Summary
Extracellulärt DNA (ecDNA) som frigörs under celldöd är proinflammatoriskt och bidrar till inflammation. Mätning av ecDNA på skadeplatsen kan bestämma effekten av terapeutisk behandling i målorganet. Detta protokoll beskriver användningen av ett verktyg för maskininlärning för att automatisera mätning av ecDNA i njurvävnad.
Abstract
Glomerular cell död är en patologisk funktion i myeloperoxidas anti neutrofil cytoplasmatisk antikroppar associerade vaskulit (MPO-AAV). Extracellulär deoxyribonucleic syra (ecDNA) frigörs under olika former av celldöd inklusive apoptos, nekros, nekros, neutrofil extracellulära fällor (NETs) och pyroptos. Mätning av denna celldöd är tidskrävande med flera olika biomarkörer som krävs för att identifiera de olika biokemiska formerna av celldöd. Mätning av ecDNA utförs i allmänhet i serum och urin som ett surrogat för njurskada, inte i det faktiska målorganet där den patologiska skadan uppstår. Den nuvarande svårigheten att undersöka ecDNA i njurarna är bristen på metoder för formalin fast paraffin inbäddade vävnad (FFPE) både experimentellt och i arkiverade mänskliga njure tarmbiopsier. Detta protokoll ger en sammanfattning av de steg som krävs för att färga för ecDNA i FFPE vävnad (både mänskliga och murine), släcka autofluorescens och mäta ecDNA i de resulterande bilderna med hjälp av en verktygsinlärningsverktyg från allmänt tillgängliga öppen källkod ImageJ plugin trainable Weka segmentering. Trainable Weka segmentering tillämpas på ecDNA inom glomeruli där programmet lär sig att klassificera ecDNA. Denna klassificerare tillämpas på efterföljande förvärvade njurbilder, vilket minskar behovet av manuella anteckningar för varje enskild bild. Anpassningsförmågan hos den trainable Weka segmenteringen visas vidare i njurvävnad från experimentella murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), att identifiera NETs och ecMPO, gemensamma patologiska bidragsgivare till anti-MPO GN. Denna metod ger objektiv analys av ecDNA i njurvävnad som tydligt visar den effekt i vilken det trainable Weka segmenteringsprogrammet kan skilja ecDNA mellan friska normala njurvävnad och sjuk njurvävnad. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att identifiera ecDNA, NETs och ecMPO i andra organ.
Introduction
Myeloperoxidas anti neutrofil cytoplasmatisk antikroppssasocierade vaskulit (MPO-AAV) är en autoimmun sjukdom som resulterar i njursvikt från patologisk glomerär skada med betydande celldöd och frisättning av deoxyribonukleinsyra (DNA)1,2. DNA kan aktivera immunsystemet genom att fungera som en varningssignal. Under normala hälsosamma förhållanden erbjuder dna-kärnan skydd mot exponering för immunsystemet. Själv-DNA som frigörs extracellulärt under antingen patogena processer eller autoimmunitet ses av immunsystemet som en potent proinflammatorisk skada associerad molekylärt självprotein (DAMP)3. Extra cellulärt DNA (ecDNA) frigörs från döende celler genom flera olika mekanismer som styrs av olika biokemiska vägar, såsom apoptos, nekrotosis neutrofil extracellulär fällabildning (NETs), nekros eller pyroptos4,,5,,6,,7,8.
Vi beskriver häri metoder för att färga och mäta ecDNA frigörs från döende celler i delar av formalin fast paraffin inbäddade (FFPE) njurar från experimentella anti-MPO GN och njurbiopsier från patienter med MPO-AAV9,10. Det finns flera metoder för påvisande av cirkulation av dubbelsträngat DNA (dsDNA) och DNA-komplex från både serum och urin och från in vitro-analyser11,12. Dessa metoder, även om de är korrekta vid fastställandet av mängden ecDNA, bestämmer inte var ecDNA frigörs anatomiskt. Det finns metoder som beskriver specifik mätning av ecDNA såsom tunel för apoptos och mätning av cellskräp13,14. Det finns ingen metod som beskriver mätning ecDNA kulminerade från alla former av celldöd i FFPE njurar där den patologiska skadan uppstår. Detta är viktigt att avgöra om experimentella terapeutiska behandlingar rensar ecDNA från platserna för patologisk skada i det faktiska målorganet.
Förvärvet av flera bilder från njurprover skapar en stor mängd data som analyseras ofta av en enda användare. Detta är arbetsintensivt, tidskrävande och kan bli föremål för opålitlig reproducerbarhet av andra användare, på grund av användarens partiskhet. Trainable Weka segmentering är en öppen källkod plugin för ImageJ som använder framkant bioinformatiska verktyg för att klassificera pixlar med hjälp av maskininlärning algoritmer15,16. Denna metod är "trainable" där den lär sig från användarens klassificering av segment av pixlar och tillämpar den nya inlärd klassificering till andra bilder. Den här metoden bygger på vanliga analysverktyg i ImageJ-programmet som används för att "klassificera" varje pixel i ett segment som tillhör en viss "klass". När programmet lär sig "klassificerare", kan de användas för att identifiera andra liknande klassificerade segment inom samma bild. Den här modellen sparas och tillämpas sedan på andra uppsättningar bilder i samma experiment.
Aktuella hinder för att bestämma ecDNA in situ i njure sektioner är endogena autofluorescens från fixering i formalin och arbetsintensiv analys av bilderna. Vi beskriver här hur man släcka denna autofluorescens, upptäcka ecDNA och använda övervakad maskininlärning för hög genomströmning mätning av ecDNA. Vi har tidigare publicerat mätning av unga som varken arbetar eller studerar med hjälp av ett makro i ImageJ, vi visar nu semi automatisering av dessa metoder med hjälp av övervakad maskininlärning1. Vi visar att maskininlärningsverktyget är anpassningsbart för att klassificera en alternativ fläck för unga som varken arbetar eller studerar inom samma bild. Dessa färgningsmetoder som beskrivs här för att upptäcka ecDNA, NETs och ecMPO kan översättas till andra fasta organ och sjukdomar där ecDNA, NETS och ecMPO spelar en roll för att vidmakthålla sjukdomar såsom reumatoid artrit och lupus17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna metod möjliggör detektion av pan ecDNA från alla former av celldöd. Samma metod och antikroppar används för human njurbiopsivävnad (från steg 4). Alla djur- och mänskliga ämnen hade etikgodkännande från Monash University, och Monash Health, Clayton, Victoria, Australien.
1. Färgning för ecDNA med DAPI och β-Actin
- Inducera en 20 dagars modell av anti-myeloperoxidas glomerulonefrit (anti-MPO-GN) i 8-10 veckor gamla C57/Bl6 möss, medkontroller 9.
- Avliva möss humant med hjälp av en CO2 kammare.
- Ta bort njurarna genom att göra ett främre mittlinjesnitt genom huden med sax, och sedan försiktigt skära bukhinnan och stift tillbaka på en dissekering ombord. Använda pincett skjuta åt sidan den främre njurmedicinska fascia och parietal bukhinnan och skär njuren fri genom att bryta urinledaren och blodkärlen (njurartär och ven) vid njurbäckenet. Ta bort med pincett och skär njurarna i hälften (sagittal plan) med en storlek 22 skalpell.
- Placera njuren i fixativ (4% buffrad formalin) i 16 timmar vid rumstemperatur (RT). Ta bort och blöt fast njure i 30% etanol i 24 timmar före bearbetning.
- Bearbeta njurar med en vanlig 6-timmarscykel:
70% etanol i 15 min
90% etanol i 15 min
100% etanol i 15 min
100% etanol i 20 min
100% etanol i 25 min
100% etanol i 30 min
Xylen i 20 min
Xylen i 30 min
Xylen i 40 min
Vax i 30 min
Vax i 35 min
Vax i 40 min
OBS: Detta är viktigt eftersom njurar inte bör utsättas för långvarig exponering för värme i vaxet, eftersom det kan förstöra antigener av intresse. - Skär 3 μm sektioner på en mikrotom och montera på kommersiellt tillgängliga glasmikroskop diabilder belagda med en positiv laddning. Låt torka över natten.
- Sätt glasrutschbanor i ett rutschack i en 60 °C ugn i 60 min.
OBS: Steg 1.3 och 1.4 är avgörande för att säkerställa att sektionerna inte flyter iväg under antigenhämtningssteget. - Sänk ned rutschbanor i två byte av lösningsmedel (xylen eller ersättning) i 40 minuter vardera, i en rökhuva.
- Rehydrera diabilder i 100% etanol, 100% etanol, 70% etanol för 5 min vardera. Tvätta i 5 min i kranvatten.
- Placera en kokplatta i en rökhuva och preboil antigen hämtningslösning (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) i en tryckkokare. Så snart antigenhämtningslösningen börjar koka, placera bilderna i grytan horisontellt med hjälp av ett par tong och lås locket. Koka på hög (motsvarande 15 psi eller 103 kPa) i 10 min.
OBS: Detta steg är avgörande eftersom det hämtar antigen av intresse genom att avslöja antigen epitop (korskopplad via formalin fixering) för att möjliggöra epitop antikropp specifik bindning den efterföljande färgning kommer inte att fungera utan den. - Ta bort tryckkokaren från värmen och ta omedelbart bort locket genom att köra kall kran ovanpå locket i ett handfat. Låt bilderna balansera i 20 minuter i antigenhämtningslösningen.
- Tvätta diabilder två gånger i 5 min i 0,01 M fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (pH 7.4) på en orbital shaker.
- Använd en hydrofoba penna för att dra cirklar runt njurvävnaden vara noga med att inte låta någon vävnad torka ut i denna tid.
- Blockera vävnad i 10% kycklingserum i 5% bovin serum albumin (BSA) /PBS (pH 7.4, 0.01 M) för 30 min, 60 μL per avsnitt. Tvätta inte efter detta steg, men ta försiktigt bort blockeringslösningen med en 60 μL pipett, låt inte sektionerna torka ut.
- Applicera primär antikroppscocktail för β-aktin utspädd 1/1000 i 1% BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M), 60 μL per sektion och inkubera över natten i en fuktighetskammare vid 4 °C.
- Tvätta rutschbanor två gånger i 5 min i PBS (pH 7.4, 0.01 M) på en orbital shaker.
- Applicera sekundär antikropp, kyckling antikanin 488 (1/200), 60 μL per snitt utspätt i 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) i 40 min vid RT.
- Tvätta rutschbanorna två gånger i 5 min i PBS (pH 7.4, 0.01 M) på en orbital shaker.
- Sänk ned rutschbanorna i 0,3% Sudan Black i 70% etanol i 30 min i en Coplin burk.
OBS: Detta steg är viktigt eftersom det släcker autofluorescens orsakas av formalin fixering. - Tvätta rutschbanorna i kranvatten för att avlägsna fällningen och sänk sedan ned i PBS (pH 7.4, 0.01 M) i 10 min för att förhindra att ytterligare Sudan Black fälls ut bildas.
- Montera glidbanor på konfokalglasöverdrag med tre 60 μl droppar monteringslösning med DAPI och försegla täcken med nagellack genom att applicera runt omkretsen på täckslipen.
- Låt bilderna härda i 24 timmar vid RT (så att DAPI kan tränga in) och förvara sedan 4 °C skyddad från ljus.
OBS: Viktigt att hålla i mörker för att förhindra blekning av fluorescerande sonder. - Bildbilder med hjälp av ett konfokalt laserscanningshuvud som är fäst vid ett mikroskop. Excite diabilder med 405 laser för DAPI och 488 Laser för Beta Actin. Fånga enstaka plan 1024 x1024 pixel bilder med hjälp av linje-sekventiell fånga och 4-line genomsnitt, vilket är viktigt för att upptäcka ecDNA. 40x 1.0 NA oljemål används.
- Bild minst 20 glomeruli per prov. Spara bilder som ND2-filer.
2. DAPI- och β-Actin-analys
- Installera ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
- Kontrollera att den tågbara Weka-segmenteringen är tillgänglig under Insticksprogram | Segmentering | Tågbar Weka Segmentering.
- Släpp bilden på verktygsfältet ImageJ. Klicka på Bild | Färg | Delade kanaler. En bild med DAPI i blått färgning alla kärnor kommer att visas och 1 bild med β-aktin i grönt kommer att visas, som beskriver glomeruli.
- Skapa en sammanslagen fil med de enskilda bilderna för att rita en region av intresse (ROI) för glomerulus genom att klicka på Färg | Sammanfoga kanaler. En popup-ruta ber att du ska tilldela varje kanal en färg. När du har tilldelat varje kanal en färg markerar du rutan Skapa sammansatt och rutan Behåll källbilder och klickar på Ok. En sammanfogad sammansatt bild visas.
- Använd β-aktinfärgning som en guide, rita en ROI runt den glomerära tofsen. Håll den här bilden åt sidan för att använda avkastningen i slutet av det här protokollet.
- Utför en Gaussisk oskärpa på den enda blå DAPI-bilden. Klicka på Process | Filter | Gaussisk oskärpa,sätt i 1-2,00. Bilden kommer nu att se lite suddig, men kärnor är nu släta och bakgrunden mjuknat.
Det här steget är förformaterat för att ta bort brus för att rensa upp bilden från artefakter som kan förhindra relevant identifiering av bildattribut som ska analyseras. - Klicka på Plugins | Segmentering | Tågbar Weka Segmentering.
- Med hjälp av linjeverktyget på verktygsraden i ImageJ spårar du först intakta kärnor med hjälp av de fria handverktygen (det finns alternativ för linje, cirkulär och fyrkantigt verktyg att välja mellan) och lägg sedan till rutan Lägg till klass 1.
- Använda linjeverktyget i verktygsraden i ImageJ avgränsa områden i bakgrunden till klass 2-rutan.
- Klicka på knappen Skapa ny klass etikett på Weka segmentering fönster och etikett "ecDNA." Använd linjeverktyget (från ImageJ-verktygsraden) för att avgränsa extranukleärt DNA som färgats av DAPI.
- Klicka på knappen Tågklassificerare i träningsmenyn i det tågbara Weka-segmenteringsfönstret.
STOPP-knappen visas i stället för tågklassificeringsknappen och förblir tills träningen är avslutad. Klicka inte på den här knappen under träningen eftersom processen avbryts. - Klicka på Skapa resultat-knappen för att skapa en bild med alla klassificerade komponenter, bestående av intakta kärnor, bakgrunden och identifierade ecDNA.
- Klicka på knappen Hämta sannolikhet. Växla musen för att ge en svartvit bild av alla klasser med objektet markering markerad i vitt.
- Duplicera den här bilden genom att klicka på Bild | Duplicera.
- Växla till skärmen med hjälp av musknappen som innehåller ecDNA. Tillämpa en tröskel för att bara få det som har identifierats som ecDNA. Klicka på Använd när tröskelvärdet är tillräckligt.
- Om det efter tröskelning finns det fler områden med DNA som inte är ecDNA, återgår till den ursprungliga tränade bilden, lägger till fler klassificerare och upprepar steg 2.1-2.13.
- Klicka på Bild | Bildjustering | Gör binära. Kopiera den glomerular-avkastningen som gjordes i steg 2.3 och klicka på Ctrl+Skift+E. Aktivera Weka-fönstret genom Redigera | Urval | Återställ, vilket återställer markeringen. Klicka på Analysera partiklar, som mäter endast ecDNA-partiklarna i glomerulus.
OBS: Ett resultatblad beräknas med antalet partiklar, området, medelmåttpunkter och procentandelen glomerulus som innehåller ecDNA. Dessa resultat kan exporteras till ett kalkylblad och sparas, för senare statistisk analys. - Spara klassificeraren som ecDNA.classifier genom att klicka på Spara klassificerare från alternativmenyn till ImageJ-appen på skrivbordet. Klicka sedan på Spara data från alternativmenyn och spara som ecDNA.arff i mappen ImageJ. AVKASTNINGEN måste läggas till manuellt varje gång som glomerulus storlek och form kommer att förändras, men programmet har lärt sig vad ecDNA är.
- Om du vill använda modellen på efterföljande bilder igen upprepar du steg 2.1-2.5 med en ny bild. Klicka på Läs in klassificerare från alternativmenyn och sedan ecDNAmodel.classifier i mappen ImageJ från steg 2.16. Loggmenyn kommer att dyka upp och köra modellen.
- När modellen har körts klickar du på Läs in data i alternativmenyn och väljer filen ecDNA.arff som sparats i mappen ImageJ från steg 2.16. Klicka på Skapa resultat. Om den resulterande bilden har misslyckats med att plocka upp alla kärnor, bakgrund eller ecDNA klicka på re-train klassificerare och lägga till fler klassificerare och spara den nya modellen. Slutför analysprocessen genom att upprepa steg 2.9-2.16.
Obs: Flera bilder kan användas för att generera den slutliga modellen som används för att upptäcka ecDNA. Detta uppnås genom att använda modellen på efterföljande bilder, lägga till fler klassificerare och spara den nya modellen och data i ImageJ-mappen. Detta kan vara särskilt viktigt när olika prover har högre bakgrund. Weka Segmentation programmet är också kompatibel med ImageJ makrospråk som gör att många av kommandona vara makro inspelningsbara för att automatisera några av stegen.
3. Mätning av extracellulära fällor och ecMPO
OBS: Denna metod identifierar ungas bort genom colocalization av extracellulära DNA, Citrullinated Histones peptidyl arginas 4 (PAD4) och MPO.
- Inducera en 20 dagars modell av anti-myeloperoxidas glomerulonefrit (anti-MPO-GN) i 8-10 veckor gamla C57/Bl6 möss, medkontroller 9.
- Avliva möss humant med hjälp av en CO2 kammare.
- Ta bort njurarna genom att göra ett främre mittlinjesnitt genom huden med sax, och sedan försiktigt skära bukhinnan och stift tillbaka på en dissekering ombord. Använda pincett skjuta åt sidan den främre njurmedicinska fascia och parietal bukhinnan och skär njuren fri genom att bryta urinledaren och blodkärlen (njurartär och ven) vid njurbäckenet. Ta bort med pincett och skär njurarna i hälften (sagittal plan) med en storlek 22 skalpell.
- Placera njuren i fixativ (4% buffrad formalin) i 16 timmar vid rumstemperatur (RT). Ta bort och blöt fast njure i 30% etanol i 24 timmar före bearbetning.
- Bearbeta njurar med en vanlig 6-timmarscykel:
70% etanol i 15 min
90% etanol i 15 min
100% etanol i 15 min
100% etanol i 20 min
100% etanol i 25 min
100% etanol i 30 min
Xylen i 20 min
Xylen i 30 min
Xylen i 40 min
Vax i 30 min
Vax i 35 min
Vax i 40 min
OBS: Njurar bör inte utsättas för långvarig exponering för värme i vaxet, eftersom det kan förstöra antigener av intresse. - Skär 3 μm sektioner på en mikrotom och montera på kommersiellt tillgängliga glasmikroskop diabilder belagda med en positiv laddning. Låt torka över natten
- Sätt glasrutschbanor i ett rutschack i en 60 °C ugn i 60 min.
Obs: Steg 3.3-3.4 är avgörande för att säkerställa att sektionerna inte flyter iväg under antigenhämtningssteget. - Sänk ned rutschbanor i två byte av lösningsmedel (xylen eller ersättning) i 40 minuter vardera, i en rökhuva.
- Rehydrera diabilder i 100% etanol, 100% etanol, 70% etanol för 5 min vardera.
- Tvätta i 5 min i kranvatten.
- Placera en kokplatta i en rökhuva och preboil antigen hämtningslösning (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) i en tryckkokare. Så snart antigen hämtningslösningen börjar koka placera bilderna i potten horisontellt med hjälp av ett par tongs och låsa locket. Koka på hög (motsvarande 15 psi eller 103 kPa) i 10 min.
OBS: Detta steg hämtar antigen av intresse genom att avslöja antigeneptop (korskopplad via formalin fixering) för att möjliggöra epitopantikropp specifik bindning den efterföljande färgning kommer inte att fungera utan detta steg. - Ta bort tryckkokaren från värmen och ta omedelbart bort locket genom att köra kall kran ovanpå locket i ett handfat. Låt bilderna balansera i 20 minuter i antigenhämtningslösningen.
- Tvätta diabilder två gånger i 5 min i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (pH 7.4, 0,01 M) på en orbital shaker.
- Använd en hydrofoba penna för att dra cirklar runt njurvävnaden vara noga med att inte låta någon vävnad torka ut i denna tid.
- Blockera vävnad i 10% kycklingserum i 5% bovin serum albumin (BSA) /PBS (pH 7.4, 0.01 M) för 30 min, 60 μL per avsnitt. Tvätta inte efter detta steg utan ta försiktigt bort blockeringslösningen med en 60 μL pipett. Låt inte sektionerna torka ut.
- Gör en cocktail av de primära antikropparna utspädda i 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) i 1 rör. Applicera 60 μL per njursektion. Koncentrationen av de primära antikropparna är följande:
Kanin anti människa /mus H3Cit 1/100
Mus anti människa / mus PAD4 1 / 50
Get anti människa / mus MPO 1 / 200 - Inkubera över natten vid 4 °C i en fuktighetskammare.
- Tvätta rutschbanor två gånger i 5 min i PBS (pH 7.4, 0.01 M) på en orbital shaker.
- Gör en cocktail av de sekundära antikropparna i 1 rör. Sekundära antikroppar appliceras i 1% BSA/PBS, 60 μL per avsnitt enligt följande:
Kyckling anti kanin 488 1/200.
Kyckling anti mus 647 1 / 200.
Kyckling anti get 594 1/200. - Inkubera på RT i 40 min.
- Tvätta rutschbanor två gånger i 5 min i PBS (pH 7.4, 0.01 M) på en orbital shaker.
- Applicera sekundär antikropp 1:200 i 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) i 40 min vid RT 60 μL per sektion.
- Tvätta rutschbanor två gånger i 5 min i PBS (pH 7.4, 0.01 M) på en orbital shaker.
- Sänk ner rutschbanor i 0,3% Sudan Svart i 70% etanol i 30 min.
- Tvätta rutschbanor i kranvatten för att avlägsna fällningen och sänk sedan ned i PBS (pH 7.4, 0.01 M) i 10 min för att förhindra att ytterligare Sudan Black fällning bildas.
- Montera rutschbanor på konfokalglasskyddskulor med tre 60 μl droppar monteringslösning med DAPI. Täta täcken med nagellack genom att applicera runt omkretsen av täckslipen.
- Låt bilderna härda i 24 timmar vid RT (så att DAPI kan tränga in) och förvara sedan 4 °C skyddad från ljus. Förvaras i mörker för att förhindra blekning av fluorescerande sonder.
- Bildbilder med hjälp av ett konfokalt laserscanningshuvud som är fäst vid ett mikroskop. Excite diabilder med 405 laser för DAPI och 488 Laser för H3Cit, 561 för MPO, och 647 för PAD4. Fånga enstaka plan 1024x1024 pixel bilder med hjälp av linje-sekventiell fånga och 4-line genomsnitt som är viktigt för att upptäcka ecDNA. Använd ett 40x 1.0 NA-oljemål. Bild minst 20 glomeruli per prov. Spara bilder som ND2-filer.
4. Neutrophil extracellulära fällor och ecMPO Analys
- Installera ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
- Kontrollera att den tågbara Weka-segmenteringen är tillgänglig under Insticksprogram | Segmentering | Tågbar Weka Segmentering.
- Släpp bilden i ImageJ. Klicka på Bild | Färg | Delade kanaler. En bild med DAPI i blått färgning alla kärnor kommer att visas, en bild med H3Cit i grönt, en bild med MPO i rött, och en bild med PAD4 i vitt kommer att visas.
- Skapa en sammanslagen fil med de enskilda bilderna för att rita en ROI för glomerulus genom att klicka på Färg | Sammanfoga kanaler. En popup-ruta ber att du ska tilldela varje kanal en färg. När du har tilldelat varje kanal en färg markerar du rutan Skapa sammansatt och rutan Behåll källbilder och klickar på Ok. En sammanfogad bild visas. Till skillnad från protokollet för ecDNA tidigare kommer vi att använda den sammansatta bilden för att utföra resten av stegen.
- Utför en gaussk oskärpa på den sammansatta bilden. Detta gör det möjligt att jämna ut kärnorna. Klicka på Process | Filter | Gaussisk oskärpa, sätta i 1,00-2,00. Bilden kommer nu att se lite suddig men kärnor är nu släta och bakgrunden mjuknat.
Det här steget är förformaterat för att ta bort brus för att rensa upp bilden från artefakter som kan förhindra relevant identifiering av bildattribut som ska analyseras. - Klicka på Plugins | Segmentering | Tågbar Weka Segmentering. Ett helt nytt fönster visas med bilden som ska analyseras och Weka segmentering specifika menyverktyg.
- Med hjälp av linjeverktyget på verktygsraden (i ImageJ) spåras först först runt intakta kärnor som inte är positiva för alla 4 NET-komponenter (MPO, PAD4, DAPI och H3Cit) med hjälp av verktyget fri hand och lägg sedan till i rutan Lägg till klass 1.
- Om du använder linjeverktyget i verktygsfältet ImageJ avgränsas bakgrundsområdena till rutan Klass 2.
- Klicka på knappen Skapa ny klass etikett i etikettmenyn och etiketten "NETs". Använd linjeverktyget för att avgränsa NETS som identifierats som samlokalisering DAPI (blå), MPO (röd), PAD4 (vit) och citrullinerade histoner (grön).
- Klicka på knappen Skapa ny klass etikett i etikettmenyn och etiketten "ecMPO". Använd linjeverktyget för att avgränsa MPO (röd) som är cellfri.
- Klicka på knappen Träna klassificerare i träningsmenyn i fönstret Trainable Weka Segmentation.
STOPP-knappen visas i stället för tågklassificeringsknappen och förblir tills träningen är avslutad. Klicka inte på den här knappen under träningen och processen avbryts. - Klicka på Knappen Skapa resultat i träningsmenyn och en bild skapas med alla klassificerade komponenter, bestående av intakta kärnor, bakgrunden och vad som identifierades som ecMPO.
- Klicka på knappen Hämta sannolikhet i träningsmenyn. Växla musen för att ge en svartvit bild av alla klasser med objektet markering markerad i vitt.
- Duplicera både NET-sannolikheten och ecMPO-sannolikhetsbilden genom att klicka på Bild | Duplicera.
- Växla till skärmen med hjälp av musknappen som innehåller unga eller andra uppgifter. Tillämpa ett tröskelvärde för att säkerställa att endast markering av identifierade unga eller andra tecken. Klicka på Bild | Justera | Tröskelvärdet. Flytta de skjutbara växlingslisterna tills net-komponenterna är markerade. Klicka på Använd när du är nöjd med tröskelvärdet. Upprepa samma steg för ecMPO.
- Om det efter tröskelvärdet fortfarande finns områden med ecMPO eller NETs, gå tillbaka till den ursprungliga tränade avbildningen och lägg till fler klassificerare och tillämpa steg 4.1-4.14 på nytt.
- Klicka på Bild | Bildjustering | Gör binära. Kopiera den glomerular ROI som gjorts i steg 4.3, klicka på Ctrl+Skift+E. Aktivera Weka-fönstret genom Redigera | Urval | Återställ, vilket återställer markeringen. Klicka på Analysera partiklar för att mäta endast NET-partiklarna i glomerulus.
- Växla till skärmen med musknappen som innehåller ecMPO. Tillämpa ett tröskelvärde för att säkerställa att endast identifierade ecMPO erhålls. Klicka på Använd när du är nöjd med tröskelvärdet. Upprepa steg 4.16 ovan.
OBS: Ett resultatblad beräknas med antalet partiklar, området, medelpixlar pixlar och procentandelen av glomerulus som innehåller både NETs och ecMPO. Dessa resultat kan sedan sättas in i ett kalkylblad och sparas, för senare statistisk analys. - Spara klassificeraren som NETs.classifier genom att klicka på Spara klassificerare på alternativmenyn och spara filen i ImageJ-appen på skrivbordet (ImageJ-mappen). Klicka sedan på Spara data på alternativmenyn och spara som FILEN NETs.arff. Den glomerular ROI måste läggas till manuellt varje gång som glomerulus storlek och form kommer att förändras, men programmet har lärt sig vad både UNGA OCH EMPPO är.
- Om du vill använda modellen på efterföljande bilder igen upprepar du steg 4.1-4.5 med en ny bild. Klicka på Läs in klassificerare på alternativmenyn. Klicka på Nets.classifier i mappen ImageJ. Loggmenyn kommer att dyka upp och köra modell, när modellen har kört klicka på Ladda data i alternativmenyn och välj NETs.arff fil.
- Klicka på Skapa resultat. Om den resulterande bilden har misslyckats med att plocka upp alla kärnor, bakgrund eller ecDNA klicka på re-train klassificerare och lägga till fler klassificerare och spara den nya modellen. Slutföra analysprocessen genom att upprepa steg 4.11-4.19.
Obs: Flera bilder kan användas för att generera den slutliga modellen som används för att upptäcka ecDNA, ecMPO och NETs. Detta uppnås genom att använda modellen på efterföljande bilder, lägga till fler klassificerare och spara den nya modellen och data i ImageJ-mappen. Detta kan vara särskilt viktigt när olika prover har högre bakgrund. Weka Segmentation programmet är kompatibelt med ImageJ makrospråk som gör att många av kommandona vara makro inspelningsbara för att automatisera några av stegen.
- Klicka på Skapa resultat. Om den resulterande bilden har misslyckats med att plocka upp alla kärnor, bakgrund eller ecDNA klicka på re-train klassificerare och lägga till fler klassificerare och spara den nya modellen. Slutföra analysprocessen genom att upprepa steg 4.11-4.19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dessa bilder representerar flera steg som krävs för att framgångsrikt använda trainable Weka segmentering för att minimera arbetsintensiva manuell mätning av ecDNA i fluorescerande färgade FFPE njurvävnad från en mus med inducerad anti-MPO GN. Dessa steg sammanfattas i figur 1 och figur 2 med bilder tagna direkt från Weka-segmenteringsprogrammet, som beskriver varje steg i analysprocessen. Mätningar från denna analys visas sedan i figur 3 som visar programmets förmåga att bestämma de olika mängder ecDNA som deponerats i glomerulus, i kontrollvävnad, utan inducerad anti MPO GN. Figur 4 visar att modellen för ecDNA kan anpassas för att identifiera ecDNA i njurbiopsi exemplar från en kontroll patient (Minimal Change Disease patienter har minimal glomerular skada uppenbart på en histologisk nivå) och jämfört med en njurbiopsi från en patient med MPO-AAV. Figur 5 visar översättningsförmågan hos detta program till andra fläckar i njurvävnad. Vi har använt ett representativt prov från en mus njure med inducerad experimentell anti-MPO GN att fläcka för nets och ecMPO. Det trainable Weka-segmenteringsprogrammet används sedan för att identifiera både NETS och ecMPO i samma bild. Figur 6 visar att det inte finns någon signifikant skillnad i resultatet av resultaten i mängden ecDNA kvantifiering på samma datauppsättning analyseras av två oberoende användare skapa 2 olika modeller som utformats för att semi-quantitate ecDNA.
Figur 1: Bilder som illustrerar klassificering av kärnor, bakgrund och extracellulärt DNA inom musnjurar glomeruli från experimentell MPO-ANCA GN med hjälp av trainable Weka segmentering. (A)Visar enkanalsbilder av DAPI för att färga DNA (blå), β-aktin (grön) för att avgränsa glomerularområdet och den sammansatta filen med ett område av intresse (ROI) som anger det glomerära område som ska mätas. B)Klassificering av intakta kärnor för att utveckla modellen (rosa) och oklassificerade kärnor (blå). C)Klassificering av vad som anses vara bakgrund (grön). ( D) Klassificering av vad som anses vara ecDNA (lila). (E)Den modell som genereras av tågbar Weka segmentering visar kärnor i rött, bakgrund i grönt och ecDNA område i lila. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bilder som visar den övervakade komponenten i modellen för att minska felaktigheten. Weka-modellen genererar sannolikheten för att känna igen varje klassificerare i oklassificerade komponenter. (A) Modell genererade klassificering av vad intakt kärnor är. (B)Modell genererade klassificering av vad som anses bakgrund. (C)Modellgenerering av vad ecDNA anses. (D)Illustrerar bilden av klassificerad ecDNA ojordad. (E) Visar justeringen av tröskelvärdet för att utesluta eventuella fel i vad som har identifierats som ecDNA, identifierad ecDNA som visas i rött. (F)Tröskelvärdet tillämpas på bilden och görs till en binär bild för partikelanalys. (G)Den glomerära AVKASTNINGEN läggs ovanpå bilden så att endast glomerular ecDNA analyseras. HH) Visar en sammanfattning av resultaten från analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bilder som illustrerar klassificering av kärnor, bakgrund och extracellulärt DNA i musnjurs glomeruli från en kontrollmus utan inducerad experimentell MPO-ANCA GN med hjälp av trainable Weka segmentering. (A) Visar den ursprungliga sammanslagna bilden med den glomerära regionen som ska analyseras, utbildningen och det tränade modellresultatet (bakgrundsgrönt, kärnor röda och ecDNA som identifierats i lila. (B)Visar modellsanolikheterna för identifiering, kärnor, bakgrund och ecDNA. (C)Resultat av vad modellen klassificeras och identifieras som ecDNA, visas i godtyckliga enheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bild som illustrerar trainable Weka segmentering är anpassningsbar för analys av ecDNA i mänskliga njurbiopsier från en patient med minimal förändring sjukdom och en patient med MPO-ANCA vaskulit. (A) Visar att minimal ecDNA detekteras med hjälp av tågbar Weka segmentering intakt kärnor (röd), bakgrund (grön) och ecDNA (lila). (B)visar stora mängder ecDNA i en patient njurbiopsi från en patient med MPO-ANCA vaskulit intakt atomkärnor (röd), bakgrund (grön) och ecDNA lila. Resultaten visar att 8 partiklar av ecDNA hittades inom regionen glomerular av en patient med MCD jämfört med en patient med aktiv MPO ANCA vaskulit (180 partiklar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Trainable Weka segmentering kan användas för att identifiera NETS och ecMPO inom samma bild och modell analys, i mus njurvävnad från experimentellA MPO-ANCA GN. (A)Visar en glomerulus med unga och ungar [samlokalisering av grönt (Citrullinate histone 3), röd (MPO) DAPI (kärnor) och PAD4 (vit)]. ecMPO anses vara cellfritt. (B)Utbildning för identifiering av klassificerare, röd (intakt atomkärnor), grön (bakgrund), lila (UNGAR) och gul (ecDNA)]. (C)Den modell trainable Weka segmentering använder för att klassificera unga och sociala kostnader och ecMPO, Röd (Intakt atomkärnor), Grön (bakgrund), Lila (NET) och gul (ecDNA). (D)Partikelanalys av vad modellen bestämde sig för att vara unga som varken arbetar eller studerar. E)Partikelanalys av vad modellen bestämde sig för att vara ecMPO. (F)Resultatblad från partikelanalysen för både unga och andra valen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Jämförelse av två oberoende användare vid utformningen av en modell för detektion av ecDNA. (A)Originalbild som visar DAPI, Beta Actin och sammanslagna bilder som ska analyseras. b)Jämförelse av utbildningsmodell, klassificerare, trösklar och glomerular ROI mellan två oberoende användare. Den gula pilen anger att användare 2 var tvungen att omskola modellen för att ta bort bakgrunden. C)Resultat som gavs som visar jämförelsen mellan ecdna-antal, total areal, % yta och omkrets, mellan två användare. (D)Diagram över resultat som inte visar någon signifikant skillnad mellan det antal ecDNA som påvisats inom glomeruli och % område från två oberoende utredare. Statistisk analys utförd med Mann-Whitney U-test med signifikans inställd på <0,05. Provstorleken är n=6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera protokoll finns som mäter proinflammatory markörer i serum och urin av både patienter och mus modeller av glomerulonefrit. Detta beskrivna protokoll möjliggör analys av produkter av celldöd (ecDNA, NETs och ecMPO) inom glomerulus direkt. De viktigaste stegen i detta protokoll är vävnadsberedning och avbildning. Den viktigaste begränsa inslag av att använda en fluorescerande färgning metod för analys är vävnad autofluorescens. Formalin fast paraffinvävnad är föremål för autofluorescens som kan skymma specifika fluorescerande färgning. Det sista steget i färgningsmetoden där diabilderna sänks ned i Sudan svart, dämpar vävnadens autofluorescens och gör det möjligt att belysa den antikroppsspecifika färgningen genom minskning av signal- och brusförhållandet19. Avbildningen av vävnaden måste utföras med minst 40x oljeförstoring för att kunna upptäcka mindre fragment av ecDNA och MPO. När avbildning förvärvas är det viktigt att det görs på ett linjärt sekventiellt sätt för att säkerställa att ingen blödning genom fluorescens av en markör till en annan.
En fördel med protokollet för analys är att det är tillgängligt i öppen tillgång via ImageJ för alla att komma åt16. Vi har häri visat att metoden lätt kan anpassas för att mäta olika fluorescerande markörer i njurvävnad. När modellen i trainable Weka segmentering har fastställts det kan tillämpas på efterföljande bilder utan partiskhet och på exakt samma sätt varje bild har analyserats. Analysens övervakade karaktär gör att eventuella fel i segmenteringen kan justeras genom de ytterligare stegen för att trösklar de "tränade" bilderna, eller omskolning av programmet och lägga till fler klassificerare. Fördelen med detta program är att två olika användare kommer att få liknande resultat med samma modell, förutsatt att de exakt avgränsa den glomerära tofsen. Den största felaktighet i reproducerbarhet av två olika slutanvändare skapas av olika sätt på vilket människor spåra runt den glomerära tofsen. Till exempel, om en person ritar en grov cirkel runt den glomerära tofsen och en annan användare noggrant drar runt de yttersta kapillärslingorna kommer det område som undersöks att skilja sig åt (vilket framgår av resultaten). Därför är det viktigt att båda användarna är utbildade för att identifiera den glomerära tofsen på ett identiskt sätt. Den praktiska tillämpningen av detta program skulle vara för två användare att utforma modellen tillsammans på flera bilder för att bygga en robust modell som skall tillämpas på ytterligare datamängder. Ju fler bilder som används för att träna klassificerarna desto mer exakt blir modellen.
Begränsningar av detta protokoll skulle vara mätning av fragment av ecDNA mindre än vad confocal mikroskop kan upptäcka. Detta skulle kunna övervinnas med hjälp av att fånga bilder med super upplösning mikroskopi metoder och tillämpa trainable Weka segmentering till dessa bilder. Den övervakade komponenten i maskininlärningen lägger till extra steg och minskar möjligheten att batchprocessera stora uppsättningar av bilder. Men som vi visat inom resultaten oövervakade modeller har minskad noggrannhet och införa den övervakade komponenten minskat felaktigheter avsevärt.
Vi har tidigare publicerat att förutom neutrofiler som producerar extracellulära fällor, monocyter / makrofager observerades också för att producera extracellulära fällor (kallas METs) i mänskliga ANCA vaskulit, men i mindre proportioner1. De nuvarande metoder som beskrivs häri skiljer inte mellan extracellulära fällor som produceras av neutrofiler eller monocyter/makrofager. Detta är svårt att uppnå eftersom de flesta konfokalmikroskop begränsas av antalet lasrar. Identifiering av unga som varken arbetar eller studerar kräver 4 olika lasrar, vilket begränsar antalet cellmarkörer som kan bearbetas via standardkonfocal avbildning. Om MPO-positiva ursprungscell krävs kan en andra seriell sektion färgas med antingen en neutrofil eller makrofag/monocytmarkör för att identifiera celltypen som producerar den extracellulära fällan.
Patologiska funktioner i MPO-ANCA vaskulit inkluderar nedfall av ecDNA, NETS och ecMPO inom glomeruli av njuren20. Terapeutiskt inriktade DNA inom unga och andra forskning och andra samt ecMPO samt mätning av dem i humana tarmbiopsier som sjukdomsmarkörer har varit föremål för nyligen genomförda studier1,,20,21,22. Betydelsen av dessa metoder inom detta område är att exakt bestämma den relativa andelen ecDNA, NETs och ecMPO inom målorganet, på ett reproducerbart, mindre tidskrävande sätt. Sammanfattningsvis har vi visat en övervakad maskininlärningsverktyg trainable Weka segmentering till semi automatisera analysen av stora datamängder av förvärvade bilder för ecDNA, NETs och ecMPO. Användningen av detta verktyg kommer att minska bildanalystiden avsevärt och teknikerna kan enkelt anpassas till andra fläckar i andra organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi bekräftar Monash Micro Imaging för användning av Nikon C1 upprätt confocal laserscanning mikroskop och Monash Histology Platform för bearbetning av njurvävnad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
References
- O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
- Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R.
- Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
- Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
- Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
- Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
- Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
- Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
- Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
- Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
- Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).
