Summary
우리는 이 프로토콜에서 시스테나 마그나에 자가 전혈을 이중 으로 주입하여 표준화된 지주막 출혈(SAH) 마우스 모델을 기술하였다. 이중 주사 절차의 높은 수준의 표준화는 사망률에 관한 상대적 안전과 SAH의 중간-급성 모델을 나타낸다.
Abstract
뇌졸중 중, 뇌동맥류의 파열에 연속 된 뇌동맥류 (SAH)는 5-9 %를 나타내지만 신경 학적 결과의 관점에서 중요한 이환율을 가진 총 뇌졸중 관련 사망률의 약 30 %를 담당합니다. 지연된 대뇌 혈관경련(CVS)은 지연된 대뇌 허혈과 관련하여 가장 자주 발생할 수 있습니다. SAH의 다른 동물 모델은 현재 혈관 내 천공 및 시스테나 마그나 또는 심지어 전치질 통에 혈액의 직접 주입을 포함하여 사용되고 있으며, 각각 뚜렷한 장점과 단점을 나타낸다. 본 기사에서는, SAH의 표준화된 마우스 모델이 시스테나 마그나로 의정된 부피의 결정된 볼륨을 이중 직접 주입하여 제시된다. 간단히 말해서, 마우스는 이소플루란 흡입에 의해 계량한 다음 마취하였다. 이어서, 동물은 37°C의 직장 온도를 유지하는 가열된 담요상에 기대어 배치하고 약 30°의 자궁경부 굴곡이 있는 스테레오테틱 프레임에 배치하였다. 일단 제자리에, 같은 나이와 성별의 다른 마우스의 경동맥에서 가져온 상동성 동맥 혈액으로 채워진 길쭉한 유리 마이크로피펫의 끝 (C57Bl/6J)은 미세 조작기를 통해 아틀란토 -문부막과 접촉하는 직각으로 위치하였다. 그런 다음 60 μL의 혈액을 시스테르나 마그나에 주입한 다음 2분 동안 동물의 30° 하향 기울기가 뒤따랐습니다. 시스테나 마그나에 혈액 30 μL의 두 번째 주입은 첫 번째 후 24 시간 수행되었다. 각 동물의 개별 후속 은 매일 수행됩니다 (무게와 웰빙의 주의 평가). 이 절차는 인공 뇌 척수액 (CSF)의 동등한 주입에 의해 모방 될 수있는 두개 내 압력 고도를 동반, 혈액의 예측 가능하고 매우 재현 가능한 분포를 허용하고, 낮은 사망률을 유도 SAH의 급성에서 온화한 모델을 나타냅니다.
Introduction
수막치출혈(SAH)은 모든 뇌졸중 사례의 최대 5%를 차지하며, 100,000명당 7.2~9명의 환자를 발생시키고, 연구3결과에따라 사망률이 20%-60%인 비교적 흔한 병리학을2구성한다., 급성 단계에서, 사망률은 출혈, 재출혈, 뇌 혈관 경련 (CVS) 및 /또는 의학적 합병증4의중증도에 기인한다. 생존자에서, 초기 뇌 손상 (EBI)는 출혈의 빈약한 연장및 두개내 압력의 급격한 증가와 연관됩니다, 이는 1 차대 뇌 허혈귀착될 수 있는 5 및케이스6의 대략 10%-15%에 있는 즉각적인 죽음 귀착될 수 있습니다. SAH의 초기 "급성" 단계 후, 예후는 대뇌 전산 단층 촬영에 의해 환자의 거의 40%에서 검출된 "이차" 또는 지연된 대뇌 허혈(DCI)의 발생에 달려 있으며, 자기 공명 영상(MRI)7,,8후 환자의 최대 80%에서 검출된다. CAH 환자의 대다수에서 동맥류 파열 후 4~21일 사이에 발생하는 CVS 외에도, DCI9는 마이크로혈전증 형성, 감소된 뇌관류, 신경염증 및 피질 확산 우울증(CSD),10,11,,12,,13에이차적으로 다인성 확산 뇌 병변으로 인해 발생할 수 있다. 이는 SAH 생존자의 30%에 영향을 미치며 시각 기억, 언어 기억, 반응 시간 및 집행, visuospatial 및 언어 기능14[일상 생활]을포함한 인지 기능에 영향을 미친다. 현재 SAH 환자의 CVS 및/또는 열악한 인지 결과를 방지하기 위한 표준 요법은 Ca2+ 채널 억제제를 Nimodipine으로 사용하여 Ca2+ 신호 및 혈관 수축의 막힘에 기반을 두고 있습니다. 그러나 혈관 수축을 대상으로 한 최근의 임상 시험은 환자의 신경 학적 결과와 CVS16의예방 사이의 해리를 밝혀, SAH 장기 결과에 관련된 더 복잡한 병생리적 메커니즘을 제안. 따라서, SAH와 수반되는 병리학적 사건의 수와 원래의 치료 내정간섭을 시험하기 위하여 유효하고 표준화된 동물 모형의 발달의 더 중대한 이해를 위한 의학 필요가 있습니다.
인간에 있는 SAH를 주로 책임 있는 두개 내 동맥류의 파열은 전임상 동물 모형에서 모방하기 어렵습니다. 현재, 동맥류 파열 및 SAH 상황은 마우스17,,18에서CVS 및 감시운동 기능 장애를 담당하는 중뇌동맥(혈관 내 천자 모델)의 천공에 의해 잠정적으로 시험될 수 있다. 이 모형에 있는 출혈의 개시 및 혈액의 확산을 통해 가능한 통제의 부족 때문에, 그밖 방법은 혈관 내 파열 없이 SAH 모형을 생성하기 위하여 설치류에서 개발되었습니다. 보다 정밀하게, 그들은 마그나시스테나(19)에서 단일 또는 이중 주사또는 전각 시스테른(20)에 단일 또는 이중 주사를20통해 수막체 공간으로 동맥 혈액을 직접 투여하는 것으로 구성된다. 혈관 내 파열없이 이러한 마우스 모델의 주요 장점은 주입 된 혈액 샘플의 외과 적 절차와 품질 및 양을 재현적으로 마스터 할 수있는 가능성입니다. 특히 혈관 내 천포에 의해 모델에 비해이 모델의 또 다른 장점은 동물의 일반적인 복지의 보존이다. 사실, 이 수술은 경동맥 벽 파열을 생성하는 데 필요한 것보다 덜 침습적이고 기술적으로 덜 도전적입니다. 이 마지막 모델에서, 동물은 외부 경동맥에 삽입되고, 내부 경동맥으로 진보하는 동안, 동물을 삽관하고 기계적으로 환기되어야 합니다. 이것은 가능성이 와이어 경로에 의해 혈관 방해로 인해 일시적인 허혈으로 이어집니다. 따라서, 수술과 관련된 공동 이환율(moribund 상태, 중요한 통증 및 죽음)은 혈관 내 천공 모델에 비해 이중 주사 모델에서 덜 중요하다. 보다 일관된 SAH일 뿐만 아니라, 이중 직접 주사 방법은 연구 및 테스트(마취 하에서 시간 단축, 수술 및 고통의 조직 중단으로 인한 통증)을 준수하며 프로토콜 연구 및 인력 훈련에 사용되는 최소 총 동물 수로 이어집니다.
더욱이, 이것은 SAH의 최적화된 병리학적 이해와 잠재적인 치료 화합물의 비교 시험의 가능성으로 이끌어 내는 형질성 마우스에 동일 프로토콜의 구현을 허용합니다. 여기서, 우리는 6-8주 된 남성 C57Bl/6J 마우스에서 시스테르나 마그나에 자가 동맥 혈액을 이중으로 연속주사함으로써 수막뇌출혈(SAH)의 표준화된 마우스 모델을 제시한다. 이 모델의 주요 장점은 혈관 내 천포 모델에 비해 출혈 부피의 제어, 그리고 두개내압력(21)의급격한 증가 없이 출혈 이벤트의 보강이다. 최근에는 시스테나 마그나로 혈액을 이중 직접 주사하는 것은 마우스의 실험적 및 생리병리학적 문제에 대해 잘 설명되어 왔다. Indeed, we recently demonstrated CVS of large cerebral arteries (basilar (BA), middle (MCA) and anterior (ACA) cerebral arteries), cerebrovascular fibrin deposition and cell apoptosis from day 3 (D3) to 10 (D10), circulation defects of paravascular cerebrospinal fluid accompanied by altered sensitivomotor and cognitive functions in mice, 10 days post-SAH in this model22. 따라서 이 모델은 SAH 이후 단기 및 장기 행사를 마스터, 검증 및 특징으로 합니다. 새로운 표적의 장래 식별및 SAH 관련 합병증에 대한 강력하고 효율적인 치료 전략에 대한 연구에 이상적입니다.
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Protocol
모든 절차는 프랑스 윤리위원회와 유럽 의회 지침 2010/63/EU 및 과학 목적으로 사용되는 동물 보호 위원회의 지침에 따라 H. 카스텔의 감독하에 수행되었습니다. 이 프로젝트는 지역 CENOMEXA와 동물 연구 및 테스트에 대한 국가 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 8-12주 세의 남성 C57Bl/6J Rj 마우스(Janvier)는 통제된 표준 환경 조건하에서 보관되었습니다: 22°C ±1°C, 12시간/12시간 빛/어두운 사이클, 물 및 식품 사용 가능한 광고 리비툼.
1. SAH 수술 및 주사 준비 설정
- 수술이 시작되기 전에 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 적절한 수의 유리 모세 혈관을 당깁니다. 사출 파이펫은 0.86mm의 내지름과 1.5mm의 외경을 나타내야 한다.
- 가짜 상태에 대한 인공 뇌척수액 (aCSF)을 준비합니다.
- 119mM NaCl, 2.5mM KCl, 1mM NaH 2 PO4,1.3mM MgCl2,10mMM 포도당, 26.2 mM NaHCO23 InH2O, pH 7.4로 용액을 준비한다.
- 가스 aCSF 와 95% O2 및 5% CO2 에 대 한 15 분, 다음 추가 2.5 mM MM CaCl2.
- 0.22 μm 필터 장치로 산소aCSF를 살균한다. aCSF 용액은 4°C에서 3-4주 동안 안정될 수 있다. 오염(용액이 흐리거나) 또는 예금 형성이 나타나면 폐기하고 신선한 aCSF를 만듭니다.
- 동종 마우스 기증자로부터 혈액의 수집
- 기관지를 따라 경동맥을 분리하고 경동맥의 천자에 의한 최대 양의 혈액을 수집합니다.
- 실제로, 마취 실에 마우스를 놓고 동물이 의식을 잃을 때까지 5 %의 이소플루란으로 챔버를적재합니다.
- 수술 실험 절차의 설정을 허용하기 위해 두 개의 뒷다리 중 하나를 클램핑하여 반사 신경의 부족을 확인합니다.
- 26G 바늘(헤파린 나트륨)을 사용하여 헤파린 용액으로 1mL 주사기를 코팅합니다. 이것은 다음 단계 도중 혈액 응고를 방지할 것입니다.
- 다리를 떼어내고 코를 마취 마스크에 배치한 동물을 설치합니다(2~2.5%의 이소플루란을 가진 마취 유지 보수).
- 오모로이드 근육을 세로로 해부하여 기관지를 따라 경동맥을 분리한다. 동맥이 분리되면 미세 한 갈고리와 집게의 도움으로 심장쪽으로 바늘을 삽입하고 경동맥구멍을 통해 최대 혈액을 수집합니다 (SAH 마우스 당 60 μL이 필요합니다).
- 자궁 경부 탈구를 사용하여 혈액 수집 직후 마취 된 기증자 마우스를 희생하십시오.
2. 동물 (8-10 주 된 C57BL /6J 남성 마우스) 준비
- 전자 균형을 사용하여 각 마우스의 무게를 정확하게 측정합니다. 현재 연구에서, 쥐의 범위 내에서 체중을 가질 것 이다 20 받는 일 25 수술 직전에 그램.
- 앞서 설명한 바와 같이(1.3.2 및 1.3.3단계 참조), 수술되는 마우스의 마취를 유도한다.
- 적절한 전기 클리퍼로 목과 귀 사이의 공간을 면도합니다.
- 스테레오전술 프레임에 다리와 코를 분리한 복부 탈구에 배치된 동물을 스테레오전술 프레임에 2~2.5%의 마취 마스크에 설치합니다.
- 마우스가 자고 있고 머리가 제대로 막혔는지 확인합니다.
- 피하 부프레노르핀(0.1 mg/kg)을 허리에 26G 바늘로 피하하여 각성 후 통증을 피합니다.
- 보호 액체 젤을 사용하여 안구건조건조를 방지하고 자동 조절 된 전기 담요를 사용하여 37 °C의 내장 온도를 유지합니다.
- 멸균 면 도로를 사용하여 방부제 용액 (포비도 요오드 또는 클로르헨시딘)로 후방 목 면도 영역을 치료하십시오.
- 준비된 피부/피하 조직을 만지는 모든 계측기를 사전 살균하고(2시간 동안 200°C로 가열)하고 무균 처리합니다.
3. SAH 유도
- 첫날(D-1)
- 후목의 얇은 가위로 1cm 절개를 자르고 중간선을 따라 근육이 분리되어 시스테르나 마그나에 접근합니다.
- 얇은 가위로 빈 유리 파이펫의 끝을 잘라냅니다. 그런 다음 유연한 실리콘 커넥터에 연결된 주사기에 적응합니다.
- 정밀 마이크로피펫을 사용하여 0.5mL 튜브에서 혈액 또는 aCSF(SAH 또는 sham 상태의 경우 각각)의 60 μL을 전송합니다.
- SAH 상태를 위한 60 μL 또는 가짜 상태를 위한 aCSF의 60 μL을 유리 파이펫으로 빨아 넣습니다.
- 주입을 위해, 링 또는 블루 압정을 사용하여 입체 프레임에 파이펫을 설치하고 천천히 시스테나 마그나와 인터페이스에서 멤브레인에 파이펫 팁을 가져.
- 스테레오전술 프레임의 마이크로 조작기를 사용하여 아틀란토 후현막을 시스테나 마그나에 천천히 삽입합니다.
- 이전에 혈액 또는 aCSF로 채워진 파이펫을 압력 유도에 대비한 주사기에 연결합니다.
- 급성 두개 내 압력을 피하기 위해 플런저를 약 10 μL/min 의 낮은 속도로 눌러 주입하십시오.
- 주사 하는 동안, 밀접 하 게 호흡 속도 및 직장 온도 모니터링.
- 주입이 끝나면 마이크로 조작기를 통해 파이펫을 조심스럽게 벗고 철수 중에 누출이 없는지 시각적으로 확인하십시오.
- 흡수성 hemostat를 사용하여 hemostasis를 달성하고 편조 비 흡수성 봉합 실로 두 봉합사를 실행합니다.
- 수술 직후, 마우스를 분해하고 수축을 조절하고 회복 기간 동안 열린 상자에 생존 담요로 덮습니다.
- 유도 의 둘째 날 (D0)
- 24 시간 후에 마취를 유도하십시오 (1.3.2 및 1.3.3 단계 참조). 피하 부프레노르핀 100 μL을 다시 주입하고(0.1 mg/kg) 보호액 젤을 사용하여 안구건조증을 방지합니다(2.7단계 및 2.8단계 참조).
- 전날의 고정 프레임에 동물을 설치합니다.
- 미세 가시와 봉합사를 조심스럽게 제거합니다.
- 아틀란토-후두막을 이전과 같이 준비하고 멸균 면봉으로 목의 면도 부위에 방부제 준비를 적용합니다.
- 낮은 속도로 혈액 또는 aCSF의 30 μL을 주입하십시오(단계 3.1.2 ~ 3.1.8). 호흡 속도와 직장 온도를 모니터링합니다.
- 주사가 끝나면 조심스럽게 파이펫을 벗고 철수 시 혈액 누출의 부재를 제어하십시오.
- hemostasis를 달성하고 편조 흡수 가능한 봉합 실로 두 봉합사를 실행합니다.
4. 수술 후 후속 조치 및 실험 종료
- 수술 직후, 회복 중에 마우스를 분리하고 생존 담요를 뒤쪽에 서바이벌 담요로 분리하고 배치합니다.
- 무게와 조심스럽게 희생 될 때까지 각 마우스의 행동을 매일 관찰 (예를 들어, D7 수술 후).
- 인도적 종점 중, 상당한 체중 감소 (>15% 무게)는 고전적으로 발견된다. "구부러진" 자세, 느린 움직임, 프로스트레이션, 상처 및 /또는 중요한 공격적인 행동의 비정상적인 발성또한 동물의 고통의 중요한 징후입니다. 이러한 징후 또는 징후의 조합이 나타나면 동물의 모니터링이 출현 후 몇 시간 내에 강화됩니다. 동물의 복지가 48시간 이내에 악화되거나 개선되지 않으면 참을 수 없는 고통의 수준에 도달하고 안락사가 수행되는 것으로 간주됩니다.
- 선택의 시점에서, 참수에 의해 마취 된 마우스를 희생하고, 추가 분석을 위해 뇌를 수확.
- 이소플루란 마취 후 안락사 (참수)를 수행 (5%).
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Representative Results
실험적 타임라인, 절차, 후속 및 사망률
도 1A 및 도 1B는 혈액의 이중 인종 차별적 주입에 의해 SAH 모델 프로토콜을 요약한다. 간략하게, SAH 유도 (D-1)의 첫날에, 60 μL의 혈액은 동종 마우스 또는 인공 뇌척수액 (aCSF)의 60 μL에서 각각 SAH 또는 sham 조건에서 시스테나 마그나로 주입되었다. 다음 날(D0), 동종 마우스에서 30μL 또는 aCSF의 30 μL을 각각 SAH 또는 샴 조건에서 시스테나 마그나에 주입했다. 수술 후 24시간, 마우스 살해 및 뇌 분석은 도 1C에도시된 바와 같이 파라혈관 공간으로의 혈액 분포를 관찰할 수 있게 되었다. D1에서 희생까지 일반적인 복지에 대한 민감한 지표로서, 체중은 D1에서 D8까지 매일 평가되었고, D1에서 D8까지의 가짜 동물에 비해 SAH에서 체중이 현저한 감소된 것으로 나타났으며(그림1D),오래 지속되는 회복 과정과 장기간 병리학적 사건을 시사합니다. 수술 후 사망률은 D7에서 26.7%였으며 대부분의 동물은 수술 후 D1 또는 D4로 사망했습니다(그림1D). D5에서 인도 잉크의 경동맥 관류는 도 1C에도시화 된 CVS의 관찰을 가능하게했다.
SAH 후 뇌 혈관 경련
엘 암키 외22에의해 도시된 바와 같이, 바실라 동맥의 CVS (BA), 중간 뇌동맥 (MCA) 및 전방 뇌동맥 (ACA)은 D3에서 D10 수술 후 D3에서 D10에 이르기까지 ACA, MCA 또는 BA중 하나에서 혈액의 이중 인종 차별적 주사에 의해 SAH 모델에 존재하였다. 간단히(그림 2A),마우스 희생 및 참수 후, 뇌는 수확 및 후 고정 4% 파라포름알데히드 (PFA), 다음 -80 °C에서 냉동, 냉동 저온을 사용하여 20 μm 트랜스 버질 조각으로 슬라이스되기 전에. 헤마톡클린과 에오신 염색은 BA(인터보랄 0.40mm, 브레그마 -3.40mm), MCA(인터보랄 2.58mm, 브레그마 -1.22mm) 및 ACA(인터아우랄 4.90mm; 브레그마 1.10mm)를 위해 수행되어 마이크로스코프를 사용하여 체계적인 이미지를 통해 CVS 를 식별할 수 있도록 하였다. 거시적 CVS의 부재 또는 존재를 평가하기 위해, 루멘 영역/벽 두께 비율은 각 스테인드 동맥에 대해 계산되었다. 비율이 낮을수록 CVS가 더 심각합니다. 따라서, CVS는 샴 마우스 뇌(도 2B)와비교하여 SAH 뇌의 BA에서 발생하지만 다른 큰 대뇌 동맥 (MCA, ACA,22을나타내지 않은 데이터)에서도 발생하였다.
SAH 후 감시티보모터 기능 장애
엘암키 외22 및 Clavier 외23에의해 이 SAH 모델에 잘 기재된 특정 모터 적자의 측정은 이러한 SAH 관련 장기 효과를 조절하는 특정 치료 표적을 테스트하는 결과의 주요 평가 기준으로 간주될 수 있다. 간략하게(도3A)D6 수술 후, 각 마우스는 10분 동안 오픈필드 테스트에서 평가되었다. ANY 미로 소프트웨어 버전 4.99를 통해, 가거리 커버 거리와 사육 및 기울기의 수가 기록되었다. 오픈 필드 테스트 후 24 시간, 각 마우스는 장치 습관 기간 후, 총 보행 시간의 측정, 플랫폼에 도달하는 시간 및 여행 수를 포함하는 빔 보행 테스트의 세 연속 세션에 참여했다. 결과는 세 세션의 평균으로 표현되었다. 엘암키(22)에22의해 도시된 바와 같이, D10 수술 후 빔 보행 시험에 의해 평가된 감시시보운동 기능 장애는 SAH 모델(도3B)에존재하는 것으로 나타났다. D9에서, 10분 동안 오픈필드 테스트에 의해 평가된 마우스의 자발적활성은, 또한 가짜상태(도 3C)에비해 교차된 거리와 수직 활성에 의해 검출된 바와 같이 SAH에 의해 유의한 영향을 받았다.
그림 1. 실험 설계, 외과 적 수술, 혈액 분포, 거시적 인 혈관 경련, 체중 및 SAH 후 사망률. (A)이 프로토콜의 실험 적 디자인을 보여주는 회로도. D-1 및 D0은 각각 시스테나 마그나에 60 및 30 μL의 이중 주사(Sham) 또는 혈액(SAH)을 주사하여 수술일을 나타낸다. D1에서 D8까지, 마우스는 매일 관찰되고 무게가 있었습니다. D1에서 뇌는 파라혈관공간(C)으로혈액분포를 관찰하기 위해 수확되었다. D6 및 D7은 개방필드 및 빔 보행 테스트를 포함한 행동 분석을 위한 최적화된 시간 창으로 선택되었습니다. D8에서, 뇌는 CVS를 평가하기 위해 샘플링되었다, 매크로(C)에서도시적으로 도시된 바와 같이. (B)시스테나 마그나에 혈액 주사의 외과 적 절차. 혈액은 동종 마우스의 경동맥에서 채취되었다. 동물 제제와 스테레오전술 프레임에 설치한 후 후 후목목에서 목절이 수행되었고, 후방 근육이 분리되었고, 그 후 근본적인 근육은 시스테르나 마그나를 구분하는 혈관막에 대한 접근을 열어 놓았다. 파이펫은 혈액 주입 전에 시스테르나 마그나에 삽입되었다. (C)수술 후 24시간 후 파라혈관 공간으로 혈액 분포를 조사하고, SAH에서 수술 후 5일 간 인도 잉크의 간 관류 후 매크로스코픽 CVS가 샴 상태에 비해. (D)샴 (n=10) 및 SAH C57Bl/6J (n=15) 마우스에서 D-1에서 D8 수술 후 수술 후까지의 체중 진화. SAH 마우스는 가짜 마우스 (p&01)에 비해 D1에서 D8까지 체중 증가의 비율감소를 보였다. 여러 비교 테스트에 대한 본페로니의 포스트 호크 테스트와 ANOVA. 샴 (n =10) 및 SAH C57Bl/6J (n=15) 마우스에서 수술 후 생존 곡선. 데이터는 카플란 마이어 곡선으로 표현되었다. SAH 마우스는 가짜 마우스에 비해 D7 수술 후 사망률을 보였다 (p&0.05). 만텔 콕스 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. SAH 후 바질라 동맥에서 뇌 혈관 경련 분석 및 대뇌 혈관 경련의 시간 과정을 위한 실험 설계. (A)CVS 정량화프로토콜의 실험설계를 보여주는 회로도. 4%의 PFA를 수정한 후, 냉동 된 뇌는 젤라틴 코팅 유리 슬라이드에 20 μm 트랜스 버질 슬라이스로 저온화를 사용하여 연일 슬라이스되었습니다. 헤마톡슬린과 에오신(H&E) 염색은 ACA, MCA 및 BA를 베어링하는 뇌 슬라이스에서 수행되었다. 현미경 사진은 200배 배율로 현미경 장착 카메라를 사용하여 획득되었습니다. 루멘 영역과 용기 벽 두께는 간단한 블라인드 방법으로 ImageJ를 사용하여 정량화하였다. (B)SAH 후 BA에서 CVS의 시간 과정. D7 포스트 SAH에서 가짜와 SAH 뇌 슬라이스에 BA 형태 (루멘 영역 및 벽 두께)를 보여주는 H&E 염색의 대표적인 현미경 사진. D3에서 D10 수술 후 BA에서 CVS를 나타내는 루멘 영역/벽 두께 비율의 정량화 히스토그램 (*, p&0.05). 데이터는 평균 ±SEM. n=6/조건으로 표현되었다. 여러 비교에 대한 본페로니의 포스트 호크 테스트와 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. SAH 후 장기 감시운동 적자의 행동 분석을 위한 실험 설계. (A)SAH 후 행동 분석 프로토콜의 실험 설계를 보여주는 회로도. 간단히, D6 수술 후, 마우스의 운동 활동 행동은 10 분 동안 오픈 필드 테스트에 의해 평가되었으며, 그 중 거리와 양육 및 기울기의 수가 기록되었다. 24시간 휴식기간 이후에, 마우스의 감시운동 거동은 보행 시험에 의해 평가되었고, 보행 시간, 플랫폼에 도달하는 시간 및 여행 횟수가 기록되었다. (B)엘암키 외22: 빔 보행 테스트에서 SAH 마우스는 D7 (**, p&0.01), D10 (***, p&0.001) 및 D14 (*, p&0.05) 및 D10 (*, p&0.05)의 대조군과 비교하여 여행 횟수가 증가한 것으로 나타났습니다.0.05.05.05.05.05.05.05). (C)엘암키 외22에서: SAH 마우스는 D9 (*, p&01)에서 샴 마우스에 비해 감소 된 거리 교차 (*, p & 0.05) 및 수직 활성을 나타냈다. ANOVA 다음에 시다크의 여러 비교 테스트가 뒤따랐다. 데이터는 평균 ±SEM. n=10-12/조건으로 표현되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
SAH 분야의 연구의 강도와 지난 20년 동안 증가하는 혈관 내 및 약리학적 치료 옵션과 같은 치료 전략의 발달에도 불구하고 사망률은 입원 첫 주 내에 높게 유지되며 다음 6개월 동안 약 50%에 도달하고,있으며, 25년후 6개월 동안 약 50%에24도달한다.. 시스테나 마그나에 동종 동맥 혈액의 매일 이중 주입에 의한 이 현재 전임상 모델은 그것의 타당성 및 낮은 사망률과의 협회에 대한 인식되고 있습니다. 실제로, SAH 설치류 모델 중, 사망률의 넓은 범위가 보고되었습니다 : 시스테나 마그른26,2727,,,28,,,,2629,30,,,31,32,,33,34,35,10-33 % 전천시에 혈액 주입을 가진사망률26,27,36에단일 혈액 주사를,가진 0-16 %의 사망률이보고되었습니다.,37,16-66% 내시경 천공,38,39,,40,,,41,,42,,43,,44,,45 및 0-43% 시스테나 마그나(34,35,34,,46,,47,48)로이중 혈액 주입에 의해 모델., 모델의 낮은 사망률(쥐의 나이에 따라 9% 또는 27%,)은 다른 이중 주사 모델에 비해 뇌간에서 국소압력을 피하는 약한 양의 혈액 주입, 주사의 느린 지속 시간 및 동물의 기울기로부터 발생할 수 있다. SAH 환자에서 CVS 발생의 창은 출혈 후 D4-D10에서 고전적으로 검출됩니다. 그러나, 동물에서는 CVS의 발병 시간 및 지속 시간이 덜 연구되고 HSA 모델 마다 다를 수 있습니다., 실험 프로토콜 및 동물 종에 따라 가능성이21.
이러한 맥락에서, 여기서 모델은 SAH 관련 CVS의 관점에서 임상 SAH 생리병리학과 유사합니다. 일반적으로, 혈관 내 천포 모델에서 CVS는마우스(17)에서3일 후 쥐40에서 1시간 후 MCA 및 BA에서 발생한다. 전구체 시스테른으로 혈액 주입에 의한 모델에서 CVS 발생은 쥐에서49 일과 8 일사이에 나타났다. 쥐에서 시스테나 마그나에 이중 주입의 모델에서, CVS는 10 분29 과 3 일31사이에서 개발한다. 우리는 3 일부터 주요 대뇌 동맥 (ACA, MCA 및 BA)에 CVS를 확립하고SAH환자에서 관찰되는 것에 가까운 10 일까지 유지되는 이중 주사로 SAH의 마우스 모델에서 CVS의 출현을 가장 먼저 설명합니다. 이 마지막 모형은 CVS를 표적으로 하는 기계장치 및 치료치료의 조사를 허용하는, 사망률 없이 충분히 가혹한 SAH의 숙련된 모형으로 정의될 수 있었습니다.
그러나 이 마우스 SAH 모델은 일부 제한을 표시할 수도 있습니다. 첫 번째 점은 혈관 기저라미나(50)의파괴/소화를 통해 콜라게나제 유도 SAH 모델에서 재현될 수 있는 혈관 벽 파열의 부재이다. 거시적 CVS의 발생에 관해서는, 일부 뇌 영토에서 감소 된 대뇌 혈류 (CBF)는 체계적으로 신경 결과와 상관 관계가 되지 않으므로 CBF는 SAH의이 제안 된 모델에서 평가되어야합니다. 이전 쥐 연구는 이중 주사의 SAH 모델에서 레이저 도플러 플로메트리를 사용하여 CBF가 첫 번째 주사 후 기준선에서 30-52 %로 급격히 감소했으며 2 ~ 3 일 후 기준선으로 복귀하여 주입후 51,,52,,53을입증했다. 이에 따라 MRI는 D3에서 33~50%, D5에서 27~44% 하락한 것으로 나타났으며, 쥐 이중 사출모델에서SAH 유도 후 D5에서는24,55로나타났다. 시스테나 마그나에 이중 주사는 수막 부 공간을 따라 혈액의 예측 가능한 분포를 허용, 특히 후방 순환 주위 혈전의 결과, 하지만 생리 매개 변수의 변화를 소개할 수 있습니다. 척추운하에 주입된 혈액의 부피가 상승하여 발생하는 두개 내 압력(ICP)을 피하기 위해, 둘 다 기능 장애를 혼동하는 것으로 이어지는56,다른모델30,,51에서이전에 수행했던 것처럼 뇌척수액의 동등한 양을 제거하는 선택은 이루어질 수 있다. 여기서 모델에서, 샴 마우스는 aCSF 또는 생리학적 0.9% NaCl의 동등한 부피를 받았고, 실험에 따라 ICP의 상승으로 이어질 것이 분명하다. 따라서, ICP의 급성 증가는 시스테나 마그나 모델에서 혈액의 단일 주입에서 18 mmHg에서 120 mmHg27,,48,,53으로 증가하며, 46 에서 107 mmHg27,,37,,49 의 prechiasmatic cistern 혈액 주입 모델에서, 그리고 27 에서 110 mmHg 39,,40,,53,,57,,58 혈관 내 천공 모델. 대조적으로, 시스테나 마그나로의 이중 혈액 주사는 60 mmHg48,,53로더 작은 ICP 증가와 연관되었다. 또한 CSF를 제거하는 동작은 ICP를 변경하고 CSF를 수정합니다. 여기서 SAH 모델에서, 결정은 혈액 주사 전에 CSF를 제거하지 않고 30 °에서 동물 머리를 힐링으로 구성된 절차에 의해 수술을 동반하는 것이었습니다. 목표는 전방 순환으로 혈액 분포를 허용하여 ICP를 감쇠하는 것입니다, 인간 SAH 생리병리학을 모방하는 중요하고 필요한 단계. SAH 환자에서, ICP에 있는 급격한 상승은 검출되고 과도글로벌 대뇌 허혈(59)과연관됩니다, 가능성이 자동 조절 및 초기 신경 세포손실60의지속적인 손상에 기여. 그러나, SAH 이후 첫 번째 이벤트 후, 뇌 부종 및수두증(61)을피하기 위해 우려되는 SAH 환자를 위해 초기 외부 심실 배수가 종종 채택된다. 여기서, 이중 주사 SAH 모델은 환자에서 관찰된 ICP 의존적인 결과를 유발하는 첫번째 출혈 사건에서 가혹하지 않을 수 있습니다, 그러나 가능성이 SAH 후에 일 동안 지속적이고 온화한 향상된 ICP를 재현합니다.
또한, 여기서 SAH 모델에서 또 다른 통제되지 않은 파라미터는 지나치게 빠른 혈액 주입절차(27)에의해 유도된 평균 동맥 혈압(MABP)의 잠재적 인 변이였다. 실제로, MABP는 전형적으로 대뇌 관류 압력을 보존하기 위하여 실험적인 SAH 후에 급격하게 상승하고 그 후에, 기준선으로 떨어집니다. 여기서 SAH 모델에서는 이러한 MABP 변이를 피하기 위해 낮은 비율로 혈액 또는 aCSF(~10 μL/min)를 주입했습니다. 인간에서 관찰된 것을 모방한 이 모형에 있는 신경생물학 사건에 관하여, 우리는 이전에 SAH의 이중 혈액 주입 모형이 SAH22의 잠재적인 paravascular 확산에 있는 결점을 포함하여 오래 지속되는 CVS, microthrombosis 대형 및 대뇌 두뇌 손상을 유도한다는 것을 이전에 보여주었습니다. 그러나, CSD가 SAH 관련DCI(13)에 관여하고 있음을 설명하는 최근 데이터는 이중 주사의 마우스 모델에서 이러한 유형의 조사를 강력하게 지지한다. 이것은 CSD를 표적으로 하는 새로운 치료의 유익한 충격에 과학적인 돌파구를 가능하게 해야 합니다.
결론적으로, 시스테나 마그나에 전체 동맥 혈액의 이중 주입 모델은 CVS, 미세 혈전증, 혈관 염증, 신경 적자 및 사망률을 포함한 인간 SAH 생리병리학을 모방하는 쉬운 방법을 허용하는 마스터 모델입니다. 그것은 SAH 관련 morbi-사망을 취급하기 위하여 새로운 치료 접근을 시험하기 위한 검증된 모형을 나타냅니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 이미징 장비에 대한 PRIMACEN 플랫폼 (노르망디 루앙 대학, 프랑스)과 씨 아르노 아라보, 부인 줄리 마우코텔과 부인 마틴 Dubois, 동물 주택 및 치료에 대한 감사합니다. 셀레스트 니콜라 여사님이 프로토콜의 비디오 녹화에 목소리를 빌려준 것에 감사드립니다. 이 작품은 세나리 노르망디 성숙 프로그램, FRM, 노르망디 루앙 대학과 Inserm의 후원 AVC에 의해 지원되었다. 노르망디 지역과 유럽 연합 (3R 프로젝트). 유럽은 유럽 지역 개발 기금 (ERDF)와 노르망디에 참여한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absorbable hemostat | Ethicon | Surgicel | |
| absorbable suturing thread | Ethicon | Vicryl 5.0 | |
| auto-regulated electric blanket | Harvard Apparatus | 50-7087-F | |
| bluetack for capillary fixation | UHU | Patafix | |
| electronic balance | Denver Instrument | MXX-2001 | |
| glass capillaries | Harvard Apparatus | GC150F-15 | inner diameter 0.86 mm outer diameter 1.5 mm |
| isoflurane vaporizer | Phymep | V100 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| needle 26 G | BD microbalance | 300300 | |
| non absorbable suturing thread | Peters surgical | Filapeau 4.0 | |
| stereotaxic frame | David Kopf instruments | Model 902 | |
| surgical equipment | Kent scientific | clamp, microscissors, thin scissors | |
| syringe 20 mL TERUMO | Thermofisher | 11866071 |
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