Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mätning av insulin- och sammandragningsstimulerat glukosupptag i isolerade och inkuberade mogna skelettmuskler från möss

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

Intakt reglering av muskelglukosupptag är viktigt för att upprätthålla glukoshomeostas i hela kroppen. Detta protokoll presenterar bedömning av insulin- och kontraktionsstimulerat glukosupptag i isolerad och inkuberad mogen skelettmuskel när man avgränsar effekterna av olika fysiologiska ingrepp på hela kroppens glukosmetabolism.

Abstract

Skelettmuskeln är en insulinresponsiv vävnad och tar vanligtvis upp det mesta av glukosen som kommer in i blodet efter en måltid. Dessutom har det rapporterats att skelettmuskeln kan öka extraktionen av glukos från blodet med upp till 50 gånger under träning jämfört med viloförhållandena. Ökningen av muskelglukosupptaget under träning och insulinstimulering är beroende av translokationen av glukostransportör 4 (GLUT4) från intracellulära fack till muskelcellens ytmembran, liksom fosforylering av glukos till glukos-6-fosfat av hexokinas II. Isolering och inkubation av musmuskler som m. soleus och m. extensor digitorum longus (EDL) är en lämplig ex vivo-modell för att studera effekterna av insulin och elektriskt inducerad sammandragning (en modell för träning) på glukosupptaget i mogen skelettmuskel. Således tillåter ex vivo-modellen utvärdering av muskelinsulinkänslighet och gör det möjligt att matcha muskelkraftproduktionen under sammandragning vilket säkerställer enhetlig rekrytering av muskelfibrer under mätningar av muskelglukosupptag. Dessutom är den beskrivna modellen lämplig för farmakologisk föreningstestning som kan påverka muskelinsulinkänsligheten eller kan vara till hjälp när man försöker avgränsa den regulatoriska komplexiteten hos skelettmuskelglukosupptaget.

Här beskriver och tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för hur man mäter insulin- och sammandragningsstimulerat glukosupptag i isolerade och inkuberade soleus- och EDL-muskelpreparat från möss med hjälp av radioaktivt märkt [3H]2-deoxi-D-glukos och [14C]mannitol som en extracellulär markör. Detta möjliggör noggrann bedömning av glukosupptaget i mogen skelettmuskel i avsaknad av förvirrande faktorer som kan störa den intakta djurmodellen. Dessutom tillhandahåller vi information om metabolisk livskraft hos inkuberad musskelettmuskel som tyder på att den tillämpade metoden har vissa försiktighetsåtgärder under vissa förhållanden när man studerar muskelenergimetabolism.

Introduction

Skelettmuskeln har förmågan att extrahera stora mängder glukos från det extracellulära utrymmet som svar på insulin och motion. Detta hjälper till att upprätthålla hela kroppen glukoshomeostas och säkrar glukosförsörjningen under tider med högt energibehov. Eftersom intakt reglering av glukosupptaget i skelettmuskeln har visat sig vara viktigt för den allmänna hälsan och fysiskaprestationen 1,2 har mätningar av muskelglukosupptag under olika förhållanden fått stor uppmärksamhet. Hos människor och djur har den hyperinsulinemiska-euglykemiska klämman använts som guldstandardteknik för att bedöma insulinkänslighet in vivo 3,4. Till skillnad från fynd som erhållits från ett oralt glukostoleranstest kräver hyperinsulinemisk-euglykemisk klämteknik inte intakt gastrointestinal funktion eller insulinsekretion från bukspottkörteln och tillåter därmed insulinsvar att jämföras mellan försökspersoner som uppvisar variationer i mag-tarm- och / eller bukspottkörtelfunktionen. Mätningar av muskelglukosupptag in vivo under träning hos människor har utförts ofta sedan 1960-talet5. Först genom användning av arteriovenösa balanstekniker6 och senare genom användning av positronemissionstomografi (PET) i kombination med en positronemitterande glukosanalog, t.ex. 18F-fluor-deoxi-glukos7. Hos gnagare utförs träningsstimulerat muskelglukosupptag in vivo typiskt genom användning av radioaktiva eller stabila isotopmärkta glukosanaloger 8,9,10.

En kompletterande metod till mätningar av muskelglukosupptag in vivo är att isolera och inkubera små muskler från gnagare och därefter mäta glukosupptaget med hjälp av radioaktiva eller stabila isotopmärkta glukosanaloger 11,12,13. Denna metod möjliggör noggrann och tillförlitlig kvantifiering av glukosupptagningshastigheter i mogen skelettmuskel och kan utföras i närvaro av olika insulinkoncentrationer och under sammandragning framkallad av elektrisk stimulering. Ännu viktigare är att mätningar av glukosupptag i isolerade och inkuberade skelettmuskler är relevanta när man undersöker den muskelmetaboliska fenotypen hos möss som har genomgått olika ingrepp (t.ex. näring, fysisk aktivitet, infektion, terapi). Den isolerade skelettmuskelmodellen är också ett lämpligt verktyg för farmakologisk föreningstestning som kan påverka glukosupptaget i sig och / eller modifierainsulinkänsligheten 12,14. På detta sätt kan effekten av föreningar som är utformade för att reglera muskelglukosmetabolismen testas och utvärderas i en mycket kontrollerad miljö före efterföljande in vivo-testning i prekliniska djurmodeller.

Under vissa förhållanden kan metabolisk livskraft utgöra en utmaning i det isolerade och inkuberade skelettmuskelmodellsystemet. Faktum är att bristen på ett cirkulationssystem i de inkuberade musklerna innebär att leverans av substrat (t.ex. syre och näringsämnen) helt beror på enkel diffusion mellan muskelfibrerna och den omgivande miljön. Med hänsyn till detta är det av vikt att de inkuberade musklerna är små och tunna och därmed utgör mindre av en barriär för syrediffusion under inkubation15. Speciellt under långvariga inkubationer i flera timmar kan hypoxiska tillstånd utvecklas på grund av otillräcklig syretillförsel vilket resulterar i muskelenergiutarmning15. Även om olika markörer för metabolisk livskraft i inkuberad råttmuskel har rapporterats tidigare tillsammans med identifieringen av viktiga variabler som hjälper till att upprätthålla råttmuskelns livskraft15, är en omfattande utvärdering av metabolisk livskraft i små inkuberade musmuskler fortfarande motiverad. Därför har glykogenhalten för närvarande huvudsakligen använts som en markör för metabolisk livskraft i inkuberad musskelettmuskel 16,17.

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att mäta basal-, insulin- och sammandragningsstimulerat glukosupptag i isolerad och inkuberad soleus- och EDL-muskel från möss med hjälp av radioaktivt märkt [3H]2-deoxi-D-glukos och [14C]mannitol som en extracellulär markör. I den aktuella studien mättes glukosupptaget under en 10-minutersperiod och metoden presenteras med användning av submaximalt och maximalt effektiva insulinkoncentrationer samt ett enda sammandragningsprotokoll. De protokoll som beskrivs här kan emellertid enkelt modifieras med avseende på inkubationstid, insulindosering och elektriskt stimuleringsprotokoll. Dessutom ger vi en grundlig karakterisering av olika markörer för metabolisk livskraft i inkuberad soleus och EDL musmuskel. Resultaten indikerar att glukostillskott till inkubationsbufferten är avgörande för att bevara metabolisk livskraft hos muskler inkuberade i 1 timme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Försök med försök med försök med försök bör utföras i enlighet med relevanta riktlinjer och lokal lagstiftning. Alla djurförsök som användes för denna studie uppfyllde den europeiska konventionen om skydd av ryggradsdjur som används för experimentella och andra vetenskapliga ändamål och godkändes av den danska djurförsöksinspektionen.

1. Beredning av experimentapparaten och suturslingorna

OBS: För denna studie, använd ett integrerat muskelremsa myografsystem med anpassade inkubationskrokar för att inkubera isolerade musskelettmuskler (Figur 1). Detta system tillåter muskler att bada i en fysiologisk lösning med kontinuerlig syresättning (95%O2 och 5% CO2) och vid konstant temperatur. Muskelvävnadsbadet är kopplat till en kraftgivare för mätning av muskelkraftproduktion under sammandragning. För att framkalla och registrera myo-mekaniska svar under sammandragning, använd en elektrisk pulsstimulator respektive ett datainsamlingsprogram. Stimulera de inkuberade musklerna att dra ihop sig av platinaelektroder placerade centralt och på båda sidor av muskeln.

  1. Slå på myografsystemet och värm kamrarna till 30 °C. Programvara för insamling av öppna data som är kompatibel med myografsystemet och kalibrerar kraftgivare för att säkerställa jämförbarhet mellan datauppsättningar.
  2. Börja med att skära ~ 16 cm trådar av icke-absorberbar kirurgisk nylonsutur. Använd pincett för att skapa en slinga med cirka 0,4 cm i diameter från en enda sträng. Upprepa detta tills tillräckligt många slingor har producerats. Varje muskel behöver två öglor - en för den proximala och en för den distala senan.

2. Beredning av lösningar och inkubationsmedier

  1. Framställning av basala inkubationsmedier
    1. Förbered följande stamlösningar: 2,5 M natriumklorid (NaCl, 250 ml), 0,5 M natriumbikarbonat (NaHCO3, 250 ml), 0,5 M kaliumklorid (KCl, 50 ml), 0,25 M kalciumklorid (CaCl2, 50 ml), 0,25 M kaliumdivätefosfat (KH2PO4, 50 ml), 0,25 M magnesiumsulfat (MgSO4, 50 ml), 110 mM natriumpyruvat (Na-pyruvat, 100 ml), 500 mM D-mannitol (100 ml), 1 M 2-deoxi-D-glukos (4 ml), 15 % lösning av bovint serumalbumin (BSA) dialyserat mot Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) buffert (beskrivs nedan i steg 4) (100 ml).
      OBS: Två lösningar krävs för att mäta vilo- och sammandragningsstimulerat glukosupptag. Dessutom kräver varje enskild insulinkoncentration som används för att bedöma insulinstimulerat glukosupptag två lösningar. Således behövs totalt sex olika lösningar för att mäta basalt, submaximalt insulin-, maximalt insulin- och sammandragningsstimulerat glukosupptag i isolerad musskelettmuskel. I det följande avses med "basalt inkubationsmedier" medier utan insulin eller radioaktiva spårämnen. "Inkubationsmedier" avser medier som innehåller insulin. Med "glukosupptagsinkubationsmedier" avses medier som innehåller 2-deoxi-D-glukos och radioaktiva spårämnen utöver insulin i en koncentration som är identisk med den som används i "inkubationsmediet".
    2. Förbered en KRH-buffert genom att komplettera ultrarent vatten (ddH2 O) med NaCl (117 mM), NaHCO3 (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl2 (2,5 mM), KH2PO4 (1,2 mM) och MgSO4 (1,2 mM). Gasa sedan KRH-bufferten med 95%O2 och 5% CO2 i minst 10 min. Det önskade pH-värdet för KRH-bufferten bör ligga mellan 7,35-7,45 vid 30 °C. Om pH-justering utförs vid rumstemperatur bör KRH-buffertens pH vara mellan 7,25-7,35.
    3. Tillsätt BSA (0,1%), Na-pyruvat (2 mM) och D-mannitol (8 mM) till den gasade och pH-justerade KRH-bufferten för att slutföra basalinkubationsmediet. Förvara basala inkubationsmedier i en förseglad behållare för att minimera avgasning avO2 och CO2 och placera media vid 30 °C.
      OBS: Vanligtvis hålls osmolariteten hos KRH-tillskotten (dvs. Na-pyruvat, D-mannitol och D-glukos) konstant över ett helt experiment för att undvika krympning eller expansion av muskelcellerna. Protokollet som beskrivs här använder en osmolaritet på 10 mM för KRH kosttillskott. Om en glukosinnehållande buffert behövs, ersätt KRH-tillskott för att tillgodose behoven, t.ex. 5 mM D-glukos och 5 mM D-mannitol.
    4. För att undvika eventuella BSA-associerade föroreningar i inkubationsbufferten, dialysera BSA mot KRH.
      1. För att göra en 15% BSA-stamlösning dialyserad mot KRH-buffert, börja med att lösa upp 300 g fettfri BSA av analytisk kvalitet i 900 ml KRH-buffert. Koka sedan dialysröret i återdestillerat vatten tills slangen är mjuk.
      2. Fyll slangen med BSA-KRH-lösningen och säkra slangändarna. Placera slangen med BSA-KRH i 5 liter KRH-buffert och låt den stå över natten vid 4 °C. Följande dag byt ut KRH-bufferten och lämna slangen med BSA-KRH i KRH-bufferten över natten vid 4 °C.
      3. Slutligen samla BSA-KRH-lösningen från slangen och tillsätt KRH-bufferten till en slutlig volym på 2 liter (dvs. 15% BSA-KRH-stamlösning). Dela 15% BSA-KRH-stamlösningen i alikvoter och förvara i frysen vid ~ -20 ° C.
  2. Framställning av inkubationsmedier innehållande insulin
    1. För inkubationsmediet som innehåller en submaxim effektiv insulinkoncentration, tillsätt 1 μL av en 100 mU/ml insulinsubstocklösning per ml basalt inkubationsmedier (100 μU/ml insulin).
    2. För inkubationsmediet som innehåller en maximalt effektiv insulinkoncentration, tillsätt 1 μL av en 10 U/ml insulinsubsubationslösning per ml basalt inkubationsmedier (10 ml insulin/ml insulin).
  3. Framställning av glukosupptagnings inkubationsmedier
    VARNING: Hantering av radioaktivt material är endast tillåtet i ett begränsat och kontrollerat område av auktoriserad personal och vissa universitet, forskningsinstitutioner och företag kan kräva förvärv av ett "tillstånd för användning av radioaktivitet". Material och avfall måste hanteras enligt lämpliga lokala rutiner, riktlinjer och lagstiftning.
    1. Följ samma procedur som beskrivs i avsnitt 2.1.2.
    2. Tillsätt BSA (0,1%), Na-pyruvat (2 mM), D-mannitol (7 mM) och 2-deoxi-D-glukos (1 mM) till den gasade och pH-justerade KRH-bufferten.
    3. Tillsätt [3H]2-deoxi-D-glukos (0,028 MBq/ml) och [14C]mannitol (0,0083 MBq/ml) till den kompletterade KRH-bufferten för att komplettera glukosupptagningsinkubationsmediet. Förvara vid 30 °C. Om [3H]2-deoxi-D-glukos och [14C]mannitol löses i etanol, avlägsna etanolen genomN2-medierad avdunstning före användning.
    4. För glukosupptagningsinkubationsmediet som innehåller en submaximellt effektiv insulinkoncentration, tillsätt 1 μL av en 100 mU/ml insulinsubstocklösning per ml glukosupptagningsinkubationsmedier (100 μU/ml insulin).
    5. För glukosupptagningsinkubationsmediet som innehåller en maximalt effektiv insulinkoncentration, tillsätt 1 μL av en 10 U/ml insulinsubstocklösning per ml glukosupptagningsinkubationsmedier (10 ml/ml insulin).

3. Djur och dissektion av mussumus och EDL-muskel för inkubation

OBS: Försök med försök med försök med försöksdjur bör utföras i enlighet med relevanta riktlinjer och lokal lagstiftning. Det beskrivna förfarandet kan användas med egenuppfödda eller kommersiellt tillgängliga manliga och kvinnliga möss med olika stammar och genetisk bakgrund. Följande procedur tillhandahålls för utfodrade kvinnliga C57Bl/6J-möss. I genomsnitt var möss 19 veckor gamla och vägde 25 g. Mössen hölls på en 12:12 h ljus-mörk cykel med fri tillgång till standard gnagare chow och vatten. Djurförsök inleddes klockan 9:00 lokal tid och alla djur offrades inom en period av 2 timmar.

  1. Tillsätt 4 ml förvärmda (30 °C) basala inkubationsmedier till varje inkubationskammare och se till att det basala inkubationsmediet kontinuerligt syresätts med 95 %O2 och 5 % CO2.
  2. Bedöva möss med en intraperitoneal injektion av pentobarbital (10 mg/100 g kroppsvikt) eller annan tillgänglig anestesi (t.ex. tribromoetanol).
    OBS: Var medveten om att i vissa länder kan en licens för att hantera pentobarbital och andra bedövningsmedel krävas. Innan muskeldissektion kan initieras måste anestesi hos varje djur induceras ordentligt. För att säkerställa detta testas svans- och benreflexer. För optimala resultat bör dissektion praktiseras väl för att undvika att skada musklerna under borttagningen.
  3. Placera bedövade möss som är benägna på en dissektionsbricka (t.ex. styrofoamlock) och fäst vid behov fram- och bakpoten med en nål.
  4. Ta bort huden från underbenet och se till att både hälsenan och knäleden är synliga.
    1. För dissektion av soleusmuskeln, börja med att fästa en enda suturslinga på hälsenan. Fäst en ärttång på akillessenen distalt i suturslingan och skär för att frigöra soleus- och gastrocnemiusmusklerna från tassen. Skjut försiktigt ärttången över musen och exponera därmed soleusmuskeln.
    2. Fäst ner ärtpincetten och placera en andra suturslinga runt soleusmuskelns proximala sena. Skär sedan den proximala senan och dissekera soleus (inklusive de två bifogade suturöglorna) fri från gastrocnemiusmuskeln. Placera snabbt soleusmuskeln i inkubationskammaren genom att fästa varje suturögla på respektive krokar.
  5. Ta bort fascian som täcker m. tibialis främre ( TA) med pincett. Om det görs korrekt bör distala senor i TA- och EDL-musklerna vara klara vita och synliga; och separerade från varandra.
  6. Skär den distala senan i TA-muskeln och dissekera ut muskeln för senare analyser (t.ex. genotypning). Använd pincett, frigör försiktigt EDL-muskeln från de omgivande vävnaderna men lämna muskeln intakt och skär inte senorna. Placera en suturslinga runt den distala senan och en andra suturslinga runt den proximala senan av EDL.
  7. Skär sedan senorna som frigör EDL-muskeln med två fästa suturöglor och placera snabbt muskeln i inkubationskammaren genom att fästa varje suturögla på respektive krokar. För att inte förlora spänningen under inkubation och särskilt under elektriskt inducerad sammandragning av soleus- och EDL-musklerna är det av stor betydelse att fixera suturöglorna runt senorna med täta knutar.
  8. Slutligen avliva djuret genom t.ex. cervikal förskjutning.
  9. När musklerna har dissekerats och placerats i inkubationskammare, justera vilospänningen för varje muskel till ~ 5 mN och förinkubera musklerna i minst 10 minuter innan du påbörjar det experimentella protokollet.

4. Insulinstimulerat glukosupptag i isolerad musskelettmuskel

  1. Efter steg 3.9 ersätt det basala inkubationsmediet med inkubationsmedier som inte innehåller något insulin (basalt inkubationsmedier), en submaximellt effektiv insulinkoncentration eller en maximalt effektiv insulinkoncentration och låt stå i inkubationskamrarna i 20 minuter. Placera varje inkubationskammare med 1 minut, vilket ger tid för efterföljande skörd av muskler.
  2. I slutet av 20 minuters stimuleringsperiod, ersätt inkubationsmediet med glukosupptagningsinkubationsmediet som innehåller en identisk koncentration av insulin och lämna i inkubationskamrarna i 10 minuter, igen med 1 min avstånd mellan varje inkubationskammare.
  3. Efter 10 minuters inkubation i glukosupptagningsmediet avlägsna försiktigt musklerna från inkubationskamrarna och tvätta dem i iskalla basala inkubationsmedier. Torka sedan musklerna snabbt på filterpapper innan suturslingorna avlägsnas och musklerna fryses i flytande kväve. Det är absolut nödvändigt att de inkuberade musklerna skördas snabbt om man också vill undersöka olika intracellulära metaboliter och proteinsignalering utöver glukosupptaget.
  4. Samla in 100 μL av glukosupptagningsmediet från varje inkubationskammare och förvara det vid -20 °C. Mängden radioaktivitet i dessa prover kommer att inkluderas i beräkningen av muskelglukosupptag.

5. Sammandragningsstimulerat glukosupptag i isolerad musskelettmuskel

OBS: För att inducera sammandragning av isolerade musskelettmuskler använd följande protokoll: 1 tåg / 15 s, varje tåg 1 s långt bestående av 0,2 ms pulser levererade vid 100 Hz. Men andra liknande protokoll som framkallar sammandragning av isolerad musskelettmuskel kommer sannolikt att fungera också. Viktigt är att spänningen justeras för att generera maximal kraftutveckling av den inkuberade muskeln, vilket är beroende av den experimentella inställningen. Om detta inte säkerställs kan du riskera att inte alla fibrer i muskeln kontraherar. Detta kan i sin tur inducera partiskhet i datauppsättningen.

  1. Efter steg 3.9 placera platinaelektroderna centralt och på båda sidor av musklerna. Initiera sammandragning av musklerna omedelbart efter att ha ersatt det basala inkubationsmediet med glukosupptagningsmediet. Om möjligt, placera varje inkubationskammare med 1 minut, vilket ger tid för efterföljande skörd av muskler. Kom ihåg att registrera kraftproduktion från varje inkuberad muskel.
  2. Efter 10 minuters sammandragning i glukosupptagningsmediet, ta bort platinaelektroderna, samla försiktigt musklerna från inkubationskamrarna och tvätta dem i iskallt basalt inkubationsmedier. Torka sedan musklerna snabbt på filterpapper innan suturslingorna avlägsnas och musklerna fryses i flytande kväve. Hela muskelskördeproceduren bör utföras så snabbt som möjligt.
  3. Samla in 100 μL av glukosupptagningsmediet från varje inkubationskammare och förvara det vid -20 °C. Mängden radioaktivitet i dessa prover kommer att inkluderas i beräkningen av muskelglukosupptag.

6. Homogenisering och bearbetning av skelettmuskler

OBS: Proceduren nedan för muskelhomogenisering gör det möjligt att bestämma både glukosupptag och myocellulär signalering genom västerländsk blotting i samma uppsättning muskelprover.

  1. Homogenisera varje muskel i 400 μL iskall buffert med pH 7,5 innehållande 10 % glycerol, 20 mM natriumpyrofosfat, 1 % IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (upplöst i isopropanol), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-glycerofosfat, 10 mM natriumfluorid (NaF), 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 1 mM glykotherdiamintetraättiksyra (EGTA), 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin, 3 mM bensamidin och 2mM natrium-ortovanadat med användning av stålpärlor och en vävnadsapparat (2 x 45 s vid 30 Hz). Rotera alla homogenat i 1 timme vid 4 °C, varefter de centrifugeras vid 16 000 x g i 20 minuter vid 4 °C. Samla lysatet (supernatant) som används för att bestämma muskelglukosupptaget.

7. Bestämning av radioaktivt märkt 2-deoxiglukos och mannitol

  1. Tillsätt 150 μL av varje muskellysat och 25 μL av glukosupptagningsinterkubationsmediet från varje inkubationskammare för att separera flytande scintillationsräknande injektionsflaskor innehållande 2 ml flytande scintillationsvätska. Förbered dessutom två blinda kontrollflaskor som endast innehåller 3 ml flytande scintillationsvätska. Stäng alla injektionsflaskor och blanda noggrant genom att virvla varje injektionsflaska i ~ 5 s.
  2. Placera injektionsflaskorna i en vätskescintillationsräknare och mät radioaktiviteten hos [3H]2-deoxi-D-glukos och [14C]mannitol enligt tillverkarens riktlinjer. Spela in DPM (sönderdelningar per minut) för varje injektionsflaska med flytande scintillation.

8. Beräkning av muskelglukosupptagningshastigheter

  1. Använd lysatet från steg 6.1 för att mäta den totala proteinkoncentrationen i varje muskelprov med hjälp av standardproteinkvantifieringsmetoder (t.ex. Bicinchoninsyra eller Bradford-analyser). Beräkna mängden protein (mg) som tillsätts till varje scintillationsflaska.
    OBS: Graden av glukosupptag för varje muskelprov beräknas genom att subtrahera mängden [3H]2-deoxi-D-glukos belägen i det extracellulära utrymmet från den totala mängden [3H]2-deoxi-D-glukos i muskelprovet med [14C]mannitol som en extracellulär markör. Det antas att [3H]2-deoxi-D-glukos och [14C]mannitol uppvisar liknande diffusionsegenskaper i muskelvävnaden under inkubation. Utför följande beräkningar:
  2. Börja med att subtrahera [3H] och [14C] DPM för blindkontrollproverna från alla muskel- och medieprover.
  3. Bestäm muskelns extracellulära utrymme i μL (μL-ECS):
    [14C] DPM-muskel / ([14C]DPMmedia / Mvol)
  4. Beräkna mängden [3H]DPM i det extracellulära muskelutrymmet ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPMmedia / Mvol)
  5. Beräkna mängden [3H]DPM i muskelns intracellulära utrymme ([3H]DPMICS):
    [3H] DPM-muskel − [3H]DPMECS
  6. Beräkna muskelglukosupptagningshastigheten (μmol / g protein / timme):
    [3H] DPMICS / ([3H]DPM-media / Mvol) / [2-deoxi-D-glukos])) / mg protein) / Th
    OBS: För alla ekvationer ovan,
    [14C] DPM-muskel är mängden [14C] mannitolradioaktivitet i ett muskelprov;
    [14C] DPM-media är mängden [14C]mannitolradioaktivitet i ett medieprov.
    [3H] DPM-muskel är mängden [3H]2-deoxi-D-glukosradioaktivitet i ett muskelprov;
    [3H] DPM-mediaär mängden [3H]2-deoxi-D-glukosradioaktivitet i ett medieprov;
    [3H] DPMECS är mängden [3H]2-deoxi-D-glukosradioaktivitet i muskelns extracellulära utrymme;
    [3H] DPMICS är mängden [3H]2-deoxi-D-glukosradioaktivitet i muskelns intracellulära utrymme;
    μL-ECS är muskelns extracellulära utrymme i μL;
    Mvol är volymen (μL) av inkubationsmedier som används för scintillationsräkning (t.ex. "25" som nämnts ovan),
    Th är den tidsfaktor som används för att beräkna upptagningshastigheter per timme (dvs. "1/6" vid inkubation av muskler med glukosupptagningsmedier i 10 minuter)
  7. Ta hänsyn till den här exempelberäkningen. [3H] och [14C] DPM för blindkontrollproverna (17 respektive 6) har subtraherats från de DPM-värden som nämns nedan.
    [14C] DPM-muskel: 343
    [14C] DPM-media: 11846
    [3H] DPM-muskel: 4467
    [3H] DPM-media: 39814
    Mvol: 25
    mg protein: 0,396 (i 150 μL muskelproteinlysat)
    [2-deoxi-D-glukos]: 1 (mM)
    Th: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3H] DPMECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3H] DPM-ICS: 4467 DPM – 1153 DPM = 3314 DPM
    Glukosupptag: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0,396 mg protein) / (1/6 timme) = 31,53 μmol / g protein / timme

9. SDS-PAGE och western blot analyser

  1. Förbered soleus- och EDL-muskellysat i Laemmli-bufferten och värm i 5 minuter vid 96 °C.
  2. Separera lika stora mängder muskelprotein med SDS-PAGE på självgjutna geler och överför proteinerna till polyvinylidenfluoridmembran genom halvrenlig blottning.
  3. Därefter inkubera membran i Tris-buffrad saltlösning innehållande 0,05% Tween 20 och 2% skummjölk och sondmembran med relevanta primära och sekundära antikroppar.
  4. Detektera proteiner med kemiluminescens och visualisera dem med ett digitalt bildsystem.

10. Muskelglykogen, nukleotider, laktat, kreatin och fosfokreatin

  1. Använd perklorsyra för att extrahera EDL- och soleusmuskelprover.
  2. Därefter neutralisera prover och analysera dem för laktat, kreatin och fosfokreatin som tidigare beskrivits18.
  3. Analysera nukleotidhalten i EDL- och soleusmuskeln genom omvänd fas HPLC efter extraktion i perklorsyra.
  4. Bestäm muskelglykogenhalten i hela muskelhomogenat som glykosylenheter efter syrahydrolys med en fluorometrisk metod som tidigare beskrivits18.

11. Statistik

  1. Utföra statistiska analyser med programvara för statistiska analyser.
  2. Använd en tvåvägsanalys av varianstest (ANOVA) för att bedöma statistiska skillnader mellan värden som presenteras i tabell 1.
  3. Använd oparade Student t-tester för att bedöma statistiska skillnader i glukosupptag mellan EDL och soleus inom varje grupp som presenteras i figur 2. Presentera data som medel ± standardfel i medelvärdet (SEM). P < 0,05 anses vara statistiskt signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som visas i figur 2 var de basala glukosupptagningshastigheterna likartade mellan isolerade soleus- och EDL-muskler från honmöss. Detta har också rapporterats flera gånger före 12,13,19,20. Glukosupptaget ökade med ~ 0,8 och ~ 0,6 gånger och nådde 12 och 9 μmol / g protein / h i soleus respektive EDL-muskler som svar på en submaximellt effektiv insulinkoncentration (100 μU / ml). Denna ökning var ännu högre (~ 4 och ~ 2 gånger och nådde 33 och 19 μmol / g protein / h i soleus respektive EDL-muskler) när musklerna stimulerades med en maximalt effektiv insulinkoncentration (10 mU / ml). Dessutom var både submaximalt och maximalt insulinstimulerat glukosupptag signifikant högre i soleusmuskeln vilket indikerar att soleusmuskeln uppvisar ökad insulinkänslighet och lyhördhet jämfört med EDL-muskeln. Detta kan vara relaterat till det högre uttrycket av glukostransportören 4 (GLUT4) samt insulinsignalgivarens proteinkinas B (Akt) i soleusmuskeln jämfört med EDL-muskeln 10,21,22,23,24.

Sammandragningsinducerad glukosupptagning var signifikant högre i EDL-muskler jämfört med soleusmuskeln (figur 2) som också tidigarerapporterats 13,19. Således ökade glukosupptaget med ~ 2 och ~ 2,5 gånger och nådde 14 och 22 μmol / g protein / h i soleus respektive EDL-muskler som svar på elektriskt inducerade sammandragningar. Figur 3 visar maximal muskelkraftsproduktion i soleus- och EDL-muskler under 10 minuters stimuleringsperiod. Som sett och tidigare rapporterat19 genererar EDL-muskeln mer kraft (225 mN i EDL jämfört med 150 mN i soleus) under den första delen av stimuleringsperioden. Å andra sidan uppvisar EDL-muskeln en snabbare nedgång i kraftproduktionen jämfört med soleusmuskeln senare under stimuleringsperioden. Dessa fynd beror sannolikt på skillnaden i fibertypfördelning mellan soleus (typ 1 > typ 2) och EDL (typ 2 > typ 1) muskel25 eftersom typ 2-fibrer genererar mer kraft men trötthet snabbare jämfört med typ 1-fibrer26,27.

För att utvärdera effekten av insulin och sammandragning på intracellulär signalering i isolerad soleus- och EDL-muskel utfördes fosforylering av Akt Thr308, TBC1-domänfamiljemedlem 4 (TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 och acetyl-CoA-karboxylas (ACC) Ser212 med western blotting-tekniken (Figur 4). Som förväntat inducerade den submaximalt och maximalt effektiva insulinkoncentrationen en ökning av fosforyleringen av Akt Thr308 och TBC1D4 Ser588 medan sammandragningen inducerade en ökning av fosforyleringen av AMPKα Thr172 och ACC Ser212. Varken insulin eller sammandragning ledde till en förändring av det totala proteininnehållet i Akt2, TBC1D4, AMPKα2 och ACC i soleus- och EDL-muskler (figur 4).

Genom att undersöka olika markörer för metabolisk livskraft hos inkuberad soleus och EDL-muskel observerade vi en total minskning av nivåerna av adenosinnukleotider (ATP, ADP, AMP) (~ 15-25%) samt kreatin (~ 10-35%) oavsett om musklerna inkuberades i närvaro av pyruvat eller glukos jämfört med icke-inkuberade muskler (tabell 1 ). Å andra sidan förhindrades minskningen av glykogennivåerna som observerades i soleus- och EDL-muskler inkuberade med pyruvat om musklerna inkuberades med glukos. Intressant nog observerade vi dock att inosinmonofosfatnivåerna (IMP) ökade flera gånger men endast i inkuberad soleusmuskel. IMP-nivåer ökar vanligtvis i muskler under svår metabolisk stress när muskeln försöker förhindra AMP-ackumulering genom att omvandla AMP till IMP för att upprätthålla ATP / ADP-förhållandet28. Detta indikerar att soleusmuskeln är något mer metaboliskt stressad jämfört med EDL-muskeln under inkubation. Denna uppfattning stöds också av fynd av förhöjd AMPKα Thr172 och ACC Ser212 fosforylering i soleusmuskeln inkuberad med pyruvat (Figur 5). Viktigt är att den observerade ökningen av IMP-nivåer samt AMPKα Thr172 och ACC Ser212 fosforylering minskar när soleusmuskeln inkuberas med glukos. Därför verkar det fördelaktigt att inkubera isolerad skelettmuskel i en glukosinnehållande buffert för att minimera fluktuationer i adenosinnukleotider och förhindra en minskning av muskelglykogen när musklerna inkuberas under en längre tid. När det gäller 2-deoxiglukosupptag har vi bevis som tyder på att inkubation av muskler i 6 till 8 timmar i närvaro av pyruvat kommer att öka basala / vilande glukosupptagningshastigheter. Inkubation av muskler i ett medium som innehåller glukos verkar förhindra en sådan ökning av glukosupptaget (opublicerade data).

Figure 1
Figur 1: Inkubationssystem. (A) Myografsystem med fyra enkla inkubationskammare. (B) Anpassade inkubationskrokar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Glukosupptag i isolerade mogna skelettmuskler från möss. 2-deoxiglukosupptag bestämdes i isolerade soleus- (svarta stänger) och EDL-muskler (grå stänger) som svar på en submaximt effektiv insulinkoncentration (100 μU / ml), en maximalt effektiv insulinkoncentration (10 mU / ml) och elektriskt inducerade sammandragningar (0,2 ms puls, 100 Hz, 1 s / 15s, 30 V, 10 min). Data analyserades av studenter t test inom varje grupp. ###p<0.001, ##p<0.01 vs. soleus muskel. Värden är medel ± SEM. n = 4-6 per grupp. h, timme. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Muskelkraftskurvor som svar på elektriskt inducerade sammandragningar. Toppkraftsproduktionen under elektrisk stimulering beräknades för soleus (svarta prickar) och EDL (grå prickar) muskeln. Varje enskilt värde motsvarar ett genomsnitt av de sista 500 ms av varje 1-s stimuleringsperiod. Värden är medel ± SEM. n = 5-6 per grupp. s, för det andra. mN, milli-Newton. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Representativa västra fläckar av Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 och ACC Ser212 fosforylering samt Akt2, TBC1D4, AMPKα2 och ACC protein. Western blot-analyser utfördes på mussulaus- och EDL-muskelproverna som beskrivs i figur 2. B, basal. S, submaximellt effektivt insulin. M, maximalt effektivt insulin. C, sammandragning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Representativa västra fläckar av AMPKα Thr172 och ACC Ser212 fosforylering samt AMPKα2 och ACC protein. Western blot-analyser utfördes på musens soleus- och EDL-muskelprover som beskrivs i tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna figur.

icke-inkuberad Inkuberad 1h med pyruvat Inkuberad 1h med glukos Huvudsakliga effekter Interaktion
Soleus EDL Soleus EDL Soleus EDL
Laktat 1.00 ± 0.01 1.00 ± 0.02 0.96 ± 0.03 0.98 ± 0.02 1.05 ± 0.01 0.99 ± 0.01 - -
Hp 1.00 ± 0.04 1,00 ± 0,06 0,64 ± 0,07 ### 0,76 ± 0,05 ### 0,76 ± 0,07 ## 0.88 ± 0.09 ## p < 0,001 -
PCr 1.00 ± 0.19 1,00 ± 0,06 0,80 ± 0,12 1.13 ± 0.14 0,65 ± 0,31 0,75 ± 0,08 - -
PCr/(Cr + PCr) 1.00 ± 0.20 1.00 ± 0.07 1.17 ± 0.11 1.25 ± 0.12 0,78 ± 0,36 0,92 ± 0,11 - -
ATP 1.00 ± 0.03 1.00 ± 0.02 0,72 ± 0,03 ###,§§§ 0,99 ± 0,03 * 0,81 ± 0,06 ### 0,85 ± 0,04 ## - p < 0,001
ADP 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.04 0.75 ± 0.05 ### 0.92 ± 0.03 ### 0.84 ± 0.04 ## 0,86 ± 0,03 ## p < 0,001 -
AMPERE 1,00 ± 0,11 1.00 ± 0.12 0,85 ± 0,15 0,79 ± 0,13 0,84 ± 0,18 0,75 ± 0,13 - -
BUSFRÖ 1.00 ± 0.17 1.00 ± 0.30 4.43 ± 0.67 ###,§§§ 0,72 ± 0,29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1.08 ± 0.01 - p < 0,001
AMP/ATP-förhållande 1.00 ± 0.12 1,00 ± 0,13 1.18 ± 0.22 0,81 ± 0,16 1.06 ± 0.23 0,90 ± 0,19 - -
Glykogen 1.00 ± 0.08 1.00 ± 0.12 0,74 ± 0,07 (#),* 0,80 ± 0,12 (#),* 1.12 ± 0.10 1.10 ± 0.03 p = 0,035 -
pAMPK Thr172 / AMPKα2 1.00 ± 0.10 1.00 ± 0.12 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ 1,55 ± 0,27 1.68 ± 0.19 # 1.36 ± 0.19 - p = 0,002
pACC Ser212 / ACC 1.00 ± 0.18 1.00 ± 0.12 2.22 ± 0.58 ###,**,§§ 0,96 ± 0,21 0,99 ± 0,15 0,83 ± 0,09 - p = 0,030

Tabell 1: Jämförelse av metabolisk livskraft hos mus soleus och EDL-muskler inkuberade i 1 timme i närvaro av 2 mM pyruvat eller 5 mM glukos. Icke-inkuberade muskler dissekerades från bedövade och matade djur innan de frystes i flytande kväve. Separata muskler inkuberades i 1 timme i KRH-buffert kompletterad med BSA (0,1%), Na-pyruvat (2 mM) och D-mannitol (8 mM) medan andra inkuberades i 1 timme i KRH-buffert kompletterad med BSA (0,1%), D-glukos (5 mM) och D-mannitol (5 mM) innan de frystes i flytande kväve. Data omvandlades till relativa enheter för att markera observerade förändringar i olika markörer för metabolisk livskraft. Absoluta värden från icke-inkuberade mus soleus och EDL muskler ges nedan. Laktat (mmol/kg w.w): 137,53soleus; 139.05EDL. Cr (mmol/kg w.w): 9,35soleus; 8.98EDL. PCr (mmol/kg w.w): 1,50soleus; 5.20EDL. PCr/(PCr+Cr): 13,98soleus; 37.30EDL. ATP (mmol/kg w.w): 3,07soleus; 4.24EDL. ADP (mmol/kg w.w): 0,60soleus; 0,51EDL. AMP (mmol/kg w.w): 0,18soleus; 0,08EDL. IMP (mmol/kg w.w): 0,07soleus; 0,14EDL. AMP/ ATP-förhållande: 0,06soleus; 0,02EDL. Glykogen (pmol/μg protein): 77,01soleus; 67.56EDL. Data analyserades av en tvåvägs ANOVA inom varje grupp. ###p<0.001, ##p<0.01 och #p<0.05 jämfört med icke-inkuberade. p<0.001, **p<0.01 och *p<0.05 vs inkuberad 1 timme med glukos. §§§p<0.001, §§p<0.01 och §p<0.05 vs EDL. Värden är medel ± SEM. n = 12 i icke-inkuberad grupp, n = 4-6 i inkuberade grupper. Cr, kreatin; PCr, fosfokreatin; w.w, våt vikt; h, timme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intakt reglering av glukosupptag i skelettmuskeln är viktigt för att bevara den allmänna hälsan1. Således fungerar undersökning av muskelglukosupptag ofta som en primär avläsning vid utvärdering av olika hälsoförändrande ingrepp. Här beskriver vi en ex vivo-metod för att mäta glukosupptag i isolerade och inkuberade soleus- och EDL-muskler från möss som svar på insulin och elektriskt inducerade sammandragningar. Metoden är snabb och tillförlitlig och möjliggör en exakt kontroll av den omgivande miljön i den inkuberade muskeln som möjliggör noggranna undersökningar av muskelglukosupptagshastigheter isolerade från den potentiellt förvirrande påverkan av hormoner och substrat som finns i blodet. Metoden har använts i flera år i många studier och är allmänt antagen av muskelforskadesamhället.

Ex vivo-inkubationsmodellen har i allmänhet ansetts vara en metod för att bedöma glukostransportkapacitet snarare än glukosupptag i skelettmuskeln. Glukostransportkapacitet i inkuberad muskel kan bestämmas genom att mäta ackumulerad D-glukos under en tidsperiod. Detta utgör dock ett problem eftersom D-glukos snabbt metaboliseras i muskelcellen efter upptag. För att kringgå detta problem har glukosanalogen 3-O-metyl-D-glukos (3-MG) använts i stor utsträckning för att bedöma glukostransportkapaciteten, eftersom 3-MG inte metaboliseras ytterligare inuti cellen efter att ha transporterats över cellytans membran. Således tjänar den initiala hastigheten för intracellulär ackumulerad 3-MG som ett index för cellulär glukostransportkapacitet i sig eftersom den inte påverkas av andra steg i glukosmetaboliska vägar. Användningen av 3 MG kan emellertid utgöra ett problem eftersom 3-MG kommer att ackumuleras och därigenom minska transmembrangradienten för 3-MG och därefter minska ytterligare upptag. För att erhålla ett mått på membrantransportkapaciteten måste således den initiala hastigheten för 3 MG upptag uppskattas. I synnerhet när transportkapaciteten är hög kan detta utgöra ett problem på grund av utflöde av 3-MG från muskeln29,30. Det potentiella problemet med 3 MG efflux kan undvikas med 2-deoxi-D-glukos (2-DG). Efter transport till skelettmuskeln fosforyleras 2-DG av hexokinas II till 2-deoxi-D-glukos-6-fosfat (2-DG-6P). Eftersom skelettmuskeln saknar glukos-6-fofatas och GLUT4 inte kan transportera fosforylerad 2-DG, kommer 2-DG-6P att fångas i muskelcellen. Till skillnad från glukos-6-fosfat är 2-DG-6P en mycket svag allosterisk hämmare av hexokinas II30 som hjälper till att upprätthålla transmembrangradienten för 2-DG. Således har observationer visat att 2-DG-upptaget i inkuberad (råtta) muskel förblir linjär tills den intracellulära 2-DG-6P-koncentrationen överstiger 30 mM, en koncentration som sänker hexokinas II-aktiviteten30. Dessutom förblir upptaget i inkuberad musskelettmuskel 2-DG linjärt i ~ 30 min när temperaturen på inkubationsbuffertarna är 37 ° C eller mindre31. Detta tyder på att 2-DG kan användas för att mäta glukostransportkapacitet snarare än glukosupptag i inkuberade muskler, med undantag för situationer där 2-DG-6P-koncentrationer blir mycket höga (t.ex. observerade under inkubationer >2 timmar med 1 mM 2-DG och en maximal insulinkoncentration29,30). Tanken att 2-GD-upptag sannolikt återspeglar glukostransportkapacitet stöds också av fynd som visar att maximalt insulinstimulerat 2-DG-upptag är likartat i inkuberade muskler från vilda möss och möss som överuttrycker hexokinas II32. En potentiell oro vid användning av 2-DG för muskelglukostransportmätningar under sammandragning är en ökning av den intracellulära glukos-6-fosfatkoncentrationen på grund av en förhöjd glykogenolyshastighet. Eftersom en linjär ökning av (råtta) muskel 2-DG-upptag observeras under sammandragning över tid29, indikerar detta att ackumuleringen av glukos-6-fosfat från nedbrytningen av glykogen under sammandragning inte stör hexokinas II-aktiviteten och därmed 2-GD-upptagshastigheter. Baserat på detta verkar 2-DG väl lämpad för mätningar av glukostransport i isolerad skelettmuskel under insulin och sammandragning med tanke på begränsningarna av 3-MG.

Även om det allmänt antas att 2-DG inte metaboliseras ytterligare efter fosforylering av hexokinas II, har det rapporterats att vissa 2-DG riktas mot och införlivas i muskelglykogen. Således, under en 2 h normoglykemisk hyperinsulinemisk klämma hos råttor ~ 30% av 2-DG som tas upp av skelettmuskeln införlivas i glykogen33. Därför kan det resoneras att frekvensen av insulinstimulerat 2-DG-upptag i inkuberad skelettmuskel underskattas om ackumulering av 2-DG i glykogen försummas. Vi har fastställt att det här beskrivna protokollet om hur man förbereder muskellysat (supernatant) för efterföljande analyser av 2-GD-upptagshastigheter i tidigare inkuberade skelettmuskler inte påverkas av den potentiella införlivandet av 2-DG i glykogen. Det kan hävdas att glykogen ackumuleras i pelletsen vid centrifugering av hela muskelhomogenat för att generera lysat för 2-DG upptagsmätningar. Men när vi jämför nivåerna av radioaktivitet i insulinstimulerat hela muskelhomogenat kontra lysat upptäcker vi ingen signifikant skillnad (opublicerade data). Detta tyder på att inkubation av musmuskel i 10 min i 1 mM av 2-DG inte orsakar en detekterbar ackumulering av 2-DG i glykogen.

Bestämning av skelettmuskel 2-DG-upptag utan att ta hänsyn till att 2-DG distribueras i både det extra- och intracellulära utrymmet kommer att leda till en överskattning av 2-DG-upptaget. För att kringgå detta bör L-glukos användas som en extracellulär markör eftersom detta inte transporteras över cellmembranet men annars uppvisar liknande egenskaper som D-glukos inklusive massa, löslighet, passiv diffusion, bindning etc. På grund av de överdrivna kostnaderna för tillverkning och därmed inköp av L-glukos används mannitol vanligtvis som en extracellulär markör eftersom mannitol inte tas upp av muskelcellen, är relativt billigt och uppskattas ha en något liknande extracellulär distributionsvolym som glukos och 2-DG34.

Inneboende cellulära och molekylära klockor verkar spela en viktig roll för reglering av helkroppsmetabolism och energihomeostas35. Det har observerats att muskelspecifik knockout av kärnklockgenen Bmal1 försämrar insulinstimulerat glukosupptag i isolerad musskelettmuskel36. Vidare uppvisar submaximalt insulinstimulerat glukosupptag av isolerad skelettmuskel dygnsrytm med det lägsta och högsta insulinsvaret i mitten av den ljusa respektive mörka fasen, 37. Baserat på dessa resultat är det därför viktigt att införliva tiden för djuroffer i den experimentella designen för att öka reproducerbarheten av data.

En stor nackdel med ex vivo-metoden är bristen på kapillärflöde i den isolerade muskeln. Detta innebär att leverans och borttagning av olika substrat helt beror på enkel diffusion mellan muskelfibrerna och den omgivande miljön. Följaktligen har validering av den metaboliska livskraften hos isolerad muskel inkuberad ex vivo fokuserats på diffusionsbegränsningar av syre till såväl ytliga som djupa muskelfibrer. Således tenderar inkuberad muskel, särskilt mycket metabolisk musmuskel, att utveckla hypoxiska kärnor där nedbrytning av glykogen sker 16,17,38. I en detaljerad granskning av Bonen och kollegor15 föreslogs att hypoxiska kärnor av inkuberad muskel sannolikt utvecklas när de inkuberar muskler för tjocka för att kunna syresättas ordentligt, särskilt vid inkubation vid temperaturer på ≥ 37 ° C. Detta ledde till rekommendationen att endast tunna och cylindriska musmuskler, såsom soleus och EDL, bör användas för inkubationer vid 25-30 °C för att undvika utveckling av hypoxiska kärnor. Detta indikerar att tjocklek och geometri snarare än massa är viktiga faktorer att tänka på när man inkuberar musskelettmuskler. Dessutom rekommenderades att inkubationstemperatur, muskeltjocklek samt ATP- och fosfokreatinhalt och glykogenhalt och/eller frisättning av laktat skulle mätas och rapporteras rutinmässigt för att utvärdera den inkuberade muskelns livskraft15. Såvitt vi vet har sådana fullständiga analyser av inkuberade muskler huvudsakligen rapporterats för råttmuskel 39,40,41,42 och endast i begränsad utsträckning rapporterats för musmuskel 16,17. För att öka insikten i olika metaboliska markörer för livskraft i inkuberade musskelettmuskler bedömde vi möjliga förändringar i intracellulärt innehåll av laktat, kreatin, fosfokreatin, adenosinnukleotider, glykogen och AMPK-signalering i soleus- och EDL-muskler efter 1 timmes inkubation i glukos- eller pyruvat-kompletterad KRH-buffert. I likhet med tidigare fynd i inkuberad mus soleus och EDL-muskel17 observerade vi att glykogennivåerna minskade när musklerna inkuberades i glukosfria medier. Detta indikerar att frånvaron av glukos under inkubation främjar glykogennedbrytning och efterföljande inträde av glukos-6-fosfat i glykolys som kan verka för att säkra ATP-produktionen, särskilt om syretillförseln är otillräcklig. Vidare fann vi en total minskning av ATP- och ADP-nukleotidpoolerna i inkuberad soleus- och EDL-muskel. Detta kan innebära att syretillförseln inte är helt tillräcklig för att möta efterfrågan på inkuberad musmuskel både i närvaro och frånvaro av glukos. Eftersom den oxidativa soleusmuskeln är mer beroende av syre för ATP-produktion jämfört med den glykolytiska EDL-muskeln, skulle detta tyda på att soleusmuskeln påverkas i större utsträckning av inkubationsförfarandet. I samförstånd fann vi att de intracellulära nivåerna av IMP såväl som AMPK-signalering ökade markant i soleus jämfört med EDL-muskeln när de inkuberades i frånvaro av glukos. Detta innebär att soleusmuskeln uppvisar en högre grad av metabolisk stress under inkubation, vilket måste beaktas vid utvärdering av data från ex vivo musmuskelmodellen.

Odlade muskelceller inklusive odödliga L6 och C2C12 samt primära humana myorör används ofta som surrogat för mogen skelettmuskel för att studera effekterna av olika genetiska och farmakologiska manipulationer på insulinstimulerat muskelglukosupptag. Men på flera sätt liknar odlade muskelceller inte mogna skelettmuskler och när man jämför de två modellsystemen blir många skillnader uppenbara. Dessa inkluderar skillnader i proteinuttryck, dimensionell struktur, omgivande miljö, proliferations- och differentieringstillstånd, fibertypskomposition, metaboliska processer och funktionella egenskaper43 som alla kan påverka hur muskelcellen reglerar glukosupptaget som svar på olika stimuli. Vanligtvis observeras större relativa effekter av insulin på glukosupptagningshastigheter i mogna skelettmuskler jämfört med odlade muskelceller44 vilket kan tyda på att odlade muskelceller i viss utsträckning saknar det maskineri som är ansvarigt för att reglera glukosupptagningshastigheterna, inklusive en hög uttrycksnivå för den insulinkänsliga glukostransportören GLUT443 . Med tanke på de begränsningar och försiktighetsåtgärder som är förknippade med användningen av antingen odlade muskelceller och isolerade skelettmuskler är det därför sannolikt fördelaktigt att ta ett kombinerat tillvägagångssätt när man studerar olika muskelmetaboliska processer såsom glukosupptag.

Soleus- och EDL-muskler anses vanligtvis vara representativa för långsamma respektive snabba ryckmuskler. Därför är dessa muskeltyper idealiska för mekaniska studier som försöker undersöka interventioner som påverkar muskelkraft och trötthetsutveckling. Dessutom rapporteras soleusmuskeln vanligtvis ha förbättrad insulinkänslighet och lyhördhet jämfört med EDL-muskler och därmed kan interventioner som riktar sig mot muskelinsulinkänslighet påverka soleus och EDL annorlunda. Dessutom skiljer sig den relativa fördelningen av de olika AMPK-komplexen mellan soleus- och EDL-muskeln som verkar påverka förmågan hos AMPK-aktiverande föreningar att öka muskelglukosupptaget. Således uppnås sannolikt den största insikten i regleringen av muskelglukosupptaget om både soleus- och EDL-musklerna används under experiment med ex vivo-inkubationsmodellen.

Den här beskrivna metoden relaterar glukosupptaget till mängden totalt proteinöverflöd som bestäms i varje muskelprov efter homogenisering. Det är vår erfarenhet att variationen minskar när man relaterar glukosupptag per mängd muskelprotein istället för muskelvikt (opublicerade data). Vidare gör homogenisering av muskelprover i en buffert som används för olika biokemiska analyser det möjligt att bestämma både glukosupptag, myocellulär signalering och enzymaktiviteter i samma provberedning45,46. Detta kommer ofta att minska mängden möss som används för en studie. Ändå kan glukosupptaget lätt bestämmas i skelettmuskelprover som löses genom uppvärmning i natriumhydroxid (NaOH) följt av neutralisering med väteklorid20. Eftersom behandling av muskler med NaOH stör mätningar av total muskelproteinkoncentration, måste glukostransport mätt med denna procedur relateras till muskelvikt.

Baserat på olika optimeringar innehåller vår glukosupptagningsinkubationsbuffert en specifik aktivitet på 0,028 MBq/ml [3H]2-deoxi-D-glukos och 0,0083 MBq/ml [14C]Mannitol. Å ena sidan sänker detta mängden lysat (150 av 400 μL) som behövs för att få tillräckliga och tillförlitliga radioaktivitetsmätningar. Å andra sidan ökar mängden radioaktivt [3H] 2-deoxi-D-glukos och [14C] mannitol som behövs för varje experiment, vilket ökar experimentella kostnader. För alla experimentella inställningar är det således möjligt att reglera mängden radioaktivitet som används i glukosupptagningsekubationsmediet för att passa specifika krav. Man måste dock se till att inte minska mängden radioaktivitet i inkubationsbufferten i en utsträckning som gör radioaktivitetsmätningar otillförlitliga. Detta säkerställs genom att radioaktiviteten i prover hålls högre än de angivna detektionsgränserna för de maskiner för vätskescintillationsräkning som används.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av anslag från det danska rådet för oberoende forskning - medicinska vetenskaper (FSS8020-00288B) och Novo Nordisk Foundation (NNF160C0023046). Detta arbete stöddes också av ett forskningsanslag till Rasmus Kjøbsted från Danska Diabetesakademin, som finansieras av Novo Nordisk Foundation, anslagsnummer NNF17SA0031406. Författarna vill tacka Karina Olsen, Betina Bolmgren och Irene Bech Nielsen (Institutionen för kost, motion och idrott, Naturvetenskapliga fakulteten, Köpenhamns universitet) för deras skickliga tekniska bistånd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
  2. Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), Pt 1 230-235 (1983).
  3. Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
  4. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  5. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
  6. Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
  7. Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
  8. Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
  9. Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
  10. Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
  11. Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5'-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
  12. Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
  13. Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
  14. Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
  15. Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
  16. van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
  17. Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
  18. Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
  19. Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
  20. Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
  21. Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
  22. Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
  23. Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
  24. Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
  25. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
  26. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
  27. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
  28. Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
  29. Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), Pt 1 184-191 (1998).
  30. Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
  31. Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
  32. Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
  33. Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
  34. Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
  35. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
  36. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
  37. Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
  38. Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
  39. Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
  40. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  41. Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
  42. Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), Pt 1 154-160 (1991).
  43. Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
  44. Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
  45. Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
  46. Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).

Tags

Biologi utgåva 171 skelettmuskulatur glukostransport glukosupptag insulinkänslighet sammandragning explant ex vivo in vitro inkubation radioaktiva glukosspårämnen 2-deoxi-D-glukos
Mätning av insulin- och sammandragningsstimulerat glukosupptag i isolerade och inkuberade mogna skelettmuskler från möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter