Summary
Este manuscrito describe un método para grabaciones continuas de video EEG utilizando electrodos de profundidad múltiple en ratones neonatales sometidos a hipoxia-isquemia.
Abstract
La isquemia por hipoxia es la causa más común de convulsiones neonatales. Los modelos animales son cruciales para comprender los mecanismos y la fisiología subyacentes a las convulsiones neonatales y la isquemia por hipoxia. Este manuscrito describe un método para el monitoreo continuo de video electroencefalograma (EEG) en ratones neonatales para detectar convulsiones y analizar el fondo de EEG durante la isquemia por hipoxia. El uso de video y EEG en conjunto permite la descripción de la semiología de convulsiones y la confirmación de convulsiones. Este método también permite el análisis de espectrogramas de potencia y tendencias de patrones de fondo de EEG durante el período de tiempo experimental. En este modelo de isquemia por hipoxia, el método permite el registro de EEG antes de la lesión para obtener una línea de base normativa y durante la lesión y la recuperación. El tiempo total de monitoreo está limitado por la incapacidad de separar a los cachorros de la madre durante más de cuatro horas. Aunque, hemos utilizado un modelo de convulsiones hipóxico-isquémicas en este manuscrito, este método para el monitoreo de EEG de video neonatal podría aplicarse a diversos modelos de enfermedades y convulsiones en roedores.
Introduction
La encefalopatía isquémica hipóxica (HIE) es una afección que afecta a 1,5 de cada 1000 recién nacidos anualmente y es la causa más frecuente de convulsiones neonatales1,2. Los bebés que sobreviven están en riesgo de diversas discapacidades neurológicas como parálisis cerebral, discapacidad intelectual y epilepsia3,4,5.
Los modelos animales juegan un papel crítico en la comprensión e investigación de la fisiopatología de la isquemia por hipoxia y las convulsiones neonatales6,7. Se utiliza un modelo de Vannucci modificado para inducir isquemia por hipoxia (HI) en el día 10 postnatal (p10)7,8. Los cachorros de ratón de esta edad se traducen neurológicamente aproximadamente al término completo neonato humano9.
La monitorización continua por video electroencefalografía (EEG) utilizada junto con este modelo de lesión permite una mayor comprensión y caracterización de las convulsiones isquémicas hipóxicas neonatales. Estudios previos han utilizado diversos métodos para analizar las convulsiones neonatales en roedores, incluidas grabaciones de video, grabaciones limitadas de EEG y grabaciones de EEG de telemetría10,11,12,13,14,15,16. En el siguiente manuscrito, discutimos en profundidad el proceso de grabación de video continuo EEG en cachorros de ratón durante la hipoxia-isquemia. Esta técnica para el monitoreo continuo de video EEG en cachorros de ratón neonatales podría aplicarse a una variedad de modelos de enfermedades y convulsiones.
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Protocol
Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia.
1. Edificio de electrodos / edificio de cables
- Utilice un cable de acero inoxidable con aislamiento unipolar (diámetro desnudo de 0,005", recubierto de 0,008") para hacer un electrodo que esté conectado con un conector de enchufe hembra (conector de receptáculo hembra 0.079).
- Utilice un cable especial hecho a medida para conectar animales al amplificador.
- Conecte un conector macho de 4 pines (conector macho 0.079") a un amplificador operacional (amplificador operacional) de impedancia de ganancia de unidad de 4 canales. Conecte una resistencia de 10K a los cables que se conectan a la batería de 9 V. Un cable de tierra no conectado al amplificador operacional actúa como el punto medio de la batería.
- Conecte un extremo del cable (AWG, 0.012" OD) al amplificador operacional y conecte el otro extremo del cable al amplificador.
2. Cirugía de implantación de electrodos
- Anestesiar al cachorro (día postnatal 9) con 4-5% de isoflurano en una capucha de flujo descendente. Antes del inicio del procedimiento, inyecte a los cachorros con bupivacaína (0.02-0.05 mL, infiltración local subcutánea al 0.25%).
- Una vez que el animal está inmóvil, transfiéralo a una etapa estereotáctica con un cono nasal. Use el reverso de la barra de la oreja, ya que es suave para mantener la cabeza firme. A esta edad, los cachorros no tienen una oreja completamente desarrollada para usar el extremo puntiagudo de la barra de la oreja.
- Reduzca el flujo de isoflurano y manténgalo en 2.5-3%. Vigile la respiración constante del cachorro durante todo el procedimiento quirúrgico. Pellizque la cola para verificar la respuesta al dolor y luego proceda a la incisión.
- Esterilizar el área de incisión en el cráneo con betadina y alcohol (3 ciclos de yodo alterno y etanol al 70%). Cubra la parte circundante del cuerpo de tal manera que la región de la incisión sea visible.
- Abra el cuero cabelludo anterior-posterior desde ligeramente por encima de los ojos y retraiga aproximadamente 0,5 cm de piel. Reposicione la cabeza del ratón en la etapa estereotáxica para que la piel tire hacia afuera exponiendo el cráneo.
- Aplique peróxido de hidrógeno en el cráneo con un hisopo de algodón y raspe el cráneo limpio con una cuchilla de bisturí. El cráneo es muy suave; tenga cuidado al raspar.
- Aplique una gota (aproximadamente 50 μL) de adhesivo y extiéndalo alrededor del área expuesta del cráneo usando su aplicador. Exponer a la luz UV durante 40 s para fijar el adhesivo.
- Mida las coordenadas utilizando el bregma expuesto como referencia. Implantar electrodos bilateralmente en la región CA1 del hipocampo [-3,5 mm Dorsal-Ventral (DV), ±2 mm Medial-Lateral (ML), -1,75 mm Profundo (D)] y bilateralmente en la corteza parietal [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] y un electrodo de referencia en el cerebelo17. Use una aguja de 32 G para crear un agujero en la región marcada.
- Limpie la sangre de la superficie del cráneo. Electrodos inferiores unidos al conector de la cavidad femenina en el cerebro con la ayuda del brazo estereotáxico y fijarlos en su lugar con acrílico dental. Implantar el electrodo en el cerebro. El auricular conector de enchufe se encuentra en la parte superior del cráneo pegado por acrílico dental.
- Inyecte ketoprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea en la región interescapular una vez fijado el electrodo. Coloque a los cachorros de nuevo con la madre.
NOTA: Presente la mitad de la camada con los auriculares a la vez a la madre en lugar de presentarlos uno a la vez. Esto evitará que la madre dañe los auriculares del cachorro.
3. Configuración y registro del EEG (línea de base/pre-lesión)
- Después de 24 h de recuperación después de la implantación del electrodo, coloque a cada animal en una cámara de plexiglás calentada (37 ° C) hecha a medida para el registro de EEG. Esta cámara también servirá como una cámara de hipoxia.
- Conecte a los cachorros en la cámara a un sistema de monitoreo de video-EEG a través de un cable flexible (cable op-amp hecho a medida).
NOTA: Con los auriculares en su lugar, los ratones son libremente móviles y no exhiben ninguna diferencia en el comportamiento. Una vez conectados a los cables de los electrodos, los cables deben ajustarse dentro de la correa de la cámara para proporcionar la cantidad correcta de holgura para que el cachorro pueda moverse libremente por toda la cámara. - Digitalice los datos de EEG a 1000 Hz con ganancia de 1K utilizando un amplificador de hierba. Revise la señal EEG (filtro de paso de banda entre 3-70 Hz) más tarde utilizando software (por ejemplo, LabChart Pro).
- Registre un EEG basal previo a la lesión durante 30 minutos antes de desconectar a los animales para el procedimiento de ligadura de la arteria carótida.
4. Ligadura de la arteria carótida izquierda
- Anestesiar al cachorro (día postnatal 10) con 4-5% de isoflurano en una capucha de flujo descendente y colocarlos en una configuración especialmente dispuesta en una almohadilla de baño de agua. Coloque el animal en decúbito supino y asegure las extremidades anteriores con cinta de papel.
- Reducir el flujo de isoflurano a 2-3%. Pellizque la cola para la respuesta al dolor y controle la respiración durante todo el procedimiento.
- Esterilizar el área de incisión (entre la mandíbula y la clavícula) en el lado izquierdo del cuello con betadina y alcohol (3 ciclos de yodo alterno y etanol al 70%).
- Haga una incisión de aproximadamente 1 cm de largo en el lado izquierdo del cuello usando microescisores. Usando un microscopio de disección, retraiga cuidadosamente el tejido subcutáneo y la piel para exponer la arteria carótida. Tenga cuidado de identificar el nervio vago (que corre lateral a la arteria) y sepárelo y retraiga delicadamente de la arteria.
- Enhebrar una sutura de seda estéril de 5 cm de largo debajo de la arteria usando microfuerzas. Ata una sutura de doble anudado alrededor de la arteria para ocluir el flujo.
- Corte el exceso de sutura y cierre la arteria expuesta tirando hacia atrás del tejido subcutáneo y la piel. Use la unión veterinaria para sellar la incisión.
- Coloque al animal de nuevo en monitoreo continuo de EEG en una cámara a temperatura ambiente, que se coloca en un colchón que se calienta. Realice controles de temperatura infrarrojos puntuales de la temperatura del núcleo del cachorro para evitar abrir la cámara. Permita que el animal se recupere durante 1 h antes de la hipoxia.
5. EEG e hipoxia
- Monitoree continuamente FiO2 (fracción de oxígeno inspirado) dentro de la cámara a través de un monitor de oxígeno.
- Enjuague la cámara con 60 L/min de 100% N2 y 0.415 L/min para 100% de O2. Una vez que la saturación de oxígeno en la cámara alcanza el 12%, disminuya el flujo de N2 a 10 L / min mientras mantiene el flujo de O2 sin cambios. Con pequeños ajustes, mantenga el FiO2 al 8% durante 45 min.
- Después de 45 min de exposición a la hipoxia, devuelva la FiO2 al 21%.
- Haga que los cachorros se recuperen en la cámara y monitoree el EEG durante 2 h después de la hipoxia.
- Después de completar el período de grabación, desconecte los ratones de la grabación de EEG y regrese a la madre.
6. Análisis EEG
- Analice el archivo EEG con video en LabChart Pro. Haga que un investigador ciego marque el EEG para detectar convulsiones y patrones de fondo17. Las convulsiones se definen como un evento electrográfico de duración superior a 10 segundos con descargas rítmicas de onda aguda de alta frecuencia (≥3x basal) con clara evolución17.
- Haga que un segundo investigador ciego revise los eventos marcados al azar para el acuerdo.
- Revisar el video asociado para cada evento electrográfico marcado y analizar de acuerdo con la puntuación de convulsión conductual del roedor neonatal16. Brevemente, esta puntuación oscila entre 0-6 (inmovilidad a comportamiento tónico-clónico severo). Para caracterizar aún más la semiología convulsiva, analice el comportamiento para la lateralidad (movimientos multifocales / bilaterales vs. focales / unilaterales vs. mixtos).
- Cree un espectrograma de potencia. Utilice una transformada rápida de Fourier con una ventana de datos de Cosine-Bell con un tamaño de 1024 puntos de datos. Cree un eje X suave en el espectrograma con la ayuda de una superposición de ventanas del 87,5%. Exprese la potencia como μV218.
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Representative Results
Semiología de convulsiones
La exposición a hipoxia-isquemia neonatal da lugar a convulsiones generalizadas y focales en ratones (Figura 1A-C). Las grabaciones de video EEG permiten que los hallazgos electrográficos se correlacionen con el comportamiento en video. Estos comportamientos se puntuaron utilizando una puntuación de convulsiones conductuales de roedores neonatales (BSS) publicada anteriormente16. Además de BSS, categorizamos los eventos en función de si el comportamiento fue focal/ unilateral, bilateral o mixto (Figura 1B).
En este modelo, los ratones generalmente exhibieron 3 patrones de semiología convulsiva: 1) círculos repetitivos hacia el lado de la ligadura con extensión de extremidades contralaterales, 2) pérdida de postura con flexión corporal y cola curvada al lado de la ligadura, o 3) pérdida de postura con remo unilateral o bilateral de extremidades (variando gravedad y longitud). La mayoría de los eventos observados involucraron comportamientos focales/unilaterales o mixtos (Figura 1B). Además, durante el período hipóxico, un subconjunto de ratones exhibió actividad convulsiva convulsiva, donde el cachorro estaba inmóvil con actividad convulsiva sostenida en el EEG (Figura 1C).
Grabaciones electrográficas
El registro del EEG se inició 30 minutos antes de la ligadura carotídea para obtener una línea de base previa a la lesión. La actividad basal (Figura 1A y Figura 2A) fue similar al fondo descrito anteriormente en cachorros de ratón p1017. Después de la ligadura, los cachorros fueron colocados inmediatamente de nuevo en video EEG. Durante el período entre la ligadura y el comienzo de la hipoxia, un subconjunto de ratones exhibe convulsiones (Figura 1A-C).
Después de la inducción de la hipoxia, la amplitud de fondo en el EEG se redujo (Figura 3B) y exhibió intermitentemente ráfagas de descargas de ondas de pico, seguidas de supresión (Figura 2A). Los ratones exhiben convulsiones electrográficas, que emergen de un fondo suprimido a medida que las descargas rítmicas de ondas de pico y progresan para volverse más complejas y frecuentes, con ondas polispike (Figura 2B). Durante la hipoxia, el análisis del espectrograma de potencia fue notable por las asimetrías entre el hemisferio isquémico y el contralateral (Figura 3A, B). El hemisferio isquémico exhibió un patrón de supresión de ráfagas y el hemisferio contralateral exhibió un fondo suprimido (Figura 1A y Figura 3A, B). En promedio, las convulsiones comienzan 5.5±8.1 minutos después de la inducción de la hipoxia, y cada evento dura 56±57 segundos. Hubo una tasa de mortalidad del 13% durante la hipoxia (n = 4/30), con todas las muertes después de una convulsión convulsiva (BSS = 5-6).
Durante la reoxigenación y la recuperación, un subconjunto de ratones continúa teniendo convulsiones durante el resto del período de registro (2 h después de la hipoxia). El fondo de EEG se suprimió en comparación con el valor basal después de la hipoxia (Figura 1A y Figura 3), con recuperación gradual durante el período de registro posterior a la hipoxia. Durante todo el período de registro, los ratones exhibieron en promedio 9±5 eventos de convulsiones, cada uno duró 54±57.7 s.
Figura 1: Características de las convulsiones en ratones p10 expuestos a hipoxia-isquemia neonatal. (A) Espectrograma de potencia representativa desde el electrodo de la corteza parietal isquémica a través de la línea de tiempo experimental. (Escala de mapa de calor de color de amplitud x10–6). Las flechas indican el tiempo que representan los trazados de electroencefalogramas en bruto debajo del espectrograma. (B) Comportamientos convulsivos para todo el experimento, postisquemia/prehipoxia, durante la hipoxia y posthipoxia. (C) Puntuación de convulsiones conductuales (BSS) y tiempo para todos los eventos de convulsiones (n = 30 ratones, cada ratón tiene un símbolo único, cada punto es un evento de convulsión discreto). 100% de los ratones capturados durante la hipoxia (caja azul; tiempo = -60 minutos es la finalización de la ligadura carotídea, tiempo = 0 es el comienzo de la hipoxia). El trece por ciento murió durante la hipoxia después de una convulsión convulsiva (grado 5-6). Esta cifra ha sido modificada a partir de Burnsed et al13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Patrones característicos de electroencefalografía (EEG) durante la isquemia por hipoxia. (A) Antecedentes de EEG de izquierda a derecha: línea de base preinjurio, supresión de ráfaga durante la hipoxia, supresión posterior a la hipoxia. Grabación desde el electrodo de profundidad de la corteza parietal ipsilateral. (B) Evolución de una convulsión durante la hipoxia. Grabación desde electrodo de profundidad del hipocampo ipsilateral. Los cuadros sombreados (I-V) correspondían a extractos de EEG expandidos a la derecha de (B). Esta cifra ha sido modificada a partir de Burnsed et al13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Asimetrías en fondo de EEG entre hemisferios isquémicos y contralaterales. (A) Espectrograma de potencia asimétrica en ratones HI durante la hipoxia (período de 45 minutos) en la corteza isquémica (izquierda) y la corteza contralateral (derecha; escala de amplitud x10–6). Patrón de supresión de ráfagas y convulsiones en el hemisferio isquémico, supresión en el hemisferio CL. (B) Supresión de fondo durante la hipoxia y la reoxigenación en los hemisferios IL y CL. Todas las mediciones del voltaje medio tomadas de extractos aleatorios de 10 segundos del encefalograma durante el período de tiempo experimental (línea de base, 30 minutos después de la ligación, durante la hipoxia: 15 minutos y 30 minutos después del inicio, después de la reoxigenación: 15 minutos y 60 minutos después del inicio) se compararon con la línea de base. La línea de base de cada animal sirvió como su propio control, y los datos se informan como un porcentaje de la línea de base (n = 5 ratones). Las mediciones se tomaron de electrodos corticales. Esta cifra ha sido modificada a partir de Burnsed et al13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos presentado un modelo para la monitorización continua de video-EEG en ratones neonatales durante las convulsiones hipóxico-isquémicas. El análisis de video en conjunto con EEG permite la caracterización de la semiología de convulsiones. El análisis de EEG permite la extracción de espectrogramas de potencia y el análisis de amplitud de fondo.
La colocación correcta y cuidadosa de los electrodos es crucial en este protocolo, ya que las lesiones durante la colocación de los electrodos o la colocación inexacta pueden afectar significativamente los resultados. La evaluación de la actividad normal del EEG basal antes de la lesión es primordial, ya que puede ocurrir sangrado o lesión durante la colocación del electrodo, aunque es raro. En segundo lugar, para confirmar la colocación correcta del electrodo, los cerebros se pueden seccionar y examinar en busca de pistas de electrodos en la colocación adecuada. Además, el hecho de no devolver a los cachorros a la madre en grupos (individualmente) puede resultar en que los auriculares de electrodos se dañen o los cachorros sean asesinados o descuidados por la madre.
Una limitación de este método es el límite de localización espacial de los registros de electrodos de profundidad en un cerebro neonatal pequeño. Esto restringe la capacidad de localizar focos de convulsiones específicos en las grabaciones de EEG. Otra limitación en este modelo de isquemia por hipoxia es la variabilidad en la carga convulsiva. La variabilidad en el tamaño de la lesión y los déficits conductuales en este modelo de roedor de isquemia por hipoxia ha sido bien descrita previamente7,8,19. No es sorprendente que esta variabilidad exista en la carga de las convulsiones (tanto la duración de los eventos convulsivos como el número de eventos convulsivos). Sin embargo, consistentemente, el 100% de los cachorros en este modelo exhiben convulsiones durante la hipoxia. Por último, la cantidad de tiempo que los cachorros pueden estar en monitoreo de EEG (lejos de la madre) es limitada. Por lo tanto, no es posible caracterizar las convulsiones en curso con EEG continuo en puntos de tiempo posteriores en relación con la lesión.
Aunque hemos utilizado un modelo de convulsión por hipoxia-isquemia en este manuscrito, este método para el monitoreo continuo de video-EEG en cachorros de ratón neonatales podría aplicarse fácilmente a otros modelos de enfermedad / convulsiones. Las convulsiones en roedores neonatales son difíciles de reconocer basándose solo en el comportamiento, lo que hace que el monitoreo de video-EEG sea importante. Las investigaciones futuras podrían utilizar estas técnicas para analizar la carga convulsiva y la semiología en otros modelos de convulsiones neonatales o la respuesta a medidas terapéuticas y neuroprotectoras.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Reconocemos las siguientes fuentes de financiación: NIH NINDS – K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), Facultad de Medicina de la Universidad de Virginia (JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SURGERY | |||
| Ball Point Applicator | Metrex Research | 8300-F | i-bond applicator |
| Cranioplast (Powder/Resin) | Coltene | H00383 | Perm Reline/Power |
| I-Bond | Kulzer GmbH, Germany | ||
| LOOK Silk Suture | Surgical Specialities Corporation | SP115 | LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture |
| RS-5168 Botvin Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS5168 | Forcep for surgery/ligation |
| RS-5138 Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS5138 | Forcep for surgery/ligation |
| UV light for I-Bond | Blast Lite By First Media | BL778 | UV ligth for I-bond |
| Vannas Microdissecting Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS5618 | Scissor for ligation |
| Vet Bond | 3M Vetbond | 1469SB | Vet Glue |
| HYPOXIA | |||
| Hypoxidial | Starr Life Science | ||
| Oxygen sensor | Medical Products | MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig | |
| EEG RECORDING | |||
| Female receptacle connector 0.079" | Mill-Max Manufacturing Corp | 832-10-024-10-001000 | Ordered from Digikey |
| Grass Amplifier | Natus Neurology Incorporated | Grass Product | |
| LabChart Pro | ADI Instruments | Software to run the system | |
| Male Socket Connector 0.079" | Mill-Max Manufacturing Corp | 833-43-024-20-001000 | Ordered from Digikey |
| Operational Amplifier | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2274CD | TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier |
| Operational Amplifier | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2272ACDR | TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier |
| Stainless Steel wire | A-M Systems | 791400 | 0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft |
| Ultra-Flexible Wire | McMaster-Carr | 9564T1 | 36 Gauze wire of various color |
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