصاً ومصفوفة عينة تقترن برقم من خلال الشريحة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: تخطيط تخطيط شريحة صفيف واحد. يعرض الجدول أعلاه تخطيط بسيط يمكن استخدامه عند التخطيط لتشغيل شريحة صفيف واحد. على اليسار هي المساحات التي ينبغي أن تكون مليئة أهداف التمهيدي من الفائدة وعلى اليمين هي المساحات التي ينبغي أن تكون مليئة عينات من الفائدة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3: قائمة التمهيديات RT-qPCR المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

تكميلية الجدول 1 : التمهيدي من قاعدة البيانات من التمهيديات RT - qPCR. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

في هذه الورقة، يظهر بروتوكول Worm-to-CT على أنه طريقة سريعة وفعالة لاستخراج الحمض النووي الريبي من الديدان المفردة أو مجموعة صغيرة من الديدان. إن الإنتاجية العالية التي يوفرها نظام النانولوريدك تجعله مثالياً للقياس الكمي لقياسات التباين بين الأفراد. وعلاوة على ذلك، فإن الحساسية العالية لهذه الطريقة تسمح بالكشف عن الجينات التي يتم التعبير عنها بمستويات منخفضة تقل عن الكشف عند استخدام تقنيات RNA-seq أحادية الدودة9.

عند النظر في اختيار طريقة لإعداد cDNA من الديدان واحدة. Ly وآخرون29 الأمثل بروتوكول الذي يعتمد على البروتينات K للهضم بشرة. بشرة هو عقبة رئيسية لعزل الجزيئات من الديدان والبروتينات K يوفر طريقة فعالة لكسره. ومع ذلك، البروتينات K يجب أن تكون غير تنشيط الحرارة لتكون قادرة على استخدام الإنزيمات للنسخ العكسي. في حين أن Ly et al. استخدم التعرض 10 دقائق إلى 96 درجة مئوية ، تم تجنب هذه الخطوة في هذا البروتوكول لأن الحمض النووي الريبي قابل للتحلل بسهولة. بدلا من استخدام البروتينات K، واستخدمت دورات تجميد ذوبان المتكرر لكسر بشرة. التجميد ذوبان هو وسيلة فعالة لكسر بشرة لأنه يمكن عزل أكثر RNA لكل دودة. Ly وآخرون أن مجموع RNA المستخرج لكل دودة هو 35 نانوغرام باستخدام البروتينات K، في حين أن هذا البروتوكول يحصل على 51.75 نانوغرام ± 6.74 SEM من مجموع RNA لكل دودة. تجنب التعرض للحرارة إلى جانب خطوات التضخيم على ما يبدو يوسع نطاق دودة إلى CT الديناميكية للكشف مقارنة مع البروتوكولات القياسية. تقرير Ly et al. قيم Ct المطلقة من 21.1 ± 0.15 لhsp-16.2 و 22.8 ± 0.17 لhsp-70 بعد الصدمة الحرارية. باستخدام نفس ظروف الصدمة الحرارية (1 ساعة عند 30 درجة مئوية)، يحصل هذا البروتوكول على قيم Ct مطلقة من 17.93 ± 0.57 لhsp-16.2 و 21.13 ±0.33 لhsp-70. وهذا يشير إلى أن طريقة التجميد- ذوبان الجليد توفر غلة أعلى من الحمض النووي الريبي وأكثر ملاءمة للنصوص التعبيرية بشكل منخفض.

نظم Nanofluidic مثالية عند التحقيق في مجموعة معينة من النصوص الهدف واستخدام إما أصغر (رقاقة متعددة الصفائف) أو أكبر (شريحة واحدة صفائف) عدد من العينات السماح التكيف مع حجم التجربة. للحصول على صورة غير متحيزة لجميع النصوص التي تم التعبير عنها في دودة واحدة ، فإن الخيار الواضح هو استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، إذا كان تركيز التجربة هو مجموعة أصغر ولكن لا تزال كبيرة نسبيا من الجينات المستهدفة، فمن الأكثر فعالية من حيث التكلفة لاستخدام هذا البروتوكول، شريطة أن يكون الباحث لديه إمكانية الوصول إلى آلة PCR نانوفلوريدس. وتقدر تكلفة الكواشف النظام النانوي والشريحة ذات الصفيف الواحد بنحو 13 جنيها استرلينيا لكل دودة، في حين أن تكاليف الكواشف لتسلسل الدودة الواحدة ستكون حوالي 60 جنيها استرلينيا لكل دودة، ولا تشمل تكاليف التسلسل.

عند النظر في ما PCR منصة لاستخدام, الدودة إلى CT طريقة مقرونة إلى qPCR nanofluidic يوفر مزايا فيما يتعلق بالوقت والإنتاجية. من الممكن الحصول على 9,216 نتائج RT-qPCR في ما يقرب من يومين من العمل، في حين أن تضخيم نفس العدد من الأهداف باستخدام منصة QPCR القياسية سيستغرق حوالي 5 أسابيع عمل باستخدام 96 طبق جيدا المقايسات، تشغيل أربع لوحات في اليوم. ومع ذلك، إذا كان عدد الأهداف التي سيتم اختبارها أصغر، فمن الأكثر فعالية من حيث التكلفة استخدام Worm-to-CT إلى جهاز qPCR قياسي. لا يمكن إعادة تشغيل رقائق الصفيف المفرد، لذلك يقلل تشغيل الآبار الفارغة من كفاءة التكلفة.

أحد قيود الأسلوب هو التشكيل المحتمل للتممير التمهيدي أثناء الخطوة متعددة، ولكن يحدث هذا في أقل من 1٪ من الحالات. على الرغم من أن بروتوكول Worm-to-CT فعال ويوفر نتائج موثوقة عند تطبيقها على الديدان المفردة، إلا أن هناك معدل فشل يبلغ حوالي 5٪، والذي من المرجح أن يتوافق مع الحالات التي تظل فيها الدودة محاصرة في الغطاء أو الجزء العلوي من الأنبوب أثناء خطوة الحصاد.

معا، وهذا الأسلوب تنوعا وموثوق بها يوفر زيادة الإنتاجية والحساسية مقارنة مع تقنيات أكثر القياسية. يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة جدا للتحقق من الشاشات عالية الإنتاجية، وهي خيار ممتاز إما لرصد أو التحقق من صحة مستويات التعبير الجيني دودة واحدة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على تقنيات أخرى صعبة، مثل كمية التعبير الجيني من الأنسجة المعزولة. على سبيل المثال، إن عزل الأنسجة الكاملة، مثل الأمعاء أو الدناد أو الخلايا المعزولة بواسطة FACs، يوفر ما يكفي من المواد لإجراء تجارب تسلسل الحمض النووي الريبي. غير أن كميات محدودة من المواد كثيرا ما تؤدي إلى تكرار القراءة، مما يحول دون كمية النصوص النادرة. في هذا السيناريو، استخدام تكنولوجيا نانوفليديس القائمة يجب أن توفر حساسية إضافية للتجارب وزيادة كفاءة التكلفة إذا كان الباحثون بحاجة إلى رصد مجموعة فرعية فقط من جميع النصوص في تلك الأنسجة أو الخلايا.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر شارلين مردوخ ومرافق معهد بابراهام على دعمها. وقد تم دعم JLP من قبل صندوق ويلكوم (093970/Z/10/Z) و OC مدعوم من قبل ERC 638426 و BBSRC [BBS/E/B000C0426].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100µM stock primers for genes of interest.
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 for 96.96 chip (Single-Array Chip)
2X Assay Loading Reagent Fluidigm 100-7611
384 well plates
8-strip PCR tubes
96 well ice block
96 well plates
96.96 Dynamic Array IFC Fluidigm BMK-M-96.96 Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip"
96-well sealing tape
BioMark & EP1 Software Fluidigm 101-6793 Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software
BioMark or BioMark HD system Fluidigm 100-2451 K1 Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler"
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs Fluidigm 89000021 Referenced throughout manuscript as "control line fluid"
DNA Suspension buffer TEKnova T0021
domed PCR caps
Exonuclease I New England BioLabs M0293L
Exonuclease I reaction buffer New England BioLabs B0293S
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent Fluidigm 100-7673 referenced throughout manuscript as "sample reagent"
FLEXsix Gene Expression IFC Fluidigm 100-6308 referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip"
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide Fluidigm 68000088 This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.
IFC Controller MX Fluidigm 68000112 I1 Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine"
IFC Controllers SOFTWEAR Fluidigm 100-2297 Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX
liquid nitrogen in dewar
Microcentrifuge StarLab C1301B-230V Used to spin down PCR tube strips in the protocol.
Nuclease Free Water
plate spinner Labnet K4050725 mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner"
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit invitrogen 4402955 This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.
PreAmp Master Mix Fluidigm 100-5580, 100-5581
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions Fluidigm 100-6299 One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)
Rnase Free water
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad Laboratories 172-5211 referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix"
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA TEKnova T0224 Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer
ThermoMixer C Eppendorf 5382000031 Referenced throughout the text as "thermal mixer"
Trizol Thermo-Fisher 15596026 Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform"
Warm water bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).
  2. Semrau, S., van Oudenaarden, A. Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools. Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).
  3. Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future. Science. 358 (6359), 69-75 (2017).
  4. Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).
  5. Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 107-112 (2007).
  6. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , Edited by The C. elegans Research Community (2015).
  7. Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
  8. Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).
  9. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  10. Serra, L., et al. Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq. Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).
  11. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).
  12. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  13. Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).
  14. Ståhlberg, A., Kubista, M. The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).
  15. Livak, K. J., et al. Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells. Methods. 59 (1), 71-79 (2013).
  16. Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide. , https://www.fluidigm.com/binaries/content/documents/fluidigm/resources/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/fluidigm%3Afile (2018).
  17. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. U. S. National Library of Reference. Primer Blast. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ (2020).
  19. Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).
  20. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).
  21. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Jr Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).
  22. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).
  23. Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).
  24. Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
  25. Zhang, X., Zhang, Y. Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).
  26. Sørensen, J. B. The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research. Sociological Methods & Research. 30 (4), 475-491 (2002).
  27. Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).
  28. Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
  29. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).

Tags

علم الوراثة، الإصدار 159، RT-qPCR، دودة واحدة، C. elegans،عينات السائبة، دودة إلى CT، الديدان الخيطية، عالية الإنتاجية، nanofluidic، multix
عالية الإنتاجية الكمية RT-PCR في عينات <em>C. c.</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chauve, L., Le Pen, J., Hodge, F.,… More

Chauve, L., Le Pen, J., Hodge, F., Todtenhaupt, P., Biggins, L., Miska, E. A., Andrews, S., Casanueva, O. High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology. J. Vis. Exp. (159), e61132, doi:10.3791/61132 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter