Summary
Detta manuskript beskriver en metod för kontinuerlig video EEG inspelningar med flera djup elektroder i neonatal möss genomgår hypoxi-ischemi.
Abstract
Hypoxi ischemi är den vanligaste orsaken till neonatal beslag. Djurmodeller är avgörande för att förstå mekanismerna och fysiologin bakom neonatal beslag och hypoxi ischemi. Detta manuskript beskriver en metod för kontinuerlig video elektroencefalogram (EEG) övervakning i neonatal möss för att upptäcka beslag och analysera EEG bakgrund under hypoxi ischemi. Användning av video och EEG i samband med möjliggör beskrivning av beslag semiologi och bekräftelse av beslag. Denna metod tillåter också analys av effektspektrogram och EEG bakgrundsmönster trender under den experimentella tidsperioden. I denna hypoxi ischemi modell, metoden tillåter EEG registrering före skada att erhålla en normativ baslinje och under skada och återhämtning. Den totala övervakningstiden begränsas av oförmågan att skilja ungar från modern längre än fyra timmar. Även om vi har använt en modell av hypoxic-ischemic beslag i detta manuskript, denna metod för neonatal video EEG övervakning kan tillämpas på olika sjukdom och beslag modeller hos gnagare.
Introduction
Hypoxic ischemisk encefalopati (HIE) är ett tillstånd som påverkar 1,5 hos 1000 nyfödda årligen och är den vanligaste orsaken till neonatal beslag1,2. Spädbarn som överlever löper risk för olika neurologiska funktionsnedsättningar som cerebral pares, intellektuell funktionsnedsättning och epilepsi3,4,5.
Djurmodeller spelar en avgörande roll för att förstå och undersöka patofysiologi av hypoxi ischemi och neonatal beslag6,7. En modifierad Vannucci-modell används för att inducera hypoxi ischemi (HI) på postnatal dag 10 (p10)7,8. Musvalpar i denna ålder översätter neurologiskt ungefär till hela termen människa neonate9.
Kontinuerlig video elektroencefalografi (EEG) övervakning som används i samband med denna skada modell möjliggör ytterligare förståelse och karakterisering av neonatal hypoxic skandinaviska beslag. Tidigare studier har använt olika metoder för att analysera neonatala anfall hos gnagare, inklusive videoinspelningar, begränsade EEG-inspelningar och telemetri-EEG-inspelningar10,11,12,13,14,15,16. I följande manuskript diskuterar vi ingående processen att spela in kontinuerlig video EEG i musvalpar under hypoxi-ischemi. Denna teknik för kontinuerlig video EEG övervakning i neonatal mus pups kan tillämpas på en mängd olika sjukdomar och beslag modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Virginia.
1. Elektrodbyggnad/kabelbyggnad
- Använd en enpolig isolerad tråd i rostfritt stål (0,005" bar diameter, 0,008" belagd) för att göra en elektrod som är ansluten till en kvinnlig socketkontakt (honkontakt 0,079).
- Använd en speciell specialtillverkad kabel för att ansluta djur till förstärkaren.
- Fäst en hane 4-stiftskontakt (Hankontakt 0,079") på 4-kanals enhetsförstärkningsmatchande driftsförstärkare (op-amp). Anslut ett 10K-motstånd till kablarna som ansluts till 9 V-batteriet. En jordkabel som inte är ansluten till op-amp fungerar som mittpunkten på batteriet.
- Anslut ena änden av kabeln (AWG, 0,012" OD) till op-ampen och anslut den andra änden av kabeln till förstärkaren.
2. Elektrodimplantationskirurgi
- Bedöva valpen (postnatal dag 9) med 4-5% isofluran i en nedåtgående flödeshuv. Innan proceduren börjar injicera valparna med bupivakain (0,02-0,05 ml, 0,25% subkutan lokal infiltration).
- När djuret är orörligt, överför till ett stereotaktiskt stadium med en näskon. Använd öronstångens baksida eftersom den är mjuk för att hålla huvudet stadigt. Vid denna ålder har valpar inte ett fullt utvecklat öra för att använda öronstångens spetsiga ände.
- S nej till flödet av isofluran och håll det på 2,5-3%. Håll ett öga på valpens stadiga andning under hela operationen. Nyp ihop svansen för att kontrollera smärtresponsen och fortsätt sedan till snitt.
- Sterilisera snittområdet på skallen med betadin och alkohol (3 cykler av alternerande jod och 70% etanol). Drapera den omgivande kroppsdelen så att snittregionen är synlig.
- Öppna hårbotten främre-bakre från något ovanför ögonen och dra tillbaka ca 0,5 cm hud. Flytta mushuvudet på det stereotaxiska stadiet så att huden drar utåt och exponerar skallen.
- Applicera väteperoxid på skallen med en bomullspinne och skrapa skallen ren med ett skalpellblad. Skallen är mycket mjuk; var försiktig under skrapning.
- Applicera en droppe lim (cirka 50 μL) lim och sprid det runt det exponerade skallområdet med hjälp av dess applikator. Exponera för UV-ljus i 40 s för att ställa in limet.
- Mät koordinaterna med den exponerade bregma som referens. Implantatelektroder bilateralt i CA1-regionen i hippocampus [-3,5 mm Dorsal-Ventral (DV), ±2 mm Medial-Lateral (ML), -1,75 mm Djup (D)] och bilateralt i parietal cortex [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] och en referenselektrod i cerebellum17. Använd en 32 G-nål för att skapa ett hål i den markerade regionen.
- Rengör blodet från skallens yta. Nedre elektroder fästa vid den kvinnliga socketkontakten i hjärnan med hjälp av den stereotaxiska armen och fixera på plats med dental akryl. Implantera elektroden i hjärnan. Socketkontaktheadsetet sitter ovanpå skallen limmat ihop av dental akryl.
- Injicera ketoprofen (5 mg/kg) subkutant i interscapular-regionen när elektroden är fastsatt. Placera valparna tillbaka med mamman.
OBS: Introducera hälften av kullen med headsetet på en gång till mamman i stället för att introducera dem en i taget. Detta förhindrar att mamman skadar valpens headset.
3. EEG-inställning och registrering (utgångsvärde/förskada)
- Efter 24 timmars återhämtning efter elektrodimplantation, placera varje djur i en uppvärmd (37 °C) skräddarsydd plexiglaskammare för EEG-registrering. Denna kammare kommer också att fungera som en hypoxikammare.
- Anslut valpar i kammaren till ett video-EEG-övervakningssystem via en flexibel kabel (specialtillverkad op-amp-kabel).
OBS: Med headsetet på plats är mössen fritt mobila och uppvisar inga skillnader i beteende. När kablarna är fästa vid elektrodtrådarna måste de justeras i kammarens tjuder för att ge rätt mängd slack så att valpen fritt kan röra sig genom kammaren. - Digitalisera EEG-data vid 1000 Hz med 1K-förstärkning med en gräsförstärkare. Granska EEG-signalen (bandpassfiltret mellan 3-70 Hz) senare med hjälp av programvara (t.ex. LabChart Pro).
- Registrera en EEG före skada i 30 minuter före frånkoppling av djur för halspulsåder ligatur förfarande.
4. Vänster halspulsåder ligatur
- Bedöva valpen (postnatal dag 10) med 4-5% isofluran i en nedåtgående flödeshuv och placera dem på speciellt arrangerade inställningar på en vattenbadplatta. Placera djurets supin och säkra förbenen med papperstejp.
- Sänk flödet av isofluran till 2-3%. Nyp ihop svansen för smärtrespons och övervaka andningen under hela proceduren.
- Sterilisera snittområdet (mellan underkäken och nyckelbenet) på vänster sida av nacken med betadin och alkohol (3 cykler av alternerande jod och 70% etanol).
- Gör ett cirka 1 cm långt snitt på vänster sida av nacken med hjälp av mikroscissorer. Använd ett dissekerande mikroskop och dra försiktigt tillbaka den subkutana vävnaden och huden för att exponera halsartären. Var noga med att identifiera vagusnerven (som löper lateralt till artären) och försiktigt separera och dra tillbaka den från artären.
- Trä en 5 cm lång steril silkessyskon under artären med hjälp av mikroforceps. Knyt en dubbelknuten sutur runt artären för att ockludera flödet.
- Skär den överflödiga suturen och stäng den exponerade artären genom att dra tillbaka den subkutana vävnaden och huden. Använd veterinärbindning för att försegla snittet.
- Placera djuret tillbaka på kontinuerlig EEG-övervakning i en kammare vid rumstemperatur, som placeras på en värmande madrass. Ta kontroll av infraröd temperatur av valpens kärntemperatur för att undvika att öppna kammaren. Låt djuret återhämta sig i 1 h före hypoxi.
5. EEG och hypoxi
- Övervaka kontinuerligt FiO2 (fraktion av inspirerat syre) i kammaren via en syremätare.
- Spola kammaren med 60 L/min på 100% N2 och 0,415 L/min för 100% O2. När syremättnaden i kammaren når 12%, minska N2-flödet till 10 L/min samtidigt som O2-flödet hålls oförändrat. Med små justeringar, behåll FiO2 på 8% i 45 min.
- Efter 45 minuters hypoxiexponering, återgå FiO2 till 21%.
- Låt valpar återhämta sig i kammaren och övervaka EEG för 2 h post-hypoxi.
- Efter avslutad inspelningsperiod, koppla bort möss från EEG-registrering och återvänd till modern.
6. EEG-analys
- Analysera EEG-filen med video i LabChart Pro. Låt en blindad forskare markera EEG för anfall och bakgrundsmönster17. Anfall definieras som en elektrografisk händelse som varar mer än 10 sekunder med högfrekventa rytmiska skarpa vågurladdningar (≥3x baslinje) med tydlig evolution17.
- Ha en andra blindad forskargranskning markerade händelser slumpmässigt för överenskommelse.
- Granska tillhörande video för varje markerad elektrografisk händelse och analysera enligt neonatal gnagare beteendemässiga beslag poäng16. Kortfattat varierar denna poäng från 0-6 (orörlighet till allvarligt toniskt-kloniskt beteende). För att ytterligare karakterisera beslag semiologi, analysera beteende för lateralitet (multifokal/bilaterala rörelser vs. focal/unilateral vs. mixed).
- Skapa ett effektspektrogram. Använd en Snabb Fourier Transform med ett Cosine-Bell-datafönster med en storlek på 1024 datapunkter. Skapa en slät x-axel i spektrogrammet med hjälp av en fönsteröverlappning på 87,5 %. Uttryck kraften som μV218.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Semiologi för anfall
Neonatal hypoxi-ischemi exponering resulterar i både generaliserade och fokala anfall hos möss (figur 1A-C). Video EEG-inspelningar gör det möjligt att korrelera elektrografiska fynd till beteende på video. Dessa beteenden poängsatts med hjälp av en tidigare publicerad neonatal gnagare beteendemässiga beslag poäng (BSS)16. Förutom BSS kategoriserade vi händelser baserat på om beteendet var focal/unilateralt, bilateralt eller blandat (figur 1B).
I denna modell uppvisade möss i allmänhet 3 mönster av beslag semiologi: 1) repetitiv cirkling till sidan av ligatur med förlängning av kontralateral extremiteter, 2) förlust av hållning med kroppen flexion och svans krullade till sidan av ligatur, eller 3) förlust av hållning med ensidig eller bilaterala paddling av extremiteter (varierande svårighetsgrad och längd). Majoriteten av observerade händelser involverade fokala/ensidiga eller blandade beteenden (figur 1B). Under den hypoxiska perioden uppvisade dessutom en delmängd av möss icke-konvulsiv anfallsaktivitet, där valpen var orörlig med ihållande anfallsaktivitet på EEG (figur 1C).
Elektrografiska inspelningar
EEG registrering startades 30 minuter före halsartärning ligatur för att erhålla en pre-injury baslinje. Baslinjeaktiviteten (figur 1A och figur 2A) liknade tidigare beskriven bakgrund hos p10 musvalpar17. Efter ligatur placerades valpar omedelbart tillbaka på video EEG. Under perioden mellan ligatur och början av hypoxi uppvisar en delmängd av möss konvulsiva anfall (figur 1A-C).
Efter hypoxi induktion, bakgrund amplitud på EEG minskat (figur 3B) och periodvis uppvisade bursts av spike-wave urladdningar, följt av undertryckande (figur 2A). Möss uppvisar elektrografiska anfall, som kommer från en undertryckt bakgrund som rytmiska spikvågurladdningar och framsteg för att bli mer komplexa och frekventa, med polyspikvågor (figur 2B). Under hypoxi var effektspektrogram analys anmärkningsvärt för asymmetrier mellan ischemiska och kontralateral halvklotet (figur 3A, B). Den ischemiska halvklotet uppvisade ett burst suppression mönster och den kontralateral halvklotet uppvisade undertryckt bakgrund (figur 1A och figur 3A,B). I genomsnitt börjar anfall 5,5±8,1 minuter efter induktion av hypoxi, med varje händelse varar 56±57 sekunder. det fanns en 13% dödlighet under hypoxi (n=4/30), med alla dödsfall efter en konvulsiv (BSS=5-6) beslag.
Under reoxygenation och återhämtning fortsätter en delmängd av mössen att ha kramper under återstoden av inspelningsperioden (2 h efter hypoxi). EEG-bakgrund undertrycktes jämfört med utgångsvärdet efter hypoxi (figur 1A och figur 3), med gradvis återhämtning under inspelningsperioden efter hypoxi. Under hela inspelningsperioden uppvisade möss i genomsnitt 9±5 anfallshändelser, var och en varade 54±57,7 s.
Figur 1: Anfallsegenskaper hos p10 möss som exponeras för neonatal hypoxi-ischemi. (A) Representativt effektspektrogram från den ischemiska parietala cortexelektroden genom den experimentella tidslinjen. (Amplitudfärg värmekarta skala x10–6). Pilar anger den tid som rå elektroencefalogramspårning under spektrogrammet representerar. (B) Anfallsbeteenden för hela experimentet, postischemi/prehypoxia, under hypoxi och posthypoxi. (C) Beteendemässig anfallspoäng (BSS) och timing för alla anfallshändelser (n = 30 möss, varje mus har en unik symbol, varje punkt är en diskret anfallshändelse). 100% av mössen som grips under hypoxi (blå låda; tid = −60 minuter är slutförandet av halspulsådering, tid = 0 är början på hypoxi). Tretton procent dog under hypoxi efter en konvulsiv beslag (grad 5-6). Denna siffra har ändrats från Burnsed et al13. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Karakteristiska elektroencefalografimönster (EEG) under hypoxi ischemi. (A) EEG bakgrund från vänster till höger: preinjury baslinje, burst suppression under hypoxi, posthypoxia suppression. Inspelning från ipsilateral parietal cortex djup elektrod. B) Utveckling av ett anfall under hypoxi. Inspelning från ipsilateral hippocampal djupelektrod. Skuggade lådor (I-V) motsvarade utökade EEG-utdrag till höger om (B). Denna siffra har ändrats från Burnsed et al13. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Asymmetrier i EEG-bakgrund mellan ischemiska och kontralaterala halvklot. (A) Asymmetriskt effektspektrogram hos HI-möss under hypoxi (45-minuters period) i ischemisk cortex (vänster) och kontralateral cortex (höger; amplitudskala x10–6). Burst dämpning mönster och beslag i skandinaviska halvklotet, undertryckande i CL halvklotet. (B) Bakgrundsdämpning under hypoxi och reoxygenation på IL- och CL-halvklot. Alla mätningar av medelspänning som tagits från 10-sekunders slumpmässiga utdrag av encefalogrammet under den experimentella tidsperioden (baslinje, 30 minuters postligation, under hypoxi- 15 minuter och 30 minuter efter start, efter reoxygenation-15 minuter och 60 minuter efter start) jämfördes med baslinjen. Varje djurs baslinje fungerade som sin egen kontroll, och data rapporteras som en procentandel av baslinjen (n = 5 möss). Mätningarna gjordes från när elektroder. Denna siffra har ändrats från Burnsed et al13. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har presenterat en modell för kontinuerlig video-EEG övervakning i neonatal möss under hypoxic-skandinaviska beslag. Video analys i samband med EEG tillåter karakterisering av beslag semiologi. Analys av EEG möjliggör extraktion av effektspektrogram och bakgrunds amplitud analys.
Korrekt och noggrann placering av elektroder är avgörande i detta protokoll, eftersom skada under elektrodplacering eller felaktig placering kan påverka resultaten avsevärt. Bedömning av normal EEG-aktivitet vid baslinjen före skada är av största vikt, eftersom blödning eller skada under elektrodplacering, även om det är sällsynt, kan inträffa. För det andra, för att bekräfta korrekt elektrodplacering kan hjärnor delas upp och undersökas för elektrodspår vid rätt placering. Dessutom kan underlåtenhet att returnera valpar till modern i grupper (individuellt) leda till att elektrodheadset skadas eller att valpar dödas eller försummas av modern.
En begränsning av denna metod är gränsen för rumslig lokalisering av djupelektrodinspelningar i en liten neonatal hjärna. Detta begränsar möjligheten att lokalisera specifika anfallshöns på EEG-inspelningar. En annan begränsning i denna modell av hypoxi ischemi är variabiliteten i beslag börda. Variabilitet i lesion storlek och beteendemässiga underskott i denna gnagare modell av hypoxi ischemi har beskrivits väl tidigare7,8,19. Inte överraskande finns denna variabilitet i anfallsbördan (både längden på anfallshändelser och antal anfallshändelser). Men konsekvent uppvisar 100% av valparna i denna modell anfall under hypoxi. Slutligen kan tiden som valpar kan vara på EEG-övervakning (bort från modern) begränsad. Därför kan vi inte karakterisera pågående beslag med kontinuerlig EEG vid senare tidpunkter i förhållande till skadan.
Även om vi har använt en hypoxi-ischemi beslag modell i detta manuskript, denna metod för kontinuerlig video-EEG övervakning i neonatal mus pups lätt kan tillämpas på andra sjukdom/beslag modeller. Anfall hos neonatal gnagare är svåra att känna igen baserat på beteende ensam, vilket gör video-EEG övervakning viktigt. Framtida undersökningar kan använda dessa tekniker för att analysera beslag börda och semiologi i andra neonatal beslag modeller eller svar på terapeutiska och neuroprotektiva åtgärder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi bekräftar följande finansieringskällor: NIH NINDS – K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), University of Virginia School of Medicine (JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SURGERY | |||
| Ball Point Applicator | Metrex Research | 8300-F | i-bond applicator |
| Cranioplast (Powder/Resin) | Coltene | H00383 | Perm Reline/Power |
| I-Bond | Kulzer GmbH, Germany | ||
| LOOK Silk Suture | Surgical Specialities Corporation | SP115 | LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture |
| RS-5168 Botvin Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS5168 | Forcep for surgery/ligation |
| RS-5138 Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS5138 | Forcep for surgery/ligation |
| UV light for I-Bond | Blast Lite By First Media | BL778 | UV ligth for I-bond |
| Vannas Microdissecting Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS5618 | Scissor for ligation |
| Vet Bond | 3M Vetbond | 1469SB | Vet Glue |
| HYPOXIA | |||
| Hypoxidial | Starr Life Science | ||
| Oxygen sensor | Medical Products | MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig | |
| EEG RECORDING | |||
| Female receptacle connector 0.079" | Mill-Max Manufacturing Corp | 832-10-024-10-001000 | Ordered from Digikey |
| Grass Amplifier | Natus Neurology Incorporated | Grass Product | |
| LabChart Pro | ADI Instruments | Software to run the system | |
| Male Socket Connector 0.079" | Mill-Max Manufacturing Corp | 833-43-024-20-001000 | Ordered from Digikey |
| Operational Amplifier | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2274CD | TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier |
| Operational Amplifier | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2272ACDR | TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier |
| Stainless Steel wire | A-M Systems | 791400 | 0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft |
| Ultra-Flexible Wire | McMaster-Carr | 9564T1 | 36 Gauze wire of various color |
References
- Vasudevan, C., Levene, M. Epidemiology and aetiology of neonatal seizures. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine. , (2013).
- Volpe, J., et al.
- Shankaran, S., et al. Network EKSNNR. Childhood outcomes after hypothermia for neonatal encephalopathy. New England Journal of Medicine. 366 (22), 2085-2092 (2012).
- Pappas, A., et al. Cognitive outcomes after neonatal encephalopathy. Pediatrics. 135 (3), 624-634 (2015).
- van Schie, P. E., et al. Long-term motor and behavioral outcome after perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy. European Journal of Paediatric Neurology. 19 (3), 354-359 (2015).
- Rensing, N., et al. Longitudinal analysis of developmental changes in electroencephalography patterns and sleep-wake states of the neonatal mouse. PLoS One. 13 (11), 1-17 (2018).
- Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
- Burnsed, J. C., et al. Hypoxia-ischemia and therapeutic hypothermia in the neonatal mouse brain--a longitudinal study. PLoS One. 10 (3), 0118889 (2015).
- Semple, B. D., et al. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Progress in Neurobiology. , 1-16 (2013).
- Comi, A. M., et al. Gabapentin neuroprotection and seizure suppression in immature mouse brain ischemia. Pediatric Research. 64 (1), 81-85 (2008).
- Comi, A. M., et al. A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse. Pediatric Neurology. 31 (4), 254-257 (2004).
- Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. Continuous Electroencephalographic Monitoring with Radio-Telemetry in a Rat Model of Perinatal Hypoxia-Ischemia Reveals Progressive Post-Stroke Epilepsy. Journal of Neuroscience. 30 (1), 404-415 (2010).
- Burnsed, J., et al. Neuronal Circuit Activity during Neonatal Hypoxic - Ischemic Seizures in Mice. Annals of Neurology. 86, 927-938 (2019).
- Sampath, D., White, A. M., Raol, Y. H. Characterization of neonatal seizures in an animal model of hypoxic-ischemic encephalopathy. Epilepsia. 55 (7), 985-993 (2014).
- Sampath, D., Valdez, R., White, A. M., Raol, Y. H. Anticonvulsant effect of flupirtine in an animal model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Neuropharmacology. 123, 126-135 (2017).
- Kang, S. K., et al. and sex-dependent susceptibility to phenobarbital-resistant neonatal seizures: role of chloride co-transporters. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-16 (2015).
- Zanelli, S., Goodkin, H. P., Kowalski, S., Kapur, J. Impact of transient acute hypoxia on the developing mouse EEG. Neurobiology of Disease. 68, 37-46 (2014).
- Lewczuk, E., et al. EEG and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2017).
- Wu, D., Martin, L. J., Northington, F. J., Zhang, J. Oscillating gradient diffusion MRI reveals unique microstructural information in normal and hypoxia-ischemia injured mouse brains. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1366-1374 (2014).
