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Developmental Biology

माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से तंत्रिका जनक और न्यूरॉन्स का भेदभाव और लक्षण वर्णन

Published: May 15, 2020 doi: 10.3791/61446
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Penn State College of Medicine, Penn State Hershey Cancer Institute

Summary

हम हैंगिंग ड्रॉप विधि का उपयोग करके न्यूरोनल कोशिकाओं में माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं के इन विट्रो भेदभाव के लिए प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम आरटी-क्यूपीसीआर, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, आरएनए-सेक्यू और फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से एक व्यापक फेनोटाइपिक विश्लेषण करते हैं।

Abstract

हम न्यूरॉनल वंश में माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं को बनाने और अलग करने के लिए कदम-दर-कदम प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जिसके बाद विभेदित कोशिकाओं की विशेषता के लिए परख की एक श्रृंखला होती है। E14 माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं को फांसी ड्रॉप विधि के माध्यम से भ्रूण निकायों के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और फिर रेटिनोइक एसिड द्वारा तंत्रिका जनक कोशिकाओं में अंतर करने के लिए प्रेरित किया, और अंत में न्यूरॉन्स में विभेदित । मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों से पता चला है कि तंत्रिका जनक और न्यूरॉन्स क्रमशः 8 और 12 के बाद भेदभाव के दिन में इसी मार्कर (तंत्रिका जनकों के लिए नेस्टिन और न्यूरॉन्स के लिए न्यूरोफिलामेंट) प्रदर्शित करते हैं। एक Sox1 प्रमोटर संचालित GFP रिपोर्टर व्यक्त एक E14 लाइन पर प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोगों से पता चला है कि 8 दिन में कोशिकाओं के बारे में ६०% GFP सकारात्मक हैं, इस स्तर पर तंत्रिका जनक कोशिकाओं के सफल भेदभाव का संकेत है । अंत में, आरएनए-एसईक्यू विश्लेषण का उपयोग वैश्विक ट्रांसक्रिप्टोस्मिक परिवर्तनों को प्रोफाइल करने के लिए किया गया था। ये विधियां न्यूरोनल भेदभाव के दौरान कोशिका पहचान संक्रमण को विनियमित करने में विशिष्ट जीन और रास्तों की भागीदारी का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी हैं।

Introduction

चूंकि विकासशील माउस ब्लास्टोसिस्ट1,2,माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं (एमईएससी) के आंतरिक कोशिका द्रव्यमान से उनके पहले व्युत्पन्न को स्टेम सेल आत्म-नवीकरण और भेदभाव3का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, एमईएससी भेदभाव का अध्ययन करने से आणविक तंत्रों की जबरदस्त समझ होती है जो न्यूरोडीजेनेरेटिवविकारों जैसेरोगों के इलाज में स्टेम सेल आधारित चिकित्सा में दक्षता और सुरक्षा में सुधार कर सकती है 4 । पशु मॉडल की तुलना में, यह इन विट्रो सिस्टम अभ्यास और मूल्यांकन में सादगी, जानवरों के विपरीत सेल लाइनों को बनाए रखने में कम लागत, और आनुवंशिक जोड़तोड़ में सापेक्ष आसानी सहित कई फायदे प्रदान करता है। हालांकि, विभेदित कोशिका प्रकारों की दक्षता और गुणवत्ता अक्सर एमएससी की विभिन्न रेखाओं के साथ - साथ भेदभाव विधियों5,6से प्रभावित होती है। इसके अलावा, अंतर दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए पारंपरिक परख चयनित मार्कर जीन की गुणात्मक परीक्षा पर भरोसा करते हैं जिसमें मजबूती की कमी है और वे इसलिए जीन अभिव्यक्ति में वैश्विक परिवर्तनों को समझने में विफल रहते हैं ।

यहां हम न्यूरोनल भेदभाव के व्यवस्थित मूल्यांकन के लिए परख की एक बैटरी का उपयोग करने का लक्ष्य है। चयनित मार्कर और आरएनए-सेक्यू पर पारंपरिक इन विट्रो विश्लेषणों का उपयोग करके, हम इस प्रक्रिया के दौरान भेदभाव दक्षता के साथ-साथ ट्रांसक्रिप्टोमिक परिवर्तनों के मापन के लिए एक मंच स्थापित करते हैं। पहले से स्थापित प्रोटोकॉल7के आधार पर, हमने हैंगिंग ड्रॉप तकनीक के माध्यम से भ्रूण निकायों (ईबी) उत्पन्न किए, जिसके बाद तंत्रिका जनक कोशिकाओं (एनपीसी) उत्पन्न करने के लिए रेटिनोइक एसिड (आरए) की सुपरफिजियोलॉजिक मात्रा का उपयोग करके प्रेरण किया गया, जिसे बाद में तंत्रिका प्रेरण माध्यम के साथ न्यूरॉन्स में अंतर किया गया। भेदभाव की दक्षता की जांच करने के लिए, पारंपरिक आरटी-क्यूपीसीआर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) परख के अलावा, हमने आरएनए-सेक्यू और प्रवाह साइटोमेट्री का प्रदर्शन किया। ये विश्लेषण चरण-विशिष्ट भेदभाव की प्रगति का व्यापक मापन प्रदान करते हैं ।

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Protocol

1. एमएससी संस्कृति

  1. 0.1% जिलेटिन के साथ 10 सेमी ऊतक-संस्कृति-उपचारित प्लेट को कोट करें और जिलेटिन को कम से कम 15-30 मिनट के लिए सेट करने की अनुमति दें।
  2. बीज γ-विकिरणित माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) पूर्व-गर्म एमईसी माध्यम (Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में mESCs की खेती से पहले 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), गैर आवश्यक अमीनो एसिड, β-मर्केप्टोथेन, एल-ग्लूटामाइन, पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, सोडियम पाइरुवेट, एलआईएफ, पीडी0325901 (पीडी), और चिर99021 (सीएच)) ।
  3. γ-विकिरणित MEFs को बसने और E14 कोशिकाओं को बनाने से पहले प्लेट की सतह से जोड़ने की अनुमति दें।
  4. गल E14 ESCs 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में और जल्दी से गर्म एमईएससी माध्यम के साथ एक 15 सेमी शंकु नली में कोशिकाओं को स्थानांतरित। 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली दें और सुपरनैंट को हटा दें।
  5. एमएससी माध्यम के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और पहले वरीयता प्राप्त γ-विकिरणित एमईएफ युक्त संस्कृति प्लेट पर कोशिकाओं को प्लेट करें। 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेल कल्चर को इनक्यूबेट करें।
  6. संस्कृति पासिंग के लिए, ई माध्यम को एस्पिरेट करें और बाँझ 1x पीबीएस के साथ प्लेट धोएं। प्लेट की सतह को कवर करने और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए पर्याप्त 0.05% ट्राइप्सिन जोड़ें।
  7. एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए एमईएससी माध्यम और पिपेट के साथ ट्राइप्सिन को बेअसर करें। 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें।
  8. एक हीमोसाइटोमीटर या सेल काउंटर और बीज के बारे में 5.0 x 105 कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं की गणना एक 10 सेमी संस्कृति प्लेट में।
  9. एमएससी माध्यम के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, जिलेटिन-लेपित ऊतक संस्कृति प्लेट पर कोशिकाओं को प्लेट करें और पहले वर्णित संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह सिफारिश की जाती है कि कोशिकाओं को उनकी कॉलोनियों में अंतर करने से रोकने के लिए हर 2 दिनों में एमएससी को पारित किया जाए। मध्यम कार्यों में फेनोल लाल केवल पीएच संकेतक के रूप में और सेलुलर घनत्व के आधार पर, यह पीले (अधिक अम्लीय) को 2 दिनों से जल्दी बदल सकता है। इसलिए हर दिन माध्यम में बदलाव करना जरूरी हो सकता है। γ-विकिरणित MEFs अंततः मार्ग के एक जोड़े के बाद बंद मर जाएगा ।

2. ईबी, एनपीसी, और न्यूरॉन भेदभाव

  1. पहले उल्लिखित संस्कृति पासिंग प्रोटोकॉल करें और कोशिकाओं (चरण 1.7-1.10) की गणना करें।
  2. हैंगिंग ड्रॉप विधि(दिन 0)
    1. 10 सेमी सेल कल्चर प्लेट के लिए, लगभग 2.5 x 104 कोशिकाओं की गणना करें जहां 5.0 x 102 कोशिकाओं को 20 माइक्रोन विभेदन माध्यम (डीएमईएम के साथ 15% एफबीएस, गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, β-मर्केप्टोथेन, एल-ग्लूटामाइन, पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसीसिन, सोडियम पायेर) में निलंबित किया जाएगा। कोशिकाओं से युक्त लगभग पचास 20 μL बूंदों को एक 10 सेमी प्लेट पर चढ़ाया जा सकता है।
    2. एलिकोट कोशिकाओं की उचित संख्या, और फिर 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र और सुपरनेट को हटा दें।
    3. 5.0 x 102 कोशिकाओं प्रति 20 माइक्रोन (उदाहरण के लिए, 2.5 x 104 कोशिकाओं के 1 एमसीएल विभेदन माध्यम में) के सेल घनत्व के लिए विभेदन माध्यम की उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
    4. माइक्रोपिपेट या रिपीटर पिपेट का उपयोग करके, ऊतक संस्कृति प्लेट के ढक्कन पर सेल निलंबन की 20 माइक्रोन बूंदें रखें। सुनिश्चित करें कि बूंदें उन्हें विलय से रोकने के लिए एक-दूसरे के बहुत करीब नहीं हैं।
      नोट: बूंदों या तो एक ऊतक संस्कृति का इलाज लगाव थाली या निलंबन प्लेट पर चढ़ाया जा सकता है के रूप में वे ढक्कन पर रखा जाएगा और नहीं थाली ही । अधिक व्यवहार्य और बाँझ दृष्टिकोण के लिए, लगाव ऊतक-संस्कृति प्लेट पर बूंदों को प्लेट करें और नीचे वर्णित निलंबन प्लेट में उन्हें स्थानांतरित करें।
    5. प्लेट को 1x पीबीएस के 5-10 एमएल से भरें और ध्यान से प्लेट पर वापस ढक्कन डाल दें। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
      नोट: पीबीएस को सूखने से बूंदों को रोकने के लिए संस्कृति प्लेट में जोड़ा जाता है।
  3. दूसरे दिन,ढक्कन से बूंदों को इकट्ठा करने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें और उन्हें 10 सेमी सेल कल्चर सस्पेंशन प्लेट में रखें जो 10 एमएल विभेदन माध्यम से भरा हुआ है। इनक्यूबेटर में कम गति से हिलते हुए एक कक्षीय शेखर पर संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  4. 4 दिन,ईबी फसल करने के लिए, कोशिकाओं को इकट्ठा करें, 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें, और सुपरनैंट को हटा दें।
    नोट: बाद के प्रयोगों की आवश्यकताओं के अनुसार ईबी को 1x पीबीएस के साथ भी धोया जा सकता है।
  5. प्रक्रिया जारी रखने और तंत्रिका जनक कोशिकाओं (एनपीसी) में ईबी भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, 5 माइक्रोन एम रेटिनोइक एसिड (आरए) के साथ भेदभाव माध्यम तैयार करें।
  6. 3 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर ईबी को पेलेट करके पुराने माध्यम को हटा दें या पुराने माध्यम को बाहर निकालने से पहले ईबी को व्यवस्थित करने की अनुमति दें। संस्कृति प्लेट में 5 माइक्रोनएम आरए युक्त विभेदन माध्यम का 10 एमएल जोड़ें।
  7. 6 दिन,प्लेट को झुकाकर और ऊपर वर्णित माध्यम को बाहर निकालकर 5 माइक्रोन आरए युक्त ताजा माध्यम के साथ कम से कम आधे माध्यम को बदलें।
    नोट: यह सिफारिश की जाती है कि 5 और 7 दिनों में कम से कम आधे माध्यम को ताजा आरए युक्त माध्यम से प्रतिस्थापित किया जाए। फिनॉल लाल संकेतक पर ध्यान दें; यदि यह पीला हो जाता है, तो सभी माध्यमों को बदलना सबसे अच्छा है।
  8. 8 दिन,कोशिकाओं को इकट्ठा करके एनपीसी की कटाई करें, 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्री करें, और सुपरनैंट को हटा दें।
    नोट: एनपीसी को बाद के प्रयोगों की जरूरतों के अनुसार 1x पीबीएस के साथ भी धोया जा सकता है । यदि आवश्यक हो, तो एनपीसी को बाद की संस्कृति और विश्लेषण के लिए फिर से नीचे जमे हुए और गल सकता है । यदि एनपीसी को सुसंस्कृत किया जाना है, तो एक्पुटास का उपयोग ट्राइपसिन के विकल्प के रूप में भी किया जा सकता है।
  9. प्रक्रिया को जारी रखने और एनपीसी को न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए, अपकेंद्रित्र द्वारा 15 एमएल शंकु नली में एनपीसी एकत्र करें, उन्हें ट्राइपसिन से अलग करें और उन्हें 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एनपीसी को यह सुनिश्चित करने के लिए पिपेट करें कि सभी एनपीसी समुच्चय को अलग किया जाए और माध्यम के साथ ट्राइपसिन को बेअसर किया जाए ।
  10. 40 माइक्रोन नायलॉन सेल छन्नी के साथ कोशिकाओं को फ़िल्टर करें और एन2 माध्यम में 1.5 x 105/सेमी2 के घनत्व पर चढ़ाना से पहले कोशिकाओं की गिनती करें (DMEM/F12 मध्यम + 3 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज + 3 मिलीग्राम/एमएल लिपिड-रिच बो बाद की पीसीआर और पश्चिमी दाग प्रयोगों के लिए टिश्यू-कल्चर-ट्रीट प्लेट पर 1:100 N2 सप्लीमेंट + 10 एनजी/एमएल बीएमजीएफ + 50 यू/एमएल पेन/स्ट्रेप + 1 एमएमएम एल-ग्लूटामाइन) । या इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों के लिए एक ऊतक संस्कृति कक्ष पर।
  11. 9 दिन,पुराने माध्यम को एक ताजा N2 माध्यम से बदलें।
  12. 10 दिन,N2/B27 मध्यम (५०% DMEM/F12 और ५०% तंत्रिका बेसल, 3 मिलीग्राम/mL LBA, 1:200 N2 पूरक, 1:100 B27 पूरक, ५० U/ml कलम/स्ट्रेप, और 1 mM Lamine ग्लूट) के साथ N2 माध्यम स्विच ।
  13. 11-12 के दिनोंमें, इस प्रकार न्यूरॉन्स की कटाई करें। कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ धोएं, ट्राइप्सिन जोड़ें, और 3 मिनट के लिए 200 x g पर मध्यम और अपकेंद्रित्र के साथ ट्राइपसिन को बेअसर करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति को 200 x g पर निष्क्रिय करें।

3. एमएससी और विभेदित कोशिकाओं का लक्षण वर्णन

  1. क्षारीय फॉस्फेट (एपी) परख
    1. क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि का आकलन करने के लिए एक किट का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. संस्कृति की थाली से माध्यम निकालें और 1x PBS के साथ ESCs धोते हैं ।
    3. फिक्स समाधान के 1 एमसीएल जोड़ें (फॉर्मेल्डिहाइड और मेथनॉल होते हैं) प्लेट में किट के साथ प्रदान किए जाते हैं और इसे कमरे के तापमान पर 2-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करते हैं।
      नोट: फिक्स समाधान में अधिक इनक्यूबेशन एपी गतिविधि समझौता कर सकते हैं ।
    4. फिक्स समाधान निकालें, 1x पीबीएस के साथ ESCs धोने और प्लेट में पीबीएस की कुछ राशि छोड़ दें ।
      नोट: एपी गतिविधि से समझौता नहीं करने के लिए पीबीएस में ESCs नम रखें ।
    5. ए, बी और सी सब्सट्रेट समाधानों को 1:1:1 अनुपात में मिलाकर एपी समाधान तैयार करें। पहले ए और बी समाधान मिलाएं और सी समाधान जोड़ने से पहले 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    6. 1x पीबीएस निकालें और पहले तैयार एपी समाधान जोड़ें।
    7. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ संस्कृति प्लेट लपेटकर या एक अंधेरे कमरे में कदम 3.5 प्रदर्शन करके अंधेरे में लगभग 15 मिनट के लिए ESCs इनक्यूबेट।
    8. प्रतिक्रिया की निगरानी करें और प्रतिक्रिया समाधान को हटा दें जब समाधान गैर-विशिष्ट धुंधला से बचने के लिए उज्ज्वल हो जाता है।
    9. ईएससी को 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
    10. 1x पीबीएस या बढ़ते माध्यम के साथ ESCs को कवर करके नमूने को सूखने से रोकें।
      नोट: एक लाल या बैंगनी दाग एपी अभिव्यक्ति के लिए दिखाई देगा । प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्टोर किया जा सकता है।
  2. आरटी-क्यूपीसीआर
    1. ईएससी और ईबी और एनपीसी के लिए क्रमशः 1.6-1.7 और 2.4 चरणों का पालन करके विभिन्न चरणों में सेल एकत्र करें।
    2. आरएनए, डीएनए और प्रोटीन निष्कर्षण समाधान का उपयोग करके आरएनए को अलग करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    3. रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस किट (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ सीडीएनए उत्पन्न करें और निर्माता के मैनुअल का पालन करें।
  3. फिक्सेशन और एम्बेडिंग
    1. ऊपर वर्णित हार्वेस्ट ईबी और एनपीसी (चरण 2.6) और उन्हें कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान के साथ ठीक करें।
    2. पीएफए निकालें और 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ नमूना धो लें।
    3. नमूना 1x पीबीएस, 10%, 20%,, और 30%-sucrose समाधान 25\u201228 डिग्री सेल्सियस पर एक धारावाहिक कमजोर पड़ने में रखें, जहां नमूना इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद अगले समाधान के लिए स्थानांतरित कर दिया जाता है ।
      नोट: एम्बेडिंग चरण जारी रखने से पहले नमूना को 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% सुक्रोज समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. क्रायो-मोल्ड के केंद्र में नमूना (उन्हें स्टैकिंग किए बिना) रखने से पहले सुक्रोज समाधान के साथ पिपेट टिप गीला करें और अतिरिक्त तरल को पिपेट करें।
      नोट: अतिरिक्त समाधान को हटाने के लिए फ़िल्टर पेपर का भी उपयोग किया जा सकता है। सुक्रोज समाधान के साथ पिपेट टिप गीला करना ईबी और एनपीसी को टिप की दीवारों से चिपके रहने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
    5. ध्यान से नमूनों को फिर से खर्च किए बिना मोल्ड के लिए इष्टतम काटने का तापमान (OCT) समाधान जोड़ें और एक पिपेट के साथ अतिरिक्त बुलबुले को हटा दें।
    6. 15 मिनट के लिए नमूने को हल्का उत्तेजित करने के लिए कम गति पर एक प्रयोगशाला मिक्सर पर नमूने के साथ मोल्ड रखें। यह ईबी और एनपीसी को नीचे तक बसाने में मदद करता है यदि उन्हें अक्टूबर समाधान में फिर से निलंबित कर दिया जाता है।
    7. मोल्ड को तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ पर रखकर जल्दी से नमूना फ्रीज करें।
      नोट: अगले चरण तक जारी रखने से पहले नमूनों को -70 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. क्रायोसेक्शनिंग
    1. उपकरण को नमूना स्थानांतरित करने से पहले -20 से -18 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के लिए क्रायोस्टेट सेट करें।
    2. मोल्ड से जमे हुए OCT ब्लॉक को अलग करें और धारक की सतह पर रखे गए थोड़ा अक्टूबर समाधान के साथ धारक पर सुरक्षित करें।
    3. ईबी और एनपीसी ब्लेड के सबसे करीब हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सेक्शनिंग के दौरान नमूना खो न जाए।
    4. ध्यान से ब्लॉक की धारा 10 माइक्रोन और नमूना होते हैं कि स्लाइस पर करीब ध्यान देना।
    5. जल्दी से ऊतक एम्बेडिंग ग्लास स्लाइड पर नमूना युक्त OCT टुकड़ा जगह है और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए हवा सूखी करने के लिए OCT स्लाइस की अनुमति देते हैं ।
      नोट: नमूनों को बाद में उपयोग के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ)
    1. 10% सामान्य गधे सीरम/0.1% ट्राइटन एक्स-100 में 1x पीबीएस में न्यूरॉन्स युक्त ब्लॉक OCT वर्गों या संस्कृति कक्षों कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए।
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी में नमूनों को 5% सामान्य गधे सीरम/005% ट्राइटन एक्स-100 में 1x पीबीएस में रात 4 डिग्री सेल्सियस पर पतला किया जाता है।
    3. प्रत्येक वॉश में 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस/0.1% ट्राइटन एक्स-100 में नमूने धोएं।
    4. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों को 5% सामान्य गधे सीरम/0.05% ट्राइटन एक्स-100 में 1x पीबीएस में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पतला करें।
    5. 1x PBS/0.1% ट्राइटन एक्स-100 में तीन बार 5 मिनट प्रत्येक धोने के लिए नमूने धोने तो 1 μg/mL DAPI में नमूनों को इनक्यूबेट ।
    6. एक कवरस्लिप और कुछ बढ़ते माध्यम के साथ नमूनों माउंट और इसे सूखने के लिए अनुमति देते हैं ।
    7. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत नमूनों का निरीक्षण करें।
  6. आरएनए-एसईक्यू विश्लेषण
    1. विभिन्न चरणों में कोशिकाओं को इकट्ठा करें और आरएनए निष्कर्षण करें (चरण 3.2 देखें)।
    2. सीडीएनए पुस्तकालयों को तैयार करें, वांग एट अल8में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार गहरे अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण करें।
    3. आर पैकेज, क्लस्टरप्रोफाइलर का उपयोग करके जीन ऑन्टोलॉजी (जीओ) विश्लेषण करें।
  7. फ्लो साइटोमेट्री
    1. चरण 1.6-1.7 का पालन करके ईएससी एकत्र करें और कोशिकाओं को मध्यम में फिर से खर्च करें। चरण 2.4 का पालन करके ईबी और एनपीसी को एकत्र करें और कोशिकाओं को मध्यम में पुनर्व्यवित करें।
    2. एक नई 15 एमएल शंकु नली में 40 माइक्रोन नायलॉन सेल छलनी का उपयोग कर सेल निलंबन फ़िल्टर करें।
    3. प्रवाह साइटोमीटर (संस्था की मुख्य सुविधा द्वारा किए गए) का उपयोग करके नमूनों के जीएफपी सिग्नल को मापें।

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Representative Results

हमारी विधि के प्रतिनिधित्व के रूप में, हमने E14 कोशिकाओं पर ईबी, एनपीसी और न्यूरॉन भेदभाव प्रयोग किया। E14 कोशिकाओं को γ-विकिरणित MEFs(चित्रा 1A)पर सुसंस्कृत किया गया था जब तक कि γ-विकिरणित एमईएफ आबादी पतला नहीं हो जाती। हमने नैनोग और ऑक्ट4 मार्कर के लिए क्षारीय फॉस्फेटे (एपी) धुंधला(चित्रा 1B)और बाद में आरटी-क्यूपीसीआर (नीचे देखें) का प्रदर्शन करके E14 कोशिकाओं की बहुलता की पुष्टि की। γ-विकिरणित एमईएफ-मुक्त E14 कोशिकाओं को चित्रा 2 एमें उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके भेदभाव के लिए प्रेरित किया गया था। संक्षेप में, 500 कोशिकाओं वाले 20 माइक्रोन की विभेदन मीडिया बूंदों को संस्कृति प्लेट के ढक्कन पर वरीयता दी गई थी (विवरण के लिए प्रोटोकॉल धारा 2 देखें)। इसके बाद गठित ईबी को नए विभेदन मीडिया में एकत्र किया गया और निलंबन में रखा गया । भेदभाव के 4 दिन से 8 दिन तक, एनपीसी को प्रेरित करने के लिए संस्कृति प्लेटों में 5 μM RA जोड़ा गया था । विभेदित ईबी ने गोल आकार दिखाया और भेदभाव(चित्रा 2B) के दौरान उनकाआकार लगातार बढ़ता रहा । 8 दिन में, एनपीसी काटा और tripsinized थे, और फिर जिसके परिणामस्वरूप एकल सेल निलंबन DMEM में एक ऊतक संस्कृति कक्ष में चढ़ाया गया था/ 10 दिन तक, न्यूरॉन्स में अंतर करने वाले एनपीसी में विस्तारित-कोशिका आकार(चित्रा 2B)दिखाई देता है।

हमारे भेदभाव प्रयोग का आगे मूल्यांकन करने के लिए, हमने 12 दिन में E14 एनपीसी और 14 न्यूरॉन्स पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) प्रयोग किए । हमने न्यूरॉन्स(चित्रा 3 ए)के लिए एनपीसी और न्यूरोफिलामेंट (एनएफ) सिग्नल में नेस्टिन के लिए सकारात्मक धुंधला देखा। वैकल्पिक रूप से, आरटी-क्यूपीसीआर और आरएनए-एसईक्यू ने एनपीसी मार्कर जीन को शामिल करने और एनपीसी में प्लूपिपेंसी जीन के नुकसान(चित्र 3बी, डी, एफ)की पुष्टि की । ईएससी भेदभाव की सफलता का परीक्षण करने के लिए एक मात्रात्मक विधि के रूप में, हमने एक माउस ईएससी लाइन को अलग किया, जिसमें एक Sox1 प्रमोटर-संचालित जीएफपी रिपोर्टर9व्यक्त किया गया, जिसके बाद ईएसएस और एनपीसी पर प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण किया गया। हमने पाया कि एनपीसी चरण में कुल कोशिकाओं का 58.7% जीएफपी-सकारात्मक है जबकि जीएफपी सिग्नल ईएससी चरण(चित्रा 3सी) पर 0.0%है। भेदभाव के दौरान ट्रांसक्रिप्टोर्मिक परिवर्तनों को प्रोफाइल करने के लिए, E14 ESCs, ईबी दिन 3 और एनपीसी दिन 8 के लिए आरएनए-एसईक्यू प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया और संबंधित चरणों(चित्रा 3 डी)से जुड़े जीन समूहों का पता चला। आरएनए-सेक़ हीट-मैप में जीन को उनकी अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर हल किया गया ताकि भेदभाव के दौरान विभिन्न चरणों में अलग-अलग रूप से व्यक्त किए गए जीन की पहचान की जा सके। जीन ओंटोलॉजी (GO) चार जीन समूहों के लिए विश्लेषण से पता चला है कि इन समूहों अलग सेलुलर कार्यों या रास्तों के अनुरूप है कि mESC न्यूरोनल भेदभाव के तीन सेल चरणों प्रत्येक जीन का एक समूह है कि अत्यधिक अपने संबंधित चरण में व्यक्त कर रहे हैं, लेकिन दूसरों को नहीं(चित्रा 3E)। उदाहरण के लिए, क्लस्टर 3 में जीन अन्य चरणों की तुलना में E14 एनपीसी में अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं और न्यूरोनल विकास से संबंधित रास्तों के अनुरूप होते हैं । क्लस्टर 1, 2, और 4 में किसी भी रोगाणु परत वंश विनिर्देशों से संबंधित अत्यधिक व्यक्त जीन नहीं होते हैं लेकिन वे सेलुलर विकास और प्रसार से संबंधित हैं। इस प्रकार, आरएनए-एसईक्यू और साथ में गो विश्लेषण से पता चला है कि E14 कोशिकाओं ने भेदभाव के दिन 8 तक न्यूरोनल वंश में अंतर किया है।

Figure 1
चित्रा 1: संस्कृति में E14 ESCs । (A)लाइट माइक्रोस्कोप इमेजेज में γ-किरणित एमईएफ के ऊपर कॉलोनियों में उगने वाली E14 कोशिकाएं (काला तीर) दिखाई देती हैं । E14 कालोनियों के रूप में 1 दिन और 3 दिन संस्कृतियों के बीच कॉलोनी आकार अंतर में देखा पैदा करने के लिए जारी है । (ख)क्षारीय फॉस्फेट (एपी) दाग द्वारा E14 ESCs की pluripotency की पुष्टि । बैंगनी तीर एमईएससी को इंगित करते हैं जो एपी दाग के लिए सकारात्मक थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ईबी, एनपीसी और न्यूरॉन्स में E14 भेदभाव। (क)योजनाबद्ध ईबी, एनपीसी और न्यूरॉन्स में ई 14 कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रमुख कदमों का सारांश देता है । (ख)ई14 ईएससी बिना एलआईएफ और 2i के बिना माध्यम में सुसंस्कृत, दूसरे दिन दिखाई देने वाले ईबीएस के व्यक्तिगत क्षेत्रों के रूप में जहां वे बाद के दिनों में आकार में बढ़ते और विस्तार करते रहते हैं । आरए को एनपीसी में भेदभाव को प्रेरित करने के लिए भेदभाव के दिन 4 में जोड़ा जाता है । इंडक्शन के 4 दिनों के बाद, इन एनपीसी को न्यूरॉन्स में भेदभाव के लिए चढ़ाया जाता है, जिन्हें नीचे पैनल में दिखाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: विभेदित कोशिकाओं का लक्षण वर्णन। (क)शीर्ष पैनल में इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां 8 दिन में एनपीसी युक्त ईबी को नेस्टिन (ग्रीन) और नाभिक (DAPI, नीला) के लिए जांच दिखाती हैं । नीचे पैनल न्यूरोफिलामेंट (हरे रंग) के लिए जांच 12 दिन में न्यूरॉन्स के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों से पता चलता है । विलय छवियों में लाल बॉक्स बेहतर देखने के लिए 3x में ज़ूम कर रहे हैं। (B)आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण जिसमें E14 ईएससी और एनपीसी के pluripotency मार्कर (Nanog और Oct4) और एनपीसी मार्कर (पैक्स6, न्यूरोडी1और एनईएस) को दिखाया गया है । त्रुटि सलाखों का मतलब है ± एसडी(सी)E14 कोशिकाओं एक Sox1 प्रमोटर संचालित GFP रिपोर्टर व्यक्त एनपीसी में विभेदित किया गया । 8 दिन में दोनों ईएसएस और एनपीसी को प्रवाह साइटोमेट्री के साथ सकारात्मक जीएफपी फ्लोरोसेंट सिग्नल के लिए निर्धारित किया गया था। (घ)हीटमैप ईएससी, ईबी और एनपीसी चरणों में व्यक्त किए गए जीन के निर्धारित एफपीकेएम के लिए जेड-स्कोर दिखाता है । चार अलग-अलग जीन समूहों की पहचान जीन के समूहों को दर्शाता है जो ईएससी, ईबी या एनपीसी चरण में अलग-अलग व्यक्त किए जाते हैं। (ई)आर पैकेज, क्लस्टरप्रोफिलर का उपयोग करके आरएनए-एसईक्यू में पहचाने गए चार समूहों पर जीओ विश्लेषण किया गया था। (एफ)ग्राफ तीन अन्य pluripotency मार्कर, Sox2, Klf4,और Myc के साथ ही तंत्रिका मार्कर, NeuN, Map2,और Tubb3 ईएससी, ईबी दिन 3, और एनपीसी दिन 8 चरणों में E14 कोशिकाओं के लिए FPKM मूल्यों से पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के तंत्रिका भेदभाव के लिए विधि दशकों से स्थापित की गई है और शोधकर्ताओं ने पिछले प्रोटोकॉल को संशोधित करना जारी रखा है या विभिन्न प्रयोजनों के लिए नए बनाने के लिए7,10,11 हमने न्यूरॉन्स के लिए एमईसी के भेदभाव चरणों की दक्षता और प्रगति का व्यापक विश्लेषण करने के लिए परख की एक श्रृंखला का उपयोग किया, जिसका उपयोग माउस या मानव ईएसएसी के अन्य वंश भेदभाव के विश्लेषण में किया जा सकता है। इसके अलावा, हमारे दृष्टिकोण विट्रो 8 में न्यूरोनल भेदभाव पर विशिष्ट जीन या रास्तों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी उपकरण साबितहुएहैं।

हमारे तरीकों के साथ, रिटिनोइक एसिड (आरए) के साथ इलाज किए गए संयुक्त राष्ट्र-प्रतिबद्ध ESCs एक उच्च दक्षता के साथ तंत्रिका वंश के लिए प्रतिबद्ध हैं और न्यूरॉन्स7उत्पन्न करने के लिए प्रेरित होते हैं। तंत्रिका कोशिकाओं में ईएस कोशिकाओं के सफल भेदभाव में सुधार और विषमता को कम करने के लिए, ईएस कोशिकाओं को एक अविभेदित राज्य12में रखना महत्वपूर्ण है। गैर-प्रसार एमईएफ, γ-विकिरण या माइटोमाइसिन सी के साथ इलाज किया जाता है, ईएससी की बहुलता को बनाए रखने और उनके विकास13,14के लिए एक पाड़ प्रदान करने के लिए कार्य करता है। लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए, हम γ-विकिरणित एमईएफ पर सुसंस्कृत एमएससी के साथ प्रत्येक भेदभाव प्रयोग शुरू करते हैं। कुछ अंशों के बाद, γ-विकिरणित एमईएफ मर जाते हैं और संस्कृति अंततः एमईएससी कोशिकाओं के लिए समरूप हो जाती है। वैकल्पिक रूप से, एमईएससी को अगले मार्ग पर बेहतर तरीके से हटाने के लिए γ-विकिरणित एमईएफ को वरीयता दी जाती है, इससे पहले कि एमईएससी को लगभग 45 मिनट के लिए जिलेटिन पर प्री-प्लेटेड किया जा सकता है। ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (एलआईएफ) का उपयोग लंबे समय से जेके/स्टेट पाथवे15, 16, 17को सक्रिय करके सुसंस्कृत माउस ईएस कोशिकाओं की बहुलता स्थिति को बनाए रखनेकेलिए कियाजाता रहाहै। हाल ही में, पीडी0325901 (पीडी, एक एमईके अवरोधक) और CHIR99021 (CH, एक जीएसके अवरोधक) ईएस कोशिकाओं3,18के अतिरिक्त पूर्णता रखरखाव प्रदान करने के लिए पाए गए। हमारे प्रोटोकॉल में, हम एमईसी की उच्च बहुलता बनाए रखने के लिए एलआईएफ के साथ मिलकर इन अवरोधकों के साथ एमईसी को संस्कृति देते हैं।

सफल भेदभाव प्राप्त करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक ईबी की गुणवत्ता है। हम हैंगिंग ड्रॉप विधि द्वारा E14 कोशिकाओं का भेदभाव करते हैं, जिसे अन्य जांचकर्ताओं द्वारा5,19,20लागू किया गया है। इस विधि के साथ, एकल ईएस कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए विभेदन मध्यम बूंद में निलंबित करने की अनुमति है जहां वे अनायास कुल और ईबी बनाते हैं। परिणामस्वरूप ईबी आम तौर पर मध्यम में अलग-थलग पड़े एमईएससी को निलंबित करने की विधि की तुलना में उनकी आकृति विज्ञान(चित्रा 2 बी)के संदर्भ में अधिक अच्छी तरह से परिभाषित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप हमारे अनुभव में बहुत व्यापक रेंज में ईबी आकार होते हैं (डेटा नहीं दिखाया गया)। ईबी को प्लेटों से जोड़ने से रोकने के लिए, भेदभाव प्रक्रिया के माध्यम से जारी रखने वाले 3 दिन से शुरू होने वाले कम गति वाले रोटेशन करना महत्वपूर्ण है। ईबी को आरए के साथ इलाज करके एनपीसी में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जाता है । ईबी दिन 4 में आरए उपचार से परिणामी एनपीसी आमतौर पर तंत्रिका कोशिकाओं जैसे ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स21के लिए विषम होते हैं । आरटी-क्यूपीसीआर या इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके, एनपीसी की आबादी को न्यूरॉन और अन्य तंत्रिका वंश मार्कर जैसे एस्ट्रोसाइट्स के लिए जीएफएपी और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स के लिए ओलिगेड्रोसाइट्स के लिए ओलिगेड्रॉन्ड्रोसाइट्स के लिए जांच की जा सकती है। एनपीसी के भेदभाव को न्यूरॉन्स में और प्रेरित करने के लिए, एनपीसी इष्टतम न्यूरॉन माध्यम में सुसंस्कृत होते हैं जहां सबसे महत्वपूर्ण घटक एन 2 और बी 27 की खुराक हैं। N2 पूरक मुख्य रूप से एनपीसी को न्यूरोनल वंश के लिए प्रतिबद्ध करने में मदद करने के लिए कार्य करता है जबकि बी 27 पूरक न्यूरॉन्स की दीर्घायु को बनाए रखने के लिए कार्य करता है।

नमूनों को पूर्ण और ectoderm मार्कर के लिए आरटी-क्यूपीसीआर प्रदर्शन करके भेदभाव प्रक्रिया को ट्रैक करने के लिए विभेदन अवधि (उदाहरण के लिए, ईएससी चरण, ईबी दिन 2, ईबी दिन 4, एनपीसी दिन 6, एनपीसी दिन 8, न्यूरॉन्स दिन 10, और न्यूरॉन्स दिन 12) में एकत्र किया जा सकता है। विभिन्न सेल चरणों के बीच ऑक्ट4, नैनोग, सोक्स2, केएलएफ 4और माईक जैसे प्लुरिपोता मार्कर की तुलना करना एमसीसी(चित्र 3बी, एफ)की प्लंपिपेंसी को सत्यापित करेगा। तंत्रिका भेदभाव की दक्षता की जांच करने के लिए, मेसोडर्म परत जैसे Hand1, Snai1,और Tbxtके लिए मार्कर; और ईम्स और गेटा4 जैसी एंडोडर्म लेयर की भी जांच की जा सकती है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। इसके अलावा सत्यापन एनपीसी या न्यूरोनल मार्कर(चित्रा 3 ए)के लिए जांच करने वाले इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) के साथ किया जा सकता है। हालांकि, ये विधियां चयनित मार्कर की ओर मात्रात्मक और पक्षपातपूर्ण नहीं हैं। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम प्रवाह साइटोमेट्री और आरएनए-सेक्यू विश्लेषण(चित्रा 3सी\u2012F)को शामिल करते हैं। प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोग में उपयोग की जाने वाली सेल लाइन एक Sox1-जीएफपी E14 सेल लाइन है, जिसका उपयोग विशेष रूप से एनपीसी भेदभाव प्रक्रिया की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए इस प्रयोग में किया गया था। Sox1 न्यूरोेक्टोडर्म विकास22 के दौरान सबसे शुरुआती विशिष्ट न्यूरोनल मार्कर में से एक है इसलिए यह एनपीसी वंश के लिए एक उत्कृष्ट मार्कर बना रहा है। Sox1 एनपीसी आबादी का मूल्यांकन करने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर या पश्चिमी दाग का उपयोग करने के लिए जांच की जा सकती है। ये विश्लेषण जीन हेरफेर या रासायनिक उपचार के कारण होने वाले भेदभाव दोष की जांच करने के लिए विशेष रूप से फायदेमंद होते हैं।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यहां प्रस्तुत हमारे प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, हम केवल एक जंगली प्रकार के mESC सेल लाइन के लिए व्यापक विश्लेषण पेश कर रहे हैं । चूहों या मनुष्यों से निकलने वाली अन्य ईएससी लाइनों को सफल और कुशल न्यूरॉन भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल में परिवर्तन और आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। दूसरे, हम एक इन विट्रो न्यूरॉन भेदभाव विधि प्रस्तुत करते हैं, जो स्वाभाविक रूप से अपनी सीमाओं का अपना सेट रखता है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ईबी को एनपीसी वंश की ओर चलाने के लिए आरए के एक अधिभिज्य स्तर के साथ इलाज किया जाता है। परिणामस्वरूप एनपीसी तो शारीरिक स्थितियों की नकल और न्यूरॉन वंश प्रतिबद्धता, विकास, और दीर्घायु को प्रोत्साहित करने के लिए न्यूरॉन इष्टतम मीडिया में रखा जाता है । यहां, N2 और B27 की खुराक का उपयोग न्यूरॉन्स संस्कृति के लिए किया जाता है लेकिन अन्य पूरक भी इसी तरह के उद्देश्यों के लिए NS2123 जैसे उपलब्ध हैं, जो न्यूरॉन भेदभाव की सफलता और दक्षता को बदल सकते हैं। इन स्थितियों को कृत्रिम रूप से सेल संस्कृति परख में पुनर्गठित किया जाता है, जो पूरी तरह से शारीरिक स्थितियों का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। ईबी, एनपीसी और न्यूरॉन्स की गुणवत्ता शुरुआती एमेक्स पर निर्भर करती है। mESCs कि बहुत बार के लिए पारित किया गया है और अधिक से अधिक 1 सप्ताह के लिए संस्कृति में रखा आम तौर पर pluripotency खोने के लिए शुरू और सफलतापूर्वक भेदभाव से गुजरना नहीं हो सकता है । इस प्रकार, एक इष्टतम स्थिति में एमएससी को बनाए रखना यह सुनिश्चित करने में महत्वपूर्ण है कि वे प्रभावी रूप से ईबी, एनपीसी और न्यूरॉन्स में अंतर कर सकते हैं। 3डी मॉडल जैसे अन्य न्यूरॉन कल्चर विधियों को भी24 , 25,26कभी - कभी थ्रूपुट और व्यवहार्यता27,28 की कीमत पर बेहतर नकल करने का प्रस्ताव दिया गया है । हमारा मानना है कि हमारे प्रोटोकॉल इन 3 डी संस्कृति मॉडल की विशेषता के लिए उपयोगी हैं ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वहां कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों रहे हैं ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच (1R35GM1333496-01) से जेड गाओ तक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम सेक्शनिंग में सहायता के लिए डॉ रयान हाब्स को धन्यवाद देना चाहते हैं । हम पेन स्टेट कॉलेज ऑफ मेडिसिन की मुख्य सुविधाओं का शुक्रिया अदा करते हैं, जिनमें जीनोम साइंसेज एंड बायोइन्फॉर्मेटिक्स, एडवांस्ड लाइट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री शामिल हैं । हम आरएनए-सेक्यू विश्लेषण में सहायता के लिए डॉ युका इमामुरा को भी धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X Corning 25-052-CV
0.1% Gelatin Sigma G1890-100G Prepared in de-ionized water
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28908 Diluted in 1X PBS
40-μm cell strainer Falcon 352340
Albumax Thermo Fisher Scientific 11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11001 Antibody was diluted at 1:500 for IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit II Stemgent 00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox Azura Genomics AZ-2105
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
BD FACSCanto BD 657338
bFGF Sigma 11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626
Chir99021 Cayman Chemicals 13122
Chloroform C298-500 Fisher Chemical
DAPI Invitrogen R37606
DMEM Corning 10-017-CM
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320033
EB buffer Qiagen 19086
Ethanol 111000200 Pharmco Diluted in de-ionized water
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY-401-2501
Isopropanol BDH1133-4LG BDH VWR Analytical Diluted in de-ionized water
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030024
LIF N/A N/A Collected from MEF supernatant
m18srRNA primers IDTDNA N/A 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acids Corning 25-025-Cl
mNanog primers IDTDNA N/A 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primers IDTDNA N/A 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primers IDTDNA N/A 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primers IDTDNA N/A 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primers IDTDNA N/A 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
Nestin primary antibody Millipore MAB5326 Antibody was diluted at 1:200 for IF
Neural basal Thermo Fisher Scientific 21103049
Neurofilament primary antibody DSHB 2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit BioO Scientific NOVA-5138-07
PD0325901 Cayman Chemicals 13034
Penicillin/streptomycin Corning 30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS) N/A N/A Prepared in de-ionized water
- Potassium chloride P217-500G VWR
- Potassium phosphate monobasic anhydrous 0781-500G VWR
- Sodium chloride BP358-10 Fisher Bioreagents
- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate SX0715-1 Milipore
Random hexamer primer Thermo Scientific SO142
Retinoic acid Sigma R2625 Prepared in DMSO
Sodium pyruvate Corning 25-000-Cl
Sucrose Sigma 84097 Diluted in 1X PBS
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen 18064022
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura 4583
TriPure Isolation Reagent Sigma-Aldrich 11667165001
TruSeq Rapid Illumina 20020616
β-mercaptoethanol Fisher BioReagents BP176-100

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 159 माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाएं भ्रूण शरीर तंत्रिका जनक कोशिका न्यूरॉन्स भेदभाव फांसी ड्रॉप E14
माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से तंत्रिका जनक और न्यूरॉन्स का भेदभाव और लक्षण वर्णन
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Hanafiah, A., Geng, Z., Wang, Q., Gao, Z. Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (159), e61446, doi:10.3791/61446 (2020).

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