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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Überwachtes maschinelles Lernen zur Semiquantifizierung der extrazellulären DNA bei Glomerulonephritis

Published: June 18, 2020 doi: 10.3791/61180
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Department of Medicine, Monash University, 2Monash Micro Imaging, Monash University, 3Immunology Department, Monash Health

Summary

Extrazelluläre DNA (ecDNA), die während des Zelltodes freigesetzt wird, ist proinflammatorische und trägt zu Entzündungen bei. Die Messung von ecDNA an der Verletzungsstelle kann die Wirksamkeit der therapeutischen Behandlung im Zielorgan bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines Machine Learning-Tools zur Automatisierung der Messung von ecDNA im Nierengewebe.

Abstract

Der Glomeruläre Zelltod ist ein pathologisches Merkmal der Myeloperoxidase anti neutrophilen zytoplasmatischen Antikörperassoziierten Vaskulitis (MPO-AAV). Extrazelluläre Desoxyribonukleinsäure (ecDNA) wird bei verschiedenen Formen des Zelltodes freigesetzt, einschließlich Apoptose, Nekrose, Nekroptose, neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und Pyroptose. Die Messung dieses Zelltodes ist zeitaufwändig, wobei mehrere verschiedene Biomarker erforderlich sind, um die verschiedenen biochemischen Formen des Zelltodes zu identifizieren. Die Messung von ecDNA wird in der Regel in Serum und Urin als Ersatz für Nierenschäden durchgeführt, nicht im eigentlichen Zielorgan, wo die pathologische Verletzung auftritt. Die aktuelle Schwierigkeit bei der Untersuchung von ecDNA in der Niere ist das Fehlen von Methoden für formalin fixiertes Paraffin-eingebettetes Gewebe (FFPE) sowohl experimentell als auch in archivierten menschlichen Nierenbiopsien. Dieses Protokoll bietet eine Zusammenfassung der Schritte, die erforderlich sind, um für ecDNA in FFPE-Gewebe (sowohl menschliche als auch murine), abschrecken Autofluoreszenz und messen die ecDNA in den resultierenden Bildern mit einem Machine Learning-Tool aus der öffentlich verfügbaren Open-Source-ImageJ-Plugin trainable Weka Segmentierung. Die trainierbare Weka-Segmentierung wird auf ecDNA innerhalb der Glomeruli angewendet, wo das Programm lernt, ecDNA zu klassifizieren. Dieser Klassifizierer wird auf nachfolgende erworbene Nierenbilder angewendet, wodurch die Notwendigkeit manueller Anmerkungen für jedes einzelne Bild reduziert wird. Die Anpassungsfähigkeit der trainierbaren Weka-Segmentierung wird weiter im Nierengewebe von experimenteller muriner Anti-MPO-Glomerulonephritis (GN) nachgewiesen, um NETs und ecMPO, häufige pathologische Mitwirkende an Anti-MPO GN, zu identifizieren. Diese Methode bietet eine objektive Analyse von ecDNA im Nierengewebe, die die Wirksamkeit deutlich zeigt, in der das trainierbare Weka-Segmentierungsprogramm ecDNA zwischen gesundem normalem Nierengewebe und krankem Nierengewebe unterscheiden kann. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um ecDNA, NETs und ecMPO in anderen Organen zu identifizieren.

Introduction

Myeloperoxidase anti neutrophile zytoplasmatische Antikörper assoziierte Vaskulitis (MPO-AAV) ist eine Autoimmunerkrankung, die zu Nierenversagen von pathologischen glomerulären Verletzungen mit erheblichem Zelltod und Freisetzung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)1,2führt. DNA kann das Immunsystem aktivieren, indem sie als Gefahrensignal fungiert. Unter normalen gesunden Bedingungen bietet die nukleare Lage der DNA Schutz vor der Exposition gegenüber dem Immunsystem. Selbst-DNA, die extrazellulär während entweder pathogener Prozesse oder Autoimmunität freigesetzt wird, wird vom Immunsystem als eine potente proinflammatorische Schädigung assoziierter molekularer Selbstprotein (DAMP)3gesehen. Extra zelluläre DNA (ecDNA) wird aus sterbenden Zellen durch mehrere verschiedene Mechanismen freigesetzt, die durch verschiedene biochemische Bahnen gesteuert werden, wie Apoptose, Nekrotophile extrazelluläre Trapbildung (NETs), Nekrose oder Pyroptose4,5,6,7,8.

Wir beschreiben hierin Methoden zur Färbung und Messung von ecDNA, die aus sterbenden Zellen in Abschnitten von formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Nieren von experimentellen Anti-MPO-GN- und Nierenbiopsien von Patienten mit MPO-AAV9,10freigesetzt werden. Es gibt mehrere Methoden zum Nachweis von zirkulierender doppelsträngiger DNA (dsDNA) und DNA-Komplexen aus Serum und Urin sowie aus In-vitro-Assays11,12. Diese Methoden, obwohl genau bei der Bestimmung der Menge an ecDNA, bestimmen nicht, wo die ecDNA anatomisch freigesetzt wird. Es gibt Methoden, die spezifische Messung von ecDNA wie Tunel für Apoptose und Messung von Zellablagerungen13,14beschreiben. Es gibt keine Methode, die die Messung von ecDNA beschreibt, die aus allen Formen des Zelltodes in FFPE-Nieren gegipfelt, wo die pathologische Schädigung auftritt. Dies ist wichtig, um festzustellen, ob experimentelle therapeutische Behandlungen die ecDNA von den Stellen der pathologischen Verletzung im eigentlichen Zielorgan löschen.

Die Erfassung mehrerer Bilder aus Nierenproben erzeugt ein hohes Datenvolumen, das häufig von einem einzelnen Benutzer analysiert wird. Dies ist arbeitsintensiv, zeitaufwändig und kann aufgrund von Voreingenommenheit des Benutzers einer unzuverlässigen Reproduzierbarkeit durch andere Benutzer unterliegen. Trainable Weka Segmentierung ist ein Open-Source-Software-Plugin für ImageJ, das modernste bioinforschende Werkzeuge verwendet, um Pixel mit Machine Learning-Algorithmen15,16zu klassifizieren. Diese Methode ist "trainierbar", wobei sie aus der Klassifizierung von Pixelsegmenten des Benutzers lernt und die neu gelernte Klassifizierung auf andere Bilder anwendet. Diese Methode basiert auf gängigen Analysewerkzeugen innerhalb des ImageJ-Programms, die verwendet werden, um jedes Pixel in einem Segment als zu einer bestimmten "Klasse" gehörend zu "klassifizieren". Sobald das Programm die "Klassifikatoren" erlernt hat, können sie verwendet werden, um andere ähnliche klassifizierte Segmente innerhalb desselben Bildes zu identifizieren. Dieses Modell wird dann gespeichert und auf andere Bildsätze innerhalb desselben Experiments angewendet.

Aktuelle Hindernisse bei der Bestimmung von ecDNA in situ in Nierenabschnitten ist die endogene Autofluoreszenz durch Fixierung im Formalin und die arbeitsintensive Analyse der Bilder. Wir beschreiben hier, wie diese Autofluoreszenz zu löschen, zu erkennen ecDNA, und verwenden überwachtes maschinelles Lernen für hohe Durchsatzmessung von ecDNA. Wir haben bereits die Messung von NETs und extrazellulärem MPO (ecMPO) mit einem Makro in ImageJ veröffentlicht, wir demonstrieren jetzt die Halbautomatisierung dieser Methoden mit überwachtem maschinellem Lernen1. Wir zeigen die Anpassungsfähigkeit des Machine Learning Tools, um einen alternativen Fleck für NETs und ecMPO innerhalb desselben Bildes zu klassifizieren. Diese hier beschriebenen Färbemethoden zum Nachweis von ecDNA, NETs und ecMPO können in andere feste Organe und Krankheiten übersetzt werden, bei denen ecDNA, NETS und ecMPO eine Rolle bei der Aufrechterhaltung von Krankheiten wie rheumatoider Arthritis und Lupus17,18spielen.

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Protocol

Diese Methode ermöglicht die Detektion von Pan ecDNA aus allen Formen des Zelltodes. Die gleiche Methode und Antikörper werden für menschliches Nierenbiopsiegewebe verwendet (ab Schritt 4). Alle tierischen und menschlichen Probanden hatten die Ethik-Zulassung von der Monash University und Monash Health, Clayton, Victoria, Australien.

1. Färbung für ecDNA mit DAPI und A-Actin

  1. Induzieren Sie ein 20-Tage-Modell der Anti-Myeloperoxidase Glomerulonephritis (Anti-MPO-GN) in 8-10 Wochen alten C57/Bl6 Mäusen, mit Kontrollen9.
    1. Euthanisieren Sie Mäuse human mit einerCO2-Kammer.
    2. Entfernen Sie die Nieren, indem Sie einen vorderen Mittellinienschnitt durch die Haut mit einer Schere machen, und schneiden Sie dann vorsichtig das Peritoneum und stecken Sie wieder auf einem Sezierbrett. Mit Zangen schieben Sie die vordere Nierenfaszie und das parietale Peritoneum beiseite und schneiden Sie die Niere frei, indem Sie den Harnleiter und die Blutgefäße (Nierenarterie und Vene) am Nierenbecken abtrennen. Mit Zangen entfernen und Nieren halbieren (sagittale Ebene) mit einem Skalpell der Größe 22.
    3. Die Niere 16 Stunden bei Raumtemperatur (RT) fixativ (4% gepuffertes Formalin) aufstellen. Entfernen und einweichen feste Niere in 30% Ethanol für 24 Stunden vor der Verarbeitung.
  2. Verarbeiten Sie Nieren mit einem Standard 6-Stunden-Zyklus:
    70% Ethanol für 15 min
    90% Ethanol für 15 min
    100% Ethanol für 15 min
    100% Ethanol für 20 min
    100% Ethanol für 25 min
    100% Ethanol für 30 min
    Xylol für 20 min
    Xylol für 30 min
    Xylol für 40 min
    Wachs für 30 min
    Wachs für 35 min
    Wachs für 40 min
    HINWEIS: Dies ist wichtig, da Nieren nicht einer längeren Hitzeexposition im Wachs ausgesetzt werden sollten, da es Antigene von Interesse zerstören kann.
  3. Schneiden Sie 3 m Abschnitte auf einem Mikrotome und montieren Sie auf handelsüblichen Glasmikroskopschlitten, die mit einer positiven Ladung beschichtet sind. Über Nacht trocknen lassen.
  4. Glasrutschen in einen Schiebeträger in einen 60 °C-Ofen für 60 min geben.
    HINWEIS: Die Schritte 1.3 und 1.4 sind entscheidend, um sicherzustellen, dass Abschnitte während des Antigen-Abrufschritts nicht abschwimmen.
  5. Tauchen Sie in zwei Wechsel des Lösungsmittels (Xylol oder Ersatz) für jeweils 40 min, in einer Dunstabzugshaube.
  6. Rehydratginginginiert in 100% Ethanol, 100% Ethanol, 70% Ethanol für je 5 min. 5 min in Leitungswasser waschen.
  7. Legen Sie eine Kochplatte in eine Dunstabzugshaube und Preboil Antigen Retrieval Lösung (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) in einem Schnellkochtopf. Sobald die Antigen-Retrieval-Lösung zu kochen beginnt, legen Sie die Dias horizontal mit einer Zange in den Topf und verriegeln Sie den Deckel. Kochen sie auf hoch (entspricht 15 psi oder 103 kPa) für 10 min.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, da er das Antigen von Interesse abruft, indem es das Antigen-Epitop (kreuz verbunden über formalin fixation) entlarvt, um eine epitop-antikörperspezifische Bindung zu ermöglichen, ohne die anschließende Färbung nicht funktionieren wird.
  8. Entfernen Sie den Schnellkochtopf von der Hitze und entfernen Sie den Deckel sofort, indem Sie kalten Wasserhahn auf dem Deckel in einem Waschbecken laufen lassen. Lassen Sie die Dias für 20 min in der Antigen-Retrieval-Lösung ausdemieren.
  9. Spülen Sie zweimal für 5 min in 0,01 M Phosphat gepufferte Saline (PBS) (pH 7.4) auf einem Orbitalshaker.
  10. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um Kreise um das Nierengewebe zu ziehen, wobei darauf geachtet wird, dass in dieser Zeit kein Gewebe austrocknet.
  11. Blockgewebe in 10% Hühnersera in 5% Rinderserumalbumin (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) für 30 min, 60 l pro Abschnitt. Nach diesem Schritt nicht waschen, aber vorsichtig die Blockierlösung mit einer 60-L-Pipette entfernen, die Abschnitte nicht austrocknen lassen.
  12. Primäre Antikörper-Cocktail für 1/1000 in 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 l pro Abschnitt und über Nacht in einer Feuchtekammer bei 4 °C inkubieren.
  13. Zweimal für 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) auf einem Orbital-Shaker gleitet.
  14. Sekundärantikörper, Hühnerantikaninchen 488 (1/200), 60 l pro Abschnitt in 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) verdünnt, 40 min bei RT auftragen.
  15. Waschen Sie die Dias zweimal für 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) auf einem Orbital-Shaker.
  16. Tauchen Sie die Dias in 0.3% Sudan Black in 70% Ethanol für 30 min in einem Coplin Glas ein.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, da er die durch formale Fixierung verursachte Autofluoreszenz löscht.
  17. Waschen Sie die Dias in Leitungswasser, um Niederschlag zu entfernen, und tauchen Sie dann 10 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) ein, um weitere Sudan Black Niederschlagbildung zu verhindern.
  18. Schieben Sie die Schlitten auf konfokale Glasabdeckungen mit drei 60-L-Tropfen Montagelösung mit DAPI und versiegeln Sie die Abdeckungen mit Nagellack, indem Sie den Umfang des Deckels auftragen.
  19. Lassen Sie die Dias 24 Stunden lang bei RT aushärten (damit DAPI eindringen kann) und lagern Sie sie dann bei 4 °C, die vor Licht geschützt sind.
    HINWEIS: Wichtig, im Dunkeln zu bleiben, um das Ausbleichen von fluoreszierenden Sonden zu verhindern.
  20. Bilddiaber mit einem konfokalen Laser-Scanning-Kopf, der an einem Mikroskop befestigt ist. Excite Dias mit dem 405 Laser für DAPI und dem 488 Laser für Beta Actin. Erfassen Sie 1024 x1024 Pixel-Bilder mit einer einzigen Ebene, indem Sie zeilensequendes Erfassen und 4-Linien-Mittelung verwenden, was für die Erkennung von ecDNA unerlässlich ist. 40x 1.0 NA Ölobjektiv verwendet wird.
    1. Bild ein Minimum von 20 Glomeruli pro Probe. Speichern Sie Bilder als ND2-Dateien.

2. DAPI- und A-Actin-Analyse

  1. Installieren Sie ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Überprüfen Sie, ob die trainierbare Weka-Segmentierung unter Plugins verfügbar ist | Segmentierung | Trainable Weka Segmentierung.
  3. Legen Sie das Bild auf die ImageJ-Symbolleiste. Klicken Sie auf Bild | Farbe | Split Kanäle. Es erscheint ein Bild mit DAPI in blauer Färbung aller Kerne und 1 Bild mit dem '-Actin in grün, das die Glomeruli umfängst.
    1. Erstellen Sie eine zusammengeführte Datei der einzelnen Bilder, um eine Region von Interesse (ROI) für den Glomerulus zu zeichnen, indem Sie auf Farbe | Merge-Kanäle. In einem Popup-Feld wird darum gebeten, jedem Kanal eine Farbe zuzuweisen. Nachdem Sie jedem Kanal eine Farbe zugewiesen haben, aktivieren Sie das Feld Composite erstellen und das Feld Quellbilder beibehalten, und klicken Sie auf Ok. Ein zusammengeführtes zusammengesetztes Bild wird angezeigt.
    2. Zeichnen Sie einen ROI um den glomerulären Büschel, indem Sie die Färbung von '-actin als Leitfaden verwenden. Bewahren Sie dieses Bild beiseite, um den ROI am Ende dieses Protokolls zu verwenden.
  4. Führen Sie eine Gaußsche Unschärfe auf dem einzelnen blauen DAPI-Bild aus. Klicken Sie auf Prozess | Filter | Gaußsche Unschärfe, setzen Sie in 1-2.00. Das Bild sieht nun etwas verschwommen aus, aber die Kerne sind nun glatt und der Hintergrund aufgeweicht.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist vorgeformt, um Rauschen zu entfernen, um das Bild von Artefakten zu bereinigen, die eine relevante Erkennung von Bildattributen verhindern können, die analysiert werden.
  5. Klicken Sie auf Plugins | Segmentierung | Trainable Weka Segmentierung.
  6. Verfolgen Sie mit dem Linienwerkzeug auf der Werkzeugleiste in ImageJ zunächst intakte Kerne mit den Freien Handwerkzeugen (es stehen Linien-, Kreis- und quadratische Werkzeugoptionen zur Auswahl) und fügen Sie dann dem Feld Klasse 1 hinzufügen hinzu.
  7. Mit dem Linienwerkzeug auf der Werkzeugleiste in ImageJ zeigen Sie Die Hintergründe an das Feld Klasse 2.
  8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Klasse erstellen im Weka-Segmentierungsfenster und beschriften Sie "ecDNA". Verwenden Sie das Linienwerkzeug (aus der ImageJ-Werkzeugleiste), um die von DAPI gebeizte extranukleare DNA zu abbilden.
  9. Klicken Sie im Trainingsmenü im zugfähigen Weka-Segmentierungsfenster auf den Button Zugklassifier.
    HINWEIS: Die STOP-Taste wird anstelle der Schaltfläche Zugklassifier angezeigt und bleibt, bis das Training abgeschlossen ist. Klicken Sie während des Trainings nicht auf diese Schaltfläche, da der Prozess unterbrochen wird.
  10. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ergebnis erstellen, um ein Bild mit allen klassifizierten Komponenten zu erstellen, die aus intakten Kernen, dem Hintergrund und der identifizierten ecDNA bestehen.
  11. Klicken Sie auf die Schaltfläche Wahrscheinlichkeit abrufen. Schalten Sie die Maus um, um ein Schwarzweißbild aller Klassen mit dem weiß hervorgehobenen Auswahlobjekt zu geben.
  12. Duplizieren Sie dieses Bild, indem Sie auf Bild | Duplikat.
  13. Schalten Sie mit der Maustaste, die die ecDNA enthält, auf den Bildschirm um. Wenden Sie einen Schwellenwert an, um nur das zu erhalten, was als ecDNA identifiziert wurde. Klicken Sie auf Anwenden, wenn der Schwellenwert ausreichend ist.
  14. Wenn nach dem Schwellenwert mehr DNA-Bereiche vorhanden sind, die nicht ecDNA sind, kehren Sie zum ursprünglichen trainierten Bild zurück, fügen Sie weitere Klassifikatoren hinzu, und wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.13.
  15. Klicken Sie auf Bild | Bildanpassung | Machen Sie Binary. Kopieren Sie den glomerulären ROI in Schritt 2.3 und klicken Sie auf Strg+Umschalt+E. Aktivieren Sie das Weka-Fenster durch Bearbeiten | Auswahl | Wiederherstellen, wodurch die Auswahl wiederhergestellt wird. Klicken Sie auf Partikel analysieren, die nur die ecDNA-Partikel im Glomerulus messen.
    HINWEIS: Ein Ergebnisblatt wird mit der Anzahl der Partikel, der Fläche, den Durchschnittspixeln und dem Prozentsatz des Glomerulus berechnet, der ecDNA enthält. Diese Ergebnisse können in eine Kalkulationstabelle exportiert und gespeichert werden, um sie später statistisch zu analysieren.
  16. Speichern Sie den Klassifier als ecDNA.classifier, indem Sie im Optionsmenü in der ImageJ-App auf dem Desktop auf Klassifier speichern klicken. Klicken Sie dann im Optionsmenü auf Daten speichern und speichern Sie als ecDNA.arff im ImageJ-Ordner. Der ROI muss jedes Mal manuell hinzugefügt werden, wenn sich Glomerulus-Größe und -Form ändern, aber das Programm hat gelernt, was ecDNA ist.
  17. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.5 mit einem neuen Bild, um das Modell erneut auf nachfolgende Bilder anzuwenden. Klicken Sie im Optionsmenü auf Klassifier laden und dann im ImageJ-Ordner aus Schritt 2.16 auf "Klassifier laden". ecDNAmodel.classifier Das Protokollmenü wird angezeigt und das Modell ausgeführt.
  18. Sobald das Modell ausgeführt wurde, klicken Sie im Optionsmenü auf Daten laden und wählen Sie die im ImageJ-Ordner gespeicherte Datei ecDNA.arff aus Schritt 2.16 aus. Klicken Sie auf Ergebnis erstellen. Wenn das resultierende Bild nicht alle Kerne, Hintergründe oder ecDNA auf den Neu-Zug-Klassifikator klicken und weitere Klassifikatoren hinzufügen und das neue Modell speichern konnte. Schließen Sie den Analyseprozess ab, indem Sie die Schritte 2.9-2.16 wiederholen.
    HINWEIS: Mehrere Bilder können verwendet werden, um das endgültige Modell zu generieren, das verwendet wird, um ecDNA zu erkennen. Dies wird erreicht, indem das Modell auf nachfolgende Bilder angewendet, weitere Klassifikatoren hinzugefügt und das neue Modell und die Neuen Daten im ImageJ-Ordner gespeichert werden. Dies kann besonders wichtig sein, wenn verschiedene Stichproben einen höheren Hintergrund haben. Das Weka Segmentation Programm ist auch kompatibel mit ImageJ Makrosprache, die viele der Befehle makrobeschreibbar ist, um einige der Schritte zu automatisieren.

3. Messung von neutrophilen extrazellulären Fallen und ecMPO

HINWEIS: Diese Methode identifiziert NETs durch Kolokalisierung von extrazellulärer DNA, Citrullinated Histones peptidyl arginase 4 (PAD4) und MPO.

  1. Induzieren Sie ein 20-Tage-Modell der Anti-Myeloperoxidase Glomerulonephritis (Anti-MPO-GN) in 8-10 Wochen alten C57/Bl6 Mäusen, mit Kontrollen9.
    1. Euthanisieren Sie Mäuse human mit einerCO2-Kammer.
    2. Entfernen Sie die Nieren, indem Sie einen vorderen Mittellinienschnitt durch die Haut mit einer Schere machen, und schneiden Sie dann vorsichtig das Peritoneum und stecken Sie wieder auf einem Sezierbrett. Mit Zangen schieben Sie die vordere Nierenfaszie und das parietale Peritoneum beiseite und schneiden Sie die Niere frei, indem Sie den Harnleiter und die Blutgefäße (Nierenarterie und Vene) am Nierenbecken abtrennen. Mit Zangen entfernen und Nieren halbieren (sagittale Ebene) mit einem Skalpell der Größe 22.
    3. Die Niere 16 Stunden bei Raumtemperatur (RT) fixativ (4% gepuffertes Formalin) aufstellen. Entfernen und einweichen feste Niere in 30% Ethanol für 24 Stunden vor der Verarbeitung.
  2. Verarbeiten Sie Nieren mit einem Standard 6-Stunden-Zyklus:
    70% Ethanol für 15 min
    90% Ethanol für 15 min
    100% Ethanol für 15 min
    100% Ethanol für 20 min
    100% Ethanol für 25 min
    100% Ethanol für 30 min
    Xylol für 20 min
    Xylol für 30 min
    Xylol für 40 min
    Wachs für 30 min
    Wachs für 35 min
    Wachs für 40 min
    HINWEIS: Nieren sollten nicht einer längeren Hitzeexposition im Wachs ausgesetzt werden, da sie Antigene von Interesse zerstören kann.
  3. Schneiden Sie 3 m Abschnitte auf einem Mikrotome und montieren Sie auf handelsüblichen Glasmikroskopschlitten, die mit einer positiven Ladung beschichtet sind. Über Nacht trocknen lassen
  4. Glasrutschen in einen Schiebeträger in einen 60 °C-Ofen für 60 min geben.
    HINWEIS: Die Schritte 3.3-3.4 sind entscheidend, um sicherzustellen, dass Abschnitte während des Antigen-Abrufschritts nicht abschwimmen.
  5. Tauchen Sie in zwei Wechsel des Lösungsmittels (Xylol oder Ersatz) für jeweils 40 min, in einer Dunstabzugshaube.
  6. Rehydratginginginiert in 100% Ethanol, 100% Ethanol, 70% Ethanol für je 5 min.
  7. 5 min in Leitungswasser waschen.
  8. Legen Sie eine Kochplatte in eine Dunstabzugshaube und Preboil Antigen Retrieval Lösung (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) in einem Schnellkochtopf. Sobald die Antigen-Retrieval-Lösung beginnt zu kochen, legen Sie die Dias horizontal mit einem Paar Zange in den Topf und verriegeln Sie den Deckel. Kochen sie auf hoch (entspricht 15 psi oder 103 kPa) für 10 min.
    HINWEIS: Dieser Schritt ruft das Antigen von Interesse ab, indem das Antigen-Epitop (kreuz verbunden über Formalin-Fixierung) entlarvt wird, um eine epitop-antikörperspezifische Bindung zu ermöglichen, die nachfolgende Färbung wird ohne diesen Schritt nicht funktionieren.
  9. Entfernen Sie den Schnellkochtopf von der Hitze und entfernen Sie den Deckel sofort, indem Sie kalten Wasserhahn auf den Deckel in einem Waschbecken laufen. Lassen Sie die Dias für 20 min in der Antigen-Retrieval-Lösung ausdemieren.
  10. Zweimal für 5 min in Phosphatgepufferter Saline (PBS) (pH 7,4, 0,01 M) auf einem Orbitalshaker waschen.
  11. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um Kreise um das Nierengewebe zu ziehen, wobei darauf geachtet wird, dass in dieser Zeit kein Gewebe austrocknet.
  12. Blockgewebe in 10% Hühnersera in 5% Rinderserumalbumin (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) für 30 min, 60 l pro Abschnitt. Nach diesem Schritt nicht waschen, aber vorsichtig die Blockierlösung mit einer 60-L-Pipette entfernen. Lassen Sie die Abschnitte nicht austrocknen.
  13. Machen Sie einen Cocktail der primären Antikörper in 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) in 1 Tube verdünnt. Tragen Sie 60 l pro Nierenabschnitt auf. Die Konzentration der primären Antikörper ist wie folgt:
    Kaninchen Anti Mensch/Maus H3Cit 1/100
    Maus Anti Mensch/Maus PAD4 1/50
    Ziege Anti Mensch/Maus MPO 1/200
  14. Über Nacht bei 4 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.
  15. Zweimal für 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) auf einem Orbital-Shaker gleitet.
  16. Machen Sie einen Cocktail der sekundären Antikörper in 1 Tube. Sekundäre Antikörper werden in 1% BSA/PBS, 60 l pro Abschnitt wie folgt angewendet:
    Huhn Anti Kaninchen 488 1/200.
    Huhn Antimaus 647 1/200.
    Huhn anti Ziege 594 1/200.
  17. Inkubieren bei RT für 40 min.
  18. Zweimal für 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) auf einem Orbital-Shaker gleitet.
  19. Sekundärantikörper 1:200 in 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) für 40 min bei RT 60 l pro Abschnitt anwenden.
  20. Zweimal für 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) auf einem Orbital-Shaker gleitet.
  21. Tauchen Sie in 0.3% Sudan Black in 70% Ethanol für 30 min.
  22. Schlitten in Leitungswasser waschen, um Niederschlag zu entfernen und dann 10 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) einzutauchen, um weitere Sudan Black Niederschlagbildung zu verhindern.
  23. Montieren Sie die Schlitten auf konfokale Glasabdeckungen mit drei 60-L-Tropfen Montagelösung mit DAPI. Versiegeln Sie die Abdeckungen mit Nagellack, indem Sie um den Umfang des Coverslip auftragen.
  24. Lassen Sie die Dias 24 Stunden lang bei RT aushärten (damit DAPI eindringen kann) und lagern Sie sie dann bei 4 °C, die vor Licht geschützt sind. Halten Sie sich im Dunkeln, um das Verblassen von fluoreszierenden Sonden zu verhindern.
  25. Bilddiaber mit einem konfokalen Laser-Scanning-Kopf, der an einem Mikroskop befestigt ist. Excite Dias mit dem 405 Laser für DAPI und dem 488 Laser für H3Cit, 561 für MPO und 647 für PAD4. Erfassen Sie 1024x1024-Pixelbilder mit einer zeilensequenden Aufnahme und 4-Linien-Mittelung, die für die Erkennung von ecDNA unerlässlich ist. Verwenden Sie ein 40x 1.0 NA Ölobjektiv. Bild ein Minimum von 20 Glomeruli pro Probe. Speichern Sie Bilder als ND2-Dateien.

4. Neutrophile extrazelluläre Fallen und ecMPO-Analyse

  1. Installieren Sie ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Überprüfen Sie, ob die trainierbare Weka-Segmentierung unter Plugins verfügbar ist | Segmentierung | Trainable Weka Segmentierung.
  3. Legen Sie das Bild in ImageJ ab. Klicken Sie auf Bild | Farbe | Split Kanäle. Ein Bild mit DAPI in blauer Färbung aller Kerne erscheint, ein Bild mit H3Cit in grün, ein Bild mit MPO in rot und ein Bild mit PAD4 in Weiß.
    1. Erstellen Sie eine zusammengeführte Datei der einzelnen Bilder, um einen ROI für den Glomerulus zu zeichnen, indem Sie auf Farbe | Merge-Kanäle. In einem Popup-Feld wird darum gebeten, jedem Kanal eine Farbe zuzuweisen. Nachdem Sie jedem Kanal eine Farbe zugewiesen haben, aktivieren Sie das Feld Composite erstellen und das Feld Quellbilder beibehalten, und klicken Sie auf Ok. Ein zusammengeführtes Bild wird angezeigt. Im Gegensatz zum Protokoll für ecDNA zuvor verwenden wir das zusammengesetzte Bild, um die restlichen Schritte auszuführen.
  4. Führen Sie eine Gaußsche Unschärfe auf dem zusammengesetzten Bild aus. Dies ermöglicht eine Glättung der Kerne. Klicken Sie auf Prozess | Filter | Gaußsche Unschärfe, setzen Sie in 1.00-2.00. Das Bild sieht nun etwas verschwommen aus, aber die Kerne sind nun glatt und der Hintergrund aufgeweicht.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist vorgeformt, um Rauschen zu entfernen, um das Bild von Artefakten zu bereinigen, die eine relevante Erkennung von Bildattributen verhindern können, die analysiert werden.
  5. Klicken Sie auf Plugins | Segmentierung | Trainable Weka Segmentierung. Es erscheint ein ganz neues Fenster mit dem zu analysierenden Bild und den weka-Segmentierungsspezifischen Menüwerkzeugen.
  6. Verwenden Sie das Linienwerkzeug auf der Werkzeugleiste (in ImageJ), verfolgen Sie zunächst eine Spur um intakte Kerne, die nicht positiv für alle 4 NET-Komponenten (MPO, PAD4, DAPI und H3Cit) sind, indem Sie das Freihandwerkzeug verwenden, und fügen Sie dann dem Feld Klasse 1 hinzufügen hinzu.
  7. Mit dem Linienwerkzeug in der ImageJ-Werkzeugleiste zeigen Sie Die Hintergründe zum Feld Klasse 2.
  8. Klicken Sie im Label-Menü auf die Schaltfläche Neue Klasse erstellen und beschriften Sie "NETs". Verwenden Sie das Linienwerkzeug, um NETS zu kennnieren, die als Co-Lokalisierungs-DAPI (blau), MPO (rot), PAD4 (weiß) und citrullinierte Histone (grün) identifiziert wurden.
  9. Klicken Sie im Label-Menü auf die Schaltfläche Neue Klasse erstellen und beschriften Sie "ecMPO". Verwenden Sie das Linienwerkzeug, um mPO (rot) zu ableiten, das zellfrei ist.
  10. Klicken Sie im Trainingsmenü im Fenster Trainable Weka Segmentation auf die Schaltfläche Zugklassifier.
    HINWEIS: Die STOP-Taste wird anstelle der Schaltfläche Zugklassifier angezeigt und bleibt, bis das Training abgeschlossen ist. Klicken Sie während des Trainings nicht auf diese Schaltfläche und der Prozess wird unterbrochen.
  11. Klicken Sie im Trainingsmenü auf die Schaltfläche Ergebnis erstellen und es wird ein Bild mit allen klassifizierten Komponenten erstellt, bestehend aus intakten Kernen, dem Hintergrund und dem, was als ecMPO identifiziert wurde.
  12. Klicken Sie im Trainingsmenü auf die Schaltfläche Wahrscheinlichkeit abrufen. Schalten Sie die Maus um, um ein Schwarzweißbild aller Klassen mit dem weiß hervorgehobenen Auswahlobjekt zu geben.
  13. Duplizieren Sie sowohl die NET-Wahrscheinlichkeit als auch das ecMPO-Wahrscheinlichkeitsbild, indem Sie auf Bild | Duplikat.
  14. Schalten Sie mit der Maustaste, die NETs enthält, auf den Bildschirm um. Wenden Sie einen Schwellenwert an, um sicherzustellen, dass nur die genannten NE hervorgehoben werden. Klicken Sie in der BildJ-Menüleiste auf Bild | Anpassen | Schwellenwert. Verschieben Sie die verschiebbaren Kippstangen, bis auf den NET-Komponenten hervorgehoben ist. Klicken Sie auf Anwenden, wenn Sie mit dem Schwellenwert zufrieden sind. Wiederholen Sie die gleichen Schritte für ecMPO.
  15. Wenn nach dem Schwellenwert immer noch Bereiche von ecMPO oder NETs erkannt werden, kehren Sie zum ursprünglichen trainierten Bild zurück, und fügen Sie weitere Klassifikatoren hinzu, und wenden Sie die Schritte 4.1-4.14 erneut an.
  16. Klicken Sie auf Bild | Bildanpassung | Machen Sie Binary. Kopieren Sie den glomerulären ROI in Schritt 4.3, klicken Sie auf Strg+Umschalt+E. Aktivieren Sie das Weka-Fenster durch Bearbeiten | Auswahl | Wiederherstellen, wodurch die Auswahl wiederhergestellt wird. Klicken Sie auf Partikel analysieren, um nur die NET-Partikel innerhalb des Glomerulus zu messen.
  17. Schalten Sie mit der Maustaste, die ecMPO enthält, auf den Bildschirm um. Wenden Sie einen Schwellenwert an, um sicherzustellen, dass nur identifizierte ecMPO abgerufen werden. Klicken Sie auf Anwenden, wenn Sie mit dem Schwellenwert zufrieden sind. Wiederholen Sie Schritt 4.16 oben.
    HINWEIS: Ein Ergebnisblatt wird mit der Anzahl der Partikel, der Fläche, den Durchschnittspixeln und dem Prozentsatz der Glomerulus berechnet, die sowohl NETs als auch ecMPO enthalten. Diese Ergebnisse können dann in eine Kalkulationstabelle eingebracht und für eine spätere statistische Analyse gespeichert werden.
  18. Speichern Sie den Klassifier als NETs.classifier, indem Sie im Optionsmenü auf Klassifier speichern klicken und die Datei in der ImageJ-App auf dem Desktop (ImageJ-Ordner) speichern. Klicken Sie dann im Optionsmenü auf Daten speichern und als NETs.arff-Datei speichern. Der glomeruläre ROI muss jedes Mal manuell hinzugefügt werden, wenn sich glomerulus Größe und Form ändern, aber das Programm hat gelernt, was sowohl NETs als auch ecMPO sind.
  19. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.5 mit einem neuen Bild, um das Modell erneut auf nachfolgende Bilder anzuwenden. Klicken Sie im Optionsmenü auf Klassifier laden. Klicken Sie im ImageJ-Ordner auf Nets.classifier. Das Protokollmenü wird angezeigt und das Modell ausgeführt, sobald das Modell ausgeführt wurde, klicken Sie im Optionsmenü auf Daten laden und wählen Sie die Datei NETs.arff aus.
    1. Klicken Sie auf Ergebnis erstellen. Wenn das resultierende Bild nicht alle Kerne, Hintergründe oder ecDNA auf den Neu-Zug-Klassifikator klicken und weitere Klassifikatoren hinzufügen und das neue Modell speichern konnte. Schließen Sie den Analyseprozess ab, indem Sie die Schritte 4.11-4.19 wiederholen.
      HINWEIS: Mehrere Bilder können verwendet werden, um das endgültige Modell zu generieren, das verwendet wird, um ecDNA, ecMPO und NETs zu erkennen. Dies wird erreicht, indem das Modell auf nachfolgende Bilder angewendet, weitere Klassifikatoren hinzugefügt und das neue Modell und die Neuen Daten im ImageJ-Ordner gespeichert werden. Dies kann besonders wichtig sein, wenn verschiedene Stichproben einen höheren Hintergrund haben. Das Weka Segmentation Programm ist kompatibel mit ImageJ Makrosprache, die viele der Befehle makrobeschreibbar ist, um einige der Schritte zu automatisieren.

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Representative Results

Diese Bilder stellen die verschiedenen Schritte dar, die erforderlich sind, um die trainierbare Weka-Segmentierung erfolgreich zu verwenden, um die arbeitsintensive manuelle Messung von ecDNA in fluoreszierend gefärbtem FFPE-Nierengewebe von einer Maus mit induziertem Anti-MPO GN zu minimieren. Diese Schritte sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 mit Bildern zusammengefasst, die direkt aus dem Weka-Segmentierungsprogramm aufgenommen wurden und jeden Schritt im Analyseprozess umreißen. Die Messungen aus dieser Analyse werden dann in Abbildung 3 gezeigt, die die Fähigkeit des Programms zeigt, die verschiedenen Mengen an ecDNA zu bestimmen, die im Glomerulus, im Kontrollgewebe, ohne induzierte Anti-MPO-GN abgelagert werden. Abbildung 4 zeigt, dass das Modell für ecDNA angepasst werden kann, um ecDNA in Nierenbiopsieproben von einem Kontrollpatienten zu identifizieren (Minimal Change Disease-Patienten haben minimale glomeruläre Schäden, die auf histologischer Ebene sichtbar sind) und mit dem einer Nierenbiopsie eines Patienten mit MPO-AAV verglichen werden kann. Abbildung 5 zeigt die Übersetzungsfähigkeit dieses Programms in andere Flecken im Nierengewebe. Wir haben eine repräsentative Probe aus einer Mausniere mit induziertem experimentellem Anti-MPO GN verwendet, um neTs und ecMPO zu färben. Das trainierbare Weka-Segmentierungsprogramm wird dann verwendet, um sowohl NETS als auch ecMPO innerhalb desselben Bildes zu identifizieren. Abbildung 6 zeigt, dass es keinen signifikanten Unterschied im Ergebnis der Ergebnisse in der Menge der ecDNA-Quantifizierung auf demselben Datensatz gibt, der von zwei unabhängigen Benutzern analysiert wurde, die 2 verschiedene Modelle erstellen, die entwickelt wurden, um ecDNA halbquantitiert zu quantifizieren.

Figure 1
Abbildung 1: Bilder zur Klassifizierung von Kernen, Hintergrund und extrazellulärer DNA innerhalb von Mausnierenglomeruli aus experimentellem MPO-ANCA GN unter Verwendung der trainierbaren Weka-Segmentierung. (A) Veranschaulicht Einzelkanalbilder von DAPI, um DNA (blau), -Actin (grün) zu färben, um den glomerulären Bereich zu ableiten, und die zusammengesetzte Datei mit einem Bereich von Interesse (ROI), der den zu messenden glomerulären Bereich angibt. (B) Klassifizierung intakter Kerne zur Entwicklung des Modells (rosa) und nicht klassifizierter Kerne (blau). (C) Klassifizierung dessen, was als Hintergrund (grün) gilt. (D) Klassifikation dessen, was als ecDNA (lila) gilt. (E) Das Modell, das durch zugfähige Weka-Segmentierung erzeugt wird und Kerne in Rot, Hintergrund in Grün und ecDNA-Bereich in Violett zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Bilder, die die überwachte Komponente des Modells demonstrieren, um die Ungenauigkeit zu reduzieren. Das Weka-Modell erzeugt die Wahrscheinlichkeit, jeden Klassifier in nicht klassifizierten Komponenten zu erkennen. (A) Modell generierte Klassifizierung dessen, was intakte Kerne sind. (B) Modellgenerierte Klassifizierung dessen, was als Hintergrund betrachtet wird. (C) Modellgenerierung dessen, was ecDNA als betrachtet wird. (D) Veranschaulicht das Bild der klassifizierten ecDNA nicht schwellenwertiert. (E) Zeigt die Anpassung des Schwellenwerts, um Fehler in dem, was als ecDNA identifiziert wurde, identifizierte ecDNA, rot dargestellt, auszuschließen. (F) Schwellenwert wird auf das Bild angewendet und für die Partikelanalyse in ein binäres Bild umgewandelt. (G) Der glomeruläre ROI wird auf dem Bild überlagert, so dass nur glomeruläre ecDNA analysiert wird. (H) Zeigt die Zusammenfassung der aus der Analyse generierten Ergebnisse an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Bilder zur Klassifizierung von Kernen, Hintergrund und extrazellulärer DNA innerhalb der Mausnierenglomeruli aus einer Kontrollmaus ohne induzierte experimentelle MPO-ANCA GN mittels trainierbarer Weka-Segmentierung. (A) Zeigt das ursprüngliche zusammengeführte Bild mit der zu analysierenden glomerulären Region, dem Trainingsergebnis und dem trainierten Modellergebnis (Hintergrundgrün, Kernrot und ecDNA in Violett identifiziert). (B) Zeigt die Modellwahrscheinlichkeiten von Identifizierung, Kernen, Hintergrund und ecDNA. (C) Ergebnisse dessen, was das Modell als ecDNA klassifiziert und identifiziert hat, in beliebigen Einheiten dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Bild zur Veranschaulichung der trainierbaren Weka-Segmentierung ist anpassungsfähig für die Analyse von ecDNA in menschlichen Nierenbiopsien von einem Patienten mit minimaler Veränderungserkrankung und einem Patienten mit MPO-ANCA-Vaskulitis. (A) Veranschaulicht, dass minimale ecDNA mit trainierbaren Weka-Segmentierung intakten Kernen (rot), Hintergrund (grün) und ecDNA (lila) erkannt wird. (B) Zeigt erhebliche Mengen an ecDNA in einer Nierenbiopsie eines Patienten mit MPO-ANCA Vaskulitis intakten Kernen (rot), Hintergrund (grün) und ecDNA violett. Die Ergebnisse zeigen, dass 8 Partikel von ecDNA innerhalb der glomerulären Region eines Patienten mit MCD im Vergleich zu einem Patienten mit aktiver MPO ANCA-Vaskulitis (180 Partikel) gefunden wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Trainierbare Weka-Segmentierung kann verwendet werden, um NETS und ecMPO innerhalb derselben Bild- und Modellanalyse im Mausnierengewebe von experimentellem MPO-ANCA GN zu identifizieren. (A) Demonstriert einen Glomerulus mit NETs [Kolokalisierung von Grün (Citrullinate histone 3), rot (MPO) DAPI (Nuklei) und PAD4 (weiß)]. ecMPO gilt als zellfrei. (B) Training zur Identifizierung der Klassifikatoren, Rot (Intact-Kerne), Grün (Hintergrund), Violett (NETs) und gelb (ecDNA)]. (C) Die modelltrainierbare Weka-Segmentierung verwendet, um NETs und ecMPO, Rot (Intact-Kerne), Grün (Hintergrund), Lila (NETs) und gelb (ecDNA) zu klassifizieren. (D) Partikelanalyse dessen, was das Modell als NETs bestimmt hat. (E) Partikelanalyse dessen, was das Modell als ecMPO bestimmt hat. (F) Ergebnisblatt aus der Partikelanalyse für NETs und ecDNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Vergleich von zwei unabhängigen Benutzern bei der Entwicklung eines Modells zur Detektion von ecDNA. (A) Originalbild mit den zu analysierenden DAPI-, Beta-Actin- und Zusammengeführten Bildern. (B) Vergleich von Trainingsmodell, Klassifikatoren, Schwellenwerten und glomerulärem ROI zwischen 2 unabhängigen Benutzern. Der gelbe Pfeil zeigt an, dass Benutzer 2 das Modell neu anschulen musste, um den Hintergrund zu entfernen. (C) Die ergebnisseweise, die den Vergleich der ecDNA-Anzahl, der Gesamtfläche, der Fläche und des Umfangs zwischen 2 Benutzern zeigen. (D) Abbildung der Ergebnisse, die keinen signifikanten Unterschied zwischen der Anzahl der in Glomeruli und % von zwei unabhängigen Prüfern nachgewiesenen ecDNA zeigen. Statistische Auswertung enden mit Mann-Whitney U-Test mit Signifikanz auf <0,05. Die Stichprobengröße ist n=6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Es gibt mehrere Protokolle, die proinflammatorische Marker im Serum und Urin von Patienten und Mausmodellen der Glomerulonephritis messen. Dieses beschriebene Protokoll ermöglicht die direkte Analyse der Produkte des Zelltodes (ecDNA, NETs und ecMPO) innerhalb des Glomerulus. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die Gewebevorbereitung und -bildgebung. Das wichtigste einschränkende Element der Verwendung einer fluoreszierenden Färbungsmethode für die Analyse ist die Gewebe-Autofluoreszenz. Formalin fixiertem Paraffingewebe unterliegt einer Autofluoreszenz, die bestimmte fluoreszierende Färbungen verschleiern kann. Der letzte Schritt in der Färbemethode, bei der Dias in Sudanschwarz getaucht werden, die Autofluoreszenz des Gewebes abschwächen und die Beleuchtung der Antikörper-spezifischen Färbung durch Verringerung des Signal-Rausch-Verhältnisses19ermöglichen. Die Bildgebung des Gewebes muss mit mindestens 40-facher Ölvergrößerung durchgeführt werden, um kleinere Fragmente von ecDNA und MPO erkennen zu können. Bei der Bildgebung ist es entscheidend, dass sie zeilenseentsprechend erfolgt, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz eines Markers nicht durchblutet wird.

Ein Vorteil des Analyseprotokolls besteht darin, dass es im offenen Zugriff über ImageJ für jeden Zugriff auf16verfügbar ist. Wir haben hierin gezeigt, dass die Methode leicht angepasst werden kann, um verschiedene fluoreszierende Marker im Nierengewebe zu messen. Sobald das Modell in trainierbarer Weka-Segmentierung ermittelt wurde, kann es auf nachfolgende Bilder ohne Voreingenommenheit angewendet werden und in genau der gleichen Weise jedes Bild analysiert wurde. Die überwachte Natur der Analyse ermöglicht es, jeden Fehler in der Segmentierung durch die zusätzlichen Schritte des Schwellenwerts der "trainierten" Bilder oder des Umschulungss des Programms und hinzufügen weiterer Klassifikatoren anzupassen. Der Vorteil dieses Programms ist, dass zwei verschiedene Benutzer ein ähnliches Ergebnis mit dem gleichen Modell erhalten, vorausgesetzt, sie genau abweisen den glomerularen Büschel. Die größte Ungenauigkeit in der Reproduzierbarkeit von zwei verschiedenen Endbenutzern entsteht durch die unterschiedliche Art und Weise, in der Menschen um den glomerularen Büschel herum verfolgen. Wenn z. B. eine Person einen groben Kreis um den glomerulären Büschel zieht und ein anderer Benutzer sorgfältig um die äußersten Kapillarschlaufen zeichnet, unterscheidet sich der untersuchte Bereich (wie in den Ergebnissen gezeigt). Daher ist es wichtig, dass beide Benutzer geschult werden, um den glomerulären Büschel in einer identischen Weise zu identifizieren. Die praktische Anwendung dieses Programms wäre, dass zwei Benutzer das Modell zusammen auf mehreren Bildern entwerfen, um ein robustes Modell zu erstellen, das auf weitere Datensätze angewendet werden soll. Je mehr Bilder zum Trainieren der Klassifikatoren verwendet werden, desto genauer wird das Modell sein.

Einschränkungen dieses Protokolls wären messungen von Fragmenten von ecDNA, die kleiner sind als das, was das konfokale Mikroskop erkennen kann. Dies könnte durch die Verwendung von Bildern mit Superauflösungsmikroskopie-Methoden und die Anwendung der trainierbaren Weka-Segmentierung auf diese Bilder überwunden werden. Die überwachte Komponente des maschinellen Lernens fügt zusätzliche Schritte hinzu und reduziert die Möglichkeit, große Mengen von Bildern im Batch zu verarbeiten. Wie wir jedoch in den Ergebnissen gezeigt haben, haben unbeaufsichtigte Modelle die Genauigkeit reduziert und die Einführung der überwachten Komponente die Ungenauigkeit deutlich reduziert.

Wir haben bereits veröffentlicht, dass neben Neutrophilen, die extrazelluläre Fallen produzieren, Monozyten/Makrophagen auch beobachtet wurden, um extrazelluläre Fallen (meTs) bei menschlicher ANCA-Vaskulitis zu produzieren, aber in kleineren Anteilen1. Die hier beschriebenen aktuellen Methoden unterscheiden nicht zwischen extrazellulären Fallen, die von Neutrophilen oder Monozyten/Makrophagen produziert werden. Dies ist schwierig zu erreichen, da die meisten konfokalen Mikroskope durch die Anzahl der Laser begrenzt sind. Die Identifizierung von NETs erfordert 4 verschiedene Laser, wodurch die Anzahl der Zellmarker begrenzt wird, die mittels standardkonfokaler Bildgebung verarbeitet werden können. Wenn die MPO-positive Ursprungszelle benötigt wird, kann ein zweiter serieller Abschnitt entweder mit einem Neutrophilen- oder Makrophagen-/Monozytenmarker befleckt werden, um den Zelltyp zu identifizieren, der die extrazelluläre Falle erzeugt.

Pathologische Merkmale der MPO-ANCA-Vaskulitis sind die Ablagerung von ecDNA, NETS und ecMPO innerhalb der Glomeruli der Niere20. Die therapeutische Ausrichtung auf DNA innerhalb von NETs und ecMPO sowie deren Messung in menschlichen Biopsien als Krankheitsmarker war Gegenstand neuerer Studien1,20,21,22. Die Bedeutung dieser Methoden in diesem Bereich besteht darin, den relativen Anteil von ecDNA, NETs und ecMPO innerhalb des Zielorgans auf reproduzierbare, weniger zeitaufwändige Weise genau zu bestimmen. Abschließend haben wir ein überwachtes maschinelles Lernwerkzeug demonstriert, das eine weka-Segmentierung trainiert, um die Analyse großer Datensätze von erfassten Bildern für ecDNA, NETs und ecMPO halbautomatisieren zu können. Der Einsatz dieses Werkzeugs reduziert die Bildanalysezeit erheblich und die Techniken können leicht an andere Flecken in anderen Organen angepasst werden.

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Disclosures

Nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir würdigen Monash Micro Imaging für den Einsatz des aufrechten Konfokallaser-Scanning-Mikroskops Nikon C1 und der Monash Histology Platform für die Verarbeitung von Nierengewebe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin SIGMA A2153 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.
Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-21468 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 ThermoFisher Scientific A-121468 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-21441 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken sera SIGMA C5405 Made up in 1%BSA/PBS
Coverslips 24 x60 mm Azerscientific ES0107222 #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy
EDTA 10mM SIGMA E6758 Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution
Ethanol 30%, 70% and 100% Chem Supply UN1170 Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water
Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) TRAJAN NBF-500 Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood
Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm TRAJAN J3800AM4 Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step
Goat anti human/mouse MPO antibody R&D AF3667 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Histosol Clini Pure CPL HISTOSOL 08 Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood
Hydrophobic pen VECTOR Labs H-400 Use to draw circle around kidney tissue
Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) ABCAM ab128086 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope Coherent Scientific Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Phosphate Buffered Saline SIGMA P38135 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time
Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless Tefal GSA-P2530738 Purchased at local homeware store
Prolong Gold DAPI Life Technologies P36962 Apply drops directly to coverslip
Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody ABCAM ab8227 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody ABCAM ab5103 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Staining rack 24 slides ProScitech H4465 Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven
Sudan Black B SIGMA 199664 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature
Tris 10mM SIGMA T4661 Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution
Xylene Trajan XL005/20 Must be use used in a fume hood

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References

  1. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  2. Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
  3. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
  6. Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
  7. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  8. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  9. Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
  10. Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
  11. Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
  12. Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
  13. Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
  14. Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
  15. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
  18. Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
  19. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  20. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  21. Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
  22. Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).

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Immunologie und Infektion Ausgabe 160 Glomerulonephritis Extrazelluläre DNA Niere Zelltod Überwachtes maschinelles Lernen
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O'Sullivan, K. M., Creed, S., Gan, P. Y., Holdsworth, S. R. Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis. J. Vis. Exp. (160), e61180, doi:10.3791/61180 (2020).

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