Summary
근육 포도당 흡수의 온전한 조절은 전신 포도당 항상성을 유지하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 전신 포도당 대사에 대한 다양한 생리적 개입의 영향을 묘사 할 때 단리되고 배양 된 성숙한 골격근에서 인슐린 및 수축 자극 포도당 흡수에 대한 평가를 제시합니다.
Abstract
골격근은 인슐린 반응 조직이며 일반적으로 식사 후 혈액으로 들어가는 포도당의 대부분을 차지합니다. 또한, 골격근은 휴식 조건에 비해 운동 중에 혈액에서 포도당의 추출을 최대 50 배까지 증가시킬 수 있다고보고되었습니다. 운동 및 인슐린 자극 동안 근육 포도당 흡수의 증가는 글루코스 수송체 4 (GLUT4)의 세포 내 구획에서 근육 세포 표면 막으로의 전좌뿐만 아니라 헥소키나제 II에 의한 글루코스-6-포스페이트로의 글루코스의 인산화에 의존한다. m. soleus 및 m . extensor digitorum longus (EDL)와 같은 마우스 근육의 분리 및 인큐베이션은 성숙한 골격근의 포도당 흡수에 대한 인슐린 및 전기적으로 유도 된 수축 (운동을위한 모델)의 효과를 연구하기에 적절한 생체 외 모델입니다. 따라서, 생체외 모델은 근육 인슐린 감수성의 평가를 허용하고, 수축 동안 근육력 생산을 일치시켜 근육 글루코스 흡수의 측정 동안 근섬유의 균일한 모집을 보장하는 것을 가능하게 한다. 더욱이, 기술된 모델은 근육 인슐린 감수성에 영향을 미칠 수 있거나 골격근 글루코스 흡수의 조절 복잡성을 묘사하려고 할 때 도움이 될 수 있는 약리학적 화합물 시험에 적합하다.
여기서 우리는 방사성표지된 [3H]2-데옥시-D-글루코오스 및 [14C]만니톨을 세포외 마커로서 사용하여 마우스로부터 단리되고 배양된 단독 및 EDL 근육 제제에서 인슐린 및 수축-자극된 글루코스 흡수를 측정하는 방법에 대한 상세한 프로토콜을 설명하고 제공한다. 이것은 온전한 동물 모델에서 방해 할 수있는 혼란스러운 요인이없는 성숙한 골격근에서의 포도당 흡수의 정확한 평가를 가능하게합니다. 또한, 우리는 인큐베이션 마우스 골격근의 대사 생존력에 대한 정보를 제공하여 적용된 방법이 근육 에너지 대사를 연구 할 때 특정 조건 하에서주의 사항을 가지고 있음을 시사합니다.
Introduction
골격근은 인슐린과 운동에 반응하여 세포 외 공간에서 다량의 포도당을 추출 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 이것은 전신 포도당 항상성을 유지하는 데 도움이되며 높은 에너지 수요의시기에 포도당 공급을 확보합니다. 골격근 글루코스 흡수의 온전한 조절이 전반적인 건강 및 신체 성능(1,2)에 중요한 것으로 밝혀졌기 때문에, 다양한 조건 동안 근육 글루코스 흡수의 측정은 많은 주목을 받고 있다. 인간 및 동물에서, 고인슐린성-유혈당 클램프는 생체내 인슐린 민감성을 평가하기 위한 황금 표준 기술로서 3,4 이용되어 왔다. 경구 포도당 내성 검사에서 얻은 결과와는 달리, 고인슐린성 유글리세믹 클램프 기술은 췌장으로부터의 온전한 위장 기능 또는 인슐린 분비를 요구하지 않으며, 따라서 인슐린 반응이 위장 장 및/또는 췌장 기능의 변화를 나타내는 피험자들 사이에서 비교될 수 있게 한다. 인간의 운동 중 생체 내 근육 포도당 흡수의 측정은 1960 년대5 이후 자주 수행되었습니다. 먼저 동맥 균형 기술(6)의 사용에 의해 그리고 나중에 양전자 방출 단층촬영(PET) 이미징을 사용하여 양전자 방출 글루코스 유사체 예컨대 18F-플루오로데옥시글루코스7을 방출한다. 설치류에서, 생체 내에서 운동-자극된 근육 글루코스 흡수는 전형적으로 방사성 또는 안정한 동위원소-표지된 글루코스 유사체 8,9,10의 사용에 의해 수행된다.
생체 내에서 근육 글루코스 흡수를 측정하기 위한 상보적인 방법은 설치류로부터 작은 근육을 분리 및 배양하고, 이어서 방사성 또는 안정한 동위원소 표지된 글루코스 유사체11,12,13을 사용하여 글루코스 흡수를 측정하는 것이다. 이 방법은 성숙한 골격근에서 포도당 흡수율의 정확하고 신뢰할 수있는 정량화를 허용하며 다양한 인슐린 농도의 존재 및 전기 자극에 의해 유발 된 수축 중에 수행 될 수 있습니다. 더 중요한 것은, 격리되고 배양된 골격근에서의 글루코스 흡수의 측정은 다양한 개입(예를 들어, 영양, 신체 활동, 감염, 치료제)을 겪은 마우스의 근육 대사 표현형을 조사할 때 관련성이 있다. 분리된 골격근 모델은 또한 글루코스 흡수에 영향을 미치거나 인슐린 감수성(12,14)을 변형시킬 수 있는 약리학적 화합물 검사에 적합한 도구이다. 이러한 방식으로, 근육 글루코스 대사를 조절하도록 설계된 화합물의 효능은 전임상 동물 모델에서 후속 생체내 시험 전에 고도로 조절된 환경에서 시험되고 평가될 수 있다.
일부 조건하에서, 대사 생존력은 단리되고 인큐베이션된 골격근 모델 시스템에서 도전을 제기할 수 있다. 실제로, 인큐베이션 된 근육에서 순환계의 부족은 기질 (예 : 산소 및 영양소)의 전달이 근육 섬유와 주변 환경 사이의 단순한 확산에 완전히 의존한다는 것을 수반합니다. 이와 관련하여, 인큐베이션된 근육이 작고 얇고, 따라서, 인큐베이션(15) 동안 산소 확산에 대한 장벽을 덜 나타내는 것이 중요하다. 특히 몇 시간 동안 장기간 배양하는 동안, 저산소 상태는 불충분 한 산소 공급으로 인해 근육 에너지 고갈을 초래할 수 있습니다(15). 인큐베이션된 래트 근육에서의 대사 생존력의 다양한 마커가 래트 근육 생존력을 유지하는 데 도움이 되는 중요한 변수의 확인과 함께 이전에 보고되었지만(15), 작은 인큐베이션된 마우스 근육에서의 대사 생존력에 대한 포괄적인 평가는 여전히 보증된다. 따라서, 현재, 글리코겐 함량은 주로 배양된 마우스 골격근16,17에서 대사 생존력의 마커로서 사용되어 왔다.
여기서 우리는 방사성표지된 [3H]2-데옥시-D-글루코스 및 [14C]만니톨을 세포외 마커로서 사용하여 마우스로부터 단리되고 배양된 단독 및 EDL 근육에서 기저, 인슐린- 및 수축-자극된 글루코스 흡수를 측정하기 위한 상세한 프로토콜을 기술한다. 본 연구에서, 글루코스 흡수는 10분 기간 동안 측정되었고, 이 방법은 단일 수축 프로토콜뿐만 아니라 서브 최대화 및 최대 효과적인 인슐린 농도의 사용과 함께 제시된다. 그러나, 본원에 기재된 프로토콜은 인큐베이션 시간, 인슐린-투여량, 및 전기 자극 프로토콜과 관련하여 용이하게 변형될 수 있다. 또한, 우리는 인큐베이션된 발바닥 및 EDL 마우스 근육에서 대사 생존력의 다양한 마커의 철저한 특성화를 제공한다. 결과는 인큐베이션 버퍼에 글루코스 보충이 1시간 동안 인큐베이션된 근육의 대사 생존력을 보존하는데 필수적이라는 것을 나타낸다.
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Protocol
연구 동물과 관련된 절차는 관련 지침 및 현지 법률에 따라 수행되어야합니다. 이 연구에 사용 된 모든 동물 실험은 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호를위한 유럽 협약을 준수했으며 덴마크 동물 실험 검사원의 승인을 받았습니다.
1. 실험 장치 및 봉합사 루프의 제조
참고: 이 연구에서는 맞춤형 인큐베이션 후크가 있는 통합 근육 스트립 근전도 시스템을 사용하여 격리된 마우스 골격근을 배양합니다(그림 1). 이 시스템은 근육이 지속적인 산소화 (95 % O2 및 5 %CO2)와 일정한 온도에서 생리 학적 용액에서 목욕 할 수있게합니다. 근육 조직 욕조는 수축 동안 근육력 생산의 측정을 위해 힘 변환기에 결합된다. 수축 중에 근-기계적 반응을 유도하고 기록하려면 각각 전기 펄스 자극기와 데이터 수집 프로그램을 사용합니다. 인큐베이션 된 근육을 자극하여 근육의 중앙과 양쪽에 위치한 백금 전극에 의해 수축하십시오.
- 근전도 시스템을 켜고 챔버를 30°C로 가온한다. 근그래프 시스템과 호환되는 개방형 데이터 수집 소프트웨어 및 힘 트랜스듀서를 보정하여 데이터 세트 간의 비교 가능성을 보장합니다.
- 흡수되지 않는 외과 용 나일론 봉합사의 ~ 16cm 가닥을 절단하여 시작하십시오. 포셉을 사용하여 단일 가닥에서 직경 약 0.4cm의 루프를 만듭니다. 충분한 루프가 생성 될 때까지이 작업을 반복하십시오. 각 근육에는 두 개의 루프가 필요합니다 - 하나는 근위 및 원위 힘줄을위한 루프입니다.
2. 용액 및 인큐베이션 매질의 제조
- 기초 배양 배지의 제조
- 다음 원액을 준비하십시오: 2.5 M 염화나트륨 (NaCl, 250 mL), 0.5 M 중탄산나트륨 (NaHCO3, 250 mL), 0.5 M 염화칼륨 (KCl, 50 mL), 0.25 M 염화칼슘 (CaCl2, 50 mL), 0.25 M 인산이수소칼륨 (KH2PO4, 50 mL), 0.25 M 황산마그네슘 (MgSO4, 50 mL), 110 mM 피루베이트 나트륨 (Na-Pyruvate, 100 mL), 500 mM D-만니톨 (100 mL), 1 M 2-데옥시-D-글루코스 (4 mL), 크렙스-링거-헨셀레이트 (KRH) 완충액 (하기 단계 4에서 설명됨)에 대해 투석된 소 혈청 알부민 (BSA)의 15% 용액 (100 mL).
참고 : 휴식과 수축 자극 포도당 섭취를 측정하기 위해서는 두 가지 해결책이 필요합니다. 또한, 인슐린 자극 포도당 흡수를 평가하는 데 사용되는 각 단일 인슐린 농도에는 두 가지 솔루션이 필요합니다. 따라서, 총 여섯 가지 상이한 용액이 분리된 마우스 골격근에서 기저, 아막하 인슐린-, 최대 인슐린-, 및 수축-자극된 글루코스 흡수를 측정하기 위해 필요하다. 이하에서, '기저 인큐베이션 배지'는 인슐린 또는 방사성 추적자가 없는 배지를 의미한다. '인큐베이션 배지'는 인슐린을 함유하는 배지를 의미한다. '글루코스 흡수 인큐베이션 배지'는 '인큐베이션 배지'에서 사용된 것과 동일한 농도로 인슐린 이외에 2-데옥시-D-글루코스 및 방사성 추적자를 함유하는 배지를 의미한다. - 초순수 (ddH2O)를 NaCl (117 mM), NaHCO3 (24.6mM), KCl (4.7 mM), CaCl2 (2.5 mM),KH2PO4 (1.2 mM) 및MgSO4 (1.2mM)로 보충하여 KRH 완충액을 제조하였다. 이어서, KRH 버퍼를 95%O2 및 5%CO2로 적어도 10분 동안 가스화시킨다. KRH 완충액의 원하는 pH는 30°C에서 7.35-7.45 사이여야 한다. pH 조정이 실온에서 수행되는 경우 KRH 버퍼의 pH는 7.25-7.35 사이여야 합니다.
- BSA (0.1%), Na-피루베이트 (2 mM), 및 D-만니톨 (8 mM)을 가스화 및 pH 조정 KRH 완충액에 첨가하여 기저 인큐베이션 매질을 완성한다. O2 및CO2의 탈기를 최소화하기 위해 밀폐된 용기에 기초 인큐베이션 배지를 보관하고 30°C에서 배지를 배치한다.
참고: 일반적으로 KRH 보충제(예: Na-Pyruvate, D-Mannitol 및 D-glucose)의 삼투압은 근육 세포의 수축이나 팽창을 피하기 위해 전체 실험에 걸쳐 일정하게 유지됩니다. 본원에 기재된 프로토콜은 KRH 보충제에 대해 10 mM의 삼투압을 사용한다. 포도당 함유 완충액이 필요한 경우, 필요에 맞게 KRH 보충제를 교체하십시오(예: 5mM D-글루코오스 및 5mM D-만니톨). - 인큐베이션 완충액에서 가능한 BSA 관련 오염물질을 피하려면, KRH에 대해 BSA를 투석한다.
- KRH 버퍼에 대해 투석된 15% BSA 원액을 만들기 위해, 먼저 분석 등급의 무지방 BSA 300g을 KRH 버퍼 900mL에 용해시킨다. 다음으로, 튜브가 부드러워 질 때까지 투석 튜브를 증류수에 끓입니다.
- BSA-KRH 용액으로 튜브를 채우고 튜브 끝을 고정하십시오. BSA-KRH로 튜빙을 5 L의 KRH 완충액에 넣고 4°C에서 밤새 방치한다. 다음날 KRH 버퍼를 교체하고 튜브를 4°C에서 하룻밤 동안 KRH 버퍼 중의 BSA-KRH로 방치한다.
- 마지막으로, 튜빙으로부터 BSA-KRH 용액을 수집하고 KRH 버퍼를 2 L의 최종 부피 (즉, 15% BSA-KRH 원액)에 첨가한다. 15% BSA-KRH 원액을 분취량으로 나누고 ~-20°C의 냉동고에 보관한다.
- 다음 원액을 준비하십시오: 2.5 M 염화나트륨 (NaCl, 250 mL), 0.5 M 중탄산나트륨 (NaHCO3, 250 mL), 0.5 M 염화칼륨 (KCl, 50 mL), 0.25 M 염화칼슘 (CaCl2, 50 mL), 0.25 M 인산이수소칼륨 (KH2PO4, 50 mL), 0.25 M 황산마그네슘 (MgSO4, 50 mL), 110 mM 피루베이트 나트륨 (Na-Pyruvate, 100 mL), 500 mM D-만니톨 (100 mL), 1 M 2-데옥시-D-글루코스 (4 mL), 크렙스-링거-헨셀레이트 (KRH) 완충액 (하기 단계 4에서 설명됨)에 대해 투석된 소 혈청 알부민 (BSA)의 15% 용액 (100 mL).
- 인슐린을 함유하는 인큐베이션 배지의 제조
- 최하위 유효 인슐린 농도를 포함하는 인큐베이션 배지의 경우, 기본 인큐베이션 배지 mL당 100mU/mL 인슐린 원액 1μL를 첨가하십시오(100μU/mL 인슐린).
- 최대한의 효과적인 인슐린 농도를 포함하는 인큐베이션 배지의 경우, 기본 인큐베이션 배지 mL당 10U/mL 인슐린 원액 1μL를 첨가하십시오(10mU/mL 인슐린).
- 포도당 흡수 배양 배지의 제조
주의: 방사성 물질의 취급은 허가된 인원에 의해 제한되고 통제되는 지역에서만 허용되며, 일부 대학, 연구 기관 및 회사는 "방사능 사용 허가증"의 취득을 요구할 수 있습니다. 자재 및 폐기물은 적절한 현지 절차, 지침 및 법률에 따라 처리해야합니다.- 섹션 2.1.2에 설명된 것과 동일한 절차를 따르십시오.
- BSA (0.1%), Na-피루베이트 (2 mM), D-만니톨 (7 mM), 및 2-데옥시-D-글루코오스 (1 mM)를 가스화 및 pH 조정된 KRH 완충액에 첨가한다.
- [3H]2-데옥시-D-글루코오스 (0.028 MBq/mL) 및 [14C]만니톨 (0.0083 MBq/mL)을 보충된 KRH 완충액에 첨가하여 글루코스 흡수 인큐베이션 배지를 완료한다. 30°C에서 보관한다. [3H]2-데옥시-D-글루코오스 및 [14C]만니톨이 에탄올에 용해되면 사용 전에N2 매개된 증발에 의해 에탄올을 제거한다.
- 최하위 유효 인슐린 농도를 포함하는 글루코스 흡수 인큐베이션 배지의 경우, 글루코스 흡수 인큐베이션 배지(100μU/mL 인슐린)의 mL당 100mU/mL 인슐린 원액 1μL를 첨가하십시오.
- 최대한의 효과적인 인슐린 농도를 포함하는 글루코스 흡수 배양 배지의 경우, 글루코스 흡수 인큐베이션 배지(10 mU/mL 인슐린)의 mL당 10 U/mL 인슐린 원액 1μL를 첨가하십시오.
3. 인큐베이션을 위한 마우스 발바닥 및 EDL 근육의 동물 및 해부
참고 : 연구 동물과 관련된 절차는 관련 지침 및 현지 법률에 따라 수행되어야합니다. 기술된 절차는 다양한 균주 및 유전적 배경의 사내 사육 또는 상업적으로 이용가능한 수컷 및 암컷 마우스와 함께 사용될 수 있다. 다음 절차는 먹이를 먹인 암컷 C57Bl/6J 마우스에 대해 제공됩니다. 평균적으로, 마우스는 19주령이었고 체중은 25g이었다. 마우스를 표준 설치류 차우 및 물에 자유롭게 접근하여 12:12 h 광-암흑 주기로 유지하였다. 동물 실험은 현지 시간으로 오전 ~ 9:00에 시작되었고 모든 동물은 2 h 기간 내에 희생되었다.
- 4mL의 사전 가온된(30°C) 기저 인큐베이션 배지를 각 인큐베이션 챔버에 첨가하고, 기저 인큐베이션 배지가 95% O2 및 5%CO2로 지속적으로 산소화되도록한다.
- 펜토바르비탈 (10 mg / 100 g 체중) 또는 기타 사용 가능한 마취 (예 : 트리브로모 에탄올)의 복강 내 주사로 마우스를 마취하십시오.
참고 : 일부 국가에서는 펜토바르비탈 및 기타 마취제를 취급 할 수있는 면허가 필요할 수 있습니다. 근육 해부를 시작하기 전에 각 동물의 마취가 적절하게 유도되어야합니다. 이를 보장하기 위해 꼬리와 다리 반사 신경을 테스트합니다. 최적의 결과를 얻으려면 제거 중에 근육이 손상되지 않도록 해부를 잘 연습해야합니다. - 마취되기 쉬운 마우스를 해부 트레이 (예 : 스티로폼 뚜껑)에 놓고 필요에 따라 바늘을 사용하여 앞발과 뒷발을 고정하십시오.
- 아래 다리에서 피부를 제거하고 아킬레스 건과 무릎 관절이 모두 보이는지 확인하십시오.
- 발바닥 근육의 해부를 위해, 아킬레스 힘줄에 단일 봉합사 루프를 부착하여 시작하십시오. 봉합사 루프의 아킬레스 건에 완두콩 포셉을 고정시키고 발바닥과 위장관 근육을 발에서 방출하도록 자릅니다. 완두콩 포셉을 마우스를 가로 질러 조심스럽게 밀어 발바닥 근육을 노출시킵니다.
- 완두콩 포셉을 고정하고 발바닥 근육의 근위 힘줄 주위에 두 번째 봉합사 루프를 놓습니다. 다음으로, 근위 힘줄을 자르고 위장관 근육이없는 발바닥 (두 개의 부착 된 봉합사 루프 포함)을 해부하십시오. 각 봉합사 루프를 각각의 후크에 부착하여 인큐베이션 챔버에 발바닥 근육을 신속하게 배치하십시오.
- 포셉을 사용하여 m. tibialis anterior (TA)를 덮고있는 근막을 제거하십시오. 올바르게 수행되면 TA 및 EDL 근육의 원위 힘줄은 맑은 흰색과 시야가되어야합니다. 서로 분리되었습니다.
- TA 근육의 원위 힘줄을 자르고 나중에 분석 (예 : 유전자형)을 위해 근육을 해부하십시오. 포셉을 사용하여 EDL 근육을 주변 조직에서 부드럽게 해방시키지만 근육을 그대로 두고 힘줄을 자르지 마십시오. 원위 힘줄 주위에 하나의 봉합사 루프를 배치하고 EDL의 근위 힘줄 주위에 두 번째 봉합사 루프를 놓습니다.
- 다음으로, 두 개의 부착된 봉합사 루프로 EDL 근육을 방출하는 힘줄을 절단하고, 각각의 봉합사 루프를 각각의 후크에 부착하여 인큐베이션 챔버 내에 근육을 신속하게 배치한다. 인큐베이션 동안, 특히 발바닥과 EDL 근육의 전기적으로 유발 된 수축 중에 긴장을 잃지 않으려면 힘줄 주위의 봉합사 루프를 단단한 매듭으로 고정시키는 것이 매우 중요합니다.
- 마지막으로, 예를 들어 자궁 경부 탈구로 동물을 안락사시킵니다.
- 근육이 해부되고 인큐베이션 챔버에 놓일 때, 각 근육의 휴식 긴장을 ~5 mN으로 조정하고 실험 프로토콜을 시작하기 전에 적어도 10분 동안 근육을 사전 인큐베이션한다.
4. 격리된 마우스 골격근에서 인슐린 자극 포도당 흡수
- 다음 단계 3.9는 기저 인큐베이션 배지를 인슐린을 함유하지 않는 인큐베이션 배지(basal incubation media), 서브최 효과적인 인슐린 농도 또는 최대 유효 인슐린 농도로 교체하고 20분 동안 인큐베이션 챔버에 방치한다. 각 인큐베이션 챔버를 1 분씩 공간화하여 근육의 후속 수확을위한 시간을 만듭니다.
- 20분의 자극 기간이 끝날 때, 인큐베이션 배지를 동일한 농도의 인슐린을 함유하는 글루코스 흡수 인큐베이션 배지로 교체하고, 다시 각 인큐베이션 챔버 사이에 1분 간격으로 10분 동안 인큐베이션 챔버에 남겨둔다.
- 글루코스 흡수 인큐베이션 배지에서 10분간 인큐베이션한 후 인큐베이션 챔버로부터 근육을 부드럽게 제거하고 얼음처럼 차가운 기저 인큐베이션 배지로 세척한다. 그 후, 봉합사 루프가 제거되고 근육이 액체 질소에서 얼어 붙기 전에 여과지에서 근육을 신속하게 건조시킵니다. 포도당 섭취 이외에 다양한 세포 내 대사 산물 및 단백질 신호 전달을 조사하고자하는 경우 인큐베이션 된 근육을 신속하게 수확하는 것이 필수적입니다.
- 각 인큐베이션 챔버로부터 글루코스 흡수 인큐베이션 배지 100 μL를 수집하고 이를 -20°C에 보관한다. 이들 샘플에서 방사능의 양은 근육 글루코스 흡수의 계산에 포함될 것이다.
5. 고립 된 마우스 골격근에서 수축 자극 포도당 흡수
참고: 격리된 마우스 골격근의 수축을 유도하려면 다음 프로토콜을 사용하십시오: 1 train/15 s, 100 Hz에서 전달되는 0.2 ms 펄스로 구성된 각 트레인 1 s 길이. 그러나 고립 된 마우스 골격근의 수축을 유도하는 다른 유사한 프로토콜도 작동 할 것입니다. 중요하게도, 전압은 실험 설정에 의존하는 인큐베이션 근육의 최대 힘 발달을 생성하도록 조정되어야한다. 이것이 보장되지 않으면 근육의 모든 섬유가 수축하지 않을 위험이 있습니다. 차례로, 이것은 데이터 세트에서 편향을 유도 할 수 있습니다.
- 3.9 단계에 따라 백금 전극을 근육의 중앙과 양쪽에 놓습니다. 기본 인큐베이션 배지를 글루코스 흡수 인큐베이션 배지로 교체한 직후에 근육의 수축을 개시한다. 가능하다면, 각 인큐베이션 챔버를 1 분씩 공간화하여 근육의 후속 수확을위한 시간을 만듭니다. 각 인큐베이션 된 근육에서 힘 생산을 기록하는 것을 잊지 마십시오.
- 글루코스 흡수 인큐베이션 매질에서 10분 동안 수축시킨 후, 백금 전극을 제거하고, 인큐베이션 챔버로부터 근육을 부드럽게 수집하고, 얼음처럼 차가운 기저 인큐베이션 매질로 세척한다. 그 후, 봉합사 루프가 제거되고 근육이 액체 질소에서 얼어 붙기 전에 여과지에서 근육을 신속하게 건조시킵니다. 전체 근육 수확 절차는 가능한 한 빨리 수행되어야합니다.
- 각 인큐베이션 챔버로부터 글루코스 흡수 인큐베이션 배지 100 μL를 수집하고 이를 -20°C에 보관한다. 이들 샘플에서 방사능의 양은 근육 글루코스 흡수의 계산에 포함될 것이다.
6. 골격근 균질화 및 가공
참고 : 근육 균질화를 위해 아래에 주어진 절차는 동일한 근육 샘플 세트에서 웨스턴 블롯팅에 의한 포도당 흡수와 근세포 신호 전달을 모두 결정할 수있게합니다.
- 10% 글리세롤, 20 mM 피로포스페이트, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드 (이소프로판올에 용해됨), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-글리세로포스페이트, 10 mM 불화나트륨(NaF), 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1 mM 글리콜에테르디아민테트라아세트산(EGTA), 10 μg/ml 아프로티닌, 10 μg/mL 류펩틴, 3 mM 벤즈아미딘 및 2mM 나트륨-오르토바나데이트는 스틸 비드 및 조직 분해제(30Hz에서 2 x 45 s)를 사용합니다. 모든 균질물을 4°C에서 1시간 동안 말단 회전시킨 후, 이들을 4°C에서 20분 동안 16,000 x g 에서 원심분리한다. 근육 포도당 흡수를 결정하는 데 사용되는 용해물 (상청액)을 수집하십시오.
7. 방사성 표지된 2-데옥시글루코오스와 만니톨의 결정
- 각 인큐베이션 챔버로부터 각 근육 용해물 150 μL와 글루코스 흡수 인큐베이션 배지 25 μL를 첨가하여 2 mL의 액체 섬광 유체를 함유하는 액체 섬광 계수 바이알을 분리한다. 또한, 액체 섬광 유체 3 mL만을 함유하는 두 개의 블라인드 대조군 바이알을 준비하십시오. 모든 바이알을 닫고 각 바이알을 ~5초 동안 볼텍싱하여 완전히 혼합합니다.
- 바이알을 액체 섬광 계수기에 넣고 제조업체의 지침에 따라 [3H]2-데옥시-D-글루코오스 및 [14C]만니톨의 방사능을 측정합니다. 각 액체 섬광 바이알에 대해 DPM(분당 붕해)을 기록하십시오.
8. 근육 포도당 흡수율의 계산
- 단계 6.1로부터의 용해물을 사용하여 표준 단백질 정량 방법(예를 들어, 비친코닌산 또는 브래드포드 검정)을 사용하여 각 근육 샘플 내의 총 단백질 농도를 측정하였다. 각 섬광 바이알에 첨가된 단백질(mg)의 양을 계산한다.
참고: 각 근육 샘플에 대한 글루코스 흡수율은 [14C]만니톨을 세포외 마커로 사용하여 근육 샘플 내의 [3H]2-데옥시-D-글루코오스의 총량에서 세포외 공간에 위치한 [3H]2-데옥시-D-글루코오스의 양을 뺀 값으로 계산됩니다. [3H]2-데옥시-D-글루코오스 및 [14C]만니톨은 인큐베이션 동안 근육 조직 내에서 유사한 확산 특성을 나타낸다고 가정한다. 다음 계산을 수행합니다. - 먼저 모든 근육 및 배지 샘플로부터 블라인드 대조군 샘플의 [3H] 및 [14C] DPM을 뺀다.
- μL (μL-ECS)의 근육 세포외 공간을 결정하십시오 :
[14C] DPM근육 / ([14C]DPM매체 / M볼트) - 근육 세포외 공간 ([3 H]DPMECS)에서 [3H]DPM의 양을 계산하십시오 :
μL-ECS × ([3H]DPM매체 / M볼트) - 근육 세포 내 공간([3H]DPMICS)에서 [3H]DPM의 양을 계산합니다.
[3시간] DPM근육 - [3H]DPMECS - 근육 포도당 흡수율을 계산하십시오 (μmol / g 단백질 / 시간).
[3시간] DPMICS /([3H]DPM배지 /Mvol)/[2-데옥시-D-글루코스])/mg 단백질)/Th
참고 : 위의 모든 방정식에 대해,
[14C] DPM근육 샘플에서 [14C]만니톨 방사능의 양;
[14C] DPM배지는 배지 샘플에서 [14C]만니톨 방사능의 양이고;
[3시간] DPM근육 샘플에서 [3H]2-데옥시-D-글루코스 방사능의 양;
[3시간] DPM배지는 배지샘플에서 [3H]2-데옥시-D-글루코스 방사능의 양이고;
[3시간] DPMECS 는 근육 세포외 공간에서의 [3H]2-데옥시-D-글루코스 방사능의 양이고;
[3시간] DPMICS 는 근육 세포내 공간에서의 [3H]2-데옥시-D-글루코스 방사능의 양이고;
μL-ECS는 μL의 근육 세포외 공간이고;
Mvol 은 섬광 계수에 사용되는 인큐베이션 매질의 부피(μL)이다(예를 들어 상기 언급된 바와 같은 '25');
Th는 시간당 흡수율을 계산하는 데 사용되는 시간 계수입니다 (즉, 10 분 동안 포도당 흡수 매체로 근육을 배양 할 때 '1/6') - 이 예제 계산을 고려하십시오. 블라인드 대조군 샘플(각각 17 및 6)의 [3H] 및 [14C]DPM은 아래에 언급된 DPM 값에서 뺍니다.
[14C] DPM근육: 343
[14C] DPM미디어: 11846
[3시간] DPM근육:4467
[3시간] DPM미디어: 39814
M볼트 : 25
mg 단백질 : 0.396 (150 μL 근육 단백질 용해물 중)
[2-데옥시-D-글루코오스]: 1 (mM)
Th : 1/6 (h)
μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0.724 μL
[3시간] DPMECS: 0.724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
[3시간] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
포도당 흡수량: ((3314 DPM/(39814 DPM/25 μL) / 1 mmol/L) / 0.396 mg 단백질) / (1/6 시간) = 31.53 μmol / g 단백질 / 시간
9. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석
- 발바닥 및 EDL 근육 용해물을 Laemmli 완충액에서 제조하고 96°C에서 5분 동안 가열한다.
- 셀프 캐스트 겔 상에서 SDS-PAGE에 의해 동일한 양의 근육 단백질을 분리하고, 반건조 블롯팅에 의해 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 단백질을 옮긴다.
- 이어서, 0.05% 트윈 20 및 2% 탈지유를 함유하는 트리스 완충 식염수 및 관련 일차 및 2차 항체를 갖는 프로브 막에서 멤브레인을 인큐베이션한다.
- 화학 발광으로 단백질을 감지하고 디지털 이미징 시스템으로 시각화합니다.
10. 근육 글리코겐, 뉴클레오티드, 젖산염, 크레아틴, 포스포크레아틴
- 과염소산을 사용하여 EDL 및 단독 근육 샘플을 추출하십시오.
- 이어서, 샘플을 중화시키고 앞서 기술된 바와 같이 젖산염, 크레아틴, 포스포크레아틴에 대해 분석한다18.
- EDL 및 단독근의 뉴클레오티드 함량을 과염소산에서 추출한 후 역상 HPLC로 분석한다.
- 앞서 기술한바와 같은 플루오로메트릭 방법에 의해 산 가수분해 후 글리코실 단위로서 전체 근육 균질액에서 근육 글리코겐 함량을 결정한다.
11. 통계
- 통계 분석 소프트웨어로 통계 분석을 수행합니다.
- 분산 분석(ANOVA) 검정을 사용하여 표 1에 제시된 값 간의 통계적 차이를 평가합니다.
- 짝을 이루지 않은 학생 t 테스트를 사용하여 그림 2에 제시된 각 그룹 내에서 EDL과 단독 사이의 포도당 섭취량의 통계적 차이를 평가하십시오. 데이터를 평균(SEM)의 표준 오차± 평균으로 제시한다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.
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Representative Results
도 2에 나타난 바와 같이 기저 글루코스 흡수율은 암컷 마우스로부터 분리된 단독과 EDL 근육 사이에서 유사하였다. 이것은 또한12,13,19,20 이전에 여러 번보고되었습니다. 포도당 흡수는 최하위 유효 인슐린 농도 (100 μU / mL)에 반응하여 단독 및 EDL 근육에서 각각 12 및 9 μmol / g 단백질 / h에 도달하는 ~ 0.8 및 ~ 0.6 배 증가했습니다. 이 증가는 근육이 최대한의 효과적인 인슐린 농도 (10 mU / mL)로 자극되었을 때 훨씬 더 높았습니다 (단독 및 EDL 근육에서 각각 33 및 19 μmol / g 단백질 / h에 도달하는 ~ 4 배와 ~ 2 배). 더욱이, 최하위 및 최대 인슐린 자극된 글루코스 흡수는 모두 단독 근육에서 유의하게 더 높았으며, 이는 솔 근육이 EDL 근육에 비해 향상된 인슐린 민감성 및 반응성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 이는 EDL 근육 10,21,22,23,24에 비해 단독 근육에서 인슐린 신호전달 트랜스듀서 B(Akt) 뿐만 아니라 글루코스 수송체 4(GLUT4)의 더 높은 발현과 관련될 수 있다.
수축-유도된 글루코스 흡수는 이전에 보고된13,19도 마찬가지로 단독 근육에 비해 EDL 근육에서 유의하게 더 높았다(도 2). 따라서 포도당 흡수는 전기적으로 유발 된 수축에 반응하여 발바닥 및 EDL 근육에서 각각 14 및 22 μmol / g 단백질 / h에 도달하는 ~ 2 배 및 ~ 2.5 배 증가했습니다. 도 3은 10분 자극 기간 동안 단독 및 EDL 근육에서의 최대 근력 생산을 보여준다. 앞서 보고된도 19에서 볼 수 있듯이, EDL 근육은 자극 기간의 초기 부분 동안 더 많은 힘(EDL에서 225mN 대 밑창에서는 150mN)을 생성한다. 한편, EDL 근육은 자극 기간 후반에 발바닥 근육에 비해 힘 생산의 더 빠른 감소를 나타낸다. 이러한 발견은 타입 2 섬유가 타입 1 섬유26,27에 비해 더 많은 힘을 생성하지만 피로가 더 빠른 > 섬유로서 단독 (유형 1 > 유형 2)과 EDL (유형2 유형 1) 근육 사이의 섬유 유형 분포의 차이 때문일 가능성이 큽니다.
단리된 단독 및 EDL 근육에서 인슐린 및 세포내 신호전달에 대한 수축의 효과를 평가하기 위해, Akt Thr308, TBC1 도메인 패밀리 멤버 4(TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 및 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC) Ser212의 인산화를 웨스턴 블롯팅 기술에 의해 수행하였다(도 4). 예상한 바와 같이, 서브 최대 및 최대 효과적인 인슐린 농도는 Akt Thr308 및 TBC1D4 Ser588의 인산화의 증가를 유도한 반면, 수축은 AMPKα Thr172 및 ACC Ser212의 인산화의 증가를 유도하였다. 인슐린이나 수축 모두 단독 및 EDL 근육에서 Akt2, TBC1D4, AMPKα2 및 ACC의 총 단백질 함량의 변화를 초래하지 않았습니다 (그림 4).
인큐베이션된 단독 및 EDL 근육의 대사 생존력에 대한 다양한 마커를 조사한 결과, 우리는 근육이 비인큐베이트 근육에 비해 피루베이트 또는 글루코스의 존재하에 인큐베이트되었는지 여부에 관계없이 아데노신 뉴클레오티드 (ATP, ADP, AMP) (~ 15-25 %)뿐만 아니라 크레아틴 (~ 10-35 %)의 전반적인 감소를 관찰했다 (표 1 ). 한편, 피루베이트와 함께 인큐베이트된 단독 및 EDL 근육에서 관찰된 글리코겐 수준의 감소는 근육이 글루코스와 함께 인큐베이션되는 경우 방지되었다. 흥미롭게도, 우리는 이노신 모노 포스페이트 (IMP) 수치가 몇 배 증가했지만 배양 된 발바닥 근육에서만 증가한다는 것을 관찰했습니다. IMP 수준은 전형적으로 근육이 ATP/ADP 비율28을 유지하기 위해 AMP를 IMP로 변환함으로써 AMP 축적을 방지하려고 시도함에 따라 심각한 대사 스트레스 동안 근육에서 증가한다. 이는 발바닥 근육이 인큐베이션 동안 EDL 근육에 비해 다소 대사적으로 스트레스를 받는다는 것을 나타낸다. 이 개념은 또한 피루베이트와 함께 인큐베이트된 단독 근육에서 AMPKα Thr172 및 ACC Ser212 인산화가 증가한다는 발견에 의해 뒷받침된다(그림 5). 중요하게는, IMP 수준의 관찰된 증가는 단독 근육이 글루코스와 함께 인큐베이션될 때 AMPKα Thr172 및 ACC Ser212 인산화 감소뿐만 아니라 감소한다. 따라서, 글루코스 함유 완충액에서 단리된 골격근을 인큐베이션하여 아데노신 뉴클레오티드의 변동을 최소화하고 근육이 장기간 배양될 때 근육 글리코겐의 강하를 방지하는 것이 유리해 보인다. 2- 데옥시 글루코스 섭취와 관련하여, 우리는 피루베이트가있는 상태에서 6 ~ 8 시간 동안 근육을 배양하면 기저 / 휴식 포도당 흡수율이 증가 할 것이라고 제안하는 증거가 있습니다. 포도당을 함유하는 배지에서 근육을 배양하는 것은 글루코스 흡수의 증가와 같은 것을 방지하는 것으로 보인다 (공개되지 않은 데이터).
그림 1: 인큐베이션 시스템. (A) 네 개의 단일 인큐베이션 챔버가 있는 Myograph 시스템. (B) 주문을 받아서 만들어진 인큐베이션 후크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마우스로부터 분리된 성숙 골격근에서의 글루코스 흡수. 2-데옥시글루코스 흡수는 분리된 단독(검은색 막대) 및 EDL(회색 막대) 근육에서 결정되었으며, 이는 최하위 유효 인슐린 농도(100 μU/mL), 최대 유효 인슐린 농도(10 mU/mL) 및 전기적으로 유도된 수축(0.2 ms 펄스, 100 Hz, 1 s/15s, 30 V, 10 분). 데이터는 각 그룹 내의 학생 t 시험에 의해 분석되었다. ###p<0.001, ##p<0.01 vs. 발바닥 근육. 값은 SEM± 의미합니다. n=그룹당 4-6이다. h, 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 전기적으로 유도된 수축에 반응하는 근육력 곡선. 전기 자극 동안의 피크 힘 생산은 발바닥(검은 점) 및 EDL(회색 점) 근육에 대해 계산되었다. 각각의 단일 값은 각 1-s 자극 기간의 마지막 500ms의 평균에 대응한다. 값은 SEM± 의미합니다. n=5-6 그룹당 s, 둘째. mN, 밀리 뉴턴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 및 ACC Ser212 인산화뿐만 아니라 Akt2, TBC1D4, AMPKα2 및 ACC 단백질의 대표적인 웨스턴 블롯. 웨스턴 블롯 분석은 도 2에 기재된 마우스 발바닥 및 EDL 근육 샘플에 대해 수행되었다. B, 기저부. S, 서브 최대 효과적인 인슐린. M, 최대 효과적인 인슐린. C, 수축. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: AMPKα Thr172 및 ACC Ser212 인산화뿐만 아니라 AMPKα2 및 ACC 단백질의 대표적인 웨스턴 블롯. 웨스턴 블롯 분석은 표 1에 기재된 마우스 발바닥 및 EDL 근육 샘플에 대해 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 비인큐베이션 | 피루베이트와 함께 1h 인큐베이션 | 글루코스와 함께 1h 인큐베이션됨 | 주요 효과 | 상호작용 | ||||
| 솔레우스 | 증권 시세 표시기 | 솔레우스 | 증권 시세 표시기 | 솔레우스 | 증권 시세 표시기 | |||
| 젖산 | 1.00 ± 0.01 | 1.00 ± 0.02 | 0.96 ± 0.03 | 0.98 ± 0.02 | 1.05 ± 0.01 | 0.99 ± 0.01 | - | - |
| 크롬 | 1.00 ± 0.04 | 1.00 ± 0.06 | 0.64 ± 0.07 ### | 0.76 ± 0.05 ### | 0.76 ± 0.07 ## | 0.88 ± 0.09 ## | p < 0.001 | - |
| PCr | 1.00 ± 0.19 | 1.00 ± 0.06 | 0.80 ± 0.12 | 1.13 ± 0.14 | 0.65 ± 0.31 | 0.75 ± 0.08 | - | - |
| PCr/(Cr + PCr) | 1.00 ± 0.20 | 1.00 ± 0.07 | 1.17 ± 0.11 | 1.25 ± 0.12 | 0.78 ± 0.36 | 0.92 ± 0.11 | - | - |
| 증권 시세 표시기 | 1.00 ± 0.03 | 1.00 ± 0.02 | 0.72 ± 0.03 ###,§§§ | 0.99 ± 0.03 * | 0.81 ± 0.06 ### | 0.85 ± 0.04 ## | - | p < 0.001 |
| 증권 시세 표시기 | 1.00 ± 0.04 | 1.00 ± 0.04 | 0.75 ± 0.05 ### | 0.92 ± 0.03 ### | 0.84 ± 0.04 ## | 0.86 ± 0.03 ## | p < 0.001 | - |
| 앰프 | 1.00 ± 0.11 | 1.00 ± 0.12 | 0.85 ± 0.15 | 0.79 ± 0.13 | 0.84 ± 0.18 | 0.75 ± 0.13 | - | - |
| 꼬마 도깨비 | 1.00 ± 0.17 | 1.00 ± 0.30 | 4.43 ± 0.67 ###,§§§ | 0.72 ± 0.29 | 3.33 ± 1.25 ##,§ | 1.08 ± 0.01 | - | p < 0.001 |
| AMP/ATP 비율 | 1.00 ± 0.12 | 1.00 ± 0.13 | 1.18 ± 0.22 | 0.81 ± 0.16 | 1.06 ± 0.23 | 0.90 ± 0.19 | - | - |
| 글리코겐 | 1.00 ± 0.08 | 1.00 ± 0.12 | 0.74 ± 0.07 (#),* | 0.80 ± 0.12 (#),* | 1.12 ± 0.10 | 1.10 ± 0.03 | p = 0.035 | - |
| pAMPK Thr172 / AMPKα2 | 1.00 ± 0.10 | 1.00 ± 0.12 | 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ | 1.55 ± 0.27 | 1.68 ± 0.19 # | 1.36 ± 0.19 | - | p = 0.002 |
| pACC Ser212 / ACC | 1.00 ± 0.18 | 1.00 ± 0.12 | 2.22 ± 0.58 ###,**,§§ | 0.96 ± 0.21 | 0.99 ± 0.15 | 0.83 ± 0.09 | - | p = 0.030 |
표 1: 2 mM 피루베이트 또는 5 mM 글루코스의 존재 하에 1시간 동안 인큐베이션된 마우스 구두창 및 EDL 근육의 대사 생존율의 비교. 비-인큐베이션된 근육을 액체 질소에서 동결되기 전에 마취되고 공급된 동물로부터 해부하였다. 분리된 근육을 BSA(0.1%), Na-피루베이트(2 mM) 및 D-만니톨(8 mM)로 보충된 KRH 완충액에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, 다른 근육은 액체 질소에서 동결되기 전에 BSA(0.1%), D-글루코스(5 mM) 및 D-만니톨(5 mM)이 보충된 KRH 완충액에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 데이터는 대사 생존력의 다양한 마커에서 관찰된 변화를 강조하기 위해 상대적 단위로 변환되었다. 배양되지 않은 마우스 발바닥 및 EDL 근육으로부터의 절대값은 아래에 제시된다. 젖산 (mmol / kg w.w) : 137.53발바닥; 139.05EDL입니다. Cr (mmol / kg w.w) : 9.35솔레우스; 8.98EDL입니다. PCr (mmol / kg w.w) : 1.50솔레; 5.20EDL입니다. PCr/(PCr+Cr): 13.98단독; 37.30EDL입니다. ATP (밀리몰 / kg w.w) : 3.07솔레우스; 4.24EDL입니다. ADP (mmol / kg w.w) : 0.60솔레우스; 0.51EDL입니다. AMP (mmol / kg w.w) : 0.18솔레우스; 0.08EDL입니다. IMP (mmol / kg w.w) : 0.07솔레우스; 0.14EDL입니다. AMP / ATP 비율 : 0.06솔레; 0.02EDL입니다. 글리코겐 (pmol/μg 단백질): 77.01발바닥; 67.56EDL입니다. 데이터는 각 그룹 내의 양방향 ANOVA에 의해 분석되었다. ###p<0.001, ##p<0.01, 및 #p<0.05 대 비인큐베이션. p<0.001, **p<0.01, 및 *p<0.05 vs 글루코스와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. §§§p<0.001, §§p<0.01 및 §p<0.05 대 EDL. 값은 ± SEM을 의미한다. n=12는 비인큐베이션된 그룹에서, n=4-6은 인큐베이션된 그룹에서이다. Cr, 크레아틴; PCr, 포스포크레아틴; w.w, 젖은 무게; h, 시간.
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Discussion
골격근에서 포도당 흡수의 온전한 조절은 전반적인 건강을 보존하는 데 중요합니다1. 따라서 근육 포도당 섭취에 대한 조사는 종종 다양한 건강 변화 개입을 평가할 때 일차 판독 수단으로 작용합니다. 여기에서는 인슐린 및 전기적으로 유도된 수축에 반응하여 마우스로부터 단리되고 배양된 단독 및 EDL 근육에서의 글루코스 흡수를 측정하기 위한 생체외 방법을 기술한다. 이 방법은 빠르고 신뢰할 수 있으며 혈액에서 발견 할 수있는 호르몬 및 기질의 잠재적으로 혼란스러운 영향으로부터 분리 된 근육 포도당 흡수율의 정확한 조사를 허용하는 인큐베이션 된 근육의 주변 환경을 정확하게 제어 할 수 있습니다. 이 방법은 많은 연구에서 수년 동안 사용되어 왔으며 근육 연구 공동체에서 널리 채택되었습니다.
생체외 인큐베이션 모델은 일반적으로 골격근에서의 글루코스 흡수보다는 글루코스 수송 능력을 평가하는 방법이 고려되었다. 인큐베이션된 근육에서의 글루코스 수송 능력은 일정 기간에 걸쳐 축적된 D-글루코스를 측정함으로써 결정될 수 있다. 그러나, 이는 D-글루코오스가 섭취 후 근육세포에서 빠르게 대사됨에 따라 문제를 제기한다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 글루코스 유사체 3-O-메틸-D-글루코오스(3-MG)는 글루코스 수송 능력을 평가하기 위해 널리 사용되어 왔으며, 3-MG는 세포 표면막을 가로질러 수송된 후에 세포 내부에서 더 이상 대사되지 않기 때문이다. 따라서, 세포내 축적 초기 속도 3-MG는 글루코스 대사 경로의 다른 단계에 의해 영향을 받지 않기 때문에 그 자체로 세포 글루코스 수송 능력의 지표로서 작용한다. 그러나, 3-MG의 사용은 3-MG가 축적되어 3-MG에 대한 막횡단 구배를 감소시키고 이어서 추가 흡수를 감소시키기 때문에 문제를 구성할 수 있다. 따라서, 막 수송 능력의 측정치를 얻기 위해, 3-MG 흡수의 초기 속도가 추정되어야 한다. 특히 수송 용량이 높은 경우에는29,30의 근육으로부터 3-MG의 유출로 인한 문제를 제기할 수 있다. 3-MG 유출의 잠재적 인 문제는 2-데옥시-D-글루코스 (2-DG)를 사용하여 피할 수 있습니다. 골격근으로 수송된 후, 2-DG는 헥소키나제 II에 의해 2-데옥시-D-글루코스-6-포스페이트(2-DG-6P)로 인산화된다. 골격근에는 글루코스-6-포파타아제가 결여되고 GLUT4는 인산화된 2-DG를 수송할 수 없기 때문에, 2-DG-6P는 근육 세포 내에 포획될 것이다. 글루코스-6-포스페이트와는 달리, 2-DG-6P는 2-DG에 대한 막횡단 구배를 유지하는 데 도움이 되는 헥소키나제 II30의 매우 약한 알로스테릭 억제제이다. 따라서, 관찰에 따르면 인큐베이션된(래트) 근육에서의 2-DG 흡수는 세포내 2-DG-6P 농도가 30mM을 초과할 때까지 선형으로 유지되며, 이는 헥소키나제 II 활성을30으로 낮추는 농도이다. 더욱이, 인큐베이션된 마우스 골격근에서 2-DG 흡수는 인큐베이션 버퍼의 온도가 37°C 이하일 때 ~30분 동안 선형으로 유지된다. 이것은 2-DG-6P 농도가 매우 높아지는 상황을 제외하고는 배양 된 근육에서 포도당 흡수보다는 포도당 수송 능력을 측정하기 위해 2-DG를 사용할 수 있음을 시사합니다 (예 : 1 mM 2-DG 및 최대 인슐린 농도 29,30으로 >2 시간 동안 배양중에 관찰됨). 2-DG 흡수가 글루코스 수송 능력을 반영할 가능성이 높다는 생각은 또한 최대 인슐린 자극된 2-DG 흡수가 헥소키나제 II32를 과발현하는 야생형 마우스 및 마우스로부터의 인큐베이션된 근육에서 유사하다는 것을 보여주는 발견에 의해 뒷받침된다. 수축 동안 근육 포도당 수송 측정을 위해 2-DG를 사용할 때 잠재적 인 관심사는 글리코겐 분해의 상승 된 속도로 인한 세포 내 글루코스 -6- 인산염 농도의 증가입니다. 그러나, (래트) 근육 2-DG 흡수의 선형 증가가 시간29에 따른 수축 동안 관찰되기 때문에, 이것은 수축 동안 글리코겐의 분해로부터 글루코스-6-포스페이트의 축적이 헥소키나제 II 활성 및 따라서 2-DG 흡수율을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다. 이를 바탕으로 2-DG는 3-MG의 한계를 고려하여 인슐린 및 수축 동안 격리 된 골격근에서의 포도당 수송 측정에 매우 적합한 것으로 보입니다.
일반적으로 2-DG가 헥소키나제 II에 의한 인산화 후에 더 이상 대사되지 않는다고 가정되지만, 일부 2-DG는 근육 글리코겐을 향하고 혼입되는 것으로 보고되었다. 따라서, 래트에서 2시간 노르모글리센성 고인슐린성 클램프가 골격근에 의해 흡수된 2-DG의 ∼30%가 글리코겐33에 혼입되는 동안 혼입된다. 따라서, 인큐베이션된 골격근에서의 인슐린 자극된 2-DG 흡수의 속도는 글리코겐에 2-DG의 축적이 무시된다면 과소평가된다고 추론될 수 있다. 우리는 이전에 배양된 골격근에서 2-DG 흡수율의 후속 분석을 위해 근육 용해물(상청액)을 제조하는 방법에 관한 본원에 기재된 프로토콜이 글리코겐 내로의 2-DG의 잠재적 혼입에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 결정하였다. 글리코겐은 2-DG 흡수 측정을 위한 용해물을 생성하기 위해 전체 근육 균질물을 원심분리할 때 펠릿에 축적된다고 주장할 수 있다. 그러나 인슐린 자극 전체 근육 균질 물과 용해물의 방사능 수준을 비교할 때 우리는 유의미한 차이 (공개되지 않은 데이터)를 감지하지 못합니다. 이는 2-DG의 1 mM에서 10분 동안 마우스 근육을 인큐베이션하는 것이 글리코겐에서 2-DG의 검출가능한 축적을 야기하지 않는다는 것을 시사한다.
2-DG가 세포외 및 세포내 공간 둘 다에 분포되어 있다는 것을 고려하지 않고 골격근 2-DG 흡수의 결정은 2-DG 흡수의 과대 평가로 이어질 것이다. 이를 피하기 위해 L- 글루코스는 세포막을 가로 질러 운반되지 않지만 질량, 용해도, 수동 확산, 결합 등을 포함하여 D- 글루코스와 유사한 특성을 나타내기 때문에 세포 외 마커로 사용해야합니다. 제조의 과도한 비용 및 따라서 L-글루코오스를 구매하기 때문에, 만니톨은 만니톨이 근육 세포에 의해 흡수되지 않기 때문에 전형적으로 세포외 마커로서 사용되고, 비교적 저렴하며, 글루코스 및 2-DG34와 다소 유사한 세포외 분포 부피를 갖는 것으로 추정된다.
내재적 세포 및 분자 시계는 전신 대사와 에너지 항상성의 조절에 필수적인 역할을 하는 것으로 보인다(35). 코어 클럭 유전자 Bmal1 의 근육 특이적 녹아웃이 단리된 마우스 골격근(36)에서 인슐린 자극된 글루코스 흡수를 손상시킨다는 것이 관찰되었다. 또한, 분리된 골격근의 서브맥스 인슐린-자극된 글루코스 흡수는 각각 광과 암상의 중간에서 가장 낮은 인슐린 반응과 가장 높은 인슐린 반응을 갖는 일주기 리듬을 나타낸다(37). 따라서 이러한 결과를 바탕으로 동물 희생 시간을 실험 설계에 통합하여 데이터의 재현성을 높이는 것이 중요합니다.
생체외 방법의 주요 단점은 단리된 근육에서 모세관 흐름의 부족이다. 이것은 다양한 기질의 전달 및 제거가 근육 섬유와 주변 환경 사이의 단순한 확산에 전적으로 의존한다는 것을 의미합니다. 결과적으로, 생체외 인큐베이션된 단리된 근육의 대사 생존력의 검증은 심부 근육 섬유뿐만 아니라 피상적으로 산소의 확산 제한에 초점을 맞추어왔다. 따라서, 인큐베이션된 근육, 특히 고도로 대사된 마우스 근육은 글리코겐의 분해가 발생하는 저산소 코어를 개발하는 경향이 있다16,17,38. Bonen과 동료15의 상세한 검토에서, 인큐베이션 된 근육의 저산소 코어는 특히 ≥ 37 °C의 온도에서 배양 할 때 적절하게 산소화되기에는 너무 두꺼운 근육을 배양 할 때 발생할 가능성이 있다고 제안되었습니다. 이로 인해 저산소 코어의 발달을 피하기 위해 발바닥과 EDL과 같은 얇고 원통형 마우스 근육 만 25-30 °C에서 배양에 사용해야한다는 권고가 나왔습니다. 이것은 질량보다는 두께와 기하학이 마우스 골격근을 배양 할 때 고려해야 할 중요한 요소임을 나타냅니다. 또한, 배양 온도, 근육 두께뿐만 아니라 ATP, 포스포크레아틴, 글리코겐 함량 및/또는 젖산염의 방출을 측정하고 일상적으로 보고하여 인큐베이션된 근육(15)의 생존력을 평가하는 것이 권고되었다. 우리의 지식에 따르면, 배양 된 근육에 대한 이러한 완전한 분석은 주로 쥐 근육 39,40,41,42에 대해보고되었으며 마우스 근육 16,17에 대해보고 된 제한된 정도까지만보고되었습니다. 인큐베이션된 마우스 골격근에서 생존력의 다양한 대사 마커에 대한 통찰력을 증가시키기 위해, 글루코스 또는 피루베이트가 보충된 KRH 완충액에서 1시간 배양한 후 단독 및 EDL 근육에서 락테이트, 크레아틴, 포스포크레아틴, 아데노신 뉴클레오티드, 글리코겐 및 AMPK 신호전달의 세포내 함량의 가능한 변화를 평가하였다. 인큐베이션된 마우스 올레우스 및 EDL 근육17에서의 이전의 발견과 유사하게, 우리는 근육이 글루코스-프리 배지에서 배양될 때 글리코겐 수준이 감소하는 것을 관찰하였다. 이는 인큐베이션 동안 글루코스의 부재가 글리코겐 분해를 촉진하고 특히 산소 공급이 부적절할 경우 ATP 생산을 확보하는 작용을 할 수 있는 글리코오스-6-포스페이트의 후속 진입을 촉진한다는 것을 나타낸다. 더욱이, 우리는 인큐베이션된 솔레우스 및 EDL 근육에서 ATP 및 ADP 뉴클레오티드 풀의 전반적인 감소를 발견하였다. 이는 산소 공급이 글루코스의 존재 및 부재 모두에서 인큐베이션된 마우스 근육의 요구를 충족시키기에 완전히 충분하지 않다는 것을 암시할 수 있다. 산화성 구두근은 글리콜 성 EDL 근육에 비해 ATP 생산을 위해 산소에 더 많이 의존하기 때문에, 이것은 발바닥 근육이 인큐베이션 절차에 의해 더 큰 정도로 영향을 받는다는 것을 암시 할 것이다. 동의하여, 우리는 IMP의 세포 내 수준뿐만 아니라 AMPK 신호 전달이 포도당이없는 상태에서 배양되었을 때 EDL 근육에 비해 단독에서 현저하게 증가한다는 것을 발견했습니다. 이는 구두근이 인큐베이션 동안 더 높은 수준의 대사 스트레스를 나타낸다는 것을 의미하며, 이는 생체외 마우스 근육 모델로부터의 데이터를 평가할 때 고려되어야 한다.
불멸화 L6 및 C2C12 뿐만 아니라 일차 인간 근관을 포함하는 배양된 근육 세포는 인슐린 자극 근육 글루코스 흡수에 대한 다양한 유전적 및 약리학적 조작의 효과를 연구하기 위해 성숙한 골격근의 대리물로 일반적으로 사용된다. 그러나, 여러 가지 방법으로 배양된 근육 세포는 성숙한 골격근과 닮지 않으며, 두 모델 시스템을 비교할 때 수많은 차이가 명백해진다. 여기에는 단백질 발현, 치수 구조, 주변 환경, 증식 및 분화 상태, 섬유 유형 조성, 대사 과정 및 기능적 특성(43 )의 차이가 포함되며, 이들 모두는 근육 세포가 다양한 자극에 반응하여 글루코스 흡수를 조절하는 방법에 영향을 미칠 수 있다. 전형적으로, 배양된 근육 세포(44 )에 비해 성숙한 골격근에서 글루코스 흡수율에 대한 인슐린의 더 큰 상대적 효과가 관찰되며, 이는 배양된 근육 세포가 인슐린 민감성 글루코스 수송체 GLUT443의 높은 수준의 발현을 포함하여 글루코스 흡수율을 조절하는 기계가 어느 정도 부족하다는 것을 나타낼 수 있다. . 배양된 근육 세포 및 단리된 골격근의 사용과 관련된 한계 및 주의 사항을 고려하면, 따라서 글루코스 흡수와 같은 다양한 근육 대사 과정을 연구할 때 결합된 접근법을 취하는 것이 유리할 가능성이 높다.
솔레우스와 EDL 근육은 일반적으로 각각 느린 근육과 빠른 경련 근육의 대표로 간주됩니다. 따라서 이러한 근육 유형은 근육력과 피로 발달에 영향을 미치는 중재를 조사하려는 기계적 연구에 이상적입니다. 더욱이, 솔레우스 근육은 전형적으로 EDL 근육에 비해 향상된 인슐린 민감성 및 반응성을 갖는 것으로 보고되고, 따라서, 인슐린 감수성을 표적으로 하는 개입은 발바닥과 EDL에 다르게 영향을 미칠 수 있다. 또한, 상이한 AMPK 복합체의 상대적 분포는 단독 및 EDL 근육 사이에서 상이하며, 이는 근육 글루코스 흡수를 증가시키는 AMPK 활성화 화합물의 능력에 영향을 미치는 것으로 보인다. 따라서, 근육 글루코스 흡수의 조절에 대한 가장 큰 통찰력은 생체외 인큐베이션 모델을 사용한 실험 동안 단독 및 EDL 근육이 모두 사용되는 경우에 달성될 가능성이 높다.
본원에 기재된 방법은 균질화 후 각 근육 샘플에서 결정된 총 단백질 풍부도의 양에 대한 글루코스 흡수에 관한 것이다. 근육 중량 대신 근육 단백질 양 당 포도당 섭취와 관련이있을 때 변이가 감소한다는 것은 우리의 경험입니다 (공개되지 않은 데이터). 또한, 다양한 생화학적 분석에 사용되는 완충액 내의 근육 샘플의 균질화는 동일한 샘플 제제(45,46)에서 글루코스 흡수, 근세포 신호전달 및 효소 활성 둘 다를 결정할 수 있게 한다. 이것은 종종 연구에 사용되는 마우스의 양을 감소시킬 것입니다. 그럼에도 불구하고, 글루코스 흡수는 수산화나트륨(NaOH)에서 가열한 후 염화수소(20)로 중화시킴으로써 용해되는 골격근 샘플에서 용이하게 결정될 수 있다. NaOH로 근육을 치료하는 것은 총 근육 단백질 농도의 측정을 방해하기 때문에,이 절차에 의해 측정 된 포도당 수송은 근육 무게와 관련되어야합니다.
다양한 최적화를 바탕으로, 우리의 포도당 흡수 배양 완충액은 0.028 MBq/mL의 [3H]2-데옥시-D-글루코오스와 0.0083 MBq/mL의 [14C]만니톨의 특정 활성을 함유한다. 한편으로, 이것은 충분하고 신뢰할 수있는 방사능 측정을 얻기 위해 필요한 용해물 (400 μL 중 150 개)의 양을 줄입니다. 한편, 각 실험에 필요한 방사성 [3H]2-데옥시-D-글루코오스 및 [14C]만니톨의 양이 증가하여 실험 비용이 증가합니다. 따라서, 임의의 실험 셋업을 위해 글루코스 흡수 인큐베이션 배지에 사용되는 방사능의 양을 특정 요건에 맞게 조절할 수 있다. 그러나 인큐베이션 버퍼의 방사능 양을 방사능 측정을 신뢰할 수 없게 만드는 정도로 줄이지 않도록 주의해야 합니다. 이것은 샘플에서 방사능을 사용 된 액체 섬광 계수 기계의 지정된 검출 한계보다 높게 유지함으로써 보장됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 덴마크 독립 연구 협의회 (FSS8020-00288B)와 노보 노디스크 재단 (NNF160C0023046)의 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구는 또한 덴마크 당뇨병 아카데미의 Rasmus Kjøbsted에 대한 연구 보조금에 의해 지원되었으며, Novo Nordisk Foundation, 보조금 번호 NNF17SA0031406이 자금을 지원합니다. 저자는 Karina Olsen, Betina Bolmgren, Irene Bech Nielsen (영양학과, 운동 및 스포츠학과, 과학 학부, 코펜하겐 대학)에게 숙련 된 기술 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [14C]D-mannitol | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-deoxy-D-glucose | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP non-sterile surgical nylon suture | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| Streptavidin/HRP (Conjugate) | DAKO | P0397 | Used to detect ACC protein |
| Akt2 antibody | Cell Signaling | 3063 | |
| AMPKα2 antibody | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6505 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Calibration kit (force) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| Chemiluminescence | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glucose | Merck | 1084180100 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Data collection program | National Instruments | LabVIEW software version 7.1 | |
| Dialysis tubing | Visking | DTV.12000.09 Size No.9 | |
| Digital imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Electrical Pulse Stimulator | Digitimer | D330 MultiStim System | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| Insulin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Muscle Strip Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 820MS | |
| Na-Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Na-Pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Na-Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 antibody | Cell Signaling | 3661 | |
| pAkt Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | |
| pAMPK Thr172 antibody | Cell Signaling | 2531 | |
| phenylmethylsulfonylfluoride | Sigma | P7626 | |
| Platinum electrodes | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 antibody | Cell Signaling | 8730 | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Scintillation fluid | Perkin Elmer | 6013329 | |
| Statistical analyses software | Systat | SigmaPlot version 14 | |
| TBC1D4 antibody | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q Reference A+ System | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
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