성인 쥐 요로 방광에서 1 차신경및 glia의 격리 그리고 문화
Summary
이 프로토콜은 추가 세포 실험을 위한 쥐 방광에서 1 차적인 신경세포 및 glia 격리를 위한 반복가능한 프로토콜을 설치하기 위하여 시도합니다.
Abstract
낮은 요로는 두 가지 주요 기능, 즉, 주기적인 소변 저장 및 배뇨; 이러한 기능은 중앙 및 말초 신경 조절을 통해 중재됩니다. 낮은 요로 신경계에 대한 광범위한 연구가 실시되었지만 대부분의 연구는 1 차 문화에 초점을 맞추고 있습니다. 이 프로토콜은 스프라그-Dawley 쥐에서 방광 뉴런과 glia의 격리 및 문화에 대한 방법을 소개합니다. 이 방법에서, 뉴런과 glia는 5-7 일 동안 37 °C, 5 % CO2 인큐베이터에서 배양되었다. 그 결과, 그(것)들은 관련 후속 면역 형광 실험에 적합한 성숙한 모양으로 성장했습니다. 세포는 광학 현미경을 사용하여 형태학적으로 관찰되었다. 뉴런, 시냅스 소포 및 glia는 각각 β-III-tubulin 및 MAP-2, 시냅신-1 및 GFAP 염색에 의해 확인되었다. 한편, 면역세포화학은 콜린 아세틸트랜스퍼라제, DYNLL2 및 SLC17A9와 같은 여러 신경전달물질 관련 단백질에서 수행되었다.
Introduction
하부 요로에는 두 가지 주요 기능이 있습니다: 주기적인 소변 저장 및 배뇨1. 하부 요로 신경계(LUTNS)는 이러한 기능을 제어하고 많은 신경병증에 섬세하고 민감하며, 이는 선천적(포르피리아), 획득(라임병), 질병 상태(당뇨병 세포질), 약물 유도(출혈성 방광염), 수술 발생(복부 절제술 절제술, 4, 외상성 척추 상해, 4, 외상성 척추 상해, 4, 외상성 척추 손상, 4, 외상성 척추 손상, 3) 및 상해(외상성 척추 손상, 3) 및 상해(외상성 척추 손상, 5, 외상성 척추 손상,3) 생리적/병리학 연구에서 생체 내 및 체외 실험도 똑같이 중요합니다. LUTNS에 대한 생체 내 연구는 장기, 세포 및 분자 수준에서 한동안 수행되었지만, 오줌 방광에서 1 차 적인 뉴런에 대한 체외 연구는 거의 존재하지 않는8,9. 본 연구는 제한적이지만, 우리는 다른 연구자들이 그것을 개선할 수 있도록 이 지역에 있는 연구를 개척하기를 희망합니다. 이러한 방식으로, 이러한 공동 배양은 방광 뉴런 기능 장애와 같은 표현형에 있는 생리적 기능 장애의 세포 이해로 이끌어 낼 수 있습니다.
근육 세포의 명확한 방향성을 가진 장내 근육과 는 대조적으로, 방광의 근육은 조직되지 않습니다10. 따라서 방광의 외부 층을 벗겨내는 대신, 이 방법은 방광 전체를 소화하여 작동의 어려움을 줄이고 높은 세포 생존율에 대한 전처리 시간을 단축할 것을 제안합니다.
이 방법에 따라, 우리는 뉴런 과 다른 세포의 혼합 배양을 얻을 수 있습니다. 그들의 존재는 생체 내환경(11)을모방하기 때문에 다른 세포는 필수 불가결하다. 또한, 이러한 세포는 배지에서 사용할 수 없는 물질을 제공한다.
이 방법은 소화를 위한 두 단계를 포함합니다. 먼저, 콜라게나아제 형 II는 콜라겐을 가수분해하는 데 사용되며, 트립신이 이어서 조직을세포(10)로해리한다. 이런 식으로, 방광 조직은 단 하나 세포로 분산되고 그 때 상대적으로 독립적으로 성장합니다. 뉴런의 문화가 성숙할 때, 뉴런은 화상 진찰 또는 기능적인 소사에 사용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
플레이트 준비
면역형광 또는 칼슘 이미징 실험을 위한 6-, 12 또는 48웰 배양 판에서 유리 커버립을 사용하는 것은 경제적이고 시료 절약 적인 동작입니다. 세포는 1 차적인 세포 배양의 준비 도중 커버립 없이 접시에서 잘 자랍니다. 따라서, 커버립은 서양 블롯 또는 폴리머라제 연쇄 반응과 같은 실험에서 분배할 수 있다. 또한, 코팅은 커버립의 유무에 관계없이 세포를 도금하기 전…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연과학 재단(81673676)과 동관과학기술국(2019622101002)의 지원을 받았습니다. 저자는 메리 로즈 설리반 박사 (수술조교수, 하버드 의과 대학) 기술 컨설팅에 감사드립니다.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
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