Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dubbel direktinsprutning av blod i Cisterna Magna som en modell av Subarachnoid Hemorrhage

Published: August 30, 2020 doi: 10.3791/61322
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1University of Rouen Normandy, INSERM U1239, DC2N, Institute for Research and Innovation in Biomedicine (IRIB), Rouen, France, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Rouen University Hospital, Rouen, France

Summary

Vi beskrivs i detta protokoll en standardiserad subarachnoid blödning (SAH) mus modell genom en dubbel injektion av autolog helblod i cisterna magna. Den höga graden av standardisering av förfarandet med dubbelinsprutning representerar en medel-till-akut modell av SAH med relativ säkerhet angående dödlighet.

Abstract

Bland stroke, subarachnoid blödning (SAH) på varandra följande till sprängning av en cerebral kranskärlens aneurysm representerar 5-9% men är ansvarig för cirka 30% av den totala stroke-relaterade dödligheten med en viktig sjuklighet i form av neurologiska resultatet. En fördröjd cerebral vasospasm (CVS) kan uppstå oftast i samband med en fördröjd cerebral ischemi. Olika djurmodeller av SAH används nu inklusive endovaskulär perforering och direkt injektion av blod i cisternas storsint eller till och med den prechiasmatiska cisternen, som var och en uppvisar distinkta fördelar och nackdelar. I denna artikel presenteras en standardiserad musmodell av SAH genom dubbel direktinsprutning av beslutsamma volymer av autologt helblod in i cisterna magna. Kortfattat, möss vägdes och sedan bedövas av isofluran inandning. Sedan placerades djuret i ett liggande läge på en uppvärmd filt som upprätthåller en rektaltemperatur på 37 °C och placerade i en stereotaktisk ram med en cervikal böj på ca 30°. Väl på plats placerades spetsen på en avlång glasmikropipette fylld med det homologa kranskärlens blod som tagits från halsartären hos en annan mus i samma ålder och kön (C57Bl/6J) i rät vinkel i kontakt med membranet atlanto-occipital med hjälp av en mikromanipulator. Därefter injicerades 60 μL blod i cisterna magna följt av en 30° nedåtlutning av djuret i 2 minuter. Den andra infusionen av 30 μL blod i cisterna magna utfördes 24 h efter den första. Varje djurs individuella uppföljning görs dagligen (noggrann utvärdering av vikt och välbefinnande). Detta förfarande möjliggör en förutsägbar och mycket reproducerbar fördelning av blod, sannolikt åtföljs av intrakraniell tryck höjd som kan härmas av en motsvarande injektion av en konstgjord cerebral spinal vätska (CSF), och representerar en akut till mild-modell av SAH inducerande låg dödlighet.

Introduction

Subarachnoid blödning (SAH) står för upp till 5% av alla stroke fall och utgör en relativt vanlig patologi med en incidens på 7,2 till 9 patienter per 100.000 per år, med en dödlighet på 20%-60% beroende på studien1,2,3. I den akuta fasen beror dödligheten på blödningens svårighetsgrad, rebleeding, cerebral vasospasm (CVS) och/eller medicinska komplikationer4. I överlevande, tidig hjärnskada (EBI) är associerad med parenchymal förlängning av blödning och abrupt ökning av intrakraniellt tryck, vilket kan resultera i primär cerebral ischemi5 och omedelbar död i cirka 10%-15% av fallen6. Efter den inledande "akut" skede av SAH, prognosen beror på förekomsten av "sekundär" eller fördröjd cerebral ischemi (DCI), detekteras i nästan 40% av patienterna av cerebral datortomografi, och i upp till 80% av patienterna efter magnetisk resonanstomografi (MRT)7,8. Förutom att CVS inträffar mellan 4 till 21 dagar efter aneurysm bristning i en majoritet av SAH patienter, DCI9 kan bero på multifaktoriella diffusa hjärnskador sekundärt till microthrombosis bildning, minskad cerebral perfusion, neuroinflammation, och när spridande depression (CSD)10,11,12,13. Detta påverkar 30% av SAH överlevande och påverkar kognitiva funktioner inklusive visuellt minne, verbalt minne, reaktionstid, och verkställande, visuospatial och språkfunktioner14 försämra det dagliga livet15. Nuvarande standardterapier för att förhindra CVS och/eller de dåliga kognitiva resultaten hos SAH-patienter baseras på blockeringen av Ca2+ signalering och vasokonstriktion med hjälp av Ca2+ kanalhämmare som Nimodipin. Nyare kliniska prövningar inriktning vasoconstriction visade dock dissociation mellan patientens neurologiska resultatet och förebyggande av CVS16, vilket tyder på mer komplexa patofysiologiska mekanismer som deltar i SAH-långsiktiga konsekvenser. Därför finns det ett medicinskt behov av större förståelse för antalet patologiska händelser som åtföljer SAH och utvecklingen av giltiga och standardiserade djurmodeller för att testa ursprungliga terapeutiska interventioner.

Sprängningen av en intrakraniell aneurysm mestadels ansvarig för SAH hos människor är sannolikt svårt att efterlikna i prekliniska djurmodeller. För närvarande kan aneurysm bristning och SAH situationen preliminärt testas genom perforering av den mellersta cerebral artär (endovaskulär punktering modell) som ansvarar för CVS och sensitivomotor dysfunktioner i möss17,18. På grund av bristen på någon möjlig kontroll över blödningsansiglet och diffusion av blod i denna modell, har andra metoder utvecklats hos gnagare för att generera SAH-modeller utan endovaskulär bristning. Mer exakt, de består av direkt administrering av arteriellt blod i det subarachnoid utrymmet genom en enda eller en dubbel injektion i magnaten cisterna19 eller en enda injektion i prechiasmatiska cisternen20. Den största fördelen med dessa musmodeller utan endovaskulär bristning är möjligheten att reproducera sig det kirurgiska ingreppet och kvaliteten och kvantiteten av det injicerade blodprovet. En annan fördel med denna modell framför modellen genom endovaskulär perforering i synnerhet är bevarandet av djurets allmänna välbefinnande. I själva verket är denna operation mindre invasiv och tekniskt mindre utmanande än vad som krävs för att generera en halspulsådervägg bristning. I denna sista modell, djuret måste intuberas och mekaniskt ventileras, medan en monofilament sätts in i den externa halspulsådern, och avancerade i den inre halspulsådern. Detta leder sannolikt till transient ischemi på grund av kärl obstruktion av trådvägen. Följaktligen är den kommorolighet (döende tillstånd, viktig smärta och död) som är associerade med kirurgi mindre viktigt i dubbel injektion modell jämfört med endovaskulära perforering modell. Förutom att den är en mer konsekvent SAH, uppfyller metoden för dubbel direktinsprutning djurskyddet i forskning och testning (minskad tid under anestesi, smärta från vävnadsstörningar vid kirurgi och nöd) och leder till ett minsta totalt antal djur som används för protokollstudien och personalutbildning.

Dessutom möjliggör detta implementering av samma protokoll till transgena möss, vilket leder till en optimerad patologisk förståelse av SAH och möjligheten till jämförande testning av potentiella terapeutiska föreningar. Här presenterar vi en standardiserad mus modell av subarachnoid blödning (SAH) genom en dubbel daglig på varandra följande injektion av autolog kranskärlens blod i cisterna magna i 6-8 veckor gamla manliga C57Bl/6J möss. Den största fördelen med denna modell är kontrollen av blödningsvolymen jämfört med endovaskulär perforeringsmodell, och förstärkande av blödningshändelsen utan en drastisk ökning av intrakraniellt tryck21. Nyligen har den dubbla direktinsprutningen av blod i cisterna magna väl beskrivits på de experimentella och fysiopatologiska frågorna hos möss. Faktum är att vi nyligen visat CVS av stora cerebrala artärer (basilar (BA), mitten (MCA) och främre (ACA) cerebral artärer), cerebrovaskulär fibrin nedfall och cell apoptos från dag 3 (D3) till 10 (D10), cirkulationsfel av paravaskulära cerebrospinalvätska tillsammans med förändrade sensitivomotor och kognitiva funktioner i möss, 10 dagar efter SAH i denna modell22. Således gör det denna modell behärskas, valideras och kännetecknas för kortsiktiga och långvariga händelser efter SAH. Det bör vara idealiskt lämplig för prospektiv identifiering av nya mål och för studier om potenta och effektiva terapeutiska strategier mot SAH-associerade komplikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden utfördes under övervakning av H. Castel i enlighet med den franska etiska kommittén och riktlinjer i Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU och Rådet för skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål. Detta projekt godkändes av den lokala CENOMEXA och de nationella etikkommittéerna för djurforskning och djurförsök. Manliga C57Bl/6J Rj-möss (Janvier), i åldern 8–12 veckor, inhystes under kontrollerade standard miljöförhållanden: 22 °C ± 1 °C, 12 timmar/12 timmar ljus/mörker cykel, och vatten och mat tillgänglig ad libitum.

1. Installation av SAH-kirurgi och förberedelse för injektion

  1. Innan början av operationen, dra ett tillräckligt antal glas kapillärer genom att använda en micropipette puller. Injektionspipetten ska uppvisa en innerdiameter på 0,86 mm och ytterdiameter på 1,5 mm.
  2. Förbered den konstgjorda cerebrospinalvätskan (aCSF) för skentillståndet.
    1. Bered en lösning med 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM glukos, 26,2 mM NaHCO3 i H2O, pH 7,4.
    2. Gas aCSF med 95% O2 och 5% CO2 för 15 min, och sedan lägga 2,5 mM CaCl2.
    3. Sterilisera den syresatte aCSF med en 0,22 μm filterapparat. ACSF-lösningen kan vara stabil i 3-4 veckor vid 4 °C. Om kontaminering (lösning blir grumlig) eller en deponering formation har dykt upp, kassera och göra färska aCSF.
  3. Insamling av blod från en homolog musdonator
    1. Isolera halspulsådern längs luftstrupen och samla in den maximala mängden blod genom punktering av halspulsådern.
    2. I praktiken placera musen i en anestesikammare och ladda kammaren med 5% isofluran tills djuret förlorar medvetandet.
    3. Kontrollera bristen på reflexer genom att spänna fast en av två bakben för att möjliggöra inställningen av det kirurgiska experimentella förfarandet.
    4. Bestryk en 1 mL spruta med heparinlösning genom att använda en 26 G-nål (heparinnatrium). Detta kommer att förhindra blodkoagulation under nästa steg.
    5. Installera djuret placerat i dorsaldeubitus med ben isär, och näsan i anestesi mask (anestesi underhåll med 2 till 2,5% isofluran).
    6. Isolera halspulsådern längs luftstrupen genom att dissekera den omohyoid muskeln longitudinellt. När artären isolerat, för in nålen mot hjärtat med hjälp av mikrodissekterande krok och tärningar och samla in det maximala blodet via punktering av halspulsådern (60 μL behövs per SAH-mus).
    7. Offra den sövda givaren musen omedelbart efter blodinsamling genom att använda livmoderhalscancer dislokation.

2. Animaliskt (8-10 veckor gamla C57BL/6J hanmöss) preparat

  1. Väg varje mus exakt med hjälp av en elektronisk balans. I den aktuella studien, möss skulle ha kroppsvikt inom intervallet 20 till 25 gram strax före operationen.
  2. Som tidigare förklarats (se steg 1.3.2 och 1.3.3), inducera anestesi av möss som skall drivas.
  3. Raka nacken och utrymmet mellan öronen med en lämplig elektrisk klippare.
  4. Installera djuret placerat i ventrala decubitus med benen isär och näsan i anestesi mask (anestesi underhåll med 2 och 2,5% isofluran) på en stereotaktisk ram.
  5. Kontrollera att musen sover och att hans huvud är ordentligt blockerat.
  6. Subkutan injicera 100 μL buprenorfin (0,1 mg/kg) med en 26 G-nål i nedre delen av ryggen, för att undvika smärta efter uppvaknandet.
  7. Förhindra torra ögon genom att använda skyddande flytande gel och upprätthålla en intrarectal temperatur på 37 °C genom att använda en autoreglerad elektrisk filt.
  8. Behandla det bakre halsrakade området med en antiseptisk lösning (povidon-jod eller klorhexidin genom att använda en steril bomullsväg).
  9. Försterilisera alla instrument som rör den beredda huden/den subkutana vävnaden (uppvärmning till 200 °C i 2 timmar) och hantera aseptiskt.

3. SAH induktion

  1. På den första dagen (D-1)
    1. Skär ett 1 cm snitt med tunn sax i den bakre halsen, följt av separation av muskler längs mittlinjen för att komma åt cisterna magna.
    2. Klipp spetsen på den tomma glaspipetten med tunn sax. Sedan, anpassa sig till en spruta ansluten till en flexibel silikonkontakt.
    3. Överför 60 μL blod eller aCSF (för SAH eller skentillstånd, respektive) i ett 0,5 mL-rör med hjälp av en precisionsmikropipette.
    4. Sug i glaspipetten 60 μL blod för SAH-tillståndet eller 60 μL aCSF för skentillståndet.
    5. För injektion, installera pipetten på stereotaktisk ram med hjälp av en ring eller blå-tack och sakta föra pipetten spets till membranet i gränssnittet med cisterna magna.
    6. Sätt långsamt in pipettspetsen genom atlanto-occipitalmembranet i cisterna-magnaten, med hjälp av en mikromanipulator av den stereotaktiska ramen.
    7. Anslut pipetten som tidigare var fylld med blod eller aCSF till sprutan som är redo för tryckinduktion.
    8. Injicera genom att trycka på kolven i låg takt runt 10 μL/min, för att undvika akut intrakraniellt tryck.
    9. Under injektionen, noga övervaka andningsfrekvensen och rektaltemperaturen.
    10. I slutet av injektionen tar du försiktigt av pipetten via mikromanipulatorn och säkerställer visuellt att det inte finns någon läcka under tillbakadragandet.
    11. Uppnå hemostas med hjälp av en absorberbar hemostat och kör två suturer med flätad icke-resorberbar sutureringstråd.
    12. Omedelbart efter operationen, isolera och placera musen i nedgång decubitus och täcka den med en överlevnad filt i en öppen låda för varaktigheten av återhämtning.
  2. Andra dagen av induktion (D0)
    1. Efter 24 timmar, framkalla anestesi (se steg 1.3.2 och 1.3.3). Subkutant injicera 100 μL buprenorfin igen (0,1 mg/kg) och förhindra torra ögon genom att använda skyddande flytande gel (se steg 2.7 och 2.8).
    2. Installera djuret på den stereotaktiska ramen som dagen innan.
    3. Ta försiktigt bort suturerna med mikroscissorer.
    4. Förbered atlanto-occipital membranet som tidigare och applicera antiseptisk förberedelse på det rakade området av halsen med en steril bomullsstav.
    5. Injicera 30 μL blod eller aCSF i låg takt (se steg 3.1.2 till 3.1.8). Övervaka andningsfrekvensen och rektaltemperaturen.
    6. Vid slutet av injektionen, ta försiktigt av pipetten och kontrollera frånvaron av blodläcka under tillbakadragandet.
    7. Uppnå hemostas och kör två suturer med flätad absorberbar sutureringstråd.

4. Postoperativ uppföljning och slutet av försöket

  1. Omedelbart efter operationen, isolera och placera musen i nedgång decubitus med en överlevnad filt på ryggen i en öppen låda under återhämtning.
  2. Väg och noggrant observera dagligen beteendet hos varje mus tills offer (t.ex. D7 post-kirurgi).
  3. Bland humana effektmått märks klassiskt en betydande viktminskning (>15% av vikten). En "hunched tillbaka" hållning, långsamma rörelser, prostration, onormala läten av ont och / eller betydande aggressivt beteende är också viktiga tecken på djurs lidande. Om något av dessa tecken eller en kombination av tecken visas förstärks djurets övervakning inom några timmar efter deras utseende. Om djurets välbefinnande försämras eller inte förbättras inom 48 timmar kommer man att anse att en nivå av outhärdligt lidande uppnås, och dödshjälp utförs.
  4. Vid tidpunkten för valet, offra sövda möss genom halshuggning, och skörda hjärnor för ytterligare analyser.
  5. Utför dödshjälp (halshuggning) efter isortärbedövning (5%).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Experimentell tidslinje, förfarande, uppföljning och dödlighet
Figur 1A och figur 1B sammanfatta SAH-modellprotokollet genom dubbel intracisternal injektion av blod. Kortfattat, på den första dagen av SAH induktion (D-1), 60 μL blod som dras tillbaka från en homolog mus eller 60 μL av konstgjorda ryggmärgsvätskan (aCSF) injicerades i cisterna magna i SAH eller sken villkor, respektive. Nästa dag (D0), 30 μL blod som drogs tillbaka från en homolog mus eller 30 μL av aCSF injicerades i cisterna magna i SAH eller Sham villkor, respektive. Tjugofyra timmar efter operationen, muskonmord och hjärnanalys får observera blodfördelningen i de paravaskulära utrymmena som illustreras i figur 1C. Som en känslig indikator för allmänna välfärden från D1 till offra, kroppsvikten var dagligen bedömas från D1 till D8 och visade en betydande minskad kroppsvikt vinna i SAH jämfört med skendjur från D1 till D8 (Figur 1D), vilket tyder på en långvarig återhämtningsprocessen och långvarig patologiska händelser efter SAH. Postoperativ mortalitet var 26,7% vid D7 med de flesta djur som dog på D1 eller D4 efter operation (Figur 1D). Transcardial perfusion av indiskt bläck vid D5 möjliggjorde observation av makroskopisk CVS som illustreras i figur 1C.

Cerebral vasospasm efter SAH
Som framgår av El Amki et al.22, CVS av basilar artär (BA), mellersta cerebral artär (MCA) och främre cerebral artär (ACA) var närvarande i SAH modell genom dubbel intracisternal injektion av blod i antingen ACA, MCA eller BA från D3 till D10 post-kirurgi. Kortfattat (Figur 2A), efter musoffer och halshuggning, skördades hjärnor och efter-fixerades i 4% paraformaldehyd (PFA), och sedan fryst vid -80 °C, innan de skivas i 20 μm transversal skivor med hjälp av en kryostat. Hematoxylin och eosin färgning utfördes för BA (interaural 0,40 mm; bregma -3,40 mm), MCA (interaural 2,58 mm; bregma -1,22 mm) och ACA (interaural 4,90 mm; bregma 1.10 mm) för att möjliggöra CVS-identifiering via systematisk bildanskaffning av färgade skivor genom att använda en mikroskopmonterad kamera. För att utvärdera frånvaron eller förekomsten av makroskopiska CVS, lumen området/vägg tjocklek förhållandet beräknades för varje färgade artär. Ju lägre är förhållandet, desto allvarligare är CVS. Således inträffade en CVS i BA i SAH hjärnor jämfört med sham mus hjärnor (Figur 2B) men även i andra stora cerebral artärer (MCA, ACA, data som inte visas22).

Sensitivomotor dysfunktioner efter SAH
Mätningen av specifika motoriska underskott, väl beskrivs i denna SAH modell av El Amki et al.22 och Clavier et al.23, kan betraktas som en viktigaste utvärderingskriteriet för utfall att testa specifika terapeutiska mål som reglerar dessa SAH-associerade långsiktiga effekter. Kortfattat (Figur 3A), vid D6 efter operationen, utvärderades varje mus i testet med öppna fält i 10 minuter. Med hjälp av PROGRAMVARAN ANY-maze version 4.99, avståndet som omfattas och antalet uppfödning och lutande spelades in. Tjugofyra timmar efter testet med öppna fält deltog varje mus i tre på varandra följande sessioner av strålgångstestet, som, efter en enhetstillvänjningsperiod, mätning av total gångtid, tid för att nå plattformen och antalet resor. Resultaten uttrycktes som ett medelvärde av tre sessioner. Som framgår av El Amki et al.22, sensitivomotor dysfunktioner utvärderas av strålen gångtest vid D10 efter operationen visade sig vara närvarande i SAH-modellen (Figur 3B). Vid D9 påverkades spontan aktivitet hos möss som utvärderades genom testet med öppna fält under 10 minuter, också signifikant av SAH som detekteras av den korsade sträckan och den vertikala aktiviteten jämfört med skentillståndet (Figur 3C).

Figure 1
Bild 1. Experimentell design, kirurgiskt ingrepp, blodfördelning, makroskopisk vasospasm, kroppsvikt och dödlighet efter SAH. (A) Schematiskt diagram som visar den experimentella utformningen av detta protokoll. D-1 och D0 representerar dagarna av kirurgi med en dubbel injektion av 60 och 30 μL av aCSF (Sham) eller blod (SAH) i cisterna magna, respektive. Från D1 till D8 observerades möss dagligen och vägdes. Vid D1 skördades hjärnor för att observera blodfördelningen i paravaskulära utrymmen (C). D6 och D7 valdes som optimerat tidsfönster för beteendeanalyser inklusive öppna fält- och balkgångtester. Vid D8 provsmakade man hjärnor för att utvärdera CVS, vilket visades makroskopiskt i (C). (B) Kirurgiskt ingrepp av blodinjektion i cisterna magna. Blod samlades in från halspulsådern av en homolog mus. Efter djurberedning och installation på stereotaktisk ram, en nape snitt utfördes i bakre halsen, de bakre musklerna separerades, och sedan de underliggande musklerna var disected att öppna en tillgång till vascularized membranet avgränsa cisterna magna. Pipetten sattes in i cisterna magna före blodinjektion. (C) Illustration av blodfördelningen i paravaskulära utrymmen tjugofyra timmar efter operationen och av makroskopisk CVS efter transcardial perfusion av indiskt bläck fem dagar efter operationen i SAH jämfört med Sham tillstånd. (D) Viktevolution från D-1 till D8 efter operation i Sham (n=10) och SAH C57Bl/6J (n=15) möss. SAH-möss visade en minskning i procent av kroppsvikten från D1 till D8 jämfört med skenmössen (p<0,01). ANOVA med Bonferronis post hoc-test för flera jämförelsetester. Överlevnadskurva efter operation i sken (n=10) och SAH C57Bl/6J (n=15) möss. Data uttrycktes som Kaplan Meier kurvor. SAH-möss visade en viktigare dödlighet vid D7 efter operationen jämfört med skenmöss (p<0,05). Mantel-Cox-test. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2. Experimentell design för cerebral vasospasm analys och tidsföring av cerebral vasospasm i basilarartär efter SAH. (A) Schematiskt diagram som visar den experimentella utformningen av protokoll för CVS-kvantifiering. Efter fixering med 4%PFA, frysta hjärnor var seriellt skivad med hjälp av en kryostat i 20 μm tvärgående skivor på gelatin-belagda glas diabilder. Hematoxylin och Eosin (H&E) färgning utfördes från hjärnan skivor med ACA, MCA och BA. Mikrofotografier förvärvades med hjälp av en mikroskop-monterad kamera på en 200x förstoring. Lumen område och fartyget vägg tjocklek kvantifierades med hjälp av ImageJ genom en enkel blind metod. (B) Tidskurs för CVS i BA efter SAH. Representativa mikrofotografier av H&E färgning visar BA morfologi (lumen området och vägg tjocklek) i sken och SAH hjärnan skivor på D7 post-SAH. Kvantifiering histogram av lumen område/ vägg tjocklek förhållande som visar CVS i BA från D3 till D10 efter kirurgi (*, p & lt;0,05). Data uttrycktes som medelvärde ± SEM. n=6/condition. ANOVA med Bonferronis post hoc-test för flera jämförelser. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3. Experimentell design för beteendeanalys av långsiktiga sensitivomotor underskott efter SAH. (A) Schematiskt diagram som visar den experimentella utformningen av beteendeanalysprotokollet efter SAH. Kortfattat, vid D6 post-kirurgi, motorisk aktivitet beteende av möss utvärderades genom ett öppet fält test i 10 minuter, där täckt avstånd och antalet uppfödning och lutande spelades in. Efter en 24 h viloperiod utvärderades mössens sensitivomotoriska beteende av strålgångstestet, i vilket gångtiden, tiden för att nå plattformen och antalet resor registrerades. (B) Från El Amki m.fl.22: I strålgångstestet visade SAH-möss ett ökat antal resor jämfört med kontroller vid D7 (**, p<0,01), D10 (***, p<0,001) och D14 (*, p<0,05) och med skenmössor på D10 (*, p<0,05). (C) Från El Amki et al.22: SAH möss uppvisade en minskad sträcka korsade (*, p < 0,05) och vertikal aktivitet jämfört med Sham möss på D9 (*, p< 0,01). ANOVA följt av Sidaks multipla jämförelsetest. Data uttrycktes som medelvärde ± SEM. n=10-12/condition. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trots intensiteten i forskningen inom området SAH och utvecklingen av terapeutiska strategier såsom endovaskulära och farmakologiska behandlingsalternativ ökar under de senaste tjugo åren, dödligheten är fortfarande hög inom den första veckan av sjukhusvistelse och når cirka 50% under de följande 6 månaderna24,25. Denna nuvarande prekliniska modell genom daglig dubbel injektion av homologa kranskärlens blod i cisterna magna har erkänts för sin giltighet och dess associering med en låg dödlighet. I själva verket, bland SAH gnagare modeller, ett brett utbud av dödlighet har rapporterats: 0-16% dödlighet med enstaka blod injektion i cisterna magn26,27,2828,29,30,31,32,33,34,35, 10-33% dödlighet med blodinjektion i prechiasmatiska cister20,27,36,37, 16-66% dödlighet i modellen genom endovaskulär perforering38,39,40,41,42,43,44,45 och 0-43% med modellen genom dubbel blodinjektion i cisterna magna34,35,46,47,48. Den låga dödligheten i modellen (9% eller 27%, beroende på mössens ålder) kan bero på den svaga mängden injicerat blod, den långsamma injektionen och lutningen hos djuret som undviker lokaliserat tryck på hjärnstammen, jämfört med andra dubbelinjektionsmodeller. I SAH patienter, fönstret av CVS förekomst är klassiskt detekteras vid D4-D10 post-blödning. Hos djur studeras dock tiden till debuten och CVS varaktighet mindre och kan variera mellan HSA-modeller, sannolikt beroende på försöksprotokoll och djurarter21.

I detta sammanhang liknar modellen här kliniska SAH physiopathology i termer av SAH-associerade CVS. I allmänhet, i endovaskulär perforeringsmodell, förekommer CVS i MCA och BA efter 1 timme hosråttor 40 och efter 3 dagar hos möss17. I modellen genom blod injektion i prechiasmatiska cistern, CVS förekomst visades mellantvå 49 och åttadagar 37 hos råttor. I modellen av dubbelinjektion i cisterna magna hos råttor utvecklas CVS mellan 10 minuter29 och 3 dagar31. Vi är de första att beskriva kinetiska utseende av CVS i en mus modell av SAH genom dubbel injektion, upprättandet CVS i huvudsakliga cerebral artärer (ACA, MCA och BA) sedan 3 dagar och att vara ihållande fram till den 10: e dagen efter SAH22, nära vad som observeras i SAH patienter. Denna sista modell skulle kunna definieras som en skicklig modell av SAH, allvarlig nog utan dödlighet, vilket möjliggör undersökning av mekanismer och therapeutics inriktning CVS.

Men denna mus SAH-modellen kan också presentera vissa gränser. Den första punkten är bristen på kärl vägg bristning, som eventuellt återges i kollagenas-inducerad SAH modell, genom förstörelse / matsmältning av blodkärl basala lamina50. När det gäller förekomsten av makroskopiska CVS, är minskat cerebralt blodflöde (CBF) i vissa hjärnan territorier inte systematiskt korrelerade med neurologiska resultatet, alltså CBF bör utvärderas i denna föreslagna modell av SAH. Tidigare råttstudier där Laser Doppler Flowmetry använts i en SAH-modell av dubbelinjektion visade att CBF akut minskade till 30–52 % från baslinjen efter den första injektionen, med en återgång till baslinjen efter 2 till 3 dagar efter injektion51,52,53. I samförstånd, Det har visats av MRI en minskning av CBF på 33-50% vid D3 och 27–44% vid D5 efter SAH induktion i rat dubbel injektionmodeller 54,55. Dubbelinjektionen i cisterna magna möjliggör en förutsägbar fördelning av blod längs subarachnoid rymden, vilket resulterar särskilt i blodproppar runt den bakre cirkulationen, men kan införa variationer i fysiologiska parametrar. För att undvika intrakraniellt tryck (ICP) från att stiga med volymen injicerat blod in i ryggradskanalen, både leder till förvirrandefunktionsnedsättningar 56, valet att ta bort en motsvarande volym av cerebrospinalvätska skulle kunna göras, som tidigare gjorts i andra modeller30,51. I modellen här fick skenmöss en motsvarande volym av aCSF eller fysiologiska 0,9% NaCl, beroende på experimentet, uppenbarligen leder till en ökning av ICP. Således resulterar en akut ökning av ICP i en ökning från 18 mmHg till 120 mmHg27,48,53 i den enda injektionen av blod i cisterna magna modellen, från 46 till 107 mmHg27,37,49 i den prechiasmatiska blodinjektionsmodellen för cistern, och från 27 till 110 mmHg 39,40,53,57,58 i endovaskulär perforeringsmodell. Däremot var den dubbla blod injektion i cisterna magna förknippas med en mindre ICP ökning från 60 till 67 mmHg48,53. Dessutom skulle åtgärden att ta bort GSR också ändra ICP och ändra GSR. I SAH-modellen här var beslutet att inte ta bort CSF före blodinjektion utan att åtfölja kirurgi genom ett förfarande som består i att ta upp djurhuvudet från 30°. Syftet är att dämpa ICP genom att låta blodfördelningen i den främre cirkulationen, ett viktigt och nödvändigt steg för att efterlikna människans SAH-fysiopatologi. Hos SAH patienter, en kraftig ökning av ICP upptäcks och är associerad med en övergående globala cerebral ischemi59, sannolikt bidrar till en ihållande försämring av autoreglering och tidig neuronal cell förlust60. Men efter den första händelsen efter SAH, en tidig extern ventrikulärt dränering antas ofta för berörda SAH patienter, för att undvika hjärnan svullnad och hydrocefalus61. Här, den dubbla injektion SAH modellen kanske inte allvarliga vid den första blödning händelsen att provocera ICP-beroende konsekvenserna observerats hos patienter, men sannolikt återge en ihållande och mild förbättrad ICP för dagar efter SAH.

Dessutom var en annan okontrollerad parameter i SAH-modellen här de potentiella variationerna av det genomsnittliga artärblodtrycket (MABP) som framkallades av överdrivet snabbtblodprovsförfarande 27. Faktum är att MABP vanligtvis akut stiger efter experimentella SAH att bevara cerebrala perfusion tryck och därefter, faller till baslinjen. I SAH-modellen här injicerade vi blod eller aCSF (~ 10 μL/min) i låg takt för att undvika dessa MABP-variationer. När det gäller de neurobiologiska händelserna i denna modell härma de som observerats hos människor, vi visade tidigare att den dubbla blod injektion modell av SAH inducerar långvariga CVS, microthrombosis bildning och cerebral hjärnskada inklusive defekt i potentiella paravaskulär diffusion från dag 3 till dag 10 post-SAH22. Men, färska uppgifter som beskriver att CSD är inblandad i SAH-associerade DCI13 starkt stödja strävan efter denna typ av utredningar i musmodell av dubbel injektion. Detta bör möjliggöra vetenskapliga genombrott om de positiva effekterna av nya terapier som inriktas på värdepapperscentral.

Som avslutning, modellen av dubbel injektion av hela kranskärlens blod i cisterna magna är en behärskar modell som möjliggör ett enkelt sätt att efterlikna den mänskliga SAH physiopathology inklusive CVS, microthrombosis, Vaskulär inflammation, neurologiska underskott och dödlighet. Det representerar en validerad modell för att testa nya terapeutiska metoder för att behandla SAH-associerade morbi-dödlighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar PRIMACEN-plattformen (Normandie Rouen-universitetet, Frankrike) för bildutrustning och Arnaud Arabo, Julie Maucotel och Fru Martine Dubois, för djurbostäder och vård. Vi tackar mrs Celeste Nicola för att ha lånat ut sin röst till videofilmningen av protokollet. Detta arbete stöddes av Seinari Normandie mognadsprogram, Fondation AVC under egis av FRM, Normandie Rouen University och Inserm. Normandieregionen och Europeiska unionen (3R-projektet). Europa engagerar sig i Normandie med Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable hemostat Ethicon Surgicel
absorbable suturing thread Ethicon Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket Harvard Apparatus 50-7087-F
bluetack for capillary fixation UHU Patafix
electronic balance Denver Instrument MXX-2001
glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15 inner diameter 0.86 mm
outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer Phymep V100
micropipette puller Sutter Instrument Company P-97
needle 26 G BD microbalance 300300
non absorbable suturing thread Peters surgical Filapeau 4.0
stereotaxic frame David Kopf instruments Model 902
surgical equipment Kent scientific clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO Thermofisher 11866071

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rincon, F., Rossenwasser, R. H., Dumont, A. The epidemiology of admissions of nontraumatic subarachnoid hemorrhage in the United States. Neurosurgery. 73 (2), 212-222 (2013).
  2. Sandvei, M. S., et al. Incidence and mortality of aneurysmal subarachnoid hemorrhage in two Norwegian cohorts, 1984-2007. Neurology. 77 (20), 1833-1839 (2011).
  3. van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369 (9558), 306-318 (2007).
  4. Solenski, N. J., et al. Medical complications of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a report of the multicenter, cooperative aneurysm study. Participants of the Multicenter Cooperative Aneurysm Study. Critical Care Medicine. 23 (6), 1007-1017 (1995).
  5. Cahill, J., Calvert, J. W., Zhang, J. H. Mechanisms of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26 (11), 1341-1353 (2006).
  6. Huang, J., van Gelder, J. M. The probability of sudden death from rupture of intracranial aneurysms: a meta-analysis. Neurosurgery. 51 (5), 1101-1107 (2002).
  7. Rabinstein, A. A. Secondary brain injury after aneurysmal subarachnoid haemorrhage: more than vasospasm. Lancet Neurology. 10 (7), 593-595 (2011).
  8. Kivisaari, R. P., et al. MR Imaging After Aneurysmal Subarachnoid Hemorrhage and Surgery: A Long-term Follow-up Study. American Journal of Neuroradiology. 22 (6), 1143-1148 (2001).
  9. Mayberg, M. R., et al. Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. A statement for healthcare professionals from a special writing group of the Stroke Council, American Heart Association. Stroke. 25 (11), 2315-2328 (1994).
  10. Dankbaar, J. W., et al. Relationship between vasospasm, cerebral perfusion, and delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neuroradiology. 51 (12), 813-819 (2009).
  11. Sehba, F. A., Hou, J., Pluta, R. M., Zhang, J. H. The importance of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Progress in Neurobiology. 97 (1), 14-37 (2012).
  12. Miller, B. A., Turan, N., et al. Inflammation, vasospasm, and brain injury after subarachnoid hemorrhage. BioMed Res Int. 2014, 384342 (2014).
  13. Dreier, J. P., et al. Delayed ischaemic neurological deficits after subarachnoid haemorrhage are associated with clusters of spreading depolarizations. Brain. 129, Pt 12 3224-3237 (2006).
  14. Mayer, S., et al. Global and domain-specific cognitive impairment and outcome after subarachnoid hemorrhage. Neurology. 59 (11), 1750-1758 (2002).
  15. Al-Khindi, T., Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Cognitive and functional outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 41 (8), 519-536 (2010).
  16. Macdonald, R. L., et al. Randomized trial of clazosentan in patients with aneurysmal subarachnoid hemorrhage undergoing endovascular coiling. Stroke. 43 (6), 1463-1469 (2012).
  17. Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurological Research. 24 (5), 510-516 (2002).
  18. Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (81), e50845 (2013).
  19. Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
  20. Sabri, M., et al. Anterior circulation mouse model of subarachnoid hemorrhage. Brain Research. 1295, 179-185 (2009).
  21. Leclerc, J. L., et al. A Comparison of Pathophysiology in Humans and Rodent Models of Subarachnoid Hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
  22. El Amki, M., et al. Long-Lasting Cerebral Vasospasm, Microthrombosis, Apoptosis and Paravascular Alterations Associated with Neurological Deficits in a Mouse Model of Subarachnoid Hemorrhage. Molecular Neurobiology. 55 (4), 2763-2779 (2018).
  23. Clavier, T., et al. Association between vasoactive peptide urotensin II in plasma and cerebral vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a potential therapeutic target. Journal of Neurosurgery. , 1-11 (2018).
  24. Kundra, S., Mahendru, V., Gupta, V., Choudhary, A. K. Principles of neuroanesthesia in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Anaesthesiology Clinical Pharmacology. 30 (3), 328-337 (2014).
  25. Schertz, M., et al. Incidence and Mortality of Spontaneous Subarachnoid Hemorrhage in Martinique. PLOS ONE. 11 (5), 0155945 (2016).
  26. Lin, C. -L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
  27. Prunell, G. F., Mathiesen, T., Diemer, N. H., Svendgaard, N. -A. Experimental subarachnoid hemorrhage: subarachnoid blood volume, mortality rate, neuronal death, cerebral blood flow, and perfusion pressure in three different rat models. Neurosurgery. 52 (1), 165-176 (2003).
  28. Turowski, B., et al. New angiographic measurement tool for analysis of small cerebral vessels: application to a subarachnoid haemorrhage model in the rat. Neuroradiology. 49 (2), 129-137 (2007).
  29. Boyko, M., et al. The neuro-behavioral profile in rats after subarachnoid hemorrhage. Brain Research. 1491, 109-116 (2013).
  30. Muñoz-Sánchez, M. Á, et al. Urotensinergic system genes in experimental subarachnoid hemorrhage. Medicina Intensiva (English Edition). 41 (8), 468-474 (2017).
  31. Delgado, T., Brismar, J., Svendgaard, N. A. Subarachnoid haemorrhage in the rat: angiography and fluorescence microscopy of the major cerebral arteries. Stroke. 16 (4), 595-602 (1985).
  32. Solomon, R. A., Antunes, J. L., Chen, R., Bland, L., Chien, S. Decrease in cerebral blood flow in rats after experimental subarachnoid hemorrhage: a new animal model. Stroke. 16 (1), 58-64 (1985).
  33. Ram, Z., Sahar, A., Hadani, M. Vasospasm due to massive subarachnoid haemorrhage-a rat model. Acta Neurochirurgica. 110 (3-4), 181-184 (1991).
  34. Glenn, T. C., et al. Subarachnoid hemorrhage induces dynamic changes in regional cerebral metabolism in rats. Journal of Neurotrauma. 19 (4), 449-466 (2002).
  35. Gules, I., Satoh, M., Clower, B. R., Nanda, A., Zhang, J. H. Comparison of three rat models of cerebral vasospasm. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (6), 2551-2559 (2002).
  36. Sabri, M., et al. Mechanisms of microthrombi formation after experimental subarachnoid hemorrhage. Neuroscience. 224, 26-37 (2012).
  37. Jeon, H., Ai, J., Sabri, M., Tariq, A., Macdonald, R. Learning deficits after experimental subarachnoid hemorrhage in rats. Neuroscience. 169 (4), 1805-1814 (2010).
  38. Silasi, G., Colbourne, F. Long-term assessment of motor and cognitive behaviours in the intraluminal perforation model of subarachnoid hemorrhage in rats. Behavioural Brain Researchearch. 198 (2), 380-387 (2009).
  39. Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26 (6), 1086-1092 (1995).
  40. Bederson, J. B., et al. Acute vasoconstriction after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 42 (2), 352-362 (1998).
  41. Park, I. -S., et al. Subarachnoid hemorrhage model in the rat: modification of the endovascular filament model. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 195-200 (2008).
  42. Vanden Bergh, W., et al. Magnetic resonance imaging in experimental subarachnoid haemorrhage. Acta Neurochirurgica. 147 (9), 977-983 (2005).
  43. Peng, J., et al. LRP1 activation attenuates white matter injury by modulating microglial polarization through Shc1/PI3K/Akt pathway after subarachnoid hemorrhage in rats. Redox Biology. 21, 101121 (2019).
  44. Okada, T., et al. Selective Toll-Like Receptor 4 Antagonists Prevent Acute Blood-Brain Barrier Disruption After Subarachnoid Hemorrhage in Mice. Molecular Neurobiology. 56 (2), 976-985 (2019).
  45. Tiebosch, I. A., et al. Progression of brain lesions in relation to hyperperfusion from subacute to chronic stages after experimental subarachnoid hemorrhage: a multiparametric MRI study. Cerebrovascular Diseases. 36 (3), 167-172 (2013).
  46. Weidauer, S., Vatter, H., Dettmann, E., Seifert, V., Zanella, F. E. Assessment of vasospasm in experimental subarachnoid hemorrhage in rats by selective biplane digital subtraction angiography. Neuroradiology. 48 (3), 176-181 (2006).
  47. Lee, J. Y., Huang, D. L., Keep, R., Sagher, O. Characterization of an improved double hemorrhage rat model for the study of delayed cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 168 (2), 358-366 (2008).
  48. Cai, J., et al. A novel intravital method to evaluate cerebral vasospasm in rat models of subarachnoid hemorrhage: a study with synchrotron radiation angiography. PloS one. 7 (3), 33366 (2012).
  49. Piepgras, A., Thome, C., Schmiedek, P. Characterization of an anterior circulation rat subarachnoid hemorrhage model. Stroke. 26 (12), 2347-2352 (1995).
  50. Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).
  51. Raslan, F., et al. A modified double injection model of cisterna magna for the study of delayed cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage in rats. Experimental & Translational Stroke Medicine. 4 (1), 23 (2012).
  52. Cai, J., et al. A novel intravital method to evaluate cerebral vasospasm in rat models of subarachnoid hemorrhage: a study with synchrotron radiation angiography. PLoS One. 7 (3), 33366 (2012).
  53. Lee, J. Y., Sagher, O., Keep, R., Hua, Y., Xi, G. Comparison of experimental rat models of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (2), 331-343 (2009).
  54. Guresir, E., et al. The effect of common carotid artery occlusion on delayed brain tissue damage in the rat double subarachnoid hemorrhage model. Acta Neurochir (Wien). 154 (1), 11-19 (2012).
  55. Vatter, H., et al. Time course in the development of cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage: clinical and neuroradiological assessment of the rat double hemorrhage model. Neurosurgery. 58 (6), 1190-1197 (2006).
  56. Leonardo, C. C., Robbins, S., Doré, S. Translating basic science research to clinical application: models and strategies for intracerebral hemorrhage. Frontiers in Neurology. 3, 85 (2012).
  57. Feiler, S., Friedrich, B., Schöller, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).
  58. Westermaier, T., Jauss, A., Eriskat, J., Kunze, E., Roosen, K. Acute vasoconstriction: decrease and recovery of cerebral blood flow after various intensities of experimental subarachnoid hemorrhage in rats. Journal of Neurosurgery. 110 (5), 996-1002 (2009).
  59. van Lieshout, J. H., et al. An introduction to the pathophysiology of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgical Review. 41 (4), 917-930 (2018).
  60. Conzen, C., et al. The Acute Phase of Experimental Subarachnoid Hemorrhage: Intracranial Pressure Dynamics and Their Effect on Cerebral Blood Flow and Autoregulation. Translational Stroke Research. 10 (5), 566-582 (2019).
  61. Connolly, E. S., et al. Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/american Stroke Association. Stroke. 43 (6), 1711-1737 (2012).

Tags

Neurovetenskap Subarachnoid blödning cisterna magna mus vasospasm djurmodell sensitivo-motor test blod
Dubbel direktinsprutning av blod i Cisterna Magna som en modell av Subarachnoid Hemorrhage
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pedard, M., El Amki, M.,… More

Pedard, M., El Amki, M., Lefevre-Scelles, A., Compère, V., Castel, H. Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage. J. Vis. Exp. (162), e61322, doi:10.3791/61322 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter