Summary
Questo protocollo tenta di stabilire un protocollo ripetibile per i neuroni primari e l'isolamento degli glia dalla vescica del ratto per ulteriori esperimenti cellulari.
Abstract
Il tratto urinario inferiore ha due funzioni principali, vale a dire la conservazione periodica delle urine e la micturizione; queste funzioni sono mediate attraverso la neuroregolazione centrale e periferica. Sebbene sia stata condotta un'ampia ricerca sul sistema nervoso del tratto urinario inferiore, la maggior parte degli studi si è concentrata sulla cultura primaria. Questo protocollo introduce un metodo per l'isolamento e la coltura dei neuroni vescicali e degli glia dei ratti Sprague-Dawley. In questo metodo, i neuroni e glia sono stati incubati in un incubatore di 37 °C, 5% CO2 per 5-7 giorni. Di conseguenza, sono cresciuti in forme mature adatte ai successivi esperimenti di immunofluorescenza correlati. Le cellule sono state osservate morfologicamente usando un microscopio ottico. Neuroni, vescicole sinaptiche e glia sono stati identificati rispettivamente da β-III-tubulina e MAP-2, Synapsin-1 e GFAP. Nel frattempo, l'immunocitochimica è stata eseguita su diverse proteine correlate al neurotrasmettitore, come la colina acetiltransferasi, DYNLL2 e SLC17A9.
Introduction
Il tratto urinario inferiore ha due funzioni principali: conservazione periodica delle urine e micturizione1. Il sistema nervoso del tratto urinario inferiore (LUTNS) controlla queste funzioni ed è delicato e suscettibile a molte neuropatie, che possono essere innate (porfiria), acquisite (malattia di Lyme), secondarie agli stati di malattia (cistopatia diabetica), indotte da farmaci (cistite emorragica), chirurgia causata (resezione addominoperineale) o lesioni causate (lesione traumatica del midollo spinale)2,3,4,5,6,7. Negli studi fisiologici/patologici, gli esperimenti in vivo e in vitro sono ugualmente importanti. Mentre la ricerca in vivo sull'LUTNS è stata condotta a livello di organo, cellulare e molecolare per qualche tempo, la ricerca in vitro sui neuroni primari della vescica urinaria è quasi inesistente8,9. Sebbene il presente studio sia limitato, speriamo di essere pionieri della ricerca in questo settore in modo che altri ricercatori possano migliorarla. In questo modo, questa co-coltura può portare a una comprensione cellulare della disfunzione fisiologica nei fenotipi, come la disfunzione neuronale della vescica.
A differenza dei muscoli enterici con una chiara direzionalità delle cellule muscolari in strati discreti, i muscoli della vescica sono disorganizzati10. Pertanto, invece di staccare lo strato esterno della vescica, questo metodo propone di digerire l'intera vescica per ridurre la difficoltà di funzionamento e abbreviare i tempi di pre-elaborazione per un alto tasso di sopravvivenza cellulare.
Seguendo questo metodo, possiamo ottenere una coltura mista di neuroni e altre cellule. Le altre cellule sono indispensabili perché la loro presenza imita un ambiente in vivo11. Inoltre, tali cellule forniscono le sostanze che non sono disponibili nel mezzo.
Questo metodo prevede due passaggi per la digestione. In primo luogo, la collagenasi di tipo II viene utilizzata per idrolizzare il collagene, seguita dalla tripparina, per dissociare il tessuto nelle cellule10. In questo modo, i tessuti della vescica vengono dispersi in singole cellule e quindi crescono relativamente indipendenti. Quando la coltura dei neuroni matura, i neuroni possono essere utilizzati per l'imaging o test funzionali.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali e le procedure animali sono conformi alle linee guida del principio etico del Consiglio Nazionale delle Ricerche.
1. Preparazione dei materiali
- Sterilizzare tutti gli strumenti e ddH2O utilizzando un'autoclave prima di eseguire l'esperimento. Gli strumenti includono ma non sono limitati a forbici chirurgiche, forbici oftalmiche, forcep, divisori a nucleo cucchiai, piatti di vetro (60-100 mm di diametro) e rompisceppi di vetro.
- Preparare la soluzione di Krebs come segue(tabella 1):Sciogliere tutte le sostanze chimiche insieme a ddH2O prima dell'uso. Sciogliere CaCI2 separatamente e aggiungere lentamente nella soluzione mista mescolando per evitare sedimenti.
- Preparare il supporto rinse, costituito da mezzi F12 con siero bovino fetale al 10% (FBS) e 1% antibiotico /antimicotico (100x). Aggiungere 5 mL di FBS e 0,5 mL di antibiotico/antimicotico a 44,5 mL di mezzi F12.
- Preparare il supporto neuronale A, che comprende mezzi neurobasali A con 2% B-27, 1% FBS, 1% L-glutammina, 1% antibiotico/antimicotico (100x) e 0,1% fattore neurotrofico derivato da glia (GDNF). Aggiungere 200 μL di B-27, 100 μL di FBS, 100 μL di L-glutammina, 100 μL di antibiotico/antimicotico (100x) e 10 μL di GDNF (10 μg/mL) a 9,5 mL di mezzi neurobasali A.
NOTA: Preparare il supporto neuronale A entro una settimana dall'uso per garantire la freschezza di B-27, L-glutammina e GDNF. - Preparare il supporto neuronale B utilizzando la stessa procedura della preparazione dei mezzi neuronali A ma senza aggiungere FBS.
- Preparare la soluzione di digestione 1 sciogliendo 20 mg di collagenasi di tipo II, 6 mg di albumina di siero bovino e 200 μL di antibiotico/antimicotico (100x) in 10 mL di soluzione Krebs stabile all'ossigeno.
- Preparare la soluzione di digestione 2 diluendo 1 mL di 0,25% di tripside con 4 mL della soluzione salina bilanciata di Hank.
- Preparare una piastra con copripavimenti rivestiti.
- Utilizzare le forcep in un banco di flusso laminare quando si posizionano le coverlips di vetro in una piastra di coltura da 48.
- Diluire la poli-D-llysina con ddH2O ad una concentrazione di 0,1 mg/mL come stock di poli-D-lsina. Conservare il titolo a -20 °C e scongelare prima dell'uso.
- Aggiungere 40 μL di poli-D-lisina sopra ogni coverlip e incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 minuti.
NOTA: Per diverse piastre con diverse aree basali, regolare la concentrazione a 4 μg/cm2. Ad esempio, se l'area basale di un pozzo da una piastra di 24 po 'è 2 cm2, allora dovremmo trasferire 80 μL di poli-D-lisina in un pozzo. Ogni cm2 conterrebbe 4 μg di poli-D-lsina. - Rimuovere la poli-D-lisina nella piastra a 48 po' e sciacquare le coperture con ddH2O tre volte.
- Asciugare la piastra in una cappa di flusso laminare per almeno 30 minuti per assicurarsi che la piastra sia anidra.
- Conservare la piastra a 4 °C prima del rivestimento di laminina per 1 giorno al massimo. Conservare la piastra a -20 °C è preferibile per lo stoccaggio a lungo termine.
- Scongelare laminina a 4 °C. Diluire laminina con ddH2O ad una concentrazione di 50 μg/mL come stock di laminina. Conservare il titolo a -20 °C e scongelare a 4 °C prima dell'uso.
- Utilizzare una pipetta per trasferire 100 μL di laminina diluita nella parte superiore di ogni coverlip e incubare la laminina a 4 °C per 1 h.
NOTA: Per diverse piastre con diverse aree basali, regolare la concentrazione a 5 μg/cm2. Ad esempio, se l'area basale di un pozzo da una piastra di 24 po 'è 2 cm2, trasferire 200 μL di laminina diluita in un pozzo. Ogni cm2 conterrebbe 5 μg di laminina. - Rimuovere la soluzione di laminina e sciacquare i copriscippi con ddH2O una volta. Eseguire questa operazione sul bordo del coperchio per evitare il raschiamento.
NOTA: I copripasci rivestiti potrebbero essere conservati a 4 °C per al massimo 2 settimane.
2. Raccolta vescica
- Ottieni ratti Sprague-Dawley di cinque settimane.
- Infondere carbogeno (95% ossigeno, 5% CO2)nella soluzione Krebs per almeno 30 minuti in un bagno di ghiaccio per raggiungere uno stato di ossigeno stabile e un livello di pH.
- Dopo l'eutanasia tramite lussazione cervicale, immergere i ratti in 75% di etanolo per 30 s per la sterilizzazione.
- Posizionare i ratti su un asciugamano chirurgico sterilizzato ed esporre il loro addome. Apri la cavità addominale e rivela la vescica con una serie di forbici e forcelle.
- Sollevare delicatamente la vescica e tagliare la vescica dal collo della vescica con un altro set di forbici e forcelle per evitare la contaminazione incrociata. Posizionare rapidamente la vescica nella soluzione Krebs stabile all'ossigeno freddo per migliorare la sopravvivenza cellulare.
NOTA: Una volta rimossa la vescica, eseguire rapidamente le seguenti operazioni per migliorare la prospettiva di sopravvivenza dei neuroni. - Aggiungere la soluzione Krebs in tre piatti di vetro e rompisbi.
- Preparare piatti in vetro e rompisbi con soluzione Krebs in un bagno di ghiaccio per il preraffreddamento.
- Contrassegnare questi contenitori con i numeri da 1 a 3 in modo corrispondente per evitare confusione.
- Abbina ogni piatto di vetro a forcep e un divisore a nucleo cucchiaio.
- Nel piatto di vetro 1, aprire la vescica con forbici oftalmiche e dispiegarla con forcelle e un divisore a nucleo cucchiaio.
- Risciacquare la vescica in un rompicapo 1 e posizionare in un piatto di vetro 2.
- Elimina il grasso aderente sulla superficie del tessuto usando le flessce e le forbici oftalmiche nel piatto di vetro 2.
- Risciacquare la vescica in un rompicapo 2 e posizionarela in un piatto di vetro 3.
- Raschiare delicatamente la vescica usando le forcep e il divisore del nucleo cucchiaio sul piatto di vetro 3 per rimuovere gli attacchi esogeni.
- Risciacquare la vescica in un demolitore di vetro 3, trasferire la vescica in un tubo di centrifuga da 15 ml con 14 ml di soluzione Krebs fredda e ruotare il campione per 1 minuto a 356 x g e 4 °C.
- Ripetere il passaggio precedente due volte in altri due tubi con soluzione Krebs per ridurre la contaminazione.
3. Digestione della vescica in due fase
- Trasferire la vescica dal tubo di centrifuga a una fiala da 2 ml contenente 1 ml di soluzione di digestione 1. Utilizzare forbici oftalmiche per tagliare la vescica a piccoli pezzi (più piccoli di 1 mm) in soluzione.
- Mescolare la soluzione della vescica con 9 mL di soluzione di digestione 1 in un piatto sterile di coltura cellulare (100 mm di diametro). Eseguire la digestione del passaggio 1 in un incubatore di scuotimenti per 1 h sotto il 5% di CO2,37 °C e 200 giri/min.
- Dopo la digestione del passaggio 1, centrifugare la soluzione a 356 x g a 4 °C per 8 min.
- Posizionare la soluzione di digestione 2 in un bagno d'acqua a 37 °C per il preriscaldamento.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante che contiene la soluzione di digestione 1 e raccogliere il sedimento cellulare. È consentito un po 'di liquido rimanente. La rimozione completa della soluzione può favorire la perdita cellulare.
- Mescolare i sedimenti cellulari con la soluzione di digestione calda 2 in un tubo di centrifuga da 15 ml e agitare la miscela durante la digestione in un bagno d'acqua a 37 °C per 5 minuti. Non superare i 7 minuti della digestione del passaggio 2 o i neuroni periranno.
- Dopo la digestione, disattivare immediatamente la tripina nella miscela con 10 mL di mezzi di risciacquo a freddo.
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi a 0 °C–4 °C. Un bagno di ghiaccio potrebbe fornire tali condizioni. - Raccogliere il sedimento cellulare dopo la centrifugazione a 356 x g a 4 °C per 8 min. Rimuovere il più possibile il supporto perché la tripina rimanente è dannosa per la crescita cellulare.
- Resopend sedimento con 3 mL di mezzi neuronali delicatamente. Assicurarsi che le bolle d'aria non vengano generate nella soluzione contenente cellule per un alto tasso di sopravvivenza.
- Filtrare il supporto della miscela attraverso un colino cellulare da 70 μm in un tubo di centrifuga da 50 ml.
- Conservare il filtrato su uno shaker a 30 giri/min in un bagno di ghiaccio per 30 minuti. Questo passaggio non è necessario ma consigliato.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 356 x g a 4 °C per 8 minuti e rimorsi delicatamente il pellet cellulare in 1 mL di mezzi neuronali A.
- Aggiungere 500 μL di miscela cellulare in ogni pondo della piastra preparata a 48 porsi.
- Cellule di coltura in un incubatore a 37 °C e 5% CO2.
- Sostituire tutti i supporti con il supporto neuronale B in 1 h per fornire una coltura priva di siero.
- Cambiare metà del mezzo neuronale B ogni 3 giorni.
NOTA: I neuroni sono pronti per esperimenti immunocitochimici dopo 5-7 giorni di coltura.
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Representative Results
Nel processo di coltura cellulare primaria, le cellule acquisite erano rotonde con limiti luminosi e chiari prima dello stato attaccato. Man mano che i neuroni crescevano, dendriti e assoni cominciavano ad essere distinti. Dopo 5-7 giorni di coltura, i neuroni hanno raggiunto una forma matura con proiezioni lunghe, ideali per l'imaging o gli studi di funzione. Sebbene la maggior parte delle impurità e dei detriti cellulari potessero essere rimossi a causa del cambiamento dei mezzi, alcuni residui attaccati al rivestimento in poli-D-lisina e laminina erano visibili(figura 1).
Dopo una corretta coltura, i neuroni potrebbero essere identificati tramite β-III-tubulina e immunoso immunosottenibileMAP-2 10,12. Inoltre, glia è stato specificamente identificato tramite l'immunoso immunosocienza GFAP10. I neuroni maturi hanno sviluppato spine sinaptiche, che erano vicine alle specializzazioni presnaptiche identificate dall'immunostaining del produttore di proteine sinaptiche, synapsin-1 (Figura 2)12. Questi risultati hanno indicato che le cellule mature con sinapsi ben sviluppate sono state ottenute attraverso questo metodo. Questo risultato suggerisce il suo importante ruolo negli studi sulle funzioni future.
Nel frattempo, diversi sottotipi neuronali sono stati riconosciuti attraverso esperimenti di immunocitochimica (Figura 3). I neuroni peptidergici, che contengono vari neuropeptidi, sono stati immunosostituito con la sostanza P13. I neuroni purinergici con trasportatori nucleotidici vescicolari espressi sono stati identificati tramite colorazione SLC17A914. I neuroni nitrergici sono stati visualizzati con DYNLL-2, che collega nNOS con proteine motorie nei neuroni15. I neuroni colinergici erano immunoreattivi con colina acetiltransferasi16.
Figura 1. Immagini a contrasto di fase di cellule primarie isolate dalla coltura della vescica del ratto scattate rispettivamente a 1, 3 e 7 giorni dopo la placcatura (A, B, C). Barra di scala: 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Immagini di immunofluorescenza di cellule primarie isolate dalla vescica del ratto. L'analisi della microscopia confocale ha mostrato la colorazione delle proteine del citoscheletro neuronale (β-III-tubulina, RRID: AB_2827688, 1:200) nei neuroni della coltura primaria (A) e nella preparazione della vescica a montaggio intero (B). Nei neuroni della coltura primaria, è stata anche visualizzato l'immunosocienza della fosfoproteina neuronale (MAP 2, RRID:AB_2827689, 1:200) (C). Glia sono stati identificati mediante colorazione delle proteine acide fibrillari gliali(D; RRID: AB_627673, 1:50). Le sinapsi sono state visualizzate tramite colorazione proteica della sinapsina (Synapsin-1, RRID: AB_2798146, 1:200) nei livelli cellulari (E) e tissutali (F). Gli anticorpi secondari utilizzati erano i seguenti: Alexa Fluor 488 (verde, capra anti-coniglio lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (rosso, capra anti-topo lgG, 1:200). Il nucleo è stato visualizzato utilizzando Hoechst 33342(A, C, D, E; blu, 1 μg/mL). Barra di scala: 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immagini di immunofluorescenza di diversi sottotipi neuronali di neuroni primari. I neuroni peptidergici sono stati immunosostituito con la sostanza P (A; RRID: AB_785913, 1:50). I neuroni purinergici sono stati identificati tramite colorazione SLC17A9 (B; RRID: AB_10597575, 1:200). I neuroni nitrergici sono stati visualizzati tramite colorazione DYNLL-2 (C; RRID: AB_654147, 1:50). I neuroni colinergici erano immunoreattivi con colina acetiltransferasi (D; RRID: AB_2244867, 1:100). Gli anticorpi secondari utilizzati erano i seguenti: Alexa Fluor 488 (verde, capra anti-coniglio lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (rosso, capra anti-topo lgG, 1:200). Il nucleo è stato visualizzato utilizzando Hoechst 33342(A, B, C, D, blu, 1 μg/mL). Barra di scala: 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| ingredienti | Molarità (mM) |
| Naci | 120 |
| Kci | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| glucosio | 11.5 |
La tabella 1. Composizione della soluzione Krebs
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Discussion
Preparazione piastra
L'uso di coverlips in vetro in piastre di coltura da 6, 12 o 48 pozzi per esperimenti di imaging immunofluorescente o di calcio è un'operazione economica e parsimonioso. Le cellule crescono bene in piastre senza coverlips durante la preparazione di colture cellulari primarie. Pertanto, le coverlips sono dispensabili in esperimenti, come la macchia occidentale o la reazione a catena della polimerasi. Inoltre, il rivestimento è un passo necessario prima di placcare le celle, con o senza coverlips. La laminina e poli-D-lisina sono scelte comuni nel rivestimento dei neuroni, in particolare la laminina, che è essenziale per la crescita deineuroni 17.
Preparazione dei media
Dopo la prima sostituzione media, l'isolamento cellulare richiede mezzi senza siero perché il siero stimola la divisione cellulare e porta a uno spazio limitato di crescita neuronale18. Pertanto, i fattori di crescita dei neuroni sono cruciali. La qualità di B27 e GDNF può variare in gran parte da lotti diversi e causare effetti importanti sulla crescita dei neuroni19. Pertanto, il controllo del numero di lotto del supporto è raccomandato quando la resa dei neuroni è scarsa. Nel frattempo, le nuove scorte di media sono cruciali; l'importo richiesto deve essere calcolato e preparato in anticipo ogni volta prima della sostituzione dei supporti.
animali
I ratti Sprague-Dawley sono usati in questo metodo. Anche i topi C57BL/6 sono accettabili in questo esperimento. Pertanto, altri ceppi di ratti o topi possono anche essere adottati per questo metodo nonostante alcune variazioni nella morfologia e nei circuiti neuronali. In termini di diversi modelli animali, i ricercatori dovrebbero sviluppare un protocollo ottimizzato e mirato. Inoltre, gli animali giovani dovrebbero sempre essere considerati prima dell'applicazione di questo metodo.
Trattamento tissutale
Durante gli esperimenti, ad eccezione del processo digestivo, mantenere i tessuti a bassa temperatura è essenziale per aumentare la vitalità cellulare, che può ridurre il metabolismo cellulare ed evitare deficit energetico. I livelli di ossigeno, nutrizione e pH possono anche influenzare la resa cellulare11. Inoltre, per altri tessuti, suggeriamo ai ricercatori di eseguire questo metodo con condizioni di digestione regolate.
Coltura cellulare
Una caratteristica notevole dei neuroni quando inoculati è la loro rapida aderenza alle piastre rivestite20. In questo caso, si consiglia di cambiare i media dopo 1 h di coltura per ottenere un'alta percentuale di neuroni. Inoltre, quando la maggior parte delle cellule inizia a crescere pseudopodio, la frequenza di cambiamento dei media può essere ridotta in modo appropriato a seconda del colore del supporto e dello stato cellulare. La coltura cellulare primaria in un buon stato mostra soma nero con un bordo luminoso.
La maggior parte delle cellule nervose isolate dalla vescica sono gangli intramurali della vescica, che consistono in innervazioni efferenti afferenti e autonomiche della vescica13. Inoltre, nel tessuto raccolto non sono presenti gangli pelvici importanti. Distribuisce sotto il collo della vescica21.
limitazione
Questa è una ricerca preliminare per isolare e culturare neuroni e glia. Molti tentativi erano stati fatti, come il trattamento della citarabina o la centrifugazione del gradiente di densità. Tuttavia, la proporzione di cellule desiderate non era ancora ideale, e apparve ancora più perdita cellulare. Inoltre, le condizioni digestive tradizionali in questo protocollo, come 37 °C, sono suscettibili di uccidere alcuni tipi di neuroni sensibili e causare potenziali artefatti di espressione genica22.
In conclusione, questo protocollo offre un metodo per coltura di neuroni e glia dalla vescica del ratto. L'isolamento è facile da ripetere, efficiente in termini di tempo e comporta una contaminazione microbica minima. Sebbene sia necessario migliorare la purezza dei neuroni, speriamo che questo metodo contribuisca alla ricerca LUTNS.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi di grande importanza.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (Grant n. 81673676) e dal Dongguan Science and Technology Bureau (Grant n. 2019622101002). Gli autori ringraziano la Dott.ssa Maryrose Sullivan (Assistente professore in Chirurgia, Harvard Medical School) per la consulenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
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