Summary
रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा (पीडीएक्स) मॉडल और प्रत्यारोपण आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल ईमानदारी से मानव रोग का पुनर्पूंजीकरण करते हैं और बुनियादी और ट्रांसलेशनल स्तन कैंसर अनुसंधान के लिए पसंदीदा मॉडल हैं। यहां, ट्यूमर जीव विज्ञान का अध्ययन करने और दवा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए स्तन ट्यूमर के टुकड़ों को स्तन ट्यूमर के टुकड़ों को स्तन वसा पैड में ऑर्थोटोपिकली प्रत्यारोपण करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है।
Abstract
प्रीक्लिनिकल मॉडल जो ईमानदारी से ट्यूमर विषमता और चिकित्सीय प्रतिक्रिया का पुनर्पूंजीकरण करते हैं, अनुवाद स्तन कैंसर अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं। अमर कोशिका रेखाओं को विकसित करने के लिए आसान कर रहे है और आनुवंशिक रूप से आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए संशोधित, अभी तक सेल संस्कृति से चयनात्मक दबाव अक्सर समय के साथ आनुवंशिक और एपीजेनेटिक परिवर्तन की ओर जाता है । रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा (पीडीएक्स) मॉडल ईमानदारी से मानव स्तन ट्यूमर की विषमता और दवा प्रतिक्रिया को फिर से रीकैपिटल करता है। पीडीएक्स मॉडल ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के बाद अपेक्षाकृत कम विलंबता प्रदर्शित करते हैं जो स्तन ट्यूमर जीव विज्ञान और दवा प्रतिक्रिया की जांच की सुविधा प्रदान करता है। प्रत्यारोपण आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल स्तन ट्यूमर प्रतिरक्षा के अध्ययन की अनुमति देते हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल दवा उपचार के बाद स्तन वसा पैड में ऑर्थोटॉपिकली प्रत्यारोपण स्तन ट्यूमर के टुकड़े करने की विधि का वर्णन करता है । ये प्रीक्लिनिकल मॉडल स्तन ट्यूमर जीव विज्ञान, दवा प्रतिक्रिया, बायोमार्कर खोज और दवा प्रतिरोध के तंत्र की जांच करने के लिए मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।
Introduction
स्तन कैंसर से होने वाली अधिकांश मौतों को आवर्ती रोग के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो पारंपरिक उपचारों के लिए प्रतिरोधी है1,2. स्तन कैंसर की अंतर और अंतर-ट्यूमर विषमता चिकित्सा प्रतिरोध में योगदान देती है। इसके अलावा, ट्यूमर विषमता सटीक पूर्वानुमान पर अतिक्रमण कर सकती है और रोग प्रबंधन3,4को चुनौती दे सकती है। प्रतिक्रिया के भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की पहचान स्तन कैंसर के रोगियों के नैदानिक परिणामों में काफी सुधार होगा। हालांकि अधिकांश स्तन कैंसर प्रकार इम्यूनोलॉजिकल रूप से 'ठंड' ट्यूमर हैं जो इम्यूनोथेरेपी के प्रति अनुत्तरदायी हैं, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधकों ने नैदानिक परीक्षणों में वादा दिखाया है2,5। उदाहरण के लिए, एक चरण III परीक्षण में सुधार रोग मुक्त अस्तित्व (DFS) और प्रारंभिक सबूत है कि aezolizumab (पीडी-L1 के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) एनएबी-paclitaxel के साथ संयुक्त एक समग्र अस्तित्व लाभ प्रदान कर सकते है के रूप में एक समग्र अस्तित्व लाभ प्रदान कर सकते है के रूप में अकेले एनएबी-paclitaxel के साथ ट्यूमर में ≥1% पीडी-L1 दाग6। इम्यूनोथेरेपी के लिए स्तन ट्यूमर को जागरूक करने वाले उपचारों का विकास उपचार आहार में क्रांतिकारी बदलाव लाएगा।
प्रीक्लिनिकल मॉडल जो ईमानदारी से मानव स्तन कैंसर विषमता और दवा प्रतिक्रिया का पुनर्पूंजीकरण करते हैं, ट्यूमर जीव विज्ञान का अध्ययन करने और लक्षित चिकित्सा के लिए संभावित बायोमार्कर की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। अमर कोशिका लाइनों व्यापक रूप से स्तन कैंसर अनुसंधान के लिए उपयोग किया जाता है के बाद से इन सेल लाइनों को विकसित करने के लिए आसान कर रहे है और आनुवंशिक रूप से आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए संशोधित । हालांकि, विट्रो में दीर्घकालिक सेल संस्कृति के चयनात्मक दबाव के कारण, समय के साथ आनुवंशिक बहाव हो सकता है और स्तन कैंसर कोशिका लाइनों में सेल लाइन-विशिष्ट जीनोमिक परिवर्तन हो सकते हैं जो प्राथमिक स्तन ट्यूमर7,8,9में विपथन से अलग हैं।
रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा (पीडीएक्स) ट्यूमर का हिस्सा मानव रोग की विषमता को फिर से काटना करने में सक्षम हैं, और हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिक रूप से मूल के ट्यूमर के समान हैं10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, 22 ,23,24,25,26 ,27,28,29. महत्वपूर्ण बात यह है कि पीडीएक्स मॉडल कई प्रत्यारोपणों में फेनोथिपाइपिक रूप से स्थिर हैं, जैसा कि हिस्टोलॉजी, ट्रांसक्रिप्टोम, प्रोटेम और जीनोमिक विश्लेषण10,11,12, 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26 ,27,28,29. पीडीएक्स मॉडल चिकित्सकीय रूप से देखे गए लोगों के तुलनीय प्रतिक्रियाएं दिखाते हैं10,11,12, 13,14,15,16,17,18,19,20,22,23,24 25,26,27,28,29. एस्ट्रोजन रिसेप्टर पॉजिटिव (ईआर+),प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर पॉजिटिव (पीआर+),एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर 2 पॉजिटिव (ERBB2+,HER2+)और ट्रिपल निगेटिव ब्रेस्ट कैंसर (टीएनबीसी) पीडीएक्स मॉडल के लिए पीडीएक्स मॉडल स्थापित किए गए हैं, और एंडोक्राइन-, कीमो-और लक्षित चिकित्सा का परीक्षण करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करते हैं। हालांकि, वर्तमान में पीडीएक्स मॉडल की एक मुख्य चेतावनी माउस में एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी है।
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जीईएम), जैसे टीआरपी 53 होमोज़िगस नल, सीएसवाईसी, डब्ल्यूएनटी 1, पाइएमटी, या हर् 2 ओवरएक्सप्रेशन मॉडल, एक अक्षुण्ण प्रतिरक्षा प्रणाली के संदर्भ में सहज ट्यूमर दीक्षा, प्रगति और मेटास्टेसिस के अध्ययन की अनुमति देते हैं। हालांकि, ट्यूमर विलंबता लंबी है, जिससे कईहथियारों 30, 31के साथ प्रीक्लिनिकल परीक्षणों का संचालन करना मुश्किल होजाताहै। हालांकि, जीईएम को सिंजेनिक मेजबानों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है ताकि पर्याप्त संख्या में ट्यूमर उत्पन्न हो सके जो मानव ट्यूमर32,33, 34, 35,36, 37,38,39,40,41,42,43, 44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. उदाहरण के लिए, एक p53-null BALB/c माउस से स्तन एपिथेलियम को प्राथमिक ट्यूमर बनाने के लिए सिनेनिक जंगली प्रकार के प्राप्तकर्ता चूहों के स्वीकृत वसा पैड में प्रत्यारोपित किया गया था, जिसे सिंजेनिक मेजबान56,57में आगे प्रत्यारोपित किया जा सकता है। p53-नल ट्यूमर मानव ट्यूमर के विभिन्न उपप्रकारों का पुनर्पूंजीकरण ।
पीडीएक्स मॉडल और प्रत्यारोपण जीईएम का संयोजन स्तन ट्यूमर जीव विज्ञान, दवा प्रतिक्रिया और ट्यूमर विरोधी प्रतिरक्षा की जांच करने के लिए मूल्यवान प्रीक्लिनिकल उपकरण प्रदान करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, माउस स्तन वसा पैड में पीडीएक्स और जेईएम ट्यूमर के टुकड़ों के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण की एक विधि वर्णित है। ये मॉडल धारावाहिक मार्ग के लिए उत्तरदायी हैं और आमतौर पर एक स्थिर फेनोटाइप बनाए रखते हैं। समय के साथ मार्ग में आनुवंशिक बहाव या विषमता के नुकसान के जोखिम को कम करने के लिए, इस घटना में बाद के प्रत्यारोपण के लिए प्रत्येक मार्ग पर कई ऊतकों के टुकड़े क्रायोप्रीड किए जाते हैं कि समय29,58के साथ जैविक या रूपात्मक परिवर्तन देखे जाते हैं।
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Protocol
जानवरों का उपयोग करने वाले सभी प्रोटोकॉलों की समीक्षा की गई है और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है । ट्यूमर के टुकड़े, आकार में लगभग 1−2मिमी 3, बायलोर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा और एडवांस्ड इन वीवो मॉडल कोर से प्राप्त व्यवहार्य जमे हुए स्टॉक से हैं।
1. प्रत्यारोपण के लिए क्रायोप्रीप्रेयरेड मैमेरी ट्यूमर के टुकड़े की तैयारी
- ट्यूमर के टुकड़ों के साथ क्रायोवियल को तरल नाइट्रोजन से 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में स्थानांतरित करें।
- विगलन के दौरान कभी-कभी कोमल झटका के साथ क्रायोवियल को उत्तेजित करें।
- ऊतक गल जाने के बाद, क्रायोवियल को पानी के स्नान से बाहर निकालें और कोमल उलटा करके मिलाएं।
- क्रायोवियल के बाहर सूख ें और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। इसे बायोसेफ्टी हुड में स्थानांतरित करें।
- गल ट्यूमर ऊतकों को कोल्ड दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के 10 एमएल से भरी 15 एमएल शंकुवाणू में स्थानांतरित करें। ट्यूब को उलटा करके अच्छी तरह मिलाएं। ऊतक के टुकड़ों को ट्यूब के नीचे तक बसाने की अनुमति दें।
- कोल्ड डीएमईएम के 10 एमएल में सुपरनेट और रिसिपेंड को एस्पिरेट करें। ट्यूब को उलटा करके अच्छी तरह मिलाएं। ऊतक के टुकड़ों को ट्यूब के नीचे तक बसाने की अनुमति दें।
- कोल्ड डीएमईएम के 10 एमएल में सुपरनेट और रिसिपेंड को एस्पिरेट करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें।
नोट: ऊतक प्रत्यारोपण के लिए तैयार है ।
2. संग्रह और प्रत्यारोपण के लिए ताजा स्तन ट्यूमर की तैयारी
- स्तन ट्यूमर असर माउस इच्छामृत्यु।
नोट: PDX मेजबान SCID/बेज, एनएसजी या एनआरजी महिला चूहों हो सकता है, जबकि वर्तमान अध्ययन में महिला Balb/c चूहों आयु वर्ग के 3−5 सप्ताह का उपयोग किया जाता है । - 70% इथेनॉल के साथ इच्छामृत्यु माउस के ट्यूमर क्षेत्र स्प्रे।
नोट: ट्यूमर के नमूने के साथ बालों से बचने की कोशिश करें जो क्रायोस्टोरेज या प्रत्यारोपण के लिए ट्यूमर के टुकड़ों के प्रदूषण का कारण बन सकता है। - ट्यूमर के आसपास की त्वचा को चुटकी और उठाने के लिए दांतेदार संदंश के साथ, एक छोटा चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें।
- मेजबान माउस से पूरे ट्यूमर को विच्छेदन करने के लिए कैंची के साथ त्वचा से ट्यूमर को अलग करें। ट्यूमर की बाहरी सतह से किसी भी शेष माउस वसा पैड ऊतक को ट्रिम करें। ट्यूमर को 15 एमएल शंकु नली में रखें, जिसमें 5 एमएल ठंडे डीएमईएम से भरा हुआ है।
नोट: 1 सेमी व्यास के अधिकतम आकार पर ट्यूमर का उपयोग करें क्योंकि बड़े ट्यूमर में परिगलित कोर होने की संभावना होती है। - एक जैव बचाव हुड में, विच्छेदन ट्यूमर को एक बाँझ 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें सुखाने को रोकने के लिए पर्याप्त डीएमईएम होता है।
- ट्यूमर को एस्पेप्टिक परिस्थितियों में स्केलपेल या ब्लेड के साथ1 मिमी 3 टुकड़ों में काटें।
नोट: स्केलपेल या ब्लेड को उपयोग करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए जैवसेफ्टी हुड में यूवी के तहत उजागर किया जाना चाहिए। - ट्यूमर के टुकड़ों को ठंडे डीएमईएम से भरी 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें।
नोट: ऊतक प्रत्यारोपण के लिए तैयार है । कदम २.४ से विच्छेदित ट्यूमर के टुकड़े हो सकते हैं, 1) प्रोटीन और आरएनए/डीएनए निष्कर्षण के लिए तरल नाइट्रोजन में जमे हुए स्नैप, 2) हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन (एचएंडई) और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) विश्लेषण, या 3) के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) या 10% न्यूट्रल बफर्ड फॉर्मेलिन (एनबीबीएफ) के साथ तय किया गया, या 3) क्रायोप्रीयरेक्टेड 1.25 एमएल फ्रीजिंग मीडियम (10% डिमेथिल सल्फोक्साइड [डीएमओ], 40% डीएमईएम और 50% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस]) रात भर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में धीमी ठंड से और फिर दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित होते हैं।
3. सर्जरी के लिए पशु तैयार
- पशु दर्द प्रबंधन के लिए, चमड़े के नीचे 1 मिलीग्राम/किलो की खुराक पर सर्जरी से पहले ६० मिनट बुप्रेनोरफिन निरंतर रिलीज या एनाल्जेसिक कवरेज के ७२ घंटे के लिए संस्था के गाइड का पालन करें ।
- एसेप्टिक सर्जरी के लिए संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार सर्जिकल सुइट की स्थापना करें।
- एनेस्थेटाइज एक 4 सप्ताह पुरानी महिला को ~11.25 एमएल/एच की दर से आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया मशीन के इंडक्शन चैंबर में । माउस को बाँझ (सिलिकॉन रबर) सर्जरी बोर्ड पर प्रक्रिया क्षेत्र में स्थानांतरित करें, जहां इसे एक छोटे फेसमास्क के माध्यम से संज्ञाहरण प्राप्त होगा। माउस को अपनी पीठ पर रखें और पैरों को उनकी प्राकृतिक स्थिति में टेप करें।
नोट: एससीआईडी/बेज, एनएसजी या एनआरजी का उपयोग पीडीएक्स के लिए किया जाता है और जीईएम प्रत्यारोपण मॉडल के लिए बल्ब/सी का उपयोग किया जाता है । - सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
- टो चुटकी द्वारा सेडेशन के उचित स्तर की पुष्टि करें।
नोट: कोई प्रतिक्रिया/जानवर की गति इंगित करता है कि जानवर पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज्ड है और सर्जरी के लिए तैयार है । - निचले पेट पर माउस दाढ़ी, विशेष रूप से चौथे निप्पल के आसपास के क्षेत्र जहां सर्जरी होगी।
- एक परिपत्र गति का उपयोग करना और सर्जरी साइट के केंद्र में शुरू, पोविडोन-आयोडीन सर्जिकल स्क्रब के साथ बाहरी किनारों की ओर काम करते हैं, इसके बाद 70% आइसोप्रोपिल इथेनॉल पैड के साथ पोविडोन-आयोडीन को हटाया जाता है। दो अतिरिक्त बार दोहराएं।
4. चौथे (inguinal) स्तन वसा पैड में ट्यूमर के टुकड़े के प्रत्यारोपण
- चीरा साइट को छोड़कर जानवर के शरीर को कवर करने के लिए एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा का उपयोग करें।
नोट: चीरा बनाने से पहले अंगुली चुटकी द्वारा sedation के उचित स्तर की पुष्टि करें । - दांतेदार संदंश चुटकी का उपयोग करना और #4 निप्पल पर त्वचा को ऊपर उठाएं ।
- कुंद पक्ष नीचे के साथ, सिर की ओर #4 निप्पल से एक छोटी (लगभग 1 सेमी), परजीवी चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें।
- एक कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग करना, चीरा के मध्य की ओर पेरिटोनम से त्वचा को अलग करें।
- चीरा के पार्श्व पक्ष को पकड़ते समय, धीरे-धीरे उसी झाड़ू का उपयोग करके त्वचा से #4 स्तन वसा पैड छील लें।
- एक बार फैट पैड अलग होने के बाद जानवर के शरीर के करीब 27 जी सुई से त्वचा को पिन करें ।
- यदि अंतर्जात माउस स्तन एपिथेलियम के वसा पैड को साफ करना प्रयोगात्मक रूप से आवश्यक है तो निम्नलिखित चरणों को करें।
- दांतेदार संदंश का उपयोग करके, धीरे-धीरे वसा पैड को शरीर से दूर बढ़ाएं और इंगिनल लिम्फ नोड का पता लगाएं, जो ग्रंथि में प्रमुख जहाजों के चौराहे बिंदुओं के नीचे है (जहां संदंश ग्रंथि को पकड़े जाएंगे)।
- ध्यान से लिम्फ नोड और वसा में शामिल होने वाले जहाजों को एक त्रिकोणीय क्षेत्र बनाने वाले चौथे और पांचवें वसा पैड में शामिल होने के लिए सावधानीपूर्वक कॉटेराइज करें।
नोट: इस चरण के लिए अस्थायी रूप से ऑक्सीजन स्रोत बंद करें। - माइक्रो विच्छेदन कैंची का उपयोग करना, एक समय में प्रत्येक कॉटराइज्ड पोत को काटें (यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक कट के बाद कोई रक्तस्राव नहीं होता है) जब तक कि लिम्फ नोड में शामिल वसा पैड के खंड को हटा नहीं दिया जाता है।
- "मंजूरी दे दी" वसा पैड ऊतक त्यागें।
- कुंद जुदाई संदंश का उपयोग कर चौथे स्तन वसा पैड पकड़ो। दूसरे हाथ से, कोण वाले ठीक संदंश के बंद टिप को शेष पोत के ऊपर वसा पैड के बीच में डालें और पेरिटोनम की दीवार के करीब डालें। धीरे-धीरे एक छोटी जेब बनाने के लिए संदंश खोलें। फैट पैड से कोण वाले महीन संदंश को हटा दें।
- कोण ठीक संदंश का उपयोग करना, ट्यूमर टुकड़े का एक टुकड़ा ले और जेब में डालें ।
- धीरे-धीरे ट्यूमर के टुकड़े को वसा पैड जेब में छोड़ने के लिए संदंश युक्तियां खोलें।
- कोण वाले ठीक संदंश को सावधानी से वापस लें।
नोट: जेब को देखो पुष्टि करने के लिए कि ट्यूमर टुकड़ा मामूरी वसा पैड की जेब में रहता है जब संदंश वापस ले । ट्यूमर दोनों कॉन्ट्रालेट्रल फैट पैड में प्रत्यारोपित किया जा सकता है जब अतिरिक्त ट्यूमर ऊतक प्रयोगों या बैंकिंग के लिए आवश्यक है । गर्भनिरोधक ट्यूमर के बीच ज्ञात बातचीत के कारण दो तरफा प्रत्यारोपण वाले जानवरों को उपचार अध्ययन के लिए अनुशंसित नहीं किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, प्रत्यारोपण प्रक्रिया के लिए एक ट्रोमाकार डिवाइस का उपयोग किया जा सकता है। - चीरा के आधार से शुरू, पंजा और दांतेदार संदंश का उपयोग कर प्रत्येक पक्ष पर त्वचा इकट्ठा। दोनों पक्षों को एक साथ लाएं और घाव क्लिप आवेदन के लिए त्वचा तैयार करने के लिए थोड़ा उठाएं। पंजा संदंश के साथ चीरा के किनारों को अनकरल करें और शीर्ष पर एक निरंतर सतह बनाने के लिए किनारों को एक साथ चुटकी लें।
- दोनों पक्षों को दांतेदार संदंश के साथ एक साथ पकड़े हुए, चीरा के केंद्र में एक घाव क्लिप रखने के लिए घाव क्लिप एप्लिकेटर का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो उन्हें बंद और सुरक्षित रखने के लिए चीरा के सिरों पर ऊतक चिपकने वाला लागू करें।
- जानवर को एक साफ पिंजरे में रखें जो वार्मिंग की सतह पर है। रक्तस्राव, अस्पष्टता के लक्षण, और पोस्टर्जिकल अवधि के दौरान दर्द के लिए निगरानी करें। जानवर को ऊपर होना चाहिए और मिनटों के भीतर सर्जरी करना चाहिए।
- चीरा साइट और सर्जरी के बाद कम से कम 3 दिनों के लिए जानवरों के समग्र स्वास्थ्य पर करीब ध्यान देना। दर्द प्रबंधन के लिए संस्थागत दिशा-निर्देशों का पालन करें।
- अगले प्रत्यारोपण के साथ जारी रखने से पहले एक गिलास मोती स्टरलाइजर में 10 एस के लिए शल्य चिकित्सा उपकरण साफ । उपयोग करने से पहले उपकरणों को ठंडा करने के लिए प्रतीक्षा करें।
- सभी चूहों को प्रत्यारोपित किए जाने तक 4.1−4.15 चरण दोहराएं।
नोट: ईआर+ ट्यूमर के लिए एस्ट्रोजन पूरकता की आवश्यकता होती है, जिसे पानी या धीमी गति से रिलीज छर्रों59के माध्यम से आपूर्ति की जा सकती है।
5. दवा उपचार के जवाब में ट्यूमर विकास की निगरानी
नोट: स्थापित प्रत्यारोपण PDXs और p53-नल ट्यूमर के स्पष्ट ट्यूमर 2 सप्ताह और 8 सप्ताह के बीच लेता है सर्जरी के बाद विकसित करने के लिए, आंतरिक ट्यूमर विकास दर पर निर्भर करता है ।
- सप्ताह में दो बार कैलिपर्स का उपयोग करके दो आयामों में ट्यूमर को मापें। सूत्र का उपयोग कर मात्रा की गणना करें:
ट्यूमर की मात्रा(मिमी 3)= डब्ल्यू2 x L/2
जहां डब्ल्यू चौड़ाई है और एल ट्यूमर की लंबाई है। - ट्यूमर की मात्रा 150−300 मिमी3तक पहुंचने पर दवा उपचार शुरू करें।
नोट: दवाओं की संपत्ति के आधार पर, मौखिक गैवेज या इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग दवाओं को वितरित करने के लिए किया जा सकता है। - ट्यूमर के नमूने लीजिए और विभिन्न प्रयोजनों के लिए60,प्रोटीन और आरएनए/डीएनए अलगाव और प्रतिरक्षा फेनोटाइपिंग61 को धुंधला करते हैं। रक्त एकत्र करें और प्रतिरक्षा फेनोटाइपिंग करें या इसका उपयोग फार्माकोकाइनेटिक/फार्माकोडायनामिक अध्ययन के लिए करें।
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Representative Results
चित्रा 1 ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के उपकरण(चित्रा 1ए)और प्रमुख प्रक्रियाओं(चित्रा 1बी)को दिखाता है। चित्रा 2 एक प्रत्यारोपित PDX ट्यूमर (MC1) के लक्षण वर्णन से पता चलता है । MC1 मॉडल के ट्यूमर के टुकड़े(1 मिमी 3)SCID/Beige चूहों के #4 वसा पैड में प्रत्यारोपित किया गया । एक महीने बाद, औसत ट्यूमर का आकार 350 मिमी3के आसपास पहुंच गया। ट्यूमर की मात्रा एक महीने के लिए सप्ताह में दो बार निगरानी की गई थी। आम तौर पर हम 1 मिमी 3 ट्यूमर के टुकड़े प्रत्यारोपित(चित्रा2ए)के साथ लगभग 2 सप्ताह से8 सप्ताह में विभिन्न पीडीएक्स या जीईएमएम के लिए स्पष्ट ट्यूमर प्राप्त करते हैं। ट्यूमर के नमूने आकृति विज्ञान और सिग्नलिंग विश्लेषण(चित्रा 2बी−डी)के लिए एकत्र किए जा सकते हैं। एचएंडई धुंधला पैथोलॉजी(चित्रा 2बी)का विश्लेषण करने के लिए किया गया था । आईएचसी का उपयोग विशिष्ट सेल वंश (केराटिन 19 (K19), एपिथेलियल सेल, चित्रा 2सी),सेल स्थिति (Ki67, प्रसार, चित्रा 2डी)या ब्याज के संकेत अणु के लिए मार्कर की निगरानी के लिए किया गया था।
चित्रा 1: योजनाबद्ध सर्जरी तकनीक दिखा रहा है । (A)ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक सर्जिकल उपकरण। (ख)ट्यूमर ट्रंक प्रत्यारोपण के लिए स्तन वसा पैड के जोखिम को दिखाने वाले प्रतिनिधि छवि । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: प्रत्यारोपित ट्यूमर का लक्षण वर्णन। (ए)एक कैलिपर द्वारा मापा ट्यूमर विकास के प्रतिनिधि काइनेटिक्स । ट्यूमर की मात्रा(एमएम 3)= डब्ल्यू2 x एल/2 (डब्ल्यू = चौड़ाई और एल = लंबाई)। (ख)एचएंडई धुंधला MC1 PDX की विकृति दिखा रहा है । आईएचसी एमसी1 पीडीएक्स में एपिथेलियल मार्कर केराटिन 19(सी)और प्रसार निर्माता Ki67(D)दिखा रहा है। स्केल बार = 20 माइक्रोन, आवर्धन = 40x. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
जानवरों में ट्यूमर के विकास में भिन्नता को कम करने के लिए, प्रत्यारोपण के लिए ट्यूमर ऊतक को 1 मिमी3 टुकड़ों में काटना महत्वपूर्ण है। नरम ऊतक बढ़ने वाले मॉडल के साथ काम करना कठिन होता है और ट्यूमर के टुकड़ों को थोड़ा बड़ा (1−2 मिमी3)काटने की आवश्यकता होती है। जब स्तन वसा पैड जेब में ऊतक रखने के लिए कई टुकड़ों में ऊतक विभाजित नहीं ध्यान रखना के रूप में यह कई छोटे ट्यूमर या अजीब तरह से आकार के ट्यूमर में परिणाम होगा ।
इसके अलावा, जानवरों के प्रत्यारोपण के लिए ताजा ट्यूमर का उपयोग करें जिसका उपयोग दवा उपचार अध्ययन के लिए किया जाएगा। क्रायोप्रिजर्वेशन से ऊतक प्रत्यारोपित करने से अधिक चर लेने की दर और थोड़ी धीमी वृद्धि काइनेटिक्स निकलेगी। एक बार ट्यूमर क्रायोप्रेवित सामग्री से बढ़ने के बाद, दूसरी प्रत्यारोपण पीढ़ी उस मॉडल के लिए विशिष्ट ले दर और विकास गतिज निकलेगी। इसके अलावा, प्रत्यारोपण के लिए कोई या हल्के परिगलन के साथ ट्यूमर का उपयोग करने की कोशिश करें। अधिकांश मॉडलों के लिए यह 400−600 मिमी3की आकार सीमा होगी। यदि एक स्पष्ट परिगलित कोर देखा जाता है, तो प्रत्यारोपण के लिए ट्यूमर की बाहरी परत से ऊतक का उपयोग करें और परिगलित क्षेत्रों का उपयोग न करें। ट्यूमर के टिश्यू को बर्फ पर रखना और सूखने से बचाना जरूरी है।
जीईएमएम से ट्यूमर के हिस्से के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए जो विभिन्न माइक्रोएनवायरमेंट के साथ परिधि या ट्यूमर कोर से प्राप्त हो सकता है, एक वैकल्पिक विधि एक प्राथमिक कोशिका निलंबन तैयार करना और ट्यूमर मॉडल के आधार पर लगभग 5,000−30,000 कोशिकाओं को स्तन वसा पैड में प्रत्यारोपण करना है। सीमित कोलेजनेस पाचन 1 मिलीग्राम/एमएल प्रकार के साथ किया जाता है मैं DMEM/F12 में किसी भी योजक के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर 125 आरपीएम पर घूर्णन। स्तन ट्यूमर कोशिकाओं को 3 छोटे अपकेंद्रित्र चरणों से समृद्ध किया जा सकता है। संक्षेप में, सेल निलंबन को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें और 7 एस के लिए 450 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें और 1x दुल्बेको के फॉस्फेट बफर खारा (डीपीबीएस) के 10 एमएल में गोली को फिर से खर्च करें। पल्स अपकेंद्री को दो बार और दोहराएं। यह हिस्सा के बीच मतभेदों को यादृच्छिक बनाने में मदद करेगा।
सामान्य स्तन एपिथेलियम का प्रत्यारोपण अंतर्जात माउस एपिथेलियम की उपस्थिति में एक रूपात्मक रूप से सामान्य और कार्यात्मक डक्टल पेड़ को पुनर्जीवित नहीं करेगा। सामान्य एपिथेलियल प्रत्यारोपण के लिए अंतर्जात माउस एपिथेलियम (समाशोधन) को62विकसित करने के लिए हटाना आवश्यक है। हालांकि, नियोप्लास्टिक ऊतक अक्षुण्ण अंतर्जात माउस एपिथेलियम की उपस्थिति में भी बढ़ने में सक्षम है। अभी तक यह जरूरी नहीं कि कोई ऐसा निरोधात्मक संकेत मौजूद मतलब है । कुछ प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए मैमेरी फैट पैड समाशोधन आवश्यक है ताकि engrafted सामग्री के साथ अंतर्जात माउस स्तन एपिथेलियम की बातचीत को प्रतिबंधित किया जा सके। इसके अलावा, अंतर्जात एपिथेलियम जीनोम, ट्रांसक्रिप्टोम और प्रोटेम विश्लेषण जैसे कुछ डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को जटिल बना सकता है।
पीडीएक्स मॉडल और प्रत्यारोपण योग्य जीईएम ईमानदारी से नैदानिक उपप्रकारों की विषमता और मानव स्तन कैंसर की दवा चिकित्सा के प्रति प्रतिक्रिया को फिर से रीकैपिटल कर सकते हैं। महत्वपूर्ण बात, इन मॉडलों को प्रत्यारोपण और धारावाहिक मार्ग की एक सीमित संख्या के दौरान एक स्थिर फेनोटाइप बनाए रखने के लिए आसान कर रहे हैं । ट्यूमर विकास आसानी से कैलिपर्स के साथ मापा जा सकता है। पीडीएक्स मॉडल और प्रत्यारोपण जेईएम की एक चेतावनी यह है कि ये मॉडल ट्यूमर दीक्षा के शुरुआती चरणों का पुनर्पूंजीकरण नहीं करते हैं। इसके अलावा, पीडीएक्स मॉडल में एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ ट्यूमर की बातचीत की कमी होती है। ये प्रीक्लीनिकल मॉडल स्तन कैंसर जीव विज्ञान का अध्ययन करने और दवा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली प्रदान करते हैं। प्रत्येक ट्यूमर मॉडल के लिए जीनोमिक और प्रोटेओमिक जानकारी के साथ दवा प्रतिक्रिया का संयोजन प्रतिक्रिया भविष्यवाणी और उपचार प्रतिरोध तंत्र के लिए बायोमार्कर की पहचान की सुविधा प्रदान करेगा। इस प्रकार के डेटा से उपन्यास लक्षित उपचार हो सकते हैं जिनका उपयोग अकेले और कीमोथेरेपी या इम्यूनोथेरेपी के संयोजन में रोगी परिणामों में सुधार करने के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
एमटीएल स्टेममेड, लिमिटेड में एक सीमित साझेदार के संस्थापक और स्टेममेड होल्डिंग्स में संस्थापक और प्रबंधक है, जो इसका सामान्य साझेदार है। एमटीएल के एक संस्थापक और Tvardi चिकित्सा विज्ञान में एक इक्विटी धारक है, इंक एलईडी StemMed, लिमिटेड के एक मुआवजा कर्मचारी है
Acknowledgments
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (R37CA228304 और R01HL146642 से शी चेन, CA148761 से जेफरी एम रोसेन), अमेरिकी रक्षा विभाग (W81XWH-19-1-0524 Xi चेन को समर्थन मिला, W81XWH-19-1-0035 Xiangdong Lv करने के लिए, अमेरिकन कैंसर सोसायटी (RSG-181-01-TBE से शी चेन) और कैंसर की रोकथाम और अनुसंधान टेक्सास के अनुसंधान संस्थान (RR150009 CPRIT विद्वान कैंसर अनुसंधान पुरस्कार में शी चेन), बायलोर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में वीवो मॉडल कोर में रोगी-व्युत्पन्न Xenograft और उन्नत (RP170691 CPRIT कोर सुविधा पुरस्कार और NCI-CA125123 P30 कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट से धन) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mg/mL Buprenorphine-SR | ZooPharm (via BCM veterinarians) | Sterile | |
| 26G syringe | BD | 148232E | Sterile |
| Betadine Scrub | Fisher | 19-027132 | |
| Cotton Swabs | VWR International Laboratory | 89031-272 | Sterile |
| DMEM | Fisher | MT 10-013-CM | Sterile |
| Electric shaver | Oster | 78005-050 | |
| Glass beads sterilizer (Germinator) | Roboz Surgical Store | DS-401 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-062-35 | |
| Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5139 | Sterile |
| Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter) | Roboz Surgical Store | RS-5658BT | Sterile |
| Micro Forceps (tissue placing forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5069 | Sterile |
| Petri Dish | Fisher | 08-757- 100D | Sterile |
| Sterile drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | Sterile |
| Surgery scissors | Roboz Surgical Store | RS-5960 | Sterile |
| Tissue Forceps (claw forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5158 | Sterile |
| Wound clip applier | BD Autoclip Wound System | 01-804 | Sterile |
| Wound clip remover | BD Autoclip Wound System | 01-804-15 | Sterile |
| Wound clips | BD Autoclip Wound System | 01-804-5 | Sterile |
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