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Biology

Messung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln von Mäusen

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

Eine intakte Regulierung der Muskelglukoseaufnahme ist wichtig für die Aufrechterhaltung der Ganzkörperglukose-Homöostase. Dieses Protokoll stellt die Bewertung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln dar, wenn die Auswirkungen verschiedener physiologischer Interventionen auf den Glukosestoffwechsel des ganzen Körpers beschrieben werden.

Abstract

Die Skelettmuskulatur ist ein insulinansprechendes Gewebe und nimmt typischerweise den größten Teil der Glukose auf, die nach einer Mahlzeit in das Blut gelangt. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Skelettmuskulatur die Extraktion von Glukose aus dem Blut während des Trainings im Vergleich zu Ruhebedingungen um das bis zu 50-fache erhöhen kann. Die Erhöhung der Muskelglukoseaufnahme während des Trainings und der Insulinstimulation hängt von der Translokation des Glukosetransporters 4 (GLUT4) von intrazellulären Kompartimenten zur Muskelzelloberflächenmembran sowie der Phosphorylierung von Glukose zu Glucose-6-phosphat durch Hexokinase II ab. Die Isolierung und Inkubation von Mausmuskeln wie M. soleus und M . extensor digitorum longus (EDL) ist ein geeignetes Ex-vivo-Modell, um die Auswirkungen von Insulin und elektrisch induzierter Kontraktion (ein Modell für Bewegung) auf die Glukoseaufnahme in reifen Skelettmuskeln zu untersuchen. So ermöglicht das Ex-vivo-Modell die Bewertung der Muskelinsulinsensitivität und ermöglicht es, die Muskelkraftproduktion während der Kontraktion anzupassen, um eine gleichmäßige Rekrutierung von Muskelfasern während der Messung der Muskelglukoseaufnahme zu gewährleisten. Darüber hinaus eignet sich das beschriebene Modell für pharmakologische Wirkstofftests, die sich auf die Insulinsensitivität der Muskeln auswirken oder hilfreich sein können, wenn es darum geht, die regulatorische Komplexität der Glukoseaufnahme der Skelettmuskulatur abzugrenzen.

Hier beschreiben und liefern wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Soleus- und EDL-Muskelpräparaten von Mäusen unter Verwendung von radioaktiv markierter [3H]2-Desoxy-D-Glucose und [14C]Mannitol als extrazellulärem Marker. Dies ermöglicht eine genaue Beurteilung der Glukoseaufnahme in reifer Skelettmuskulatur in Abwesenheit von Störfaktoren, die das intakte Tiermodell stören können. Darüber hinaus liefern wir Informationen über die metabolische Lebensfähigkeit der inkubierten Mausskelettmuskulatur, was darauf hindeutet, dass die angewandte Methode unter bestimmten Bedingungen bei der Untersuchung des Muskelenergiestoffwechsels einige Vorbehalte aufweist.

Introduction

Die Skelettmuskulatur besitzt die Fähigkeit, große Mengen Glukose aus dem extrazellulären Raum als Reaktion auf Insulin und Bewegung zu extrahieren. Dies trägt zur Aufrechterhaltung der Ganzkörper-Glukosehomöostase bei und sichert die Glukoseversorgung in Zeiten hohen Energiebedarfs. Da sich eine intakte Regulation der Glukoseaufnahme der Skelettmuskulatur als wichtig für die allgemeine Gesundheit und körperliche Leistungsfähigkeiterwiesen hat 1,2, haben Messungen der Muskelglukoseaufnahme unter verschiedenen Bedingungen viel Aufmerksamkeit erhalten. Bei Menschen und Tieren wurde die hyperinsulinämisch-euglykämische Klemme als Goldstandardtechnik zur Beurteilung der Insulinsensitivität in vivo 3,4 verwendet. Im Gegensatz zu den Erkenntnissen aus einem oralen Glukosetoleranztest erfordert die hyperinsulinämisch-euglykämische Klemmtechnik keine intakte gastrointestinale Funktion oder Insulinsekretion aus der Bauchspeicheldrüse und ermöglicht somit den Vergleich der Insulinreaktionen zwischen Probanden, die Variationen in der Magen-Darm- und/oder Pankreasfunktion aufweisen. Messungen der Muskelglukoseaufnahme in vivo während des Trainings beim Menschen werden seit den 1960er Jahren häufig durchgeführt5. Zunächst durch den Einsatz von arteriovenösen Gleichgewichtstechniken6 und später durch den Einsatz der Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Bildgebung in Kombination mit einem positronenemittierenden Glukoseanalogon, z.B. 18F-Fluor-Desoxy-Glucose7. Bei Nagetieren wird die trainingsstimulierte Muskelglukoseaufnahme in vivo typischerweise durch die Verwendung von radioaktiven oder stabilen isotopenmarkierten Glukoseanaloga 8,9,10 durchgeführt.

Eine ergänzende Methode zur Messung der Muskelglukoseaufnahme in vivo besteht darin, kleine Muskeln von Nagetieren zu isolieren und zu inkubieren und anschließend die Glukoseaufnahme mit radioaktiven oder stabilen isotopenmarkierten Glukoseanaloga11,12,13 zu messen. Diese Methode ermöglicht eine genaue und zuverlässige Quantifizierung der Glukoseaufnahmeraten in reifen Skelettmuskeln und kann in Gegenwart verschiedener Insulinkonzentrationen und während der durch elektrische Stimulation ausgelösten Kontraktion durchgeführt werden. Noch wichtiger ist, dass Messungen der Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Skelettmuskeln von Bedeutung sind, wenn der metabolische Phänotyp der Muskeln untersucht wird, die verschiedenen Interventionen unterzogen wurden (z. B. Ernährung, körperliche Aktivität, Infektion, Therapeutika). Das isolierte Skelettmuskelmodell ist auch ein geeignetes Werkzeug für pharmakologische Verbindungstests, die die Glukoseaufnahme per se beeinflussen und/oder die Insulinsensitivität modifizieren können12,14. Auf diese Weise kann die Wirksamkeit von Verbindungen zur Regulierung des Muskelglukosestoffwechsels in einem hochkontrollierten Milieu getestet und bewertet werden, bevor anschließend in vivo in präklinischen Tiermodellen getestet wird.

Unter bestimmten Bedingungen kann die metabolische Lebensfähigkeit eine Herausforderung im isolierten und inkubierten Skelettmuskelmodellsystem darstellen. In der Tat bedeutet das Fehlen eines Kreislaufsystems in den inkubierten Muskeln, dass die Zufuhr von Substraten (z. B. Sauerstoff und Nährstoffen) vollständig von einer einfachen Diffusion zwischen den Muskelfasern und der Umgebung abhängt. In diesem Zusammenhang ist es von Bedeutung, dass die inkubierten Muskeln klein und dünn sind und daher weniger eine Barriere für die Sauerstoffdiffusion während der Inkubationdarstellen 15. Insbesondere bei längerer Inkubation über mehrere Stunden können sich aufgrund unzureichender Sauerstoffversorgung hypoxische Zustände entwickeln, die zu einem Erschöpfung der Muskelenergie führen15. Obwohl verschiedene Marker der metabolischen Lebensfähigkeit in inkubierten Rattenmuskeln bereits berichtet wurden, zusammen mit der Identifizierung wichtiger Variablen, die zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Rattenmuskeln beitragen15, ist eine umfassende Bewertung der metabolischen Lebensfähigkeit in kleinen inkubierten Mausmuskeln immer noch gerechtfertigt. Daher wird der Glykogengehalt derzeit hauptsächlich als Marker für die metabolische Lebensfähigkeit in inkubierten Mausskelettmuskelnverwendet 16,17.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der basalen, insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Soleus- und EDL-Muskeln von Mäusen unter Verwendung von radioaktiv markierter [3H]2-Desoxy-D-Glucose und [14C]Mannitol als extrazellulärem Marker. In der vorliegenden Studie wurde die Glukoseaufnahme während eines Zeitraums von 10 Minuten gemessen und die Methode wird unter Verwendung submaximaler und maximal wirksamer Insulinkonzentrationen sowie eines einzigen Kontraktionsprotokolls vorgestellt. Die hierin beschriebenen Protokolle können jedoch leicht in Bezug auf Inkubationszeit, Insulindosierung und elektrisches Stimulationsprotokoll modifiziert werden. Darüber hinaus bieten wir eine gründliche Charakterisierung verschiedener Marker der metabolischen Lebensfähigkeit in inkubiertem Soleus- und EDL-Mausmuskel. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Glukoseergänzung zum Inkubationspuffer unerlässlich ist, um die metabolische Lebensfähigkeit des für 1 Stunde inkubierten Muskels zu erhalten.

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Protocol

Verfahren mit Versuchstieren sollten in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und den lokalen Rechtsvorschriften durchgeführt werden. Alle für diese Studie verwendeten Tierversuche entsprachen der Europäischen Konvention zum Schutz von Wirbeltieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, und wurden von der dänischen Tierversuchsinspektion genehmigt.

1. Vorbereitung der Versuchsapparatur und der Nahtschlaufen

HINWEIS: Verwenden Sie für diese Studie ein integriertes Muskelstreifen-Myographiesystem mit maßgeschneiderten Inkubationshaken, um isolierte Mausskelettmuskeln zu inkubieren (Abbildung 1). Dieses System ermöglicht es dem Muskel, in einer physiologischen Lösung mit kontinuierlicher Sauerstoffversorgung (95%O2 und 5% CO2) und bei konstanter Temperatur zu baden. Das Muskelgewebebad ist mit einem Kraftaufnehmer zur Messung der Muskelkraftproduktion während der Kontraktion gekoppelt. Um myomechanische Reaktionen während der Kontraktion hervorzurufen und aufzuzeichnen, verwenden Sie einen elektrischen Pulsstimulator bzw. ein Datenerfassungsprogramm. Stimulieren Sie die inkubierten Muskeln, sich durch Platinelektroden zusammenzuziehen, die zentral und auf beiden Seiten des Muskels positioniert sind.

  1. Schalten Sie das Myographensystem ein und erwärmen Sie die Kammern auf 30 °C. Offene Datenerfassungssoftware, die mit dem Myographensystem kompatibel ist, und kalibrieren Sie Kraftaufnehmer, um die Vergleichbarkeit zwischen Datensätzen zu gewährleisten.
  2. Beginnen Sie mit dem Schneiden von ~ 16 cm Strängen nicht resorbierbarer chirurgischer Nylonnähte. Verwenden Sie eine Pinzette, um aus einem einzelnen Strang eine Schleife von etwa 0,4 cm Durchmesser zu erzeugen. Wiederholen Sie dies, bis genügend Schleifen erzeugt wurden. Jeder Muskel benötigt zwei Schlaufen - eine für die proximale und eine für die distale Sehne.

2. Aufbereitung von Lösungen und Inkubationsmedien

  1. Aufbereitung von basalen Inkubationsmedien
    1. Bereiten Sie die folgenden Stammlösungen vor: 2,5 M Natriumchlorid (NaCl, 250 ml), 0,5 M Natriumbicarbonat (NaHCO 3, 250 ml), 0,5 M Kaliumchlorid (KCl, 50 ml), 0,25 m Calciumchlorid (CaCl2, 50 ml), 0,25 M Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4, 50 mL), 0,25 M Magnesiumsulfat (MgSO4,50 ml), 110 mM Natriumpyruvat (Na-Pyruvat, 100 ml), 500 mM D-Mannitol (100 ml), 1 M 2-Desoxy-D-glucose (4 ml), 15%ige Lösung von Rinderserumalbumin (BSA), dialysiert gegen Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) Puffer (unten in Schritt 4 beschrieben) (100 ml).
      HINWEIS: Zwei Lösungen sind erforderlich, um die Ruhe- und kontraktionsstimulierte Glukoseaufnahme zu messen. Darüber hinaus erfordert jede einzelne Insulinkonzentration, die zur Beurteilung der insulinstimulierten Glukoseaufnahme verwendet wird, zwei Lösungen. Daher werden insgesamt sechs verschiedene Lösungen benötigt, um die basale, submaximale Insulin-, maximale Insulin- und kontraktionsstimulierte Glukoseaufnahme in isolierten Mausskelettmuskeln zu messen. Im Folgenden bezieht sich "basale Inkubationsmedien" auf Medien ohne Insulin oder radioaktive Tracer. "Inkubationsmedien" bezieht sich auf Medien, die Insulin enthalten. "Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien" bezieht sich auf Medien, die neben Insulin zusätzlich zu Insulin 2-Desoxy-D-Glucose und radioaktive Tracer in einer Konzentration enthalten, die mit der in den "Inkubationsmedien" verwendeten Konzentration identisch ist.
    2. Bereiten Sie einen KRH-Puffer vor, indem Sie Reinstwasser (ddH 2 O) mit NaCl (117 mM),NaHCO 3 (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl 2 (2,5 mM), KH 2 PO 4 (1,2 mM) und MgSO4 (1,2mM) ergänzen. Anschließend wird der KRH-Puffer mit 95% O2 und 5%CO2 für mindestens 10 min abgegast. Der gewünschte pH-Wert des KRH-Puffers sollte zwischen 7,35-7,45 bei 30 °C liegen. Wenn die pH-Einstellung bei Raumtemperatur durchgeführt wird, sollte der pH-Wert des KRH-Puffers zwischen 7,25 und 7,35 liegen.
    3. BSA (0,1%), Na-Pyruvat (2 mM) und D-Mannit (8 mM) in den begasten und pH-angepassten KRH-Puffer geben, um die basalen Inkubationsmedien zu vervollständigen. Lagern Sie basale Inkubationsmedien in einem verschlossenen Behälter, um die Entgasung vonO2 und CO 2 zu minimieren, und legen Sie die Medien bei 30 °C auf.
      HINWEIS: Typischerweise wird die Osmolarität der KRH-Ergänzungen (dh Na-Pyruvat, D-Mannit und D-Glukose) über ein gesamtes Experiment konstant gehalten, um eine Schrumpfung oder Ausdehnung der Muskelzellen zu vermeiden. Das hierin beschriebene Protokoll verwendet eine Osmolarität von 10 mM für die KRH-Ergänzungen. Wenn ein glukosehaltiger Puffer benötigt wird, ersetzen Sie KRH-Ergänzungen, um den Bedarf zu decken, z. B. 5 mM D-Glucose und 5 mM D-Mannitol.
    4. Um mögliche BSA-assoziierte Verunreinigungen im Inkubationspuffer zu vermeiden, dialysieren Sie BSA gegen KRH.
      1. Um eine 15%ige BSA-Stammlösung herzustellen, die gegen KRH-Puffer dialysiert wird, lösen Sie zunächst 300 g fettfreies BSA in analytischer Qualität in 900 ml KRH-Puffer auf. Als nächstes kochen Sie das Dialyserohr in destilliertem Wasser, bis der Schlauch weich ist.
      2. Füllen Sie den Schlauch mit der BSA-KRH-Lösung und sichern Sie die Schlauchenden. Legen Sie den Schlauch mit BSA-KRH in 5 L KRH-Puffer und lassen Sie ihn über Nacht bei 4 °C stehen. Am nächsten Tag den KRH-Puffer austauschen und den Schlauch mit BSA-KRH im KRH-Puffer über Nacht bei 4 °C belassen.
      3. Sammeln Sie schließlich die BSA-KRH-Lösung aus dem Schlauch und fügen Sie KRH-Puffer zu einem Endvolumen von 2 L hinzu (d. h. 15% BSA-KRH-Stammlösung). Teilen Sie die 15% BSA-KRH-Lagerlösung in Aliquots auf und lagern Sie sie im Gefrierschrank bei ~-20 °C.
  2. Herstellung von insulinhaltigen Inkubationsmedien
    1. Für die Inkubationsmedien, die eine submaximal wirksame Insulinkonzentration enthalten, fügen Sie 1 μL einer 100 mU/ml Insulinstammlösung pro ml basaler Inkubationsmedien (100 μU/ml Insulin) hinzu.
    2. Für die Inkubationsmedien, die eine maximal wirksame Insulinkonzentration enthalten, fügen Sie 1 μL einer 10 E/ml Insulin-Stammlösung pro ml basaler Inkubationsmedien (10 mU/ml Insulin) hinzu.
  3. Herstellung von Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien
    ACHTUNG: Der Umgang mit radioaktivem Material ist nur in einem eingeschränkten und kontrollierten Bereich durch autorisiertes Personal erlaubt und einige Universitäten, Forschungseinrichtungen und Unternehmen können den Erwerb einer "Radioaktivitätsnutzungserlaubnis" verlangen. Material und Abfall müssen gemäß den entsprechenden lokalen Verfahren, Richtlinien und Gesetzen behandelt werden.
    1. Befolgen Sie das gleiche Verfahren wie in Abschnitt 2.1.2 beschrieben.
    2. BSA (0,1%), Na-Pyruvat (2 mM), D-Mannit (7 mM) und 2-Desoxy-D-Glucose (1 mM) in den begasten und pH-eingestellten KRH-Puffer geben.
    3. [3H]2-Desoxy-D-glucose (0,028 MBq/ml) und [14C]Mannit (0,0083 MBq/ml) in den ergänzten KRH-Puffer geben, um die Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien zu vervollständigen. Bei 30 °C lagern. Wenn [3H]2-Desoxy-D-glucose und [14C]Mannit in Ethanol gelöst sind, entfernen Sie das Ethanol durchN2-vermittelte Verdampfung vor der Verwendung.
    4. Für die Glukoseaufnahmeinkubationsmedien, die eine submaximal wirksame Insulinkonzentration enthalten, fügen Sie 1 μL einer 100 mU/ml Insulinvorratslösung pro ml Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien (100 μE/ml Insulin) hinzu.
    5. Für die Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien, die eine maximal wirksame Insulinkonzentration enthalten, fügen Sie 1 μL einer 10 E/ml Insulinstammlösung pro ml Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien (10 mU/ml Insulin) hinzu.

3. Tiere und Dissektion des Maus-Soleus und des EDL-Muskels für die Inkubation

HINWEIS: Verfahren mit Versuchstieren sollten in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und lokalen Rechtsvorschriften durchgeführt werden. Das beschriebene Verfahren kann mit hauseigenen gezüchteten oder kommerziell erhältlichen männlichen und weiblichen Mäusen verschiedener Stämme und genetischer Hintergründe angewendet werden. Das folgende Verfahren wird für gefütterte weibliche C57Bl/6J-Mäuse bereitgestellt. Im Durchschnitt waren Mäuse 19 Wochen alt und wogen 25 g. Die Mäuse wurden in einem 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Standard-Nagetier-Chow und Wasser gehalten. Tierversuche wurden um ~ 9:00 Uhr Ortszeit begonnen und alle Tiere wurden innerhalb eines Zeitraums von 2 h geopfert.

  1. Geben Sie 4 ml vorerwärmte (30 °C) basale Inkubationsmedien in jede Inkubationskammer und stellen Sie sicher, dass die basalen Inkubationsmedien kontinuierlich mit 95%O2 und 5% CO2 oxygeniert sind.
  2. Anästhesien von Mäusen mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (10 mg/100 g Körpergewicht) oder einer anderen verfügbaren Anästhesie (z. B. Tribromethanol).
    HINWEIS: Beachten Sie, dass in einigen Ländern eine Lizenz für den Umgang mit Pentobarbital und anderen Anästhetika erforderlich sein kann. Bevor eine Muskeldissektion eingeleitet werden kann, muss die Anästhesie jedes Tieres richtig induziert werden. Um dies zu gewährleisten, werden Schwanz- und Beinreflexe getestet. Für optimale Ergebnisse sollte die Dissektion gut geübt werden, um eine Schädigung der Muskeln während der Entfernung zu vermeiden.
  3. Anästhesierte Mäuse, die anfällig sind, auf ein Dissektionstablett (z. B. Styropordeckel) legen und die Vorder- und Hinterpfoten bei Bedarf mit einer Nadel feststecken.
  4. Entfernen Sie die Haut vom Unterschenkel und stellen Sie sicher, dass sowohl die Achillessehne als auch das Kniegelenk sichtbar sind.
    1. Für die Dissektion des Musculus soleus befestigen Sie zunächst eine einzelne Nahtschaufe an der Achillessehne. Befestigen Sie eine Pinzette an der Achillessehne distal der Nahtschaufe und schneiden Sie sie ab, um die Muskeln Soleus und Gastrocnemius von der Pfote zu lösen. Schieben Sie vorsichtig die Pinzette über die Maus und legen Sie dabei den Musculus soleus frei.
    2. Stecken Sie die Pinzette der Pinzette ab und legen Sie eine zweite Nahtschaufe um die proximale Sehne des Musculus soleus. Als nächstes schneiden Sie die proximale Sehne ab und sezieren Sie Soleus (einschließlich der beiden angebrachten Nahtschlaufen) frei von Magen-Magen-Darm-Muskel. Legen Sie den Musculus soleus schnell in die Inkubationskammer, indem Sie jede Nahtschaufe an den jeweiligen Haken befestigen.
  5. Entfernen Sie die Faszie, die den m. tibialis anterior (TA) bedeckt, mit einer Pinzette. Wenn es richtig gemacht wird, sollten distale Sehnen der TA- und EDL-Muskeln klar weiß und sichtbar sein; und voneinander getrennt.
  6. Schneiden Sie die distale Sehne des TA-Muskels ab und sezieren Sie den Muskel für spätere Analysen (z. B. Genotypisierung) ab. Befreien Sie mit einer Pinzette sanft den EDL-Muskel aus dem umgebenden Gewebe, lassen Sie den Muskel jedoch intakt und schneiden Sie die Sehnen nicht durch. Legen Sie eine Nahtschelle um die distale Sehne und eine zweite Nahtschelle um die proximale Sehne von EDL.
  7. Als nächstes schneiden Sie die Sehnen, die den EDL-Muskel lösen, mit zwei angebrachten Nahtschlaufen ab und legen Sie den Muskel schnell in die Inkubationskammer, indem Sie jede Nahtschelle an den jeweiligen Haken befestigen. Um die Spannung während der Inkubation und insbesondere bei der elektrisch induzierten Kontraktion der Soleus- und EDL-Muskulatur nicht zu verlieren, ist es von großer Bedeutung, die Nahtschlaufen um die Sehnen mit engen Knoten zu fixieren.
  8. Zum Schluss das Tier einschläfern, z.B. durch Zervixdislokation.
  9. Wenn die Muskeln seziert und in Inkubationskammern platziert wurden, passen Sie die Ruhespannung jedes Muskels auf ~ 5 mN an und inkubieren Sie die Muskeln für mindestens 10 Minuten vor, bevor Sie das experimentelle Protokoll einleiten.

4. Insulin-stimulierte Glukoseaufnahme in isolierter Maus-Skelettmuskulatur

  1. Nach Schritt 3.9 werden die basalen Inkubationsmedien durch Inkubationsmedien ersetzt, die kein Insulin enthalten (basale Inkubationsmedien), eine submaximal wirksame Insulinkonzentration oder eine maximal wirksame Insulinkonzentration und 20 min in den Inkubationskammern belassen. Räumen Sie jede Inkubationskammer um 1 min auf und verschaffen Sie sich so Zeit für die anschließende Muskelernte.
  2. Ersetzen Sie am Ende der 20-minütigen Stimulationsperiode die Inkubationsmedien durch die Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien mit einer identischen Insulinkonzentration und lassen Sie sie 10 Minuten in den Inkubationskammern, wiederum mit einem Abstand von 1 min zwischen den einzelnen Inkubationskammern.
  3. Nach 10 min Inkubation in den Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien entfernen Sie vorsichtig die Muskeln aus den Inkubationskammern und waschen sie in eiskalten basalen Inkubationsmedien. Anschließend trocknen Sie die Muskeln schnell auf Filterpapier, bevor die Nahtschlaufen entfernt und die Muskeln in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Es ist zwingend erforderlich, dass die inkubierten Muskeln schnell geerntet werden, wenn man neben der Glukoseaufnahme auch verschiedene intrazelluläre Metaboliten und Proteinsignale untersuchen möchte.
  4. Sammeln Sie 100 μL der Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien aus jeder Inkubationskammer und lagern Sie sie bei -20 °C. Die Menge an Radioaktivität in diesen Proben wird in die Berechnung der Muskelglukoseaufnahme einbezogen.

5. Kontraktionsstimulierte Glukoseaufnahme in isolierten Mausskelettmuskeln

HINWEIS: Um eine Kontraktion der isolierten Mausskelettmuskulatur zu induzieren, verwenden Sie das folgende Protokoll: 1 Zug/15 s, jeder Zug 1 s lang, bestehend aus 0,2 ms Impulsen, die bei 100 Hz abgegeben werden. Andere ähnliche Protokolle, die eine Kontraktion der isolierten Mausskelettmuskulatur hervorrufen, werden jedoch wahrscheinlich auch funktionieren. Wichtig ist, dass die Spannung angepasst wird, um eine maximale Kraftentwicklung des inkubierten Muskels zu erzeugen, die vom Versuchsaufbau abhängig ist. Wenn dies nicht gewährleistet ist, riskieren Sie, dass sich nicht alle Fasern des Muskels zusammenziehen. Dies wiederum kann zu Verzerrungen im Datensatz führen.

  1. Nach Schritt 3.9 platzieren Sie die Platinelektroden zentral und auf beiden Seiten der Muskeln. Beginnen Sie die Kontraktion der Muskeln unmittelbar nach dem Ersetzen der basalen Inkubationsmedien durch die Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien. Wenn möglich, räumen Sie jede Inkubationskammer um 1 min und verschaffen Sie sich so Zeit für die anschließende Muskelernte. Denken Sie daran, die Kraftproduktion von jedem inkubierten Muskel aufzuzeichnen.
  2. Entfernen Sie nach 10 Minuten Kontraktion in den Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien die Platinelektroden, sammeln Sie die Muskeln vorsichtig aus den Inkubationskammern und waschen Sie sie in eiskalten basalen Inkubationsmedien. Anschließend trocknen Sie die Muskeln schnell auf Filterpapier, bevor die Nahtschlaufen entfernt und die Muskeln in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Der gesamte Muskelerntevorgang sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden.
  3. Sammeln Sie 100 μL der Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien aus jeder Inkubationskammer und lagern Sie sie bei -20 °C. Die Menge an Radioaktivität in diesen Proben wird in die Berechnung der Muskelglukoseaufnahme einbezogen.

6. Homogenisierung und Verarbeitung der Skelettmuskulatur

HINWEIS: Das unten angegebene Verfahren zur Muskelhomogenisierung ermöglicht es, sowohl die Glukoseaufnahme als auch die myozelluläre Signalgebung durch Western Blotting in denselben Muskelproben zu bestimmen.

  1. Homogenisieren Sie jeden Muskel in 400 μL eiskaltem Puffer mit einem pH-Wert von 7,5, der 10% Glycerin, 20 mM Natriumpyrophosphat, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (gelöst in Isopropanol), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-Glycerophosphat, 10 mM Natriumfluorid (NaF), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Glykoletherdiamintetraessigsäure (EGTA), 10 μg/ml Aprotinin, 10 μg/ml Leupeptin, 3 mM Benzamidin und 2mM Natriumorthovanadat unter Verwendung von Stahlperlen und einem Tissuelyser (2 x 45 s bei 30 Hz). Drehen Sie alle Homogenate Ende über Ende für 1 h bei 4 °C, danach werden sie bei 16.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Sammeln Sie das Lysat (Überstand), das zur Bestimmung der Muskelglukoseaufnahme verwendet wird.

7. Bestimmung von radioaktiv markiertem 2-Desoxyglucose und Mannitol

  1. Fügen Sie 150 μL jedes Muskellysats und 25 μL der Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien aus jeder Inkubationskammer hinzu, um flüssige Szintillationszählfläschchen mit 2 ml flüssiger Szintillationsflüssigkeit zu trennen. Bereiten Sie außerdem zwei blinde Kontrollfläschchen vor, die nur 3 ml flüssige Szintillationsflüssigkeit enthalten. Schließen Sie alle Fläschchen und mischen Sie gründlich, indem Sie jede Durchstechflasche für ~ 5 s vorwirbeln.
  2. Geben Sie die Durchstechflaschen in einen flüssigen Szintillationszähler und messen Sie die Radioaktivität von [3H]2-Desoxy-D-Glucose und [14C]Mannitol gemäß den Richtlinien des Herstellers. Notieren Sie DPM (Zerfälle pro Minute) für jede flüssige Szintillationsfläschchen.

8. Berechnung der Muskelglukoseaufnahmeraten

  1. Verwenden Sie das Lysat aus Schritt 6.1, um die Gesamtproteinkonzentration in jeder Muskelprobe mit Standard-Proteinquantifizierungsmethoden (z. B. Bicinchoninsäure- oder Bradford-Assays) zu messen. Berechnen Sie die Menge an Protein (mg), die jeder Szintillationsdurchstechflasche zugesetzt wird.
    HINWEIS: Die Rate der Glukoseaufnahme für jede Muskelprobe wird berechnet, indem die Menge an [3 H]2-Desoxy-D-Glucose im extrazellulären Raum von der Gesamtmenge an [3H]2-Desoxy-D-Glucose in der Muskelprobe subtrahiert wird,wobei [14C]Mannit als extrazellulärer Marker verwendet wird. Es wird angenommen, dass [3 H]2-Desoxy-D-glucose und [14C]Mannitol während der Inkubation ähnliche Diffusionseigenschaften innerhalb des Muskelgewebesaufweisen. Führen Sie die folgenden Berechnungen durch:
  2. Beginnen Sie mit der Subtraktion des DPM [3H] und [14C] der blinden Kontrollproben von allen Muskel- und Medienproben.
  3. Bestimmung des extrazellulären Muskelraums in μL (μL-ECS):
    [14C] DPM-Muskel / ([14C]DPM-Medien / Mvol)
  4. Berechnen Sie die Menge an [3 H]DPM im extrazellulären Muskelraum ([3H]DPMECS):
    μL-ECS-× ([3H]DPM-Medien / Mvol)
  5. Berechnen Sie die Menge an [3 H]DPM im intrazellulären Muskelraum ([3H]DPMICS):
    [3H] DPM-Muskel− [3H]DPMECS
  6. Berechnen Sie die Muskelglukoseaufnahmerate (μmol / g Protein / Stunde):
    [3H] DPMICS / ([3H]DPMmedia / M vol) / [2-Desoxy-D-glucose])) / mgProtein) / Th
    HINWEIS: Für alle obigen Gleichungen gilt
    [14C] DPM-Muskel ist die Menge an [14C]Mannitol-Radioaktivität in einer Muskelprobe;
    [14C] DPM-Medien sind die Menge an [14C]Mannitol-Radioaktivität in einer Medienprobe;
    [3H] DPM-Muskel ist die Menge an [3H]2-Desoxy-D-Glukose-Radioaktivität in einer Muskelprobe;
    [3H] DPM-Mediensind die Menge an [3H]2-Desoxy-D-Glukose-Radioaktivität in einer Medienprobe;
    [3H] DPMECS ist die Menge an [3H]2-Desoxy-D-Glucose-Radioaktivität im extrazellulären Muskelraum;
    [3H] DPMICS ist die Menge an [3H]2-Desoxy-D-Glukose-Radioaktivität im intrazellulären Muskelraum;
    μL-ECS ist der extrazelluläre Muskelraum in μL;
    Mvol ist das Volumen (μL) von Inkubationsmedien, die für die Szintillationszählung verwendet werden (z. B. "25", wie oben erwähnt);
    T h ist der Zeitfaktor, der zur Berechnung der Aufnahmeraten pro Stunde verwendet wird (d.h . "1/6" beim Inkubieren von Muskeln mit Glukoseaufnahmemedien für 10 min).
  7. Berücksichtigen Sie diese Beispielberechnung. Die [3H] und [14 C] DPM der blinden Kontrollproben (17bzw. 6) wurden von den unten genannten DPM-Werten subtrahiert.
    [14C] DPM-Muskel: 343
    [14C] DPM-Medien: 11846
    [3H] DPM-Muskel: 4467
    [3H] DPM-Medien: 39814
    Mvol: 25
    mg Protein: 0,396 (in 150 μL Muskelproteinlysat)
    [2-Desoxy-D-Glukose]: 1 (mM)
    T h: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3H] DPMECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3H] DPM-ICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Glukoseaufnahme: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol / L) / 0,396 mg Protein) / (1/6 Stunde) = 31,53 μmol / g Protein / Stunde

9. SDS-PAGE und Western Blot Analysen

  1. Soleus- und EDL-Muskellysate im Laemmli-Puffer zubereiten und 5 min bei 96 °C erhitzen.
  2. Trennen Sie gleiche Mengen an Muskelprotein durch SDS-PAGE auf selbstgegossenen Gelen und übertragen Sie die Proteine auf Polyvinylidenfluoridmembranen durch halbtrockenes Blotting.
  3. Anschließend werden Membranen in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween 20 und 2% Magermilch inkubiert und Sondenmembranen mit relevanten primären und sekundären Antikörpern.
  4. Erkennen Sie Proteine mit Chemilumineszenz und visualisieren Sie sie mit einem digitalen Bildgebungssystem.

10. Muskelglykogen, Nukleotide, Laktat, Kreatin und Phosphokreatin

  1. Verwenden Sie Perchlorsäure, um EDL- und Soleus-Muskelproben zu extrahieren.
  2. Anschließend neutralisieren Sie Proben und analysieren Sie sie auf Laktat, Kreatin und Phosphokreatin, wie zuvor beschrieben18.
  3. Analysieren Sie den Nukleotidgehalt in EDL und Soleusmuskel durch Umkehrphasen-HPLC nach der Extraktion in Perchlorsäure.
  4. Bestimmung des Muskelglykogengehalts im gesamten Muskelhomogenat als Glykosyleinheiten nach Säurehydrolyse durch eine fluorometrische Methode wie zuvor beschrieben18.

11. Statistiken

  1. Führen Sie statistische Analysen mit einer Software für statistische Analysen durch.
  2. Verwenden Sie einen ANOVA-Test (Two-Way Analysis of Variance), um statistische Unterschiede zwischen den in Tabelle 1 dargestellten Werten zu bewerten.
  3. Verwenden Sie ungepaarte Student t-Tests , um statistische Unterschiede in der Glukoseaufnahme zwischen EDL und Soleus innerhalb jeder in Abbildung 2 dargestellten Gruppe zu bewerten. Präsentieren Sie Daten als Mittel ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). P < 0,05 gilt als statistisch signifikant.

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Representative Results

Wie in Abbildung 2 gezeigt, waren die basalen Glukoseaufnahmeraten zwischen isoliertem Soleus- und EDL-Muskel von weiblichen Mäusen ähnlich. Dies wurde auch mehrmals vor12,13,19,20 berichtet. Die Glukoseaufnahme stieg um das ~0,8- und ~0,6-fache und erreichte 12 bzw. 9 μmol/g Protein/h im Soleus- bzw. EDL-Muskel als Reaktion auf eine submaximal wirksame Insulinkonzentration (100 μU/ml). Dieser Anstieg war noch höher (~ 4 und ~ 2-fach erreichten 33 bzw. 19 μmol / g Protein / h im Soleus- bzw. EDL-Muskel), wenn die Muskeln mit einer maximal wirksamen Insulinkonzentration (10 mU / ml) stimuliert wurden. Darüber hinaus waren sowohl die submaximale als auch die maximale insulinstimulierte Glukoseaufnahme im Soleus-Muskel signifikant höher, was darauf hindeutet, dass der Soleus-Muskel im Vergleich zum EDL-Muskel eine erhöhte Insulinsensitivität und Reaktionsfähigkeit aufweist. Dies kann mit der höheren Expression des Glukosetransporters 4 (GLUT4) sowie des Insulinsignalgeber-Transducer-Proteinkinase B (Akt) im Soleusmuskel im Vergleich zum EDL-Muskel 10,21,22,23,24 zusammenhängen.

Die kontraktionsinduzierte Glukoseaufnahme war im EDL-Muskel im Vergleich zum Soleusmuskel signifikant höher (Abbildung 2), wie ebenfalls zuvor berichtet13,19. So stieg die Glukoseaufnahme um das ~ 2- und ~ 2,5-fache an und erreichte 14 bzw. 22 μmol / g Protein / h im Soleus- bzw. EDL-Muskel als Reaktion auf elektrisch induzierte Kontraktionen. Abbildung 3 zeigt die maximale Muskelkraftproduktion im Soleus- und EDL-Muskel während der 10-minütigen Stimulationsperiode. Wie gesehen und zuvor berichtet19, erzeugt der EDL-Muskel während des ersten Teils der Stimulationsperiode mehr Kraft (225 mN in EDL vs. 150 mN in Soleus). Auf der anderen Seite zeigt der EDL-Muskel einen schnelleren Rückgang der Kraftproduktion im Vergleich zum Soleusmuskel später in der Stimulationsphase. Diese Ergebnisse sind wahrscheinlich auf den Unterschied in der Fasertypverteilung zwischen dem Soleus- (Typ 1 > Typ 2) und EDL-Muskel (Typ 2 > Typ 1)25 zurückzuführen, da Typ-2-Fasern mehr Kraft erzeugen, aber schneller ermüden als Typ-1-Fasern26,27.

Um die Wirkung von Insulin und Kontraktion auf die intrazelluläre Signalgebung in isolierten Soleus- und EDL-Muskeln zu bewerten, wurde die Phosphorylierung von Akt Thr308, TBC1-Domänenfamilienmitglied 4 (TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 und Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) Ser212 mit der westlichen Blotting-Technik durchgeführt (Abbildung 4). Wie erwartet, induzierte die submaximal- und maximal wirksame Insulinkonzentration einen Anstieg der Phosphorylierung von Akt Thr308 und TBC1D4 Ser588, während die Kontraktion einen Anstieg der Phosphorylierung von AMPKα Thr172 und ACC Ser212 induzierte. Weder Insulin noch Kontraktion führten zu einer Veränderung des Gesamtproteingehalts von Akt2, TBC1D4, AMPKα2 und ACC im Soleus und EDL-Muskel (Abbildung 4).

Bei der Untersuchung verschiedener Marker der metabolischen Lebensfähigkeit des inkubierten Soleus- und EDL-Muskels beobachteten wir eine allgemeine Verringerung der Adenosinnukleotidspiegel (ATP, ADP, AMP) (~ 15-25%) sowie Kreatin (~10-35%) unabhängig davon, ob die Muskeln in Gegenwart von Pyruvat oder Glucose im Vergleich zu nicht inkubierten Muskeln inkubiert wurden (Tabelle 1 ). Auf der anderen Seite wurde der Abfall des Glykogenspiegels, der bei Soleus- und EDL-Muskeln, die mit Pyruvat inkubiert wurden, beobachtet wurde, verhindert, wenn die Muskeln mit Glukose inkubiert wurden. Interessanterweise beobachteten wir jedoch, dass der Gehalt an Inosinmonophosphat (IMP) um ein Vielfaches anstieg, jedoch nur im inkubierten Soleusmuskel. Der IMP-Spiegel steigt typischerweise bei starkem metabolischem Stress im Muskel an, da der Muskel versucht, die AMP-Ansammlung zu verhindern, indem er AMP in IMP umwandelt, um das ATP / ADP-Verhältnis28 aufrechtzuerhalten. Dies deutet darauf hin, dass der Musculus soleus während der Inkubation im Vergleich zum EDL-Muskel etwas stärker metabolisch beansprucht wird. Diese Vorstellung wird auch durch Befunde der erhöhten AMPKα Thr172- und ACC Ser212-Phosphorylierung im mit Pyruvat inkubierten Soleusmuskel unterstützt (Abbildung 5). Wichtig ist, dass der beobachtete Anstieg der IMP-Spiegel sowie der AMPKα Thr172- und ACC Ser212-Phosphorylierung abnimmt, wenn der Soleusmuskel mit Glukose inkubiert wird. Daher erscheint es vorteilhaft, isolierte Skelettmuskeln in einem glukosehaltigen Puffer zu inkubieren, um Schwankungen der Adenosinnukleotide zu minimieren und einen Abfall des Muskelglykogens zu verhindern, wenn Muskeln über einen längeren Zeitraum inkubiert werden. In Bezug auf die Aufnahme von 2-Desoxyglucose haben wir Hinweise darauf, dass die Inkubation von Muskeln für 6 bis 8 h in Gegenwart von Pyruvat die Aufnahme von basaler / ruhender Glukose erhöht. Die Inkubation von Muskeln in einem Medium, das Glukose enthält, scheint einen solchen Anstieg der Glukoseaufnahme zu verhindern (unveröffentlichte Daten).

Figure 1
Abbildung 1: Inkubationssystem. (A) Myographensystem mit vier einzelnen Inkubationskammern. (B) Kundenspezifische Inkubationshaken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Glukoseaufnahme in isolierten reifen Skelettmuskeln von Mäusen. Die 2-Desoxyglucose-Aufnahme wurde in isolierten Soleus- (schwarze Balken) und EDL-Muskeln (graue Balken) als Reaktion auf eine submaximal wirksame Insulinkonzentration (100 μE/ml), eine maximal wirksame Insulinkonzentration (10 mU/ml) und elektrisch induzierte Kontraktionen (0,2 ms Puls, 100 Hz, 1 s/15s), 30 V, 10 min). Die Daten wurden von Studenten analysiert, die innerhalb jeder Gruppe getestet wurden. ###p<0.001, ##p<0.01 vs. Musculus soleus. Werte sind Mittelwerte ± SEM. n = 4-6 pro Gruppe. h, Stunde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Muskelkraftkurven als Reaktion auf elektrisch induzierte Kontraktionen. Die Spitzenkraftproduktion während der elektrischen Stimulation wurde für den Soleus (schwarze Punkte) und EDL (graue Punkte) Muskel berechnet. Jeder einzelne Wert entspricht einem Durchschnitt der letzten 500 ms jeder 1-s-Stimulationsperiode. Werte sind Mittelwerte ± SEM. n = 5-6 pro Gruppe. S, zweitens. mN, Milli-Newton. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Western Blots von Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 und ACC Ser212 Phosphorylierung sowie Akt2, TBC1D4, AMPKα2 und ACC Protein. Western Blot-Analysen wurden an den in Abbildung 2 beschriebenen Maus-Soleus- und EDL-Muskelproben durchgeführt. B, basal. S, submaximal wirksames Insulin. M, maximal wirksames Insulin. C, Kontraktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Western Blots der AMPKα Thr172 und ACC Ser212 Phosphorylierung sowie AMPKα2 und ACC Protein. Western Blot-Analysen wurden an den in Tabelle 1 beschriebenen Maus-Soleus- und EDL-Muskelproben durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

nicht inkubiert Inkubiert 1h mit Pyruvat Inkubiert 1h mit Glukose Haupteffekte Wechselwirkung
Schollenmuskel EDL Schollenmuskel EDL Schollenmuskel EDL
Lactat 1,00 ± 0,01 1,00 ± 0,02 0,96 ± 0,03 0,98 ± 0,02 1,05 ± 0,01 0,99 ± 0,01 - -
Cr 1,00 ± 0,04 1,00 ± 0,06 0,64 ± 0,07 ### 0,76 ± 0,05 ### 0,76 ± 0,07 ## 0,88 ± 0,09 ## S. < 0,001 -
PCr 1,00 ± 0,19 1,00 ± 0,06 0,80 ± 0,12 1,13 ± 0,14 0,65 ± 0,31 0,75 ± 0,08 - -
PCr/(Cr + PCr) 1,00 ± 0,20 1,00 ± 0,07 1,17 ± 0,11 1,25 ± 0,12 0,78 ± 0,36 0,92 ± 0,11 - -
ATP 1,00 ± 0,03 1,00 ± 0,02 0,72 ± 0,03 ###,§§§ 0,99 ± 0,03 * 0,81 ± 0,06 ### 0,85 ± 0,04 ## - S. < 0,001
ADP 1,00 ± 0,04 1,00 ± 0,04 0,75 ± 0,05 ### 0,92 ± 0,03 ### 0,84 ± 0,04 ## 0,86 ± 0,03 ## S. < 0,001 -
AMPERE 1,00 ± 0,11 1,00 ± 0,12 0,85 ± 0,15 0,79 ± 0,13 0,84 ± 0,18 0,75 ± 0,13 - -
KOBOLD 1,00 ± 0,17 1.00 ± 0.30 Uhr 4.43 ± 0.67 ###,§§§ 0,72 ± 0,29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1,08 ± 0,01 - S. < 0,001
AMP/ATP-Verhältnis 1,00 ± 0,12 1.00 ± 0.13 1,18 ± 0,22 0,81 ± 0,16 1,06 ± 0,23 0,90 ± 0,19 - -
Glykogen 1,00 ± 0,08 1,00 ± 0,12 0,74 ± 0,07 (#),* 0,80 ± 0,12 (#),* 1,12 ± 0,10 1,10 ± 0,03 p = 0,035 -
pAMPK Thr172 / AMPKα2 1,00 ± 0,10 1,00 ± 0,12 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ 1,55 ± 0,27 1,68 ± 0,19 # 1,36 ± 0,19 - p = 0,002
pACC Ser212 / ACC 1,00 ± 0,18 1,00 ± 0,12 2.22 ± 0.58 ###,**,§§ 0,96 ± 0,21 0,99 ± 0,15 0,83 ± 0,09 - p = 0,030

Tabelle 1: Vergleich der metabolischen Lebensfähigkeit von Maus-Soleus- und EDL-Muskeln, die 1 Stunde lang in Gegenwart von 2 mM Pyruvat oder 5 mM Glukose inkubiert wurden. Nicht inkubierte Muskeln wurden von betäubten Tieren seziert und gefüttert, bevor sie in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden. Separate Muskeln wurden für 1 h in KRH-Puffer inkubiert, ergänzt mit BSA (0,1%), Na-Pyruvat (2 mM) und D-Mannit (8 mM), während andere für 1 h in KRH-Puffer inkubiert wurden, ergänzt mit BSA (0,1%), D-Glucose (5 mM) und D-Mannit (5 mM), bevor sie in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden. Die Daten wurden in relative Einheiten umgewandelt, um beobachtete Veränderungen in verschiedenen Markern der metabolischen Lebensfähigkeit hervorzuheben. Absolute Werte von nicht inkubierten Maus-Soleus- und EDL-Muskeln sind unten angegeben. Laktat (mmol/kg w.w): 137,53Soleus; 139,05EDL Cr (mmol/kg w.w): 9,35Soleus; 8,98EDL. PCr (mmol/kg Mw): 1,50Soleus; 5.20EDL. PCr/(PCr+Cr): 13,98Soleus; 37.30EDL. ATP (mmol/kg w.w): 3,07Soleus; 4.24EDL. ADP (mmol/kg Mw): 0,60Soleus; 0,51EDL. AMP (mmol/kg Mw): 0,18Soleus; 0,08EDL. IMP (mmol/kg Mw): 0,07Soleus; 0,14EDL. AMP/ATP-Verhältnis: 0,06Soleus; 0,02EDL. Glykogen (pmol/μg-Protein): 77,01Soleus; 67,56EDL. Die Daten wurden von einer bidirektionalen ANOVA innerhalb jeder Gruppe analysiert. ###p<0.001, ##p<0.01 und #p<0.05 vs. nicht inkubiert. P<0,001, **P<0,01 und *P<0,05 vs 1 h mit Glukose inkubiert. §§p<0.001, §§p<0.01 und §p<0.05 gegen EDL. Werte sind Mittelwerte ± SEM. n = 12 in einer nicht inkubierten Gruppe, n = 4-6 in inkubierten Gruppen. Cr, Kreatin; PCr, Phosphokreatin; w.w, Nassgewicht; h, Stunde.

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Discussion

Eine intakte Regulierung der Glukoseaufnahme in der Skelettmuskulatur ist wichtig für die Erhaltung der allgemeinen Gesundheit1. Daher dient die Untersuchung der Muskelglukoseaufnahme oft als primäre Anzeige bei der Bewertung verschiedener gesundheitsverändernder Interventionen. Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Methode zur Messung der Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Soleus- und EDL-Muskeln von Mäusen als Reaktion auf Insulin und elektrisch induzierte Kontraktionen. Die Methode ist schnell und zuverlässig und ermöglicht eine präzise Kontrolle des umgebenden Milieus des inkubierten Muskels, die genaue Untersuchungen der Muskelglukoseaufnahmeraten ermöglicht, die aus dem potenziell verwirrenden Einfluss von Hormonen und Substraten isoliert sind, die im Blut gefunden werden können. Die Methode wird seit mehreren Jahren in vielen Studien verwendet und ist in der Muskelforschungsgemeinschaft weit verbreitet.

Das Ex-vivo-Inkubationsmodell wurde im Allgemeinen als eine Methode zur Beurteilung der Glukosetransportkapazität und nicht der Glukoseaufnahme in der Skelettmuskulatur angesehen. Die Glukosetransportkapazität in inkubierten Muskeln kann durch Messung der akkumulierten D-Glukose über einen bestimmten Zeitraum bestimmt werden. Dies stellt jedoch ein Problem dar, da D-Glukose nach der Aufnahme schnell in der Muskelzelle metabolisiert wird. Um dieses Problem zu umgehen, wurde das Glukoseanalogon 3-O-Methyl-D-Glucose (3-MG) häufig zur Beurteilung der Glukosetransportkapazität verwendet, da 3-MG nach dem Transport über die Zelloberflächenmembran nicht weiter in der Zelle metabolisiert wird. Somit dient die anfängliche Rate der intrazellulären akkumulierten 3-MG als Index der zellulären Glukosetransportkapazität an sich, da sie nicht von anderen Schritten in den Glukosestoffwechselwegen beeinflusst wird. Die Verwendung von 3-MG kann jedoch ein Problem darstellen, da sich 3-MG ansammelt, wodurch der Transmembrangradient für 3-MG verringert und anschließend die weitere Aufnahme verringert wird. Um also ein Maß für die Membrantransportkapazität zu erhalten, muss die Anfangsrate der 3-MG-Aufnahme geschätzt werden. Insbesondere wenn die Transportkapazität hoch ist, kann dies aufgrund des Ausflusses von 3-MG aus dem Muskel29,30 ein Problem darstellen. Das potenzielle Problem mit 3-MG-Efflux kann mit 2-Desoxy-D-Glucose (2-DG) vermieden werden. Nach dem Transport in die Skelettmuskulatur wird 2-DG durch Hexokinase II zu 2-Desoxy-D-Glucose-6-phosphat (2-DG-6P) phosphoryliert. Da der Skelettmuskulatur Glukose-6-phophatase fehlt und GLUT4 phosphoryliertes 2-DG nicht transportieren kann, wird 2-DG-6P in der Muskelzelle eingeschlossen. Im Gegensatz zu Glucose-6-phosphat ist 2-DG-6P ein sehr schwacher allosterischer Inhibitor der Hexokinase II30, der hilft, den Transmembrangradienten für 2-DG aufrechtzuerhalten. So haben Beobachtungen gezeigt, dass die 2-DG-Aufnahme in inkubierten (Ratten-) Muskeln linear bleibt, bis die intrazelluläre 2-DG-6P-Konzentration 30 mM überschreitet, eine Konzentration, die die Hexokinase II-Aktivität30 senkt. Darüber hinaus bleibt die 2-DG-Aufnahme in der inkubierten Mausskelettmuskulatur für ~ 30 Minuten linear, wenn die Temperaturen der Inkubationspuffer 37 ° C oder weniger31 betragen. Dies deutet darauf hin, dass 2-DG verwendet werden kann, um die Glukosetransportkapazität anstelle der Glukoseaufnahme in inkubierten Muskeln zu messen, außer in Situationen, in denen die 2-DG-6P-Konzentrationen sehr hoch werden (z. B. beobachtet während Inkubationen >2 Stunden mit 1 mM 2-DG und einer maximalen Insulinkonzentrationvon 29,30). Die Idee, dass die 2-DG-Aufnahme wahrscheinlich die Glukosetransportkapazität widerspiegelt, wird auch durch Ergebnisse gestützt, die zeigen, dass die maximale insulinstimulierte 2-DG-Aufnahme in inkubierten Muskeln von Wildtypmäusen und Mäusen, die Hexokinase II32 überexprimieren, ähnlich ist. Ein potenzielles Problem bei der Verwendung von 2-DG für Muskelglukosetransportmessungen während der Kontraktion ist eine Erhöhung der intrazellulären Glukose-6-Phosphat-Konzentration aufgrund einer erhöhten Glykogenolyserate. Da jedoch eine lineare Zunahme der (Ratten-) Muskel-2-DG-Aufnahme während der Kontraktion im Laufe der Zeitbeobachtet wird 29, deutet dies darauf hin, dass die Akkumulation von Glucose-6-phosphat aus dem Abbau von Glykogen während der Kontraktion die Hexokinase-II-Aktivität und damit die 2-DG-Aufnahmeraten nicht beeinträchtigt. Auf dieser Grundlage scheint 2-DG gut geeignet für Messungen des Glukosetransports in isolierten Skelettmuskeln während Insulin und Kontraktion unter Berücksichtigung der Einschränkungen von 3-MG zu sein.

Obwohl allgemein angenommen wird, dass 2-DG nach der Phosphorylierung durch Hexokinase II nicht weiter metabolisiert wird, wurde berichtet, dass einige 2-DG auf Muskelglykogen gerichtet und in dieses eingebaut sind. So werden während einer 2 h normoglykämischen hyperinsulinämischen Klemme bei Ratten ~30% der von der Skelettmuskulatur aufgenommenen 2-DG in Glykogen33 eingebaut. Daher könnte argumentiert werden, dass die Raten der insulinstimulierten 2-DG-Aufnahme in der inkubierten Skelettmuskulatur unterschätzt werden, wenn die Akkumulation von 2-DG in Glykogen vernachlässigt wird. Wir haben festgestellt, dass das hierin beschriebene Protokoll zur Vorbereitung von Muskellysaten (Überstand) für nachfolgende Analysen der 2-DG-Aufnahmeraten in der zuvor inkubierten Skelettmuskulatur nicht durch die mögliche Aufnahme von 2-DG in Glykogen beeinflusst wird. Es könnte argumentiert werden, dass sich Glykogen im Pellet ansammelt, wenn das gesamte Muskelhomogenat zentrifugiert wird, um Lysat für 2-DG-Aufnahmemessungen zu erzeugen. Beim Vergleich der Radioaktivitätsniveaus in insulinstimuliertem Homogenat des gesamten Muskels im Vergleich zu Lysat stellen wir jedoch keinen signifikanten Unterschied fest (unveröffentlichte Daten). Dies deutet darauf hin, dass die Inkubation von Mausmuskeln für 10 min in 1 mM von 2-DG keine nachweisbare Ansammlung von 2-DG in Glykogen verursacht.

Die Bestimmung der 2-DG-Aufnahme der Skelettmuskulatur, ohne zu berücksichtigen, dass 2-DG sowohl im extra- als auch im intrazellulären Raum verteilt ist, führt zu einer Überschätzung der 2-DG-Aufnahme. Um dies zu umgehen, sollte L-Glucose als extrazellulärer Marker verwendet werden, da diese nicht über die Zellmembran transportiert wird, aber ansonsten ähnliche Eigenschaften wie D-Glucose einschließlich Masse, Löslichkeit, passive Diffusion, Bindung usw. aufweist. Aufgrund der übermäßigen Herstellungskosten und damit des Einkaufs von L-Glukose wird Mannitol typischerweise als extrazellulärer Marker verwendet, da Mannitol nicht von der Muskelzelle aufgenommen wird, relativ kostengünstig ist und schätzungsweise ein ähnliches extrazelluläres Verteilungsvolumen wie Glucose und 2-DG34 aufweist.

Intrinsische zelluläre und molekulare Uhren scheinen eine wesentliche Rolle für die Regulation des Ganzkörperstoffwechsels und der Energiehomöostasezu spielen 35. Es wurde beobachtet, dass der muskelspezifische Knockout des Kernuhrgens Bmal1 die insulinstimulierte Glukoseaufnahme in isolierten Mausskelettmuskelnbeeinträchtigt 36. Darüber hinaus zeigt die submaximale insulinstimulierte Glukoseaufnahme der isolierten Skelettmuskulatur einen circadianen Rhythmus mit der niedrigsten und höchsten Insulinreaktion in der Mitte der hellen und dunklen Phase, jeweils37. Basierend auf diesen Erkenntnissen ist es daher wichtig, die Zeit der Tieropfer in das Versuchsdesign einzubeziehen, um die Reproduzierbarkeit der Daten zu erhöhen.

Ein großer Nachteil der Ex-vivo-Methode ist der fehlende Kapillarfluss im isolierten Muskel. Dies bedeutet, dass die Abgabe und Entfernung verschiedener Substrate vollständig von einer einfachen Diffusion zwischen den Muskelfasern und der Umgebung abhängt. Folglich konzentrierte sich die Validierung der metabolischen Lebensfähigkeit von isolierten Muskeln, die ex vivo inkubiert wurden, auf die Diffusionsgrenzen von Sauerstoff auf oberflächliche und tiefe Muskelfasern. So neigt der inkubierte Muskel, insbesondere der stark metabolische Mausmuskel, dazu, hypoxische Kerne zu entwickeln, in denen der Abbau von Glykogen 16,17,38 auftritt. In einer detaillierten Überprüfung durch Bonen und Kollegen15 wurde vorgeschlagen, dass sich hypoxische Kerne von inkubierten Muskeln wahrscheinlich entwickeln, wenn Muskeln inkubiert werden, die zu dick sind, um richtig mit Sauerstoff angereichert zu werden, insbesondere bei der Inkubation bei Temperaturen von ≥ 37 ° C. Dies führte zu der Empfehlung, dass nur dünne und zylindrische Mausmuskeln, wie Soleus und EDL, für Inkubationen bei 25-30 °C verwendet werden sollten, um die Entwicklung von hypoxischen Kernen zu vermeiden. Dies deutet darauf hin, dass Dicke und Geometrie und nicht Masse wichtige Faktoren sind, die bei der Inkubation von Mausskelettmuskeln zu berücksichtigen sind. Darüber hinaus wurde empfohlen, dass Inkubationstemperatur, Muskeldicke sowie ATP-, Phosphokreatin- und Glykogengehalt und/oder Freisetzung von Laktat routinemäßig gemessen und gemeldet werden sollten, um die Lebensfähigkeit des inkubierten Muskelszu bewerten 15. Unseres Wissens wurden solche vollständigen Analysen des inkubierten Muskels hauptsächlich für Rattenmuskel 39,40,41,42 und nur in begrenztem Umfang für Mausmuskel 16,17 berichtet. Um den Einblick in verschiedene metabolische Marker der Lebensfähigkeit in inkubierten Mausskelettmuskeln zu erhöhen, bewerteten wir mögliche Veränderungen des intrazellulären Gehalts von Laktat, Kreatin, Phosphokreatin, Adenosinnukleotiden, Glykogen und AMPK-Signalen in Soleus- und EDL-Muskeln nach 1 Stunde Inkubation in Glukose- oder Pyruvat-ergänztem KRH-Puffer. Ähnlich wie bei früheren Befunden bei inkubiertem Maus-Soleus und EDL-Muskel17 beobachteten wir, dass der Glykogenspiegel abnahm, wenn Muskeln in glukosefreien Medien inkubiert wurden. Dies deutet darauf hin, dass das Fehlen von Glukose während der Inkubation den Glykogenabbau und den anschließenden Eintritt von Glucose-6-phosphat in die Glykolyse fördert, was insbesondere bei unzureichender Sauerstoffversorgung zur Sicherung der ATP-Produktion beitragen kann. Darüber hinaus fanden wir eine Gesamtreduktion der ATP- und ADP-Nukleotidpools in inkubierten Soleus- und EDL-Muskeln. Dies kann bedeuten, dass die Sauerstoffversorgung nicht vollständig ausreicht, um den Bedarf an inkubiertem Mausmuskel sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Glukose zu decken. Da der oxidative Soleusmuskel im Vergleich zum glykolytischen EDL-Muskel mehr auf Sauerstoff für die ATP-Produktion angewiesen ist, würde dies darauf hindeuten, dass der Soleusmuskel in größerem Maße durch das Inkubationsverfahren beeinflusst wird. In Übereinstimmung fanden wir heraus, dass die intrazellulären Spiegel der IMP- und AMPK-Signalgebung im Soleus im Vergleich zum EDL-Muskel deutlich erhöht waren, wenn sie in Abwesenheit von Glukose inkubiert wurden. Dies bedeutet, dass der Soleusmuskel während der Inkubation einen höheren Grad an metabolischer Belastung aufweist, was bei der Auswertung von Daten aus dem Ex-vivo-Mausmuskelmodell berücksichtigt werden muss.

Kultivierte Muskelzellen, einschließlich immortalisierter L6 und C2C12 sowie primärer menschlicher Myotubes, werden häufig als Ersatz für reife Skelettmuskeln verwendet, um die Auswirkungen verschiedener genetischer und pharmakologischer Manipulationen auf die insulinstimulierte Muskelglukoseaufnahme zu untersuchen. In mehrfacher Hinsicht ähneln kultivierte Muskelzellen jedoch nicht der reifen Skelettmuskulatur und beim Vergleich der beiden Modellsysteme werden zahlreiche Unterschiede deutlich. Dazu gehören Unterschiede in der Proteinexpression, der Dimensionsstruktur, der Umgebung, dem Proliferations- und Differenzierungszustand, der Zusammensetzung des Fasertyps, den Stoffwechselprozessen und den funktionellen Eigenschaften43, die alle beeinflussen können, wie die Muskelzelle die Glukoseaufnahme als Reaktion auf verschiedene Reize reguliert. Typischerweise werden in reifen Skelettmuskeln im Vergleich zu kultivierten Muskelzellen größere relative Wirkungen von Insulin auf die Glukoseaufnahmeraten beobachtet 44, was darauf hindeuten kann, dass kultivierten Muskelzellen bis zu einem gewissen Grad die Maschinerie fehlt, die für die Regulierung der Glukoseaufnahmeraten verantwortlich ist, einschließlich einer hohen Expression des insulinsensitiven GlukosetransportersGLUT4 43 . In Anbetracht der Einschränkungen und Vorbehalte, die mit der Verwendung von kultivierten Muskelzellen und isolierten Skelettmuskeln verbunden sind, ist es daher wahrscheinlich von Vorteil, bei der Untersuchung verschiedener Muskelstoffwechselprozesse wie der Glukoseaufnahme einen kombinierten Ansatz zu verfolgen.

Soleus- und EDL-Muskeln werden typischerweise als repräsentativ für langsam und schnell zuckende Muskeln angesehen. Daher sind diese Muskeltypen ideal für mechanische Studien, die versuchen, Interventionen zu untersuchen, die die Muskelkraft- und Ermüdungsentwicklung beeinflussen. Darüber hinaus wird berichtet, dass der Soleus-Muskel im Vergleich zum EDL-Muskel typischerweise eine erhöhte Insulinsensitivität und Reaktionsfähigkeit aufweist, und daher können Interventionen, die auf die Insulinsensitivität des Muskels abzielen, Soleus und EDL unterschiedlich beeinflussen. Darüber hinaus unterscheidet sich die relative Verteilung der verschiedenen AMPK-Komplexe zwischen dem Soleus- und dem EDL-Muskel, was die Fähigkeit von AMPK-aktivierenden Verbindungen, die Muskelglukoseaufnahme zu erhöhen, zu beeinflussen scheint. Somit wird der größte Einblick in die Regulation der Muskelglukoseaufnahme wahrscheinlich erreicht, wenn sowohl der Soleus- als auch der EDL-Muskel beim Experimentieren mit dem Ex-vivo-Inkubationsmodell verwendet werden.

Das hierin beschriebene Verfahren bezieht die Glukoseaufnahme auf die Menge der Gesamtproteinhäufigkeit, die in jeder Muskelprobe nach der Homogenisierung bestimmt wurde. Es ist unsere Erfahrung, dass die Variation abnimmt, wenn die Glukoseaufnahme pro Muskelproteinmenge anstelle des Muskelgewichts in Beziehung gesetzt wird (unveröffentlichte Daten). Darüber hinaus ermöglicht die Homogenisierung von Muskelproben in einem Puffer, der für verschiedene biochemische Assays verwendet wird, sowohl die Glukoseaufnahme, die myozelluläre Signalgebung als auch die Enzymaktivitäten in derselben Probenvorbereitungzu bestimmen 45,46. Dies verringert oft die Anzahl der Mäuse, die für eine Studie verwendet werden. Dennoch kann die Glukoseaufnahme leicht in Skelettmuskelproben bestimmt werden, die durch Erhitzen in Natriumhydroxid (NaOH) gelöst werden, gefolgt von einer Neutralisation mit Chlorwasserstoff20. Da die Behandlung von Muskeln mit NaOH die Messung der gesamten Muskelproteinkonzentration beeinträchtigt, muss der mit diesem Verfahren gemessene Glukosetransport mit dem Muskelgewicht in Beziehung gesetzt werden.

Basierend auf verschiedenen Optimierungen enthält unser Glukoseaufnahme-Inkubationspuffer eine spezifische Aktivität von 0,028 MBq/ml [3H]2-Desoxy-D-glucose und 0,0083 MBq/ml [14C]Mannitol. Dies senkt zum einen die Menge an Lysat (150 von 400 μL), die benötigt wird, um ausreichende und zuverlässige Radioaktivitätsmessungen zu erhalten. Auf der anderen Seite erhöht es die Menge an radioaktiver [3 H]2-Desoxy-D-Glucose und [14C]Mannitol, die für jedes Experiment benötigt wird, was die experimentellen Kosten erhöht. So ist es für jeden Versuchsaufbau möglich, die Menge an Radioaktivität, die in den Glukoseaufnahme-Inkubationsmedien verwendet wird, an spezifische Anforderungen anzupassen. Es muss jedoch darauf geachtet werden, dass die Radioaktivitätsmenge im Inkubationspuffer nicht so stark verringert wird, dass Radioaktivitätsmessungen unzuverlässig sind. Dies wird dadurch sichergestellt, dass die Radioaktivität in den Proben über den angegebenen Nachweisgrenzen der verwendeten Flüssigszintillationszählmaschine gehalten wird.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Danish Council for Independent Research - Medical Sciences (FSS8020-00288B) und der Novo Nordisk Foundation (NNF160C0023046) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch ein Forschungsstipendium an Rasmus Kjøbsted von der Danish Diabetes Academy unterstützt, das von der Novo Nordisk Foundation mit der Fördernummer NNF17SA0031406 finanziert wird. Die Autoren danken Karina Olsen, Betina Bolmgren und Irene Bech Nielsen (Department of Nutrition, Exercise and Sports, Faculty of Science, University of Copenhagen) für ihre kompetente technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

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Biologie Ausgabe 171 Skelettmuskulatur Glukosetransport Glukoseaufnahme Insulinsensitivität Kontraktion Explantation ex vivo in vitro Inkubation radioaktive Glucose-Tracer 2-Desoxy-D-Glucose
Messung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln von Mäusen
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Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

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