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Biology

Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

A regulação intacta da absorção de glicose muscular é importante para manter a homeostase de glicose corporal inteira. Este protocolo apresenta avaliação da absorção de glicose estimulada pela insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado ao delinear o impacto de várias intervenções fisiológicas em todo o metabolismo da glicose corporal.

Abstract

O músculo esquelético é um tecido responsivo à insulina e normalmente ocupa a maior parte da glicose que entra no sangue após uma refeição. Além disso, foi relatado que o músculo esquelético pode aumentar a extração de glicose do sangue em até 50 vezes durante o exercício em comparação com as condições de repouso. O aumento da absorção de glicose muscular durante o exercício e estimulação da insulina depende da translocação do transportador de glicose 4 (GLUT4) de compartimentos intracelulares para a membrana da superfície celular muscular, bem como fosforilação da glicose para glicose-6-fosfato por hexokinase II. Isolamento e incubação de músculos do camundongo como m. soleus e m. extensor digitorum longus (EDL) é um modelo ex vivo apropriado para estudar os efeitos da insulina e contração eletricamente induzida (um modelo para exercício) na absorção de glicose no músculo esquelético maduro. Assim, o modelo ex vivo permite a avaliação da sensibilidade à insulina muscular e possibilita a combinação da produção de força muscular durante a contração, garantindo o recrutamento uniforme de fibras musculares durante as medições da absorção de glicose muscular. Além disso, o modelo descrito é adequado para testes compostos farmacológicos que podem ter um impacto na sensibilidade à insulina muscular ou podem ser de ajuda ao tentar delinear a complexidade regulatória da absorção de glicose muscular esquelética.

Aqui descrevemos e fornecemos um protocolo detalhado sobre como medir a absorção de glicose estimulada por insulina e contração em preparações musculares isoladas e incubadas de soleus e EDL de camundongos usando radiolabeled [3H]2-deoxy-D-glicose e [14C]mannitol como um marcador extracelular. Isso permite uma avaliação precisa da absorção de glicose no músculo esquelético maduro na ausência de fatores de confusão que possam interferir no modelo animal intacto. Além disso, fornecemos informações sobre a viabilidade metabólica do músculo esquelético do camundongo incubado sugerindo que o método aplicado possui algumas ressalvas sob certas condições ao estudar o metabolismo da energia muscular.

Introduction

O músculo esquelético possui a capacidade de extrair grandes quantidades de glicose do espaço extracelular em resposta à insulina e ao exercício. Isso ajuda a manter a homeostase de glicose do corpo inteiro e garante a oferta de glicose em tempos de alta demanda energética. Uma vez que a regulação intacta da absorção de glicose muscular esquelética tem se mostrado importante para a saúde geral e o desempenho físico 1,2, as medidas de absorção de glicose muscular durante várias condições têm recebido muita atenção. Em humanos e animais, o grampo hiperinsulinemico-euglicícmico tem sido usado como técnica padrão-ouro para avaliar a sensibilidade à insulina in vivo 3,4. Em contraste com os achados obtidos a partir de um teste de tolerância à glicose oral, a técnica de grampo hiperinsulinem-euglicícica não requer função gastrointestinal intacta ou secreção de insulina do pâncreas e, portanto, permite que as respostas à insulina sejam comparadas entre indivíduos que apresentam variações na função gastro-intestinal e/ou pancreática. As medidas de absorção de glicose muscular in vivo durante o exercício em humanos têm sido realizadas com frequência desde a décadade 1960 5. Primeiro pelo uso de técnicas de equilíbrio arteriovenoso6 e posteriormente pelo uso de tomografia de emissão de pósitrons (PET) em combinação com um pósitron emissor de glicose análogo por exemplo 18F-Fluoro-deoxy-glicose7. Em roedores, a absorção de glicose muscular estimulada pelo exercício in vivo é tipicamente realizada pelo uso de análogos de glicose radioativo ou estável rotulados 8,9,10.

Um método complementar às medidas de absorção de glicose muscular in vivo, é isolar e incubar pequenos músculos de roedores e, posteriormente, medir a absorção de glicose usando análogos de glicose radioativos ou estáveisrotulados 11,12,13. Este método permite quantificação precisa e confiável das taxas de absorção de glicose no músculo esquelético maduro e pode ser realizado na presença de várias concentrações de insulina e durante a contração provocada por estimulação elétrica. Mais importante, as medidas de absorção de glicose em músculo esquelético isolado e incubado são relevantes na investigação do fenótipo metabólico muscular dos camundongos que passaram por diversas intervenções (por exemplo, nutrição, atividade física, infecção, terapêutica). O modelo muscular esquelético isolado também é uma ferramenta adequada para testes compostos farmacológicos que podem afetar a absorção de glicose por si só e/ou modificar a sensibilidade à insulina12,14. Desta forma, a eficácia dos compostos projetados para regular o metabolismo da glicose muscular pode ser testada e avaliada em um meio altamente controlado antes do teste in vivo subsequente em modelos pré-clínicos de animais.

Em algumas condições, a viabilidade metabólica pode representar um desafio no sistema de modelo muscular esquelético isolado e incubado. De fato, a falta de um sistema circulatório nos músculos incubados implica que a entrega de substratos (por exemplo, oxigênio e nutrientes) depende totalmente da simples difusão entre as fibras musculares e o ambiente circundante. Em relação a isso, é importante que os músculos incubados sejam pequenos e finos e, portanto, representem menos uma barreira para a difusão de oxigênio durante a incubação15. Especialmente durante incubações prolongadas por várias horas, estados hipóxicos podem se desenvolver devido ao suprimento insuficiente de oxigênio, resultando em esgotamento de energia muscular15. Embora vários marcadores de viabilidade metabólica no músculo de rato incubado tenham sido relatados anteriormente, juntamente com a identificação de variáveis importantes que ajudam a manter a viabilidade muscular do rato15, uma avaliação abrangente da viabilidade metabólica em pequenos músculos de camundongos incubados ainda é justificada. Assim, atualmente, o teor de glicogênio tem sido usado principalmente como marcador de viabilidade metabólica no músculo esquelético do camundongo incubado16,17.

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para medir a absorção de glicose basal, insulina e contração em sola isolada e incubada e músculo EDL de camundongos usando radiolabeled [3H]2-deoxy-D-glicose e [14C]mannitol como um marcador extracelular. No presente estudo, a absorção de glicose foi medida durante um período de 10 minutos e o método é apresentado com o uso de concentrações de insulina submaxisticamente e maximamente eficazes, bem como um único protocolo de contração. No entanto, os protocolos aqui descritos podem ser facilmente modificados no que diz respeito ao tempo de incubação, daagem de insulina e protocolo de estimulação elétrica. Além disso, fornecemos uma caracterização completa de vários marcadores de viabilidade metabólica em soleus incubado e músculo do rato EDL. Os resultados indicam que a suplementação de glicose no tampão de incubação é essencial para preservar a viabilidade metabólica do músculo incubado por 1 hora.

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Protocol

Os procedimentos envolvendo animais de pesquisa devem ser realizados de acordo com as diretrizes pertinentes e a legislação local. Todos os experimentos animais utilizados para este estudo cumpriram a Convenção Europeia para a Proteção de Animais vertebrados utilizados para fins experimentais e outros científicos e foram aprovados pela Inspetoria dinamarquesa de Experimentos Animais.

1. Preparação do aparelho experimental e loops de sutura

NOTA: Para este estudo, utilize um sistema de miógrafo de tira muscular integrada com ganchos de incubação personalizados para incubar músculos esqueléticos isolados do camundongo (Figura 1). Este sistema permite que os músculos se banam em uma solução fisiológica com oxigenação contínua (95% O2 e 5% DE CO2) e em temperatura constante. O banho de tecido muscular é acoplado a um transdutor de força para a medição da produção de força muscular durante a contração. Para obter e registrar respostas miomecânicas durante a contração, empregue um estimulador de pulso elétrico e um programa de coleta de dados, respectivamente. Estimule os músculos incubados a contrair por eletrodos de platina posicionados centralmente e em ambos os lados do músculo.

  1. Ligue o sistema de miógrafo e as câmaras quentes a 30 °C. Abra o software de coleta de dados compatível com o sistema de miógrafo e calibrar transdutores de força para garantir a comparabilidade entre conjuntos de dados.
  2. Comece cortando ~16 cm de fios de sutura cirúrgica não absorvível de nylon. Use fórceps para criar um laço de aproximadamente 0,4 cm de diâmetro a partir de um único fio. Repita isso até que loops suficientes tenham sido produzidos. Cada músculo precisa de duas voltas - uma para o proximal e outra para o tendão distal.

2. Elaboração de soluções e mídia de incubação

  1. Preparação de mídia basal de incubação
    1. Preparar as seguintes soluções de estoque: cloreto de sódio de 2,5 M (NaCl, 250 mL), bicarbonato de sódio de 0,5 M (NaHCO3, 250 mL), cloreto de potássio de 0,5 M (KCl, 50 mL), 0,25 M de cloreto de cálcio (CaCl2, 50 mL), 0,25 M de fosfato de dihidrogênio de potássio (KH2PO4, 50 mL), 0,25 Sulfato de magnésio (MgSO4, 50 mL), pirugem de sódio de 110 mM (Na-Pyruvate 100 mL), 500 mM D-mannitol (100 mL), 1 M 2-desoxy-D-glicose (4 mL), solução de 15% de albumina bovina (BSA) dialisada contra tampão Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) (descrito abaixo na etapa 4) (100 mL).
      NOTA: Duas soluções são necessárias para medir o repouso e a absorção de glicose estimulada pela contração. Além disso, cada concentração de insulina usada para avaliar a absorção de glicose estimulada pela insulina requer duas soluções. Assim, no total, seis soluções diferentes são necessárias para medir a insulina basal, submaximal, insulina máxima e absorção de glicose estimulada por contração em músculo esquelético isolado do camundongo. A seguir, "mídia basal de incubação" refere-se à mídia sem insulina ou rastreadores radioativos. 'Mídia de incubação' refere-se a meios de comunicação contendo insulina. "Mídia de incubação de glicose" refere-se a meios de comunicação contendo 2-desóxi-D-glicose e rastreadores radioativos, além de insulina em uma concentração idêntica à usada na "mídia de incubação".
    2. Prepare um buffer KRH suplementando água ultrapura (ddH2O) com NaCl (117 mM), NaHCO3 (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl2 (2,5 mM), KH2PO4 (1,2 mM) e MgSO4 (1,2 mM). Posteriormente, gase o buffer KRH com 95% de O2 e 5% de CO2 por pelo menos 10 min. O pH desejado do buffer KRH deve estar entre 7,35-7,45 a 30 °C. Se o ajuste de pH for realizado à temperatura ambiente, o pH do buffer KRH deve ficar entre 7,25-7,35.
    3. Adicione BSA (0,1%), Na-Pyruate (2 mM) e D-mannitol (8 mM) ao buffer KRH ajustado a gás e pH para completar a mídia de incubação basal. Armazene mídia basal em um recipiente selado para minimizar a desgasificação de O2 e CO2 e coloque a mídia a 30 °C.
      NOTA: Normalmente, a osmolaridade dos suplementos KRH (ou seja, Na-Pyruato, D-Mannitol e D-glicose) é mantida constante em todo um experimento para evitar o encolhimento ou expansão das células musculares. O protocolo descrito aqui usa uma osmolaridade de 10 mM para os suplementos KRH. Se for necessário um tampão contendo glicose, substitua os suplementos KRH para atender às necessidades, por exemplo, 5 mM D-glicose e 5 mM D-mannitol.
    4. Para evitar possíveis contaminantes associados à BSA no buffer de incubação, dilyze BSA contra KRH.
      1. Para fazer uma solução de estoque BSA de 15% diálisada contra o buffer KRH, comece dissolvendo 300 g de BSA sem gordura de grau analítico em 900 mL de buffer KRH. Em seguida, ferva o tubo de diálise em água relítila até que a tubulação esteja macia.
      2. Encha o tubo com a solução BSA-KRH e proteja as extremidades do tubo. Coloque a tubulação com BSA-KRH em 5 L de buffer KRH e deixe-a durante a noite a 4 °C. No dia seguinte substitua o buffer KRH e deixe a tubulação com BSA-KRH no buffer KRH durante a noite a 4 °C.
      3. Por fim, colete a solução BSA-KRH da tubulação e adicione o buffer KRH a um volume final de 2 L (ou seja, 15% de solução de estoque BSA-KRH). Divida a solução de estoque BSA-KRH de 15% em alíquotas e armazene no congelador a ~-20 °C.
  2. Preparação de meios de incubação contendo insulina
    1. Para a mídia de incubação contendo uma concentração de insulina submaximicamente eficaz, adicione 1 μL de uma solução de estoque de insulina de 100 mU/mL por mL de mídia basal de incubação (100 μU/mL insulina).
    2. Para a mídia de incubação contendo uma concentração de insulina extremamente eficaz, adicione 1 μL de uma solução de estoque de insulina U/mL de 10 U/mL por mL de mídia basal de incubação (insulina de 10 mU/mL).
  3. Preparação de mídia de incubação de captação de glicose
    ATENÇÃO: O manuseio de material radioativo só é permitido em área restrita e controlada por pessoas autorizadas e algumas universidades, instituições de pesquisa e empresas podem exigir a aquisição de uma "Licença de Uso da Radioatividade". O material e o lixo devem ser tratados de acordo com os procedimentos, diretrizes e legislações locais adequados.
    1. Siga o mesmo procedimento descrito na seção 2.1.2.
    2. Adicionar BSA (0,1%), Na-Pyruate (2 mM), D-mannitol (7 mM) e 2-desoxi-D-glicose (1 mM) ao tampão KRH ajustado a gás e pH.
    3. Adicione [3H]2-desoxy-D-glicose (0,028 MBq/mL) e [14C]mannitol (0,0083 MBq/mL) ao tampão KRH suplementado para completar a mídia de incubação de captação de glicose. Armazenar a 30 °C. Se [3H]2-desoxi-D-glicose e [14C]mannitol forem dissolvidos no etanol remova o etanol por evaporação mediada N2 antes de usar.
    4. Para a mídia de incubação de captação de glicose contendo uma concentração de insulina submaximally eficaz, adicione 1 μL de uma solução de estoque de insulina de 100 mU/mL por mL de mídia de incubação de glicose (100 μU/mL insulina).
    5. Para a mídia de incubação de glicose contendo uma concentração de insulina extremamente eficaz, adicione 1 μL de uma solução de estoque de insulina de 10 U/mL por mL de mídia de incubação de glicose (insulina de 10 mU/mL).

3. Animais e dissecção do soleus do camundongo e músculo EDL para incubação

NOTA: Os procedimentos envolvendo animais de pesquisa devem ser realizados de acordo com as diretrizes pertinentes e a legislação local. O procedimento descrito pode ser usado com camundongos machos e fêmeas criados internamente ou comercialmente disponíveis de várias cepas e origens genéticas. O procedimento a seguir é fornecido para camundongos C57Bl/6J alimentados com mulheres. Em média, os camundongos tinham 19 semanas e pesavam 25 g. Os ratos foram mantidos em um ciclo claro-escuro de 12:12 h com livre acesso à comida e água de roedores padrão. Experimentos em animais foram iniciados às ~9:00 am hora local e todos os animais foram sacrificados dentro de um período de 2h.

  1. Adicione 4 mL de mídia de incubação basal pré-aquecida (30°C) a cada câmara de incubação e certifique-se de que a mídia basal de incubação esteja continuamente oxigenada com 95% de O2 e 5% de CO2.
  2. Anestesize camundongos com injeção intraperitoneal de pentobarbital (10 mg/100 g de peso corporal) ou outra anestesia disponível (por exemplo, tribromoetanol).
    NOTA: Esteja ciente de que em alguns países pode ser necessária uma licença para lidar com medicamentos pentobarbitais e outros anestésicos. Antes que a dissecção muscular possa ser iniciada, a anestesia de cada animal deve ser devidamente induzida. Para garantir isso, os reflexos da cauda e da perna são testados. Para obter resultados ideais, a dissecção deve ser bem praticada para evitar danificar os músculos durante a remoção.
  3. Coloque camundongos anestesiados propensos a uma bandeja de dissecção (por exemplo, tampa de isopor) e fixe as patas dianteiras e traseiras, conforme necessário, usando uma agulha.
  4. Remova a pele da perna inferior e certifique-se de que tanto o tendão de Aquiles quanto a articulação do joelho estejam visíveis.
    1. Para a dissecção do músculo soleus, comece anexando um único laço de sutura ao tendão de Aquiles. Fixar um fórceps de pean no tendão de Aquiles distally do laço de sutura e cortar para liberar os músculos soleus e gastrocnemius da pata. Deslize cuidadosamente as fórceps de ervilha através do rato, expondo assim o músculo soleus.
    2. Fixar os fórceps de pean e colocar um segundo laço de sutura em torno do tendão proximal do músculo soleus. Em seguida, corte o tendão proximal e disseque soleus (incluindo os dois laços de sutura anexados) livre de músculo gastrocnemius. Coloque rapidamente o músculo soleus na câmara de incubação anexando cada laço de sutura aos respectivos ganchos.
  5. Remova a fáscia que cobre o m. tibialis anterior (TA) usando fórceps. Se feito corretamente, os tendões distais dos músculos TA e EDL devem ser claros brancos e visíveis; e separados um do outro.
  6. Corte o tendão distal do músculo TA e disseca o músculo para análises posteriores (por exemplo, genotipagem). Usando fórceps, liberte suavemente o músculo EDL dos tecidos circundantes, mas deixe o músculo intacto e não corte os tendões. Coloque uma alça de sutura em torno do tendão distal e um segundo laço de sutura em torno do tendão proximal de EDL.
  7. Em seguida, corte os tendões liberando o músculo EDL com duas alças de sutura anexadas e coloque rapidamente o músculo na câmara de incubação anexando cada laço de sutura aos respectivos ganchos. Para não perder a tensão durante a incubação e especialmente durante a contração eletricamente induzida dos músculos soleus e EDL, é de grande importância fixar os laços de sutura ao redor dos tendões com nós apertados.
  8. Por fim, eutanize o animal por luxação cervical.
  9. Quando os músculos tiverem sido dissecados e colocados em câmaras de incubação, ajuste a tensão de repouso de cada músculo para ~5 mN e pré-incubar os músculos por pelo menos 10 minutos antes de iniciar o protocolo experimental.

4. Absorção de glicose estimulada por insulina em músculo esquelético de camundongos isolado

  1. Seguindo a etapa 3.9 substitua a mídia basal de incubação por meios de incubação que não contenham insulina (mídia de incubação basal), uma concentração de insulina submaximicamente eficaz ou uma concentração de insulina extremamente eficaz e deixe nas câmaras de incubação por 20 minutos. Espaço cada câmara de incubação por 1 min, assim dando tempo para a colheita subsequente dos músculos.
  2. Ao final do período de estimulação de 20 minutos, substitua a mídia de incubação pela mídia de incubação de glicose contendo uma concentração idêntica de insulina e deixe nas câmaras de incubação por 10 minutos, novamente com 1 minuto de espaçamento entre cada câmara de incubação.
  3. Após 10 minutos de incubação na mídia de incubação de glicose, remova suavemente os músculos das câmaras de incubação e lave-os em meios de incubação basal gelado. Posteriormente, seque rapidamente os músculos no papel filtro antes que as alças de sutura sejam removidas e os músculos sejam congelados em nitrogênio líquido. É imprescindível que os músculos incubados sejam colhidos rapidamente se também se desejar investigar vários metabólitos intracelulares e sinalização proteica, além da absorção de glicose.
  4. Colete 100 μL da mídia de incubação de glicose de cada câmara de incubação e armazene-a a -20 °C. A quantidade de radioatividade nessas amostras será incluída no cálculo da absorção de glicose muscular.

5. Absorção de glicose estimulada por contração em músculo esquelético de camundongos isolado

NOTA: Para induzir a contração de músculo esquelético isolado do camundongo use o seguinte protocolo: 1 trem/15 s, cada trem de 1 s de comprimento composto por pulsos de 0,2 ms entregues a 100 Hz. No entanto, outros protocolos semelhantes que provocam contração de músculo esquelético de camundongos isolados provavelmente funcionarão também. É importante ressaltar que a tensão deve ser ajustada para gerar o desenvolvimento da força máxima do músculo incubado, que depende da configuração experimental. Se isso não for garantido, você pode correr o risco de que nem todas as fibras do músculo estejam contraindo. Por sua vez, isso pode induzir viés no conjunto de dados.

  1. Seguindo o passo 3.9 coloque os eletrodos de platina centralmente e em ambos os lados dos músculos. Inicie a contração dos músculos imediatamente após a substituição da mídia basal de incubação pela mídia de incubação de glicose. Se possível, espaço cada câmara de incubação por 1 min, assim dando tempo para a colheita subsequente dos músculos. Lembre-se de registrar a produção de força de cada músculo incubado.
  2. Após 10 minutos de contração na mídia de incubação de captação de glicose, remova os eletrodos de platina, colecione suavemente os músculos das câmaras de incubação e lave-os em meios de incubação basal gelado. Posteriormente, seque rapidamente os músculos no papel filtro antes que as alças de sutura sejam removidas e os músculos congelados em nitrogênio líquido. Todo o procedimento de colheita muscular deve ser realizado o mais rápido possível.
  3. Colete 100 μL da mídia de incubação de glicose de cada câmara de incubação e armazene-a a -20 °C. A quantidade de radioatividade nessas amostras será incluída no cálculo da absorção de glicose muscular.

6. Homogeneização e processamento muscular esquelético

NOTA: O procedimento dado abaixo para homogeneização muscular permite determinar tanto a captação de glicose quanto a sinalização miocelular por manchas ocidentais no mesmo conjunto de amostras musculares.

  1. Homogeneize cada músculo em 400 μL de tampão gelado com pH 7,5 contendo 10% de glicerol, 20 mM de sódio-pirofosfato, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM fenilmetmethylsulfonylfluofluo (dissolvida em isopropanol), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-gliceofosfato, 10 mM de flúor de sódio (NaF), 1 mM ácido ethylenodiaminatotraacetic (EDTA), 1 mM ácido glicoletherdiaminetetraactic (EGTA), 10 μg/ml aprotinina, 10 μg/mL leupepínia, 3 mM de benzamidina e 2mM de sódio-ortovanadate usando contas de aço e um tecido (2 x 45 s a 30 Hz). Gire todos os homogeneizadores de ponta a ponta por 1h a 4 °C após o qual são centrifugados a 16.000 x g por 20 min a 4 °C. Recolher o lysate (supernasce) que é usado para determinar a absorção de glicose muscular.

7. Determinação de radiolabeled 2-desoxyglucose e mannitol

  1. Adicione 150 μL de cada lise muscular e 25 μL da mídia de incubação de glicose de cada câmara de incubação para separar frascos de cintilação líquida contendo 2 mL de fluido de cintilação líquida. Além disso, prepare dois frascos de controle cego contendo apenas 3 mL de fluido de cintilação líquida. Feche todos os frascos e misture bem ao vórtice cada frasco por ~5 s.
  2. Coloque os frascos em um contador de cintilação líquida e meça radioatividade de [3H]2-desoxi-D-glicose e [14C]mannitol de acordo com as diretrizes do fabricante. Registo DPM (desintegrações por minuto) para cada frasco de cintilação líquida.

8. Cálculo das taxas de absorção de glicose muscular

  1. Use o lisato da etapa 6.1 para medir a concentração total de proteínas em cada amostra muscular usando métodos padrão de quantificação de proteínas (por exemplo, ácido bicinchonínico ou ensaios de Bradford). Calcule a quantidade de proteína (mg) adicionada a cada frasco de cintilação.
    NOTA: A taxa de absorção de glicose para cada amostra muscular é calculada subtraindo a quantidade de [3H]2-deoxy-D-glicose localizada no espaço extracelular da quantidade total de [3H]2-deoxy-D-glicose na amostra muscular usando [14C]mannitol como um marcador extracelular. Supõe-se que [3H]2-deoxy-D-glicose e [14C]mannitol apresentam propriedades de difusão semelhantes dentro do tecido muscular durante a incubação. Realize os seguintes cálculos:
  2. Comece subtraindo o DPM [3H] e [14C] das amostras de controle cego de todas as amostras de músculo e mídia.
  3. Determine o espaço extracelular muscular em μL (μL-ECS):
    [14C] MúsculoDPM / ([14C]DPM media / Mvol)
  4. Calcule a quantidade de [3H]DPM no espaço extracelular muscular ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPM media / Mvol)
  5. Calcule a quantidade de [3H]DPM no espaço intracelular muscular ([3H]DPMICS):
    [3H] MúsculoDPM− [3H]DPMECS
  6. Calcule a taxa de absorção de glicose muscular (μmol / g proteína / hora):
    [3H] DPMICS / ([3H]DPMmedia / Mvol) / [2-desoxy-D-glicose]) / mg protein) / Th
    NOTA: Para todas as equações acima,
    [14C] MúsculoDPM é a quantidade de [14C]radioatividade mannitol em uma amostra muscular;
    [14C] DPMmedia é a quantidade de [14C]radioatividade mannitol em uma amostra de mídia;
    [3H] MúsculoDPM é a quantidade de radioatividade de [3H]2-deoxy-D-glicose em uma amostra muscular;
    [3H] DPMmediaé a quantidade de [3H]2-deoxy-D-glicose radioatividade em uma amostra de mídia;
    [3H] DPMECS é a quantidade de radioatividade de [3H]2-deoxy-D-glicose no espaço extracelular muscular;
    [3H] DPMICS é a quantidade de radioatividade de [3H]2-deoxy-D-glicose no espaço intracelular muscular;
    μL-ECS é o espaço extracelular muscular em μL;
    Mvol é o volume (μL) de mídia de incubação usado para contagem de cintilação (por exemplo, '25' como mencionado acima);
    Th é o fator de tempo usado para calcular as taxas de absorção por hora (ou seja, '1/6' ao incubar músculos com mídia de absorção de glicose por 10 minutos)
  7. Leve em consideração este cálculo de exemplo. O DPM [3H] e [14C] das amostras de controle cego (17 e 6, respectivamente) foram subtraídos dos valores DPM mencionados abaixo.
    [14C] MúsculoDPM: 343
    [14C] MídiaDPM: 11846
    [3H] MúsculoDPM: 4467
    [3H] MídiaDPM: 39814
    Mvol: 25
    mg proteína: 0,396 (em 150 μL de proteína muscular lysate)
    [2-desoxi-D-glicose]: 1 (mM)
    Th: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3H] DPMECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3H] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Captação de glicose: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol/L) / 0,396 mg de proteína) / (1/6 hora) = 31,53 μmol / g proteína / hora

9. Análises de SDS-PAGE e manchas ocidentais

  1. Prepare os lises musculares soleus e EDL no tampão laemmli e aqueça por 5 min a 96 °C.
  2. Separe quantidades iguais de proteína muscular por SDS-PAGE em géis autoproclamados e transfira as proteínas para membranas de flúor de polivinida por manchas semi-secas.
  3. Posteriormente, incubar membranas em soro fisiológico tamponado por tris contendo 0,05% de Tween 20 e 2% de leite desnatado e membranas sondas com anticorpos primários e secundários relevantes.
  4. Detecte proteínas com chemiluminescência e visualize-as por um sistema de imagem digital.

10. Glicogênio muscular, nucleotídeos, lactato, creatina e fosfocreatina

  1. Use ácido polemóico para extrair amostras musculares de EDL e soleus.
  2. Posteriormente, neutralize as amostras e analise-as para lactato, creatina e fosfocreatina como descrito anteriormente18.
  3. Analise o teor de nucleotídeos em EDL e músculo soleus por HPLC de fase reversa após a extração em ácido polemóico.
  4. Determine o teor de glicogênio muscular em todo o músculo homogeneizar como unidades de glicosyl após hidrólise ácida por um método fluorométrico como descrito anteriormente18.

11. Estatísticas

  1. Realizar análises estatísticas com software de análises estatísticas.
  2. Utilize uma análise bidirecional do teste de variância (ANOVA) para avaliar diferenças estatísticas entre os valores apresentados na Tabela 1.
  3. Utilizar testes t de estudante não remunerados para avaliar diferenças estatísticas na absorção de glicose entre EDL e soleus dentro de cada grupo apresentado na Figura 2. Apresentar dados como meio ± erro padrão da média (SEM). P < 0,05 é considerado estatisticamente significante.

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Representative Results

Como mostrado na Figura 2, as taxas de absorção de glicose basal foram semelhantes entre os músculos isolados soleus e EDL de camundongos fêmeas. Isso também foi relatado várias vezes antesde 12,13,19,20. A absorção de glicose aumentou em ~0,8 e ~0,6 dobra atingindo 12 e 9 μmol/g proteína/h no músculo soleus e EDL, respectivamente, em resposta a uma concentração de insulina submaximally eficaz (100 μU/mL). Esse aumento foi ainda maior (~4 e ~2 dobras atingindo 33 e 19 μmol/g proteína/h no músculo soleus e EDL, respectivamente) quando os músculos foram estimulados com uma concentração de insulina extremamente eficaz (10 mU/mL). Além disso, tanto a absorção de glicose submaximal quanto a máxima estimulada pela insulina foram significativamente maiores no músculo soleus indicando que o músculo soleus apresenta maior sensibilidade à insulina e capacidade de resposta em comparação com o músculo EDL. Isso pode estar relacionado à maior expressão do transportador de glicose 4 (GLUT4), bem como à insulina que sinaliza a proteína transdutor quinase B (Akt) no músculo soleus em comparação com o músculo EDL 10,21,22,23,24.

A absorção de glicose induzida pela contração foi significativamente maior no músculo EDL em comparação com o músculo soleus (Figura 2), como também relatado anteriormente13,19. Assim, a absorção de glicose aumentou ~2 e ~2,5 vezes atingindo 14 e 22 μmol/g proteína/h em soleus e músculo EDL, respectivamente, em resposta a contrações eletricamente induzidas. A Figura 3 mostra a produção máxima de força muscular no músculo soleus e edl durante o período de estimulação de 10 minutos. Como visto e relatado anteriormente19, o músculo EDL gera mais força (225 mN em EDL vs. 150 mN em soleus) durante a parte inicial do período de estimulação. Por outro lado, o músculo EDL apresenta um declínio mais rápido na produção de força em comparação com o músculo soleus mais tarde no período de estimulação. Esses achados são prováveis devido à diferença na distribuição do tipo de fibra entre o soleus (tipo 1 > tipo 2) e o músculo EDL (tipo 2 > tipo 1) músculo25 como fibras tipo 2 geram mais força, mas fadiga mais rápida em comparação com as fibras tipo 126,27.

Para avaliar o efeito da insulina e contração na sinalização intracelular em soleus isolado e músculo EDL, fosforilação de Akt Thr308, TBC1 membro da família de domínio 4 (TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 e acetil-CoA carboxylase (ACC) Ser212 foi realizado pela técnica de mancha ocidental (Figura 4). Como esperado, a concentração de insulina submaximicamente e maximamente eficaz induziu um aumento na fosforilação de Akt Thr308 e TBC1D4 Ser588 enquanto a contração induziu um aumento na fosforilação de AMPKα Thr172 e ACC Ser212. Nem insulina nem contração levaram a uma mudança no teor total de proteínas de Akt2, TBC1D4, AMPKα2 e ACC em soleus e músculo EDL (Figura 4).

Examinando vários marcadores de viabilidade metabólica do sola incubada e músculo EDL, observamos uma redução geral nos níveis de nucleotídeos de adenosina (ATP, ADP, AMP) (~15-25%), bem como creatina (~10-35%) independentemente de os músculos terem sido incubados na presença de piruvato ou glicose em comparação com músculos não incubados (Tabela 1 ). Por outro lado, a queda nos níveis de glicogênio observado nos músculos soleus e edl incubados com piruvato foi evitada se os músculos fossem incubados com glicose. Curiosamente, porém, observamos que os níveis de monofosfato de inosina (IMP) aumentaram várias vezes, mas apenas em músculos soleus incubados. Os níveis de IMP normalmente aumentam no músculo durante o estresse metabólico grave, à medida que o músculo tenta evitar o acúmulo de AMP convertendo AMP em IMP, a fim de manter a razão ATP/ADP28. Isso indica que o músculo soleus é um pouco mais metabolicamente estressado em comparação com o músculo EDL durante a incubação. Essa noção também é apoiada por achados de ampkα thr172 elevado e fosforilação ACC Ser212 no músculo soleus incubado com piruvato (Figura 5). É importante ressaltar que o aumento observado nos níveis de IMP, bem como ampkα Thr172 e ACC Ser212, diminuem quando o músculo soleus é incubado com glicose. Assim, parece vantajoso incubar músculos esqueléticos isolados em um tampão contendo glicose para minimizar flutuações em nucleotídeos de adenosina e evitar uma queda no glicogênio muscular quando os músculos são incubados por um período prolongado de tempo. No que diz respeito à absorção de 2 desoxicosglucose, temos evidências que sugerem que a incubação de músculos por 6 a 8 h na presença de piruvato aumentará as taxas de absorção de glicose basal/de repouso. Incubar músculos em uma mídia que contém glicose parece evitar esse aumento na absorção de glicose (dados inéditos).

Figure 1
Figura 1: Sistema de incubação. (A) Sistema de miógrafo com quatro câmaras de incubação únicas. (B) Ganchos de incubação personalizados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Captação de glicose em músculo esquelético maduro isolado de camundongos. A absorção de 2 desoxicosglucose foi determinada em músculos isolados de soleus (barras pretas) e EDL (barras cinzas) em resposta a uma concentração de insulina submaximicamente eficaz (100 μU/mL), uma concentração de insulina extremamente eficaz (10 mU/mL) e contrações eletricamente induzidas (pulso de 0,2 ms, 100 Hz, 1 s/15s, 30 V, 10 min). Os dados foram analisados pelos alunos do teste em cada grupo. ###p<0.001, ##p<0.01 vs. soleus muscle. Valores são ± SEM. n = 4-6 por grupo. h, hora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Curvas de força muscular em resposta a contrações eletricamente induzidas. A produção de força máxima durante a estimulação elétrica foi calculada para o músculo soleus (pontos pretos) e EDL (pontos cinzentos). Cada valor corresponde a uma média dos últimos 500 ms de cada período de estimulação de 1 s. Valores são ± SEM. n = 5-6 por grupo. s, segundo. mN, milli-Newton. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Manchas ocidentais representativas de Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 e ACC Ser212 fosforilação, bem como proteína Akt2, TBC1D4, AMPKα2 e ACC. Foram realizadas análises de manchas ocidentais nas amostras de s soleus do camundongo e músculo EDL descritas na Figura 2. B, basal. S, insulina submaximicamente eficaz. M, insulina extremamente eficaz. C, contração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Manchas ocidentais representativas de AMPKα Thr172 e ACC Ser212 fosforilação, bem como ampkα2 e proteína ACC. Foram realizadas análises de manchas ocidentais nas amostras de s soleus do camundongo e músculo EDL descritas na Tabela 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

não incubado Incubado 1h com piruvato Incubado 1h com glicose Principais efeitos Interação
Sóleo EDL Sóleo EDL Sóleo EDL
Lactato 1.00 ± 0.01 1.00 ± 0.02 0,96 ± 0,03 0,98 ± 0,02 1.05 ± 0.01 0,99 ± 0,01 - -
Cr 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.06 0,64 ± 0,07 ### 0,76 ± 0,05 ### 0,76 ± 0,07 ## 0,88 ± 0,09 ## p < 0,001 -
PCr 1.00 ± 0.19 1.00 ± 0.06 0,80 ± 0,12 1.13 ± 0.14 0,65 ± 0,31 0,75 ± 0,08 - -
PCr/(Cr + PCr) 1.00 ± 0.20 1.00 ± 0.07 1.17 ± 0.11 1.25 ± 0.12 0,78 ± 0,36 0,92 ± 0,11 - -
ATP 1.00 ± 0.03 1.00 ± 0.02 0,72 ± 0,03 ###,§§§ 0,99 ± 0,03 * 0,81 ± 0,06 ### 0,85 ± 0,04 ## - p < 0,001
ADP 1.00 ± 0.04 1.00 ± 0.04 0,75 ± 0,05 ### 0,92 ± 0,03 ### 0,84 ± 0,04 ## 0,86 ± 0,03 ## p < 0,001 -
AMP 1,00 ± 0,11 1.00 ± 0.12 0,85 ± 0,15 0,79 ± 0,13 0,84 ± 0,18 0,75 ± 0,13 - -
DIABRETE 1.00 ± 0.17 1,00 ± 0,30 4.43 ± 0,67 ###,§§§ 0,72 ± 0,29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1.08 ± 0.01 - p < 0,001
Relação AMP/ATP 1.00 ± 0.12 1.00 ± 0.13 1.18 ± 0.22 0.81 ± 0.16 1.06 ± 0.23 0.90 ± 0.19 - -
Glicogénio 1.00 ± 0.08 1.00 ± 0.12 0,74 ± 0,07 (#)* 0,80 ± 0,12 (#)* 1.12 ± 0.10 1.10 ± 0.03 p = 0,035 -
pAMPK Thr172 / AMPKα2 1.00 ± 0.10 1.00 ± 0.12 3.26 ± 0,58 ###,***,§§§ 1,55 ± 0,27 1,68 ± 0,19 # 1.36 ± 0.19 - p = 0,002
pACC Ser212 / ACC 1.00 ± 0.18 1.00 ± 0.12 2.22 ± 0,58 ###,**,§§ 0,96 ± 0,21 0,99 ± 0,15 0,83 ± 0,09 - p = 0,030

Tabela 1: Comparação da viabilidade metabólica dos músculos soleus do camundongo e EDL incubados por 1 hora na presença de piruvato de 2 mM ou glicose de 5 mM. Os músculos não incubados foram dissecados de animais anestesiados e alimentados antes de serem congelados em nitrogênio líquido. Os músculos separados foram incubados por 1 h em tampão KRH suplementado com BSA (0,1%), Na-pyruato (2 mM) e D-mannitol (8 mM), enquanto outros foram incubados por 1 h em tampão KRH suplementado com BSA (0,1%), D-glicose (5 mM) e D-mannitol (5 mM) antes congelados em nitrogênio líquido. Os dados foram convertidos em unidades relativas para destacar alterações observadas em vários marcadores de viabilidade metabólica. Valores absolutos dos músculos soleus do rato não incubados e EDL são dados abaixo. Lactato (mmol/kg w.w): 137,53soleus; 139,05EDL. Cr (mmol/kg w.w): 9,35soleus; 8.98EDL. PCr (mmol/kg w.w): 1,50soleus; 5.20EDL. PCr/(PCr+Cr): 13,98soleus; 37:30EDL. ATP (mmol/kg w.w): 3,07soleus; 4.24EDL. ADP (mmol/kg w.w): 0,60soleus; 0,51EDL. AMP (mmol/kg w.w): 0,18soleus; 0,08EDL. IMP (mmol/kg w.w): 0,07soleus; 0,14EDL. Relação AMP/ATP: 0,06soleus; 0,02EDL. Glicogênio (proteína pmol/μg): 77,01soleus; 67.56EDL. Os dados foram analisados por uma ANOVA bidirecional dentro de cada grupo. ###p<0.001, ##p<0,01 e #p<0,05 vs. não incubados. p<0.001, **p<0,01, e *p<0,05 vs incubado 1h com glicose. §§§§p<0.001, §§p<0,01 e §p<0,05 vs EDL. Os valores são ± SEM. n = 12 em grupo não incubado, n = 4-6 em grupos incubados. Cr, Creatina; PCr, Phosphocreatine; w.w, peso molhado; h, hora.

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Discussion

A regulação intacta da absorção de glicose no músculo esquelético é importante para preservar a saúde geral1. Assim, a investigação da absorção de glicose muscular muitas vezes serve como leitura primária ao avaliar várias intervenções que alteram a saúde. Aqui descrevemos um método ex vivo para medir a absorção de glicose em soleus isolado e incubado e músculo EDL de camundongos em resposta à insulina e contrações eletricamente induzidas. O método é rápido e confiável e permite um controle preciso do meio circundante do músculo incubado que permite investigações precisas das taxas de absorção de glicose muscular isoladas da influência potencialmente confusa de hormônios e substratos que podem ser encontrados no sangue. O método tem sido utilizado por vários anos em muitos estudos e é amplamente adotado pela comunidade de pesquisa muscular.

O modelo de incubação ex vivo tem sido geralmente considerado um método para avaliar a capacidade de transporte de glicose em vez de absorção de glicose no músculo esquelético. A capacidade de transporte de glicose em músculo incubado pode ser determinada medindo a glicemia D acumulada durante um período de tempo. No entanto, isso representa um problema, pois a glicose D é rapidamente metabolizada na célula muscular após a absorção. Para contornar esse problema, o análogo de glicose 3-O-Metil-D-glicose (3-MG) tem sido amplamente utilizado para avaliar a capacidade de transporte de glicose, uma vez que o 3-MG não é mais metabolizado dentro da célula após ser transportado através da membrana da superfície celular. Assim, a taxa inicial de 3-MG acumulada intracelular serve como um índice de capacidade de transporte de glicose celular por si só, pois não é afetada por outras etapas nas vias metabólicas de glicose. No entanto, o uso do 3-MG pode constituir um problema, pois o 3-MG se acumulará, reduzindo assim o gradiente transmembrano para 3-MG e, posteriormente, reduzirá a absorção adicional. Assim, para obter uma medida da capacidade de transporte da membrana, deve-se estimar a taxa inicial de absorção de 3 MG. Em particular quando a capacidade de transporte é alta, isso pode representar um problema devido ao efflux de 3-MG do músculo 29,30. O problema potencial com efflux 3-MG pode ser evitado usando 2-desoxi-D-glicose (2-DG). Após o transporte para o músculo esquelético, 2-DG é fosfoilado por hexokinase II a 2-desoxi-D-glicose-6-fosfato (2-DG-6P). Como o músculo esquelético não tem glicose-6-fophatase e glut4 não pode transportar fosforilado 2-DG, 2-DG-6P ficará preso dentro da célula muscular. Em contraste com a glicose-6-fosfato, 2-DG-6P é um inibidor a allosterico muito fraco de hexokinase II30 que ajuda a manter o gradiente transmembrano para 2-DG. Assim, observações têm mostrado que a absorção de 2-DG no músculo incubado (rato) permanece linear até que a concentração intracelular 2-DG-6P exceda 30 mM, uma concentração que reduz a atividade hexokinase II30. Além disso, no músculo esquelético incubado do camundongo a captação de 2-DG permanece linear por ~30 min quando as temperaturas dos buffers de incubação são de 37°C ou menos31. Isso sugere que o 2-DG pode ser usado para medir a capacidade de transporte de glicose em vez de absorção de glicose em músculo incubado, exceto para situações em que as concentrações de 2-DG-6P se tornam muito altas (por exemplo, observadas durante incubações >2 horas com 1 mM 2-DG e uma concentração máxima de insulina29,30). A ideia de que a absorção de 2-DG provavelmente reflete a capacidade de transporte de glicose também é apoiada por achados que mostram que a absorção máxima estimulada pela insulina 2-DG é semelhante em músculos incubados de camundongos e camundongos do tipo selvagem que superexpressam hexokinase II32. Uma preocupação potencial ao usar 2-DG para medições de transporte de glicose muscular durante a contração é um aumento na concentração intracelular de glicose-6-fosfato devido a uma taxa elevada de glicogenólise. No entanto, uma vez que um aumento linear na absorção muscular (rato) 2-DG é observado durante a contração ao longo do tempo29, isso indica que o acúmulo de glicose-6-fosfato da quebra do glicógeno durante a contração não interfere com a atividade hexokinase II e, portanto, as taxas de absorção de 2-DG. Com base nisso, o 2-DG parece bem adequado para as medidas do transporte de glicose no músculo esquelético isolado durante a insulina e contração considerando as limitações de 3-MG.

Embora seja geralmente assumido que o 2-DG não é mais metabolizado após a fosforilação por hexokinase II, foi relatado que alguns 2-DG são direcionados e incorporados ao glicógeno muscular. Assim, durante um grampo hiperínocrômico normoglicômico de 2 h em ratos ~30% do 2-DG tomado por músculo esquelético é incorporado em glicogênio33. Portanto, pode-se argumentar que as taxas de absorção de 2 DG estimuladas pela insulina em músculo esquelético incubado são subestimadas se o acúmulo de 2-DG em glicogênio for negligenciado. Determinamos que o protocolo descrito aqui sobre como preparar os lises musculares (supernascentes) para análises subsequentes das taxas de absorção de 2 DG em músculo esquelético incubado anteriormente não é afetado pela incorporação potencial de 2-DG em glicogênio. Pode-se argumentar que o glicogênio se acumula na pelota ao centrifugar o músculo inteiro homogeneado para gerar lise para medidas de absorção de 2 DG. No entanto, ao comparar os níveis de radioatividade em músculos inteiros estimulados pela insulina, não detectamos nenhuma diferença significativa (dados não publicados). Isso sugere que incubar o músculo do rato por 10 minutos em 1 mM de 2-DG não causa um acúmulo detectável de 2-DG em glicogênio.

A determinação da absorção do músculo esquelético 2-DG sem considerar que o 2-DG é distribuído tanto no espaço extra quanto intracelular levará a uma superestimação da absorção de 2 DG. Para contornar isso, a glicose L deve ser usada como um marcador extracelular, pois este não é transportado através da membrana celular, mas de outra forma exibe propriedades semelhantes como d-glicose, incluindo massa, solubilidade, difusão passiva, vinculação, etc. Devido aos custos excessivos de fabricação e, portanto, comprando L-glicose, o manitol é tipicamente usado como um marcador extracelular, uma vez que o manitol não é tomado pela célula muscular, é relativamente barato e estima-se que tenha um volume de distribuição extracelular um pouco semelhante como glicose e 2-DG34.

Relógios celulares e moleculares intrínsecos parecem desempenhar um papel essencial para a regulação do metabolismo do corpo inteiro e da homeostaseenergética 35. Observou-se que o nocaute específico do relógio do núcleo Bmal1 prejudica a absorção de glicose estimulada pela insulina no músculo esquelético isoladodo rato 36. Além disso, a absorção de glicose estimulada pela insulina submaximal do músculo esquelético isolado exibe ritmo circadiano com a menor e mais alta resposta à insulina no meio da fase clara e escura, respectivamente37. Com base nesses achados, é importante, portanto, incorporar o tempo de sacrifício animal no desenho experimental para aumentar a reprodutibilidade dos dados.

Uma grande desvantagem do método ex vivo é a falta de fluxo capilar no músculo isolado. Isso significa que a entrega e remoção de vários substratos dependem totalmente da simples difusão entre as fibras musculares e o ambiente circundante. Consequentemente, a validação da viabilidade metabólica do ex vivo incubado muscular isolado tem sido focada em limitações de difusão de oxigênio para fibras superficiais e musculares profundas. Assim, o músculo incubado, particularmente músculo do camundongo altamente metabólico, tende a desenvolver núcleos hipóxicos nos quais ocorre a quebra do glicogênio 16,17,38. Em uma revisão detalhada por Bonen e colegas15, foi sugerido que núcleos hipóxicos de músculo incubado provavelmente se desenvolvem ao incubar músculos muito grossos para serem adequadamente oxigenados especialmente quando incubam a temperaturas de ≥ 37 °C. Isso levou à recomendação de que apenas músculos finos e cilíndricos do camundongo, como soleus e EDL, devem ser usados para incubações a 25-30 °C para evitar o desenvolvimento de núcleos hipóxicos. Isso indica que a espessura e a geometria em vez da massa são fatores importantes a serem considerados ao incubar músculos esqueléticos do camundongo. Além disso, foi recomendado que a temperatura de incubação, a espessura muscular, bem como o ATP, o teor de fosfocreatina e glicogênio e/ou liberação de lactato devem ser medidos e relatados rotineiramente para avaliar a viabilidade do músculo incubado15. Pelo que sabemos, tais análises completas de músculo incubado foram relatadas principalmente para músculos de rato 39,40,41,42 e apenas em uma medida limitada relatada para o músculo do camundongo 16,17. Para aumentar a visão de vários marcadores metabólicos de viabilidade no músculo esquelético de camundongos incubados, avaliamos possíveis alterações no teor intracelular de lactato, creatina, fosfocreatina, nucleotídeos de adenosina, glicógeno e sinalização AMPK em soleus e músculo EDL após 1 hora de incubação em tampão KRH suplementado por glicose ou piruvato. Semelhante aos achados anteriores em soleus de camundongos incubados e músculo EDL17, observou-se que os níveis de glicogênio diminuíram quando os músculos foram incubados em mídia livre de glicose. Isso indica que a ausência de glicose durante a incubação promove a quebra do glicogênio e a subsequente entrada de glicose-6-fosfato em glicólise que pode agir para garantir a produção de ATP em particular se o fornecimento de oxigênio for inadequado. Além disso, encontramos uma redução global nas piscinas de nucleotídeos ATP e ADP em soleus incubados e músculo EDL. Isso pode implicar que a oferta de oxigênio não é inteiramente suficiente para atender à demanda de músculos de camundongos incubados, tanto na presença quanto na ausência de glicose. Uma vez que o músculo soleus oxidativo depende mais de oxigênio para a produção de ATP em comparação com o músculo EDL glicóltico, isso sugere que o músculo soleus é afetado em maior medida pelo procedimento de incubação. De acordo com, verificou-se que os níveis intracelulares de IMP, bem como a sinalização AMPK foram significativamente aumentados em soleus em comparação com o músculo EDL quando incubado na ausência de glicose. Isso significa que o músculo soleus apresenta maior grau de estresse metabólico durante a incubação, o que deve ser levado em consideração ao avaliar dados do modelo muscular do camundongo ex vivo.

Células musculares cultivadas, incluindo L6 e C2C12 imortalizados, bem como miótubos humanos primários são comumente usados como substituto para músculo esquelético maduro para estudar os efeitos de várias manipulações genéticas e farmacológicas na absorção de glicose muscular estimulada pela insulina. No entanto, de várias maneiras as células musculares cultivadas não se assemelham ao músculo esquelético maduro e ao comparar os dois sistemas modelo inúmeras diferenças tornam-se aparentes. Estes incluem diferenças na expressão proteica, estrutura dimensional, ambiente circundante, estado de proliferação e diferenciação, composição do tipo de fibra, processos metabólicos e propriedades funcionais43 , tudo isso pode afetar a forma como a célula muscular regula a absorção de glicose em resposta a vários estímulos. Tipicamente, maiores efeitos relativos da insulina nas taxas de absorção de glicose são observados no músculo esquelético maduro em comparação com as células muscularescultivadas 44 , o que pode indicar que as células musculares cultivadas, em certa medida, não possuem o maquinário responsável por regular as taxas de absorção de glicose, incluindo um alto nível de expressão do transportador de glicose sensível à insulina GLUT443 . Considerando as limitações e ressalvas associadas ao uso de células musculares cultivadas e músculo esquelético isolado, é provável, portanto, vantajoso assumir uma abordagem combinada ao estudar vários processos metabólicos musculares, como a absorção de glicose.

Os músculos Soleus e EDL são tipicamente considerados representativos de músculos lentos e de contração rápida, respectivamente. Portanto, esses tipos musculares são ideais para estudos mecânicos que buscam investigar intervenções que afetam a força muscular e o desenvolvimento da fadiga. Além disso, o músculo soleus é tipicamente relatado ter maior sensibilidade e responsividade da insulina em comparação com o músculo EDL e, portanto, intervenções que visam a sensibilidade à insulina muscular podem afetar soleus e EDL de forma diferente. Além disso, a distribuição relativa dos diferentes complexos AMPK difere entre o músculo soleus e edl que parece afetar a capacidade de amplificar compostos de ampk para aumentar a absorção de glicose muscular. Assim, a maior visão sobre a regulação da absorção de glicose muscular é provavelmente alcançada se os músculos soleus e EDL forem usados durante a experimentação com o modelo de incubação ex vivo.

O método descrito aquirelaciona a absorção de glicose à quantidade de abundância total de proteínas determinada em cada amostra muscular após a homogeneização. É nossa experiência que a variação diminui ao relacionar a absorção de glicose por quantidade de proteína muscular em vez de peso muscular (dados inéditos). Além disso, a homogeneização de amostras musculares em um tampão utilizado para vários ensaios bioquímicos permite determinar tanto a absorção de glicose, a sinalização miocelular e as atividades enzimáticas na mesma preparaçãoamostral 45,46. Isso muitas vezes diminuirá a quantidade de camundongos usados para um estudo. No entanto, a absorção de glicose pode ser facilmente determinada em amostras de músculo esquelético que são dissolvidas pelo aquecimento em hidróxido de sódio (NaOH) seguido de neutralização com cloreto de hidrogênio20. Uma vez que o tratamento muscular com NaOH interfere nas medidas de concentração total de proteína muscular, o transporte de glicose medido por este procedimento deve estar relacionado ao peso muscular.

Com base em várias otimizações, nosso buffer de incubação de absorção de glicose contém uma atividade específica de 0,028 MBq/mL de [3H]2-desoxi-D-glicose e 0,0083 MBq/mL de [14C]Mannitol. Por um lado, isso reduz a quantidade de lysate (150 de 400 μL) necessária para obter medições suficientes e confiáveis de radioatividade. Por outro lado, aumenta a quantidade de radioativa [3H]2-desoxy-D-glicose e [14C]mannitol necessário para cada experimento, o que aumenta os custos experimentais. Assim, para qualquer configuração experimental é possível regular a quantidade de radioatividade utilizada nos meios de incubação de captação de glicose para atender a requisitos específicos. No entanto, deve-se tomar cuidado para não diminuir a quantidade de radioatividade no tampão de incubação, a uma medida de radioatividade não confiável. Isso é assegurado mantendo a radioatividade em amostras superiores aos limites de detecção especificados das máquinas de contagem de cintilação líquida utilizadas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Conselho Dinamarquês de Pesquisa Independente - Ciências Médicas (FSS8020-00288B) e da Fundação Novo Nordisk (NNF160C0023046). Este trabalho também foi apoiado por uma bolsa de pesquisa para Rasmus Kjøbsted da Academia Dinamarquesa de Diabetes, que é financiada pela Fundação Novo Nordisk, número de subvenção NNF17SA0031406. Os autores agradecem Karina Olsen, Betina Bolmgren e Irene Bech Nielsen (Departamento de Nutrição, Exercício e Esportes da Faculdade de Ciências da Universidade de Copenhague) por sua assistência técnica qualificada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

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References

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Biologia Edição 171 músculo esquelético transporte de glicose captação de glicose sensibilidade à insulina contração explanta ex vivo in vitro incubação rastreadores de glicose radioativa 2-deoxy-D-glicose
Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos
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Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

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