Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Измерение поглощения глюкозы инсулином и сокращением в изолированных и инкубированных зрелых скелетных мышцах мышей

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

Интактная регуляция поглощения глюкозы мышцами важна для поддержания гомеостаза глюкозы во всем организме. В этом протоколе представлена оценка поглощения глюкозы инсулином и сокращением в изолированных и инкубированных зрелых скелетных мышцах при описании влияния различных физиологических вмешательств на метаболизм глюкозы во всем организме.

Abstract

Скелетные мышцы представляют собой инсулиночувствительную ткань и обычно поглощают большую часть глюкозы, которая поступает в кровь после еды. Кроме того, сообщалось, что скелетные мышцы могут увеличить извлечение глюкозы из крови до 50 раз во время физических упражнений по сравнению с условиями покоя. Увеличение поглощения глюкозы мышцами во время физических упражнений и стимуляции инсулина зависит от транслокации транспортера глюкозы 4 (GLUT4) из внутриклеточных компартментов к мембране поверхности мышечных клеток, а также фосфорилирования глюкозы в глюкозо-6-фосфат гексокиназой II. Выделение и инкубация мышц мыши, таких как m. soleus и m. extensor digitorum longus (EDL), является подходящей моделью ex vivo для изучения влияния инсулина и электрически индуцированного сокращения (модель для физических упражнений) на поглощение глюкозы в зрелых скелетных мышцах. Таким образом, модель ex vivo позволяет оценить чувствительность мышц к инсулину и позволяет сопоставить выработку мышечной силы во время сокращения, обеспечивая равномерный набор мышечных волокон при измерениях поглощения глюкозы мышцами. Кроме того, описанная модель подходит для фармакологического тестирования соединений, которые могут оказывать влияние на чувствительность мышц к инсулину или могут быть полезны при попытке очертить регуляторную сложность поглощения глюкозы скелетными мышцами.

Здесь мы описываем и предоставляем подробный протокол о том, как измерить поглощение глюкозы, стимулируемое инсулином и сокращением, в изолированных и инкубированных препаратах камбалы и EDL у мышей с использованием радиомаркированных [3H]2-дезокси-D-глюкозы и [14C]маннитола в качестве внеклеточного маркера. Это позволяет точно оценить поглощение глюкозы в зрелых скелетных мышцах при отсутствии смешанных факторов, которые могут мешать интактной животной модели. Кроме того, мы предоставляем информацию о метаболической жизнеспособности инкубированных скелетных мышц мыши, предполагая, что применяемый метод обладает некоторыми предостережениями при определенных условиях при изучении энергетического обмена мышц.

Introduction

Скелетные мышцы обладают способностью извлекать большое количество глюкозы из внеклеточного пространства в ответ на инсулин и физические упражнения. Это помогает поддерживать гомеостаз глюкозы во всем организме и обеспечивает снабжение глюкозой во времена высокой потребности в энергии. Поскольку было показано, что неповрежденная регуляция поглощения глюкозы скелетными мышцами важна для общего состояния здоровья и физической работоспособности 1,2, измерения поглощения глюкозы в мышцах во время различных состояний получили большое внимание. У людей и животных гиперинсулинемически-эугликемический зажим использовался в качестве метода золотого стандарта для оценки чувствительности к инсулину in vivo 3,4. В отличие от результатов, полученных в результате перорального теста на толерантность к глюкозе, метод гиперинсулинемико-эугликемического зажима не требует интактной желудочно-кишечной функции или секреции инсулина из поджелудочной железы и, таким образом, позволяет сравнивать реакции инсулина между субъектами, у которых наблюдаются различия в желудочно-кишечной и / или панкреатической функции. Измерения поглощения мышечной глюкозы in vivo во время физических упражнений у людей часто проводились с 1960-х годов5. Сначала с использованием методов артериовенозного баланса6, а затем с использованием позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) в сочетании с позитроном, излучающим аналог глюкозы, например, 18F-фтор-дезокси-глюкоза7. У грызунов мышечное поглощение глюкозы in vivo, стимулируемое физическими упражнениями, обычно осуществляется путем использования радиоактивных или стабильных аналогов глюкозы, меченных изотопами 8,9,10.

Дополнительным методом к измерениям поглощения глюкозы в мышцах in vivo является выделение и инкубация мелких мышц у грызунов и последующее измерение поглощения глюкозы с использованием радиоактивных или стабильных аналогов глюкозы, меченных изотопами 11,12,13. Этот метод позволяет точно и надежно количественно оценить скорость поглощения глюкозы в зрелых скелетных мышцах и может быть выполнен в присутствии различных концентраций инсулина и во время сокращения, вызванного электрической стимуляцией. Что еще более важно, измерения поглощения глюкозы в изолированных и инкубированных скелетных мышцах имеют значение при исследовании мышечного метаболического фенотипа мышей, которые подверглись различным вмешательствам (например, питание, физическая активность, инфекция, терапия). Изолированная модель скелетных мышц также является подходящим инструментом для фармакологического тестирования соединений, которые могут влиять на поглощение глюкозы как таковое и/или изменять чувствительность к инсулину12,14. Таким образом, эффективность соединений, предназначенных для регулирования метаболизма глюкозы в мышцах, может быть проверена и оценена в строго контролируемой среде перед последующим тестированием in vivo на доклинических моделях животных.

При некоторых условиях метаболическая жизнеспособность может представлять проблему в изолированной и инкубированной системе моделирования скелетных мышц. Действительно, отсутствие кровеносной системы в инкубируемых мышцах влечет за собой то, что доставка субстратов (например, кислорода и питательных веществ) полностью зависит от простой диффузии между мышечными волокнами и окружающей средой. В связи с этим важно, чтобы инкубированные мышцы были маленькими и тонкими и, таким образом, представляли собой меньший барьер для диффузии кислорода во время инкубации15. Особенно при длительных инкубациях в течение нескольких часов могут развиваться гипоксические состояния из-за недостаточного поступления кислорода, что приводит к истощению мышечной энергии15. Хотя ранее сообщалось о различных маркерах метаболической жизнеспособности в инкубированных мышцах крыс наряду с идентификацией важных переменных, которые помогают поддерживать жизнеспособность мышц крыс15, всесторонняя оценка метаболической жизнеспособности в небольших инкубированных мышцах мыши по-прежнему оправдана. Следовательно, в настоящее время содержание гликогена в основном используется в качестве маркера метаболической жизнеспособности в инкубированных скелетных мышцах мыши16,17.

Здесь мы описываем подробный протокол измерения базального, инсулино- и стимулируемого сокращением поглощения глюкозы в изолированных и инкубированных камбаловидных мышцах и мышцах EDL у мышей с использованием радиомаркированных [3H]2-дезокси-D-глюкозы и [14C]маннитола в качестве внеклеточного маркера. В настоящем исследовании поглощение глюкозы измеряли в течение 10-минутного периода, и метод представлен с использованием субмаксимально и максимально эффективных концентраций инсулина, а также одного протокола сокращения. Однако протоколы, описанные в настоящем описании, могут быть легко модифицированы в отношении времени инкубации, дозировки инсулина и протокола электрической стимуляции. Кроме того, мы предоставляем тщательную характеристику различных маркеров метаболической жизнеспособности в инкубированных камбаловидных и EDL мышцах мыши. Результаты показывают, что добавки глюкозы в инкубационный буфер необходимы для сохранения метаболической жизнеспособности мышц, инкубированных в течение 1 часа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Процедуры с участием исследуемых животных должны выполняться в соответствии с соответствующими руководящими принципами и местным законодательством. Все эксперименты на животных, использованные для этого исследования, соответствовали Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, и были одобрены Датской инспекцией по экспериментам на животных.

1. Подготовка экспериментального аппарата и шовных петель

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования используйте интегрированную систему миографа мышечной полосы с индивидуальными инкубационными крючками для инкубации изолированных скелетных мышц мыши (рисунок 1). Эта система позволяет мышцам купаться в физиологическом растворе с непрерывной оксигенацией (95% O2 и 5% CO2) и при постоянной температуре. Ванна мышечной ткани соединена с датчиком силы для измерения выработки мышечной силы во время сокращения. Чтобы вызвать и записать миомеханические реакции во время сокращения, используйте стимулятор электрических импульсов и программу сбора данных соответственно. Стимулируйте инкубированные мышцы сокращаться платиновыми электродами, расположенными в центре и по обе стороны мышцы.

  1. Включите систему миографа и прогрейте камеры до 30 °C. Открытое программное обеспечение для сбора данных, совместимое с системой миографа, и калибруйте силовые преобразователи для обеспечения сопоставимости между наборами данных.
  2. Начните с разрезания ~ 16 см прядей нерассасывающегося хирургического нейлонового шва. Используйте щипцы, чтобы создать петлю диаметром около 0,4 см из одной пряди. Повторяйте это до тех пор, пока не будет получено достаточное количество циклов. Каждая мышца нуждается в двух петлях - одна для проксимального и одна для дистального сухожилия.

2. Приготовление растворов и инкубационных сред

  1. Приготовление базальных инкубационных сред
    1. Готовят следующие исходные растворы: 2,5 М хлорида натрия (NaCl, 250 мл), 0,5 М бикарбоната натрия (NaHCO3, 250 мл), 0,5 М хлористого калия (KCl, 50 мл), 0,25 М хлорида кальция (CaCl2, 50 мл), 0,25 М дигидрофосфата калия (KH2PO4, 50 мл), 0,25 М сульфата магния (MgSO4, 50 мл), 110 мМ пирувата натрия (Na-пируват, 100 мл), 500 мМ D-маннитол (100 мл), 1 М2-дезокси-D-глюкоза (4 мл), 15% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA), диализированный против буфера Кребса-Рингера-Хенселейта (KRH) (описан ниже на этапе 4) (100 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения поглощения глюкозы, стимулируемого покоем и сокращением, требуется два решения. Кроме того, каждая отдельная концентрация инсулина, используемая для оценки поглощения глюкозы инсулином, требует двух растворов. Таким образом, в общей сложности необходимо шесть различных растворов для измерения базального, субмаксимального инсулин-, максимального инсулин- и стимулируемого сокращением поглощения глюкозы в изолированных скелетных мышцах мыши. Далее «базальные инкубационные среды» относятся к средам без инсулина или радиоактивных индикаторов. «Инкубационная среда» относится к средам, содержащим инсулин. «Инкубационная среда поглощения глюкозы» относится к средам, содержащим 2-дезокси-D-глюкозу и радиоактивные индикаторы в дополнение к инсулину в концентрации, идентичной той, которая используется в «инкубационной среде».
    2. Подготовьте буфер KRH, дополнив сверхчистую воду (ddH2O) NaCl (117 мМ), NaHCO3 (24,6 мМ), KCl (4,7 мМ), CaCl2 (2,5 мМ), KH2PO4 (1,2 мМ) и MgSO4 (1,2 мМ). Впоследствии газируйте буфер KRH с 95% O2 и 5% CO2 в течение не менее 10 мин. Желаемый рН буфера КРГ должен составлять 7,35-7,45 при 30 °C. Если регулировка pH выполняется при комнатной температуре, pH буфера KRH должен составлять от 7,25 до 7,35.
    3. Добавьте BSA (0,1%), Na-пируват (2 мМ) и D-маннитол (8 мМ) в газированный и скорректированный pH буфер KRH для завершения базальной инкубационной среды. Храните базальную инкубационную среду в герметичном контейнере, чтобы свести к минимуму дегазацию O2 и CO2 , и поместите среду при 30 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, осмолярность добавок KRH (т.е. Na-пируват, D-маннитол и D-глюкоза) поддерживается постоянной на протяжении всего эксперимента, чтобы избежать сокращения или расширения мышечных клеток. Протокол, описанный в настоящем описании, использует осмолярность 10 мМ для добавок KRH. Если необходим глюкозосодержащий буфер, замените добавки KRH для удовлетворения потребностей, например, 5 мМ D-глюкозы и 5 мМ D-маннитола.
    4. Чтобы избежать возможных BSA-ассоциированных загрязняющих веществ в инкубационном буфере, диализуйте BSA против KRH.
      1. Чтобы получить 15% раствор BSA, диализированный против буфера KRH, начните с растворения 300 г аналитического класса обезжиренного BSA в 900 мл буфера KRH. Затем прокипятите диализную трубку в повторной воде до тех пор, пока трубка не станет мягкой.
      2. Наполните трубку раствором BSA-KRH и закрепите концы труб. Поместите трубку с BSA-KRH в 5 л буфера KRH и оставьте на ночь при температуре 4 °C. На следующий день замените буфер KRH и оставьте трубку с BSA-KRH в буфере KRH на ночь при 4 °C.
      3. Наконец, извлеките раствор BSA-KRH из трубки и добавьте буфер KRH к конечному объему 2 л (т.е. 15% раствора BSA-KRH). Разделите 15% раствор BSA-KRH на аликвоты и храните в морозильной камере при ~-20 °C.
  2. Приготовление инкубационных сред, содержащих инсулин
    1. Для инкубационной среды, содержащей субмаксимально эффективную концентрацию инсулина, добавляют 1 мкл раствора инсулина 100 мЕд/мл на мл базальной инкубационной среды (100 мкЕд/мл инсулина).
    2. Для инкубационной среды, содержащей максимально эффективную концентрацию инсулина, добавляют 1 мкл раствора инсулина 10 Ед/мл на мл базальной инкубационной среды (10 мЕд/мл инсулина).
  3. Подготовка инкубационных сред поглощения глюкозы
    ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Обращение с радиоактивными материалами разрешается только в зоне ограниченного доступа и под контролем уполномоченного персонала, и некоторые университеты, научно-исследовательские институты и компании могут потребовать получения «Разрешения на использование радиоактивности». Материалы и отходы должны обрабатываться в соответствии с соответствующими местными процедурами, руководящими принципами и законодательством.
    1. Следуйте той же процедуре, что описано в разделе 2.1.2.
    2. Добавьте BSA (0,1%), Na-пируват (2 мМ), D-маннитол (7 мМ) и 2-дезокси-D-глюкозу (1 мМ) в газированный и скорректированный pH буфер KRH.
    3. Добавьте [3H]2-дезокси-D-глюкозу (0,028 МБк/мл) и [14С]маннитол (0,0083 МБк/мл) в добавленный буфер KRH для завершения инкубационной среды поглощения глюкозы. Хранить при температуре 30 °C. Если [3H]2-дезокси-D-глюкоза и [14C]маннит растворены в этаноле, удалите этанол путемN2 опосредованного выпаривания перед использованием.
    4. Для инкубационной среды поглощения глюкозы, содержащей субмаксимально эффективную концентрацию инсулина, добавляют 1 мкл раствора инсулина 100 мЕд/мл на мл инкубационной среды поглощения глюкозы (100 мкЕд/мл инсулина).
    5. Для инкубационной среды поглощения глюкозы, содержащей максимально эффективную концентрацию инсулина, добавляют 1 мкл раствора инсулина 10 Ед/мл на мл инкубационной среды поглощения глюкозы (10 мЕд/мл инсулина).

3. Животные и рассечение камбалы мыши и мышцы EDL для инкубации

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры с участием исследуемых животных должны выполняться в соответствии с соответствующими руководящими принципами и местным законодательством. Описанная процедура может быть использована с собственными выведенными или коммерчески доступными самцами и самками мышей различных штаммов и генетического фона. Следующая процедура предусмотрена для кормленых самок мышей C57Bl/6J. В среднем мышам было 19 недель и они весили 25 г. Мыши содержались в цикле 12:12 ч светло-темный со свободным доступом к стандартному чау-чау грызунов и воде. Эксперименты на животных были начаты в ~ 9:00 утра по местному времени, и все животные были принесены в жертву в течение 2 часов.

  1. Добавьте 4 мл предварительно нагретой (30°C) базальной инкубационной среды в каждую инкубационную камеру и убедитесь, что базальная инкубационная среда непрерывно насыщается кислородом 95% O2 и 5% CO2.
  2. Обезболивать мышей внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала (10 мг/100 г массы тела) или другой доступной анестезии (например, трибромэтанола).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что в некоторых странах может потребоваться лицензия на лечение пентобарбитала и других анестезирующих препаратов. Прежде чем можно будет начать рассечение мышц, необходимо правильно индуцировать анестезию каждого животного. Чтобы убедиться в этом, проверяются рефлексы хвоста и ноги. Для достижения оптимальных результатов следует хорошо практиковать рассечение, чтобы избежать повреждения мышц во время удаления.
  3. Поместите обезболенных мышей, склонных к рассечению, на лоток для рассечения (например, крышку из пенополистирола) и прижмите передние и задние лапы, по мере необходимости, используя иглу.
  4. Снимите кожу с голени и убедитесь, что видны как ахиллово сухожилие, так и коленный сустав.
    1. Для рассечения камбаловидной мышцы начните с прикрепления одной шовной петли к ахиллову сухожилию. Прикрепите щипцы к ахиллову сухожилию дистально шовной петли и обрежьте, чтобы освободить камбаловидные и икроножные мышцы от лапы. Осторожно скользите щипцами по мышке, тем самым обнажая камбаловидную мышцу.
    2. Зажмите щипцы и поместите вторую шовную петлю вокруг проксимального сухожилия камбаловидной мышцы. Затем отрежьте проксимальное сухожилие и рассекните камбалу (включая две прикрепленные шовные петли) без икроножной мышцы. Быстро поместите камбаловидную мышцу в инкубационную камеру, прикрепив каждую шовную петлю к соответствующим крючкам.
  5. Удалите фасцию, покрывающую переднюю часть большеберцовой кости (TA), с помощью щипцов. Если все сделано правильно, дистальные сухожилия мышц ТА и ЭДЛ должны быть четкими белыми и видимыми; и отделены друг от друга.
  6. Отрежьте дистальное сухожилие мышцы ТА и рассекните мышцу для последующего анализа (например, генотипирования). Используя щипцы, мягко освободите мышцу EDL из окружающих тканей, но оставьте мышцу нетронутой и не перережьте сухожилия. Поместите одну шовную петлю вокруг дистального сухожилия и вторую шовную петлю вокруг проксимального сухожилия EDL.
  7. Затем отрежьте сухожилия, освобождающие мышцу EDL с двумя прикрепленными шовными петлями, и быстро поместите мышцу в инкубационную камеру, прикрепив каждую шовную петлю к соответствующим крючкам. Чтобы не терять напряжения во время инкубации и особенно при электрически индуцированном сокращении камбаловидных и ЭДЛ мышц, большое значение имеет фиксация шовных петель вокруг сухожилий тугими узлами.
  8. Наконец, усыплите животное, например, путем вывиха шейки матки.
  9. Когда мышцы были рассечены и помещены в инкубационные камеры, отрегулируйте напряжение каждой мышцы в состоянии покоя до ~ 5 мН и предварительно инкубируйте мышцы в течение не менее 10 минут, прежде чем инициировать экспериментальный протокол.

4. Инсулин-стимулированное поглощение глюкозы в изолированных скелетных мышцах мыши

  1. Следуя этапу 3.9, заменить базальную инкубационную среду инкубационной средой, содержащей инсулин (базальную инкубационную среду), субмаксимально эффективную концентрацию инсулина или максимально эффективную концентрацию инсулина и оставить в инкубационных камерах на 20 мин. Оставьте каждую инкубационную камеру на 1 мин, тем самым выделив время для последующего сбора мышечной массы.
  2. В конце 20-минутного периода стимуляции заменяют инкубационную среду инкубационной средой поглощения глюкозы, содержащей одинаковую концентрацию инсулина, и оставляют в инкубационных камерах на 10 мин, снова с интервалом в 1 мин между каждой инкубационной камерой.
  3. После 10 мин инкубации в инкубационной среде поглощения глюкозы осторожно удаляют мышцы из инкубационных камер и промывают их в ледяной базальной инкубационной среде. Впоследствии быстро высушите мышцы на фильтровальной бумаге до того, как шовные петли будут удалены и мышцы застынуты в жидком азоте. Крайне важно, чтобы инкубированные мышцы были собраны быстро, если вы также хотите исследовать различные внутриклеточные метаболиты и передачу сигналов белка в дополнение к поглощению глюкозы.
  4. Соберите 100 мкл инкубационной среды поглощения глюкозы из каждой инкубационной камеры и храните ее при -20 °C. Количество радиоактивности в этих образцах будет включено в расчет поглощения глюкозы мышцами.

5. Поглощение глюкозы, стимулируемое сокращением, в изолированных скелетных мышцах мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вызвать сокращение изолированной скелетной мускулатуры мыши, используйте следующий протокол: 1 трейн/15 с, каждый трен длиной 1 с, состоящий из импульсов 0,2 мс, подаваемых при 100 Гц. Тем не менее, другие подобные протоколы, вызывающие сокращение изолированных скелетных мышц мыши, вероятно, также будут работать. Важно отметить, что напряжение должно быть отрегулировано для создания максимальной силы развития инкубированной мышцы, которая зависит от экспериментальной установки. Если это не обеспечено, вы можете рисковать, что не все волокна мышцы сокращаются. В свою очередь, это может вызвать смещение в наборе данных.

  1. После шага 3.9 поместите платиновые электроды в центр и с обеих сторон мышц. Инициируют сокращение мышц сразу после замены базальной инкубационной среды инкубационной средой поглощения глюкозы. По возможности оставьте каждую инкубационную камеру на 1 мин, тем самым выделив время для последующего сбора мышечной массы. Не забудьте записать выработку силы из каждой инкубированной мышцы.
  2. После 10 мин сокращения в инкубационной среде поглощения глюкозы удаляют платиновые электроды, аккуратно собирают мышцы из инкубационных камер и промывают их в ледяной базальной инкубационной среде. Впоследствии быстро высушите мышцы на фильтровальной бумаге до того, как шовные петли будут удалены, а мышцы заморожены в жидком азоте. Вся процедура сбора мышечной массы должна быть выполнена как можно быстрее.
  3. Соберите 100 мкл инкубационной среды поглощения глюкозы из каждой инкубационной камеры и храните ее при -20 °C. Количество радиоактивности в этих образцах будет включено в расчет поглощения глюкозы мышцами.

6. Гомогенизация и обработка скелетных мышц

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенная ниже процедура гомогенизации мышц позволяет определить как поглощение глюкозы, так и миоцеллюлярную сигнализацию путем вестерн-блоттинга в одном и том же наборе мышечных образцов.

  1. Гомогенизировать каждую мышцу в 400 мкл ледяного буфера с рН 7,5, содержащим 10% глицерина, 20 мМ натрия-пирофосфата, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 мМ фенилметилсульфонилфторида (растворенного в изопропаноле), 150 мМ NaCl, 50 мМ HEPES, 20 мМ β-глицерофосфата, 10 мМ фторида натрия (NaF), 1 мМ этилендиаминететрауксусной кислоты (ЭДТА), 1 мМ гликолетердиаминтетрауксусной кислоты (EGTA), 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпептина, 3 мМ бензамидина и 2 мМ натрия-ортованадата с использованием стальных шариков и тканевого ликера (2 x 45 с при 30 Гц). Вращайте все гомогенаты в течение 1 ч при 4 °C, после чего их центрифугируют при 16 000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Соберите лизат (супернатант), который используется для определения поглощения глюкозы мышцами.

7. Определение радиомаркированной 2-дезоксиглюкозы и маннита

  1. Добавьте 150 мкл каждого мышечного лизата и 25 мкл инкубационной среды поглощения глюкозы из каждой инкубационной камеры для разделения жидких сцинтилляционных флаконов, содержащих 2 мл жидкой сцинтилляционной жидкости. Кроме того, приготовьте два слепых контрольных флакона, содержащих только 3 мл жидкой сцинтилляционной жидкости. Закройте все флаконы и тщательно перемешайте, вихря каждый флакон в течение ~ 5 с.
  2. Поместите флаконы в жидкостный сцинтилляционный счетчик и измерьте радиоактивность [3H]2-дезокси-D-глюкозы и [14C]маннитола в соответствии с рекомендациями производителя. Запишите ДПМ (распадов в минуту) для каждого жидкого сцинтилляционного флакона.

8. Расчет скорости поглощения глюкозы мышцами

  1. Используйте лизат из стадии 6.1 для измерения общей концентрации белка в каждом мышечном образце с использованием стандартных методов количественной оценки белка (например, бицинхониновой кислоты или анализов Брэдфорда). Рассчитайте количество белка (мг), добавляемого в каждый сцинтилляционный флакон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость поглощения глюкозы для каждого мышечного образца рассчитывается путем вычитания количества [3H]2-дезокси-D-глюкозы, расположенной во внеклеточном пространстве, из общего количества [3H]2-дезокси-D-глюкозы в мышечном образце с использованием [14C]маннита в качестве внеклеточного маркера. Предполагается, что [3H]2-дезокси-D-глюкоза и [14С]маннитол проявляют аналогичные диффузионные свойства в мышечной ткани во время инкубации. Выполните следующие вычисления:
  2. Начните с вычитания [3H] и [14C] DPM слепых контрольных образцов из всех образцов мышц и сред.
  3. Определяют мышечное внеклеточное пространство в мкл (μL-ECS):
    [14С] Мышца ДПМ / ([14C]ДПМмедиа / Моб.)
  4. Рассчитайте количество [3H]DPM во внеклеточном пространстве мышц ([3H]DPMECS):
    мкл-ECS × ([3H]DPMсреда / Mоб.)
  5. Рассчитайте количество [3H]DPM в мышечном внутриклеточном пространстве ([3H]DPMICS):
    [3Ч] ДПМмышц− [3Ч]ДПМЭКС
  6. Рассчитайте скорость поглощения глюкозы мышцами (мкмоль/г белка/час):
    [3Ч] ДПМИКС / ([3Ч]ДПМсреды / Моб)/ [2-дезокси-D-глюкоза])) / мг белка) / Тч
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех приведенных выше уравнений
    [14С] Мышца ДПМ представляет собой количество радиоактивности [14С]маннитола в мышечном образце;
    [14С] средаDPM - количество радиоактивности [14С]маннитола в образце среды;
    [3Ч] Мышца ДПМ представляет собой количество [3H]2-дезокси-D-глюкозной радиоактивности в образце мышцы;
    [3Ч] средаDPM представляетсобой количество [3H]2-дезокси-D-глюкозной радиоактивности в образце среды;
    [3Ч] DPMECS представляет собой количество [3H]2-дезокси-D-глюкозной радиоактивности в мышечном внеклеточном пространстве;
    [3Ч] ДПМИКС представляет собой количество [3H]2-дезокси-D-глюкозной радиоактивности в мышечном внутриклеточном пространстве;
    μL-ECS - это мышечное внеклеточное пространство в мкл;
    Mvol - объем (мкл) инкубационных сред, используемых для сцинтилляционного подсчета (например, "25", как упоминалось выше);
    Th - это фактор времени, используемый для расчета скорости поглощения в час (т. Е. «1/6» при инкубации мышц со средой поглощения глюкозы в течение 10 мин)
  7. Примите во внимание этот пример расчета. [3H] и [14C] DPM слепых контрольных образцов (17 и 6 соответственно) были вычтены из значений DPM, упомянутых ниже.
    [14С] Мышца ДПМ: 343
    [14С] ДПМмедиа: 11846
    [3Ч] Мышца ДПМ: 4467
    [3Ч] Носитель DPM: 39814
    Mvol: 25
    мг белка: 0,396 (в 150 мкл мышечного белка лизата)
    [2-дезокси-D-глюкоза]: 1 (мМ)
    Тч: 1/6 (ч)
    мкл-ECS = 343 д/мин / (11846 д/мин / 25 мкл) = 0,724 мкл
    [3Ч] DPMECS: 0,724 мкл × (39814 DPM / 25 мкл) = 1153 DPM
    [3Ч] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Поглощение глюкозы: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 мкл) / 1 ммоль / л) / 0,396 мг белка) / (1/6 часа) = 31,53 мкмоль / г белка / час

9. Анализ SDS-PAGE и вестерн-блот

  1. Приготовьте лизаты камбалы и EDL в буфере Laemmli и нагрейте в течение 5 мин при 96 °C.
  2. Отделяйте равные количества мышечного белка с помощью SDS-PAGE на самолитых гелях и переносите белки на поливинилиденфторидные мембраны полусухим пятном.
  3. Впоследствии инкубируют мембраны в трис-буферном физиологическом растворе, содержащем 0,05% Tween 20 и 2% обезжиренного молока, и зондовые мембраны с соответствующими первичными и вторичными антителами.
  4. Обнаружение белков с хемилюминесценцией и визуализация их с помощью цифровой системы визуализации.

10. Мышечный гликоген, нуклеотиды, лактат, креатин и фосфокреатин

  1. Используйте хлорную кислоту для извлечения образцов EDL и камбаловидных мышц.
  2. Впоследствии нейтрализуйте образцы и проанализируйте их на лактат, креатин и фосфокреатин, как описано ранее18.
  3. Анализ содержания нуклеотидов в ЭДЛ и камбаловидной мышце методом ВЭЖХ обратной фазы после экстракции в хлорной кислоте.
  4. Определение содержания мышечного гликогена в гомогенате целых мышц в виде гликозиловых единиц после кислотного гидролиза флуорометрическим методом, как описано ранее18.

11. Статистика

  1. Выполняйте статистический анализ с помощью программного обеспечения для статистического анализа.
  2. Используйте тест двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) для оценки статистических различий между значениями, представленными в таблице 1.
  3. Используйте непарные тесты Student t для оценки статистических различий в поглощении глюкозы между EDL и камбалой в каждой группе, представленной на рисунке 2. Представляем данные в качестве средства ± стандартной погрешности среднего значения (SEM). P < 0,05 считается статистически значимым.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Как показано на рисунке 2, показатели поглощения базальной глюкозы были одинаковыми между изолированной камбалой и мышцами EDL у самок мышей. Об этом также сообщалось несколько раз до 12,13,19,20. Поглощение глюкозы увеличилось в ~0,8 и ~0,6 раза, достигнув 12 и 9 мкмоль/г белка/ч в камбале и ЭДЛ мышцах соответственно в ответ на субмаксимально эффективную концентрацию инсулина (100 мкЕд/мл). Это увеличение было еще выше (~4 и ~2 раза, достигая 33 и 19 мкмоль/г белка/ч в камбаловидной и ЭДЛ мышцах соответственно), когда мышцы стимулировались максимально эффективной концентрацией инсулина (10 мЕд/мл). Кроме того, как субмаксимальное, так и максимальное поглощение глюкозы, стимулируемое инсулином, было значительно выше в камбаловидной мышце, что указывает на то, что камбаловидная мышца демонстрирует повышенную чувствительность к инсулину и отзывчивость по сравнению с мышцами EDL. Это может быть связано с более высокой экспрессией транспортера глюкозы 4 (GLUT4), а также инсулинового сигнального преобразователя протеинкиназы B (Akt) в камбаловидной мышце по сравнению с мышцей EDL 10,21,22,23,24.

Поглощение глюкозы, вызванное сокращением, было значительно выше в мышцах EDL по сравнению с камбаловидной мышцей (рисунок 2), как такжесообщалось ранее 13,19. Таким образом, поглощение глюкозы увеличилось в ~2 и ~2,5 раза, достигнув 14 и 22 мкмоль/г белка/ч в камбале и ЭДЛ мышцах соответственно в ответ на электрически индуцированные сокращения. На рисунке 3 показано максимальное производство мышечной силы в камбале и мышцах EDL в течение 10-минутного периода стимуляции. Как видно и ранее сообщалось19, мышца EDL генерирует больше силы (225 мН в EDL против 150 мN в камбале) в течение начальной части периода стимуляции. С другой стороны, мышца EDL демонстрирует более быстрое снижение выработки силы по сравнению с камбаловидной мышцей позже в период стимуляции. Эти результаты, вероятно, связаны с разницей в распределении типа волокна между камбалой (тип 1 > тип 2) и EDL (тип 2 > тип 1) мышцы25, поскольку волокна типа 2 генерируют больше силы, но утомляют быстрее по сравнению с волокнами типа 126,27.

Для оценки влияния инсулина и сокращения на внутриклеточную сигнализацию в изолированных камбаловидных и ЭДЛ мышцах фосфорилирование Akt Thr308, члена семейства домена TBC1 4 (TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 и ацетил-КоА-карбоксилазы (ACC) Ser212 проводили методом западного блоттинга (рисунок 4). Как и ожидалось, субмаксимально и максимально эффективная концентрация инсулина индуцировала увеличение фосфорилирования Akt Thr308 и TBC1D4 Ser588, в то время как сокращение индуцировало увеличение фосфорилирования AMPKα Thr172 и ACC Ser212. Ни инсулин, ни сокращение не привели к изменению общего содержания белка Akt2, TBC1D4, AMPKα2 и ACC в камбаловидной и EDL мышцах (рисунок 4).

Изучая различные маркеры метаболической жизнеспособности инкубированной камбалы и EDL мышц, мы наблюдали общее снижение уровня нуклеотидов аденозина (АТФ, АДФ, АМФ) (~15-25%), а также креатина (~10-35%) независимо от того, инкубировали ли мышцы в присутствии пирувата или глюкозы по сравнению с неинкубированными мышцами (таблица 1). ). С другой стороны, падение уровня гликогена, наблюдаемое в мышцах камбалы и ЭДЛ, инкубированных пируватом, было предотвращено, если мышцы инкубировались с глюкозой. Интересно, однако, что мы заметили, что уровни инозинмонофосфата (IMP) увеличились в несколько раз, но только в инкубированной камбалочной мышце. Уровни IMP обычно увеличиваются в мышцах во время сильного метаболического стресса, поскольку мышца пытается предотвратить накопление AMP путем преобразования AMP в IMP для поддержания соотношения АТФ / АДФ28. Это указывает на то, что камбаловидная мышца несколько более метаболически напряжена по сравнению с мышцей EDL во время инкубации. Это мнение также подтверждается выводами повышенного фосфорилирования AMPKα Thr172 и ACC Ser212 в камбаловидной мышце, инкубированной пируватом (рисунок 5). Важно отметить, что наблюдаемое повышение уровней IMP, а также фосфорилирование AMPKα Thr172 и ACC Ser212 уменьшаются, когда камбаловидная мышца инкубируется с глюкозой. Следовательно, представляется целесообразным инкубировать изолированные скелетные мышцы в глюкозосодержащем буфере, чтобы свести к минимуму колебания нуклеотидов аденозина и предотвратить падение мышечного гликогена, когда мышцы инкубируются в течение длительного периода времени. Что касается поглощения 2-дезоксиглюкозы, у нас есть доказательства того, что инкубация мышц в течение 6-8 ч в присутствии пирувата увеличит скорость поглощения базальной / покоящейся глюкозы. Инкубация мышц в среде, содержащей глюкозу, по-видимому, предотвращает такое увеличение поглощения глюкозы (неопубликованные данные).

Figure 1
Рисунок 1: Инкубационная система. (А) Система миографа с четырьмя одиночными инкубационными камерами. (B) Индивидуальные инкубационные крючки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Поглощение глюкозы в изолированных зрелых скелетных мышцах у мышей. Поглощение 2-дезоксиглюкозы определяли в изолированных мышцах камбалы (черные полосы) и ЭДЛ (серые полосы) в ответ на субмаксимально эффективную концентрацию инсулина (100 мкЕд/мл), максимально эффективную концентрацию инсулина (10 мЕд/мл) и электрически индуцированные сокращения (импульс 0,2 мс, 100 Гц, 1 с/15 с, 30 В, 10 мин). Данные были проанализированы студентами теста в каждой группе. ###p<0.001, ##p<0.01 против камбаловидной мышцы. Значения являются средними ± SEM. n = 4-6 на группу. ч, час. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Кривые мышечной силы в ответ на электрически индуцированные сокращения. Пик выработки силы при электрической стимуляции был рассчитан для камбалы (черные точки) и EDL (серые точки) мышц. Каждое отдельное значение соответствует среднему значению последних 500 мс каждого периода стимуляции 1 с. Значения являются средними ± SEM. n = 5-6 на группу. с, второе. мН, милли-Ньютон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные западные пятна фосфорилирования Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 и ACC Ser212, а также белки Akt2, TBC1D4, AMPKα2 и ACC. Анализ вестерн-блоттинга проводился на образцах мышц камбалы и EDL мышей, описанных на рисунке 2. В, базальный. S, субмаксимально эффективный инсулин. М, максимально эффективный инсулин. С, сокращение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные западные пятна фосфорилирования AMPKα Thr172 и ACC Ser212, а также белки AMPKα2 и ACC. Анализ вестерн-блоттинга проводился на образцах мышц камбалы и EDL мышей, описанных в таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

неинкубированный Инкубированный 1 час с пируватом Инкубированный 1 ч с глюкозой Основные эффекты Взаимодействие
Камбала ЭДЛ Камбала ЭДЛ Камбала ЭДЛ
Лактат 1.00 ± 0.01 1.00 ± 0.02 0,96 ± 0,03 0,98 ± 0,02 1.05 ± 0.01 0.99 ± 0.01 - -
Кр 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.06 0,64 ± 0,07 ### 0,76 ± 0,05 ### 0.76 ± 0.07 ## 0,88 ± 0,09 ## p < 0.001 -
ПКр 1.00 ± 0.19 1.00 ± 0.06 0.80 ± 0.12 1,13 ± 0,14 0,65 ± 0,31 0,75 ± 0,08 - -
PCr/(Cr + PCr) 1.00 ± 0.20 1.00 ± 0.07 1.17 ± 0.11 1.25 ± 0.12 0,78 ± 0,36 0.92 ± 0.11 - -
СПС 1.00 ± 0.03 1.00 ± 0.02 0.72 ± 0.03 ###,§§§ 0,99 ± 0,03 * 0,81 ± 0,06 ### 0,85 ± 0,04 ## - p < 0.001
АДП 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.04 0,75 ± 0,05 ### 0.92 ± 0.03 ### 0,84 ± 0,04 ## 0,86 ± 0,03 ## p < 0.001 -
АМПЕР 1.00 ± 0.11 1.00 ± 0.12 0,85 ± 0,15 0.79 ± 0.13 0,84 ± 0,18 0,75 ± 0,13 - -
ШАЛУН 1.00 ± 0.17 1.00 ± 0.30 4.43 ± 0.67 ###,§§§ 0,72 ± 0,29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1.08 ± 0.01 - p < 0.001
Соотношение AMP/ATP 1.00 ± 0.12 1.00 ± 0.13 1.18 ± 0.22 0,81 ± 0,16 1.06 ± 0.23 0.90 ± 0.19 - -
Гликоген 1.00 ± 0.08 1.00 ± 0.12 0,74 ± 0,07 (#),* 0.80 ± 0.12 (#),* 1.12 ± 0.10 1.10 ± 0.03 p = 0,035 -
pAMPK Thr172 / AMPKα2 1.00 ± 0.10 1.00 ± 0.12 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ 1,55 ± 0,27 1.68 ± 0.19 # 1.36 ± 0.19 - p = 0,002
pACC Ser212 / ACC 1.00 ± 0.18 1.00 ± 0.12 2.22 ± 0.58 ###,**,§§ 0,96 ± 0,21 0,99 ± 0,15 0.83 ± 0.09 - p = 0,030

Таблица 1: Сравнение метаболической жизнеспособности камбалы мыши и ЭДЛ мышц, инкубированных в течение 1 ч в присутствии 2 мМ пирувата или 5 мМ глюкозы. Неинкубированные мышцы рассекли от анестезированных и кормили животных, прежде чем заморозить в жидком азоте. Отдельные мышцы инкубировали в течение 1 ч в буфере KRH, дополненном BSA (0,1%), Na-пируватом (2 мМ) и D-маннитолом (8 мМ), в то время как другие инкубировали в течение 1 ч в буфере KRH, дополненном BSA (0,1%), D-глюкозой (5 мМ) и D-маннитолом (5 мМ) перед замораживанием в жидком азоте. Данные были преобразованы в относительные единицы, чтобы выделить наблюдаемые изменения в различных маркерах метаболической жизнеспособности. Абсолютные значения из неинкубированных мышц камбалы мыши и EDL приведены ниже. Лактат (ммоль/кг масса): 137,53камбалы; 139.05ЖНВЛП. Cr (ммоль/кг масса): 9,35камбалы; 8.98ЭДЛ. PCr (ммоль/кг масса): 1,50камбалы; 5.20ЖНВЛП. PCr/(PCr+Cr): 13,98камбалы; 37.30ЖНВЛП. АТФ (ммоль/кг масса): 3,07камбалы; 4.24ЭДЛ. АДФ (ммоль/кг масса): 0,60камбалы; 0,51ЖНВЛП. AMP (ммоль/кг массы): 0,18камбалы; 0,08ЭДЛ. IMP (ммоль/кг масса): 0,07камбалы; 0.14ЖНВЛП. Соотношение AMP/ATP: 0,06камбалы; 0,02ЭДЛ. Гликоген (пмол/мкг белка): 77,01камбалы; 67.56ЭДЛ. Данные анализировались двусторонней ANOVA в каждой группе. ###p<0.001, ##p<0.01 и #p<0.05 против неинкубированных. p<0.001, **p<0.01 и *p<0.05 против инкубированного 1 ч с глюкозой. §§§p<0.001, §§p<0.01 и §p<0.05 против EDL. Значениями являются средние ± SEM. n = 12 в неинкубированной группе, n = 4-6 в инкубированных группах. Cr, креатин; PCr, фосфокреатин; w.w, живой вес; ч, час.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Интактная регуляция поглощения глюкозы в скелетных мышцах важна для сохранения общего состояния здоровья1. Таким образом, исследование поглощения глюкозы в мышцах часто служит первичным показанием при оценке различных вмешательств, изменяющих здоровье. Здесь мы описываем метод ex vivo для измерения поглощения глюкозы в изолированных и инкубированных камбаловидных мышцах и мышцах EDL у мышей в ответ на инсулин и электрически индуцированные сокращения. Метод является быстрым и надежным и позволяет точно контролировать окружающую среду инкубируемой мышцы, что позволяет проводить точные исследования скорости поглощения глюкозы мышцами, изолированные от потенциально смешанного влияния гормонов и субстратов, которые можно найти в крови. Метод использовался в течение нескольких лет во многих исследованиях и широко используется сообществом исследователей мышц.

Модель инкубации ex vivo обычно считается методом оценки транспортной способности глюкозы, а не поглощения глюкозы в скелетных мышцах. Транспортная способность глюкозы в инкубированной мышце может быть определена путем измерения накопленного D-глюкозы в течение определенного периода времени. Однако это создает проблему, поскольку D-глюкоза быстро метаболизируется в мышечной клетке после поглощения. Чтобы обойти эту проблему, аналог глюкозы 3-O-метил-D-глюкоза (3-MG) широко используется для оценки транспортной способности глюкозы, поскольку 3-MG не метаболизируется внутри клетки после транспортировки через клеточную мембрану. Таким образом, начальная скорость внутриклеточного накопленного 3-МГ служит индексом клеточной транспортной способности глюкозы как таковой, поскольку на нее не влияют другие этапы метаболических путей глюкозы. Однако использование 3-MG может представлять собой проблему, поскольку 3-MG будет накапливаться, тем самым уменьшая трансмембранный градиент для 3-MG и впоследствии уменьшая дальнейшее поглощение. Таким образом, для получения меры транспортной способности мембраны необходимо оценить начальную скорость поглощения 3-МГ. В частности, когда транспортная способность высока, это может представлять проблему из-за оттока 3-MG измышцы 29,30. Потенциальной проблемы с 3-МГ эффлюкса можно избежать с помощью 2-дезокси-D-глюкозы (2-DG). После транспортировки в скелетные мышцы 2-DG фосфорилируется гексокиназой II в 2-дезокси-D-глюкозо-6-фосфат (2-DG-6P). Поскольку скелетным мышцам не хватает глюкозы-6-фофатазы, а GLUT4 не может транспортировать фосфорилированный 2-DG, 2-DG-6P будет захвачен внутри мышечной клетки. В отличие от глюкозо-6-фосфата, 2-DG-6P является очень слабым аллостерическим ингибитором гексокиназы II30, который помогает поддерживать трансмембранный градиент для 2-DG. Таким образом, наблюдения показали, что поглощение 2-DG в инкубированной (крысиной) мышце остается линейным до тех пор, пока внутриклеточная концентрация 2-DG-6P не превысит 30 мМ, концентрация, которая снижает активность гексокиназы II30. Кроме того, в инкубированных скелетных мышцах мыши поглощение 2-DG остается линейным в течение ~ 30 мин, когда температура инкубационных буферов составляет 37 °C или менее31. Это говорит о том, что 2-DG может быть использован для измерения транспортной способности глюкозы, а не поглощения глюкозы в инкубированных мышцах, за исключением ситуаций, когда концентрации 2-DG-6P становятся очень высокими (например, наблюдаются во время инкубации >2 часа с 1 мМ 2-DG и максимальной концентрацией инсулина29,30). Идея о том, что поглощение 2-DG, вероятно, отражает транспортную способность глюкозы, также подтверждается результатами, показывающими, что максимальное поглощение 2-DG, стимулируемое инсулином, аналогично инкубированным мышцам у мышей дикого типа и мышей, которые чрезмерно экспрессируют гексокиназу II32. Потенциальной проблемой при использовании 2-DG для измерения мышечного транспорта глюкозы во время сокращения является увеличение внутриклеточной концентрации глюкозо-6-фосфата из-за повышенной скорости гликогенолиза. Однако, поскольку линейное увеличение поглощения (крысами) мышц 2-DG наблюдается во время сокращения с течением времени29, это указывает на то, что накопление глюкозо-6-фосфата от распада гликогена во время сокращения не влияет на активность гексокиназы II и, следовательно, на скорость поглощения 2-DG. Исходя из этого, 2-DG, по-видимому, хорошо подходит для измерения транспорта глюкозы в изолированных скелетных мышцах во время инсулина и сокращения, учитывая ограничения 3-MG.

Хотя обычно предполагается, что 2-DG не метаболизируется далее после фосфорилирования гексокиназой II, сообщалось, что некоторые 2-DG направлены и включены в мышечный гликоген. Таким образом, в течение 2 ч нормогликемического гиперинсулинемического зажима у крыс ~30% 2-DG, поглощаемого скелетными мышцами, включается в гликоген33. Таким образом, можно предположить, что скорость инсулин-стимулированного поглощения 2-DG в инкубированных скелетных мышцах недооценивается, если пренебречь накоплением 2-DG в гликогене. Мы определили, что описанный в настоящем описании протокол о том, как подготовить мышечные лизаты (супернатант) для последующего анализа скорости поглощения 2-DG в предшествующих инкубированных скелетных мышцах, не зависит от потенциального включения 2-DG в гликоген. Можно утверждать, что гликоген накапливается в грануле при центрифугировании целого мышечного гомогената для получения лизата для измерений поглощения 2-DG. Однако при сравнении уровней радиоактивности в гомогенате всей мышцы, стимулируемой инсулином, и лизате мы не обнаруживаем какой-либо существенной разницы (неопубликованные данные). Это говорит о том, что инкубация мышц мыши в течение 10 мин в 1 мМ 2-ДГ не вызывает обнаруживаемого накопления 2-ДГ в гликогене.

Определение поглощения скелетными мышцами 2-DG без учета того, что 2-DG распределено как во вне-, так и во внутриклеточном пространстве, приведет к переоценке поглощения 2-DG. Чтобы обойти это, L-глюкоза должна использоваться в качестве внеклеточного маркера, поскольку она не транспортируется через клеточную мембрану, но в остальном проявляет аналогичные свойства, как D-глюкоза, включая массу, растворимость, пассивную диффузию, связывание и т. Д. Из-за чрезмерных затрат на производство и, следовательно, покупку L-глюкозы, маннит обычно используется в качестве внеклеточного маркера, поскольку маннит не поглощается мышечной клеткой, относительно недорог и, по оценкам, имеет несколько аналогичный объем внеклеточного распределения, как глюкоза и 2-DG34.

Внутренние клеточные и молекулярные часы, по-видимому, играют важную роль в регуляции метаболизма всего тела и энергетического гомеостаза35. Было замечено, что мышечно-специфический нокаут гена основных часов Bmal1 ухудшает поглощение глюкозы инсулином в изолированных скелетных мышцах мыши36. Кроме того, субмаксимальное инсулин-стимулируемое поглощение глюкозы изолированными скелетными мышцами проявляет циркадный ритм с самым низким и самым высоким инсулиновым ответом в середине светлой и темной фазы, соответственно37. Основываясь на этих выводах, важно включить время жертвоприношения животных в экспериментальный проект, чтобы повысить воспроизводимость данных.

Основным недостатком метода ex vivo является отсутствие капиллярного потока в изолированной мышце. Это означает, что доставка и удаление различных субстратов полностью зависят от простой диффузии между мышечными волокнами и окружающей средой. Следовательно, подтверждение метаболической жизнеспособности изолированных мышц, инкубированных ex vivo, было сосредоточено на диффузионных ограничениях кислорода к поверхностным, а также глубоким мышечным волокнам. Таким образом, инкубированные мышцы, особенно высокометаболические мышцы мыши, имеют тенденцию к развитию гипоксических ядер, в которых происходит распад гликогена 16,17,38. В подробном обзоре Бонена и его коллег15 было высказано предположение, что гипоксические ядра инкубированных мышц, вероятно, развиваются при инкубации мышц, слишком толстых, чтобы быть должным образом насыщенными кислородом, особенно при инкубации при температуре ≥ 37 ° C. Это привело к рекомендации использовать только тонкие и цилиндрические мышцы мыши, такие как камбала и ЭДЛ, для инкубации при 25-30 °C, чтобы избежать развития гипоксических ядер. Это указывает на то, что толщина и геометрия, а не масса являются важными факторами, которые следует учитывать при инкубации скелетных мышц мыши. Кроме того, было рекомендовано измерять температуру инкубации, толщину мышц, а также содержание АТФ, фосфокреатина и гликогена и/или высвобождение лактата для оценки жизнеспособности инкубируемой мышцы15. Насколько нам известно, такие полные анализы инкубированных мышц в основном были зарегистрированы для мышц крыс 39,40,41,42 и только в ограниченной степени зарегистрированы для мышц мыши16,17. Чтобы улучшить понимание различных метаболических маркеров жизнеспособности в инкубированных скелетных мышцах мыши, мы оценили возможные изменения внутриклеточного содержания лактата, креатина, фосфокреатина, аденозиновых нуклеотидов, гликогена и передачи сигналов AMPK в камбаловидной и EDL-мышце после 1 часа инкубации в буфере KRH, дополненном глюкозой или пируватом. Подобно предыдущим результатам в инкубированной камбале мыши и мышце EDL17, мы наблюдали, что уровни гликогена снижались, когда мышцы инкубировались в средах без глюкозы. Это указывает на то, что отсутствие глюкозы во время инкубации способствует распаду гликогена и последующему поступлению глюкозо-6-фосфата в гликолиз, который может действовать для обеспечения производства АТФ, в частности, если снабжение кислородом недостаточно. Кроме того, мы обнаружили общее снижение пулов нуклеотидов АТФ и АДФ в инкубированных камбаловидных и ЭДЛ мышцах. Это может означать, что снабжение кислородом не совсем достаточно для удовлетворения потребностей инкубированных мышц мыши как в присутствии, так и в отсутствие глюкозы. Поскольку окислительная камбаловидная мышца больше полагается на кислород для производства АТФ по сравнению с гликолитической мышцей EDL, это говорит о том, что камбаловидная мышца в большей степени подвержена воздействию процедуры инкубации. В согласии мы обнаружили, что внутриклеточные уровни IMP, а также передачи сигналов AMPK были заметно увеличены в камбале по сравнению с мышцами EDL при инкубации в отсутствие глюкозы. Это означает, что камбаловидная мышца проявляет более высокую степень метаболического стресса во время инкубации, что необходимо учитывать при оценке данных из модели мышц мыши ex vivo.

Культивируемые мышечные клетки, включая увековеченные L6 и C2C12, а также первичные миотубы человека, обычно используются в качестве суррогата зрелых скелетных мышц для изучения влияния различных генетических и фармакологических манипуляций на поглощение глюкозы мышцами, стимулируемыми инсулином. Однако в нескольких отношениях культивируемые мышечные клетки не похожи на зрелые скелетные мышцы, и при сравнении двух модельных систем становятся очевидными многочисленные различия. К ним относятся различия в экспрессии белка, размерной структуре, окружающей среде, состоянии пролиферации и дифференцировки, составе типа волокна, метаболических процессах и функциональных свойствах43 , которые могут влиять на то, как мышечная клетка регулирует поглощение глюкозы в ответ на различные стимулы. Как правило, большее относительное влияние инсулина на скорость поглощения глюкозы наблюдается в зрелых скелетных мышцах по сравнению с культивируемыми мышечными клетками44 , что может указывать на то, что культивируемым мышечным клеткам в некоторой степени не хватает механизма, ответственного за регулирование скорости поглощения глюкозы, включая высокий уровень экспрессии инсулиночувствительного транспортера глюкозы GLUT443 . Учитывая ограничения и предостережения, связанные с использованием культивируемых мышечных клеток и изолированных скелетных мышц, поэтому, вероятно, выгодно использовать комбинированный подход при изучении различных мышечных метаболических процессов, таких как поглощение глюкозы.

Камбаловидные и EDL мышцы обычно рассматриваются как представители медленно и быстро дергающихся мышц соответственно. Поэтому эти типы мышц идеально подходят для механических исследований, направленных на изучение вмешательств, которые влияют на мышечную силу и развитие усталости. Кроме того, камбаловидная мышца, как правило, имеет повышенную чувствительность к инсулину и отзывчивость по сравнению с мышцами EDL, и, таким образом, вмешательства, направленные на чувствительность мышц к инсулину, могут по-разному влиять на камбалу и ЭДЛ. Кроме того, относительное распределение различных комплексов AMPK различается между камбалой и мышцами EDL, что, по-видимому, влияет на способность активирующих ampK соединений увеличивать поглощение глюкозы мышцами. Таким образом, наибольшее понимание регуляции поглощения глюкозы мышцами, вероятно, достигается, если во время экспериментов с моделью инкубации ex vivo используются как камбала, так и мышцы EDL.

Описанный в настоящем описании способ связывает поглощение глюкозы с количеством общего количества белка, определяемым в каждом образце мышц после гомогенизации. По нашему опыту, вариации уменьшаются при соотношении поглощения глюкозы на количество мышечного белка, а не на мышечную массу (неопубликованные данные). Кроме того, гомогенизация мышечных образцов в буфере, используемом для различных биохимических анализов, позволяет определить как поглощение глюкозы, так и миоцеллюлярную сигнализацию и активность ферментов в одном и том же пробоподготовке45,46. Это часто уменьшает количество мышей, используемых для исследования. Тем не менее, поглощение глюкозы может быть легко определено в образцах скелетных мышц, которые растворяются путем нагревания в гидроксиде натрия (NaOH) с последующей нейтрализацией хлористым водородом20. Поскольку лечение мышц NaOH мешает измерениям общей концентрации мышечного белка, транспорт глюкозы, измеренный этой процедурой, должен быть связан с мышечной массой.

Основываясь на различных оптимизациях, наш инкубационный буфер поглощения глюкозы содержит специфическую активность 0,028 МБк/мл [3H]2-дезокси-D-глюкозы и 0,0083 МБк/мл [14C]маннита. С одной стороны, это снижает количество лизата (150 из 400 мкл), необходимое для получения достаточных и надежных измерений радиоактивности. С другой стороны, он увеличивает количество радиоактивного [3H]2-дезокси-D-глюкозы и [14C]маннитола, необходимых для каждого эксперимента, что увеличивает экспериментальные затраты. Таким образом, для любой экспериментальной установки можно регулировать количество радиоактивности, используемой в инкубационной среде поглощения глюкозы, в соответствии с конкретными требованиями. Однако необходимо позаботиться о том, чтобы не уменьшить количество радиоактивности в инкубационном буфере до такой степени, что измерения радиоактивности делают измерения ненадежными. Это обеспечивается за счет поддержания радиоактивности в образцах выше установленных пределов обнаружения используемых жидкостных сцинтилляционных счетных машин.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Датского совета по независимым исследованиям - медицинским наукам (FSS8020-00288B) и Фонда Ново Нордиск (NNF160C0023046). Эта работа также была поддержана исследовательским грантом Расмусу Кьёбстеду от Датской диабетической академии, который финансируется Фондом Ново Нордиск, номер гранта NNF17SA0031406. Авторы хотели бы поблагодарить Карину Олсен, Бетину Болмгрен и Ирен Бех Нильсен (Департамент питания, физических упражнений и спорта, факультет естественных наук Копенгагенского университета) за их квалифицированную техническую помощь.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
  2. Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), Pt 1 230-235 (1983).
  3. Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
  4. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  5. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
  6. Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
  7. Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
  8. Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
  9. Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
  10. Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
  11. Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5'-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
  12. Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
  13. Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
  14. Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
  15. Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
  16. van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
  17. Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
  18. Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
  19. Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
  20. Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
  21. Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
  22. Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
  23. Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
  24. Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
  25. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
  26. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
  27. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
  28. Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
  29. Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), Pt 1 184-191 (1998).
  30. Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
  31. Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
  32. Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
  33. Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
  34. Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
  35. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
  36. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
  37. Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
  38. Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
  39. Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
  40. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  41. Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
  42. Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), Pt 1 154-160 (1991).
  43. Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
  44. Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
  45. Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
  46. Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).

Tags

Биология выпуск 171 скелетные мышцы транспорт глюкозы поглощение глюкозы чувствительность к инсулину сокращение эксплант ex vivo in vitro инкубация радиоактивные индикаторы глюкозы 2-дезокси-D-глюкоза
Измерение поглощения глюкозы инсулином и сокращением в изолированных и инкубированных зрелых скелетных мышцах мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter