Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

Published: May 15, 2020 doi: 10.3791/61446
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Penn State College of Medicine, Penn State Hershey Cancer Institute

Summary

אנו מתארים את ההליך של הבחנה במבחנה של תאי גזע עובריים עכבר לתאים עצביים באמצעות שיטת טיפה תלויה. יתר על כן, אנו מבצעים ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנטיות, RNA-seq, וציטומטריית זרימה.

Abstract

אנו מתארים את ההליך שלב אחר שלב לפולחן והבחנה של תאי גזע עובריים של עכברים לשושלות עצביות, ואחריו סדרה של גישות לאפיון התאים המובחנים. תאי הגזע העובריים של עכבר E14 שימשו ליצירת גופים עובריים באמצעות שיטת טיפת התלוי, ולאחר מכן הושרו כדי להבדיל לתאי אב עצביים על ידי חומצה רטינואית, ולבסוף נבדלו לנוירונים. תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך כמותי (RT-qPCR) וניסויים אימונופלואורסצנטיים גילו כי האבות העצביים והנוירונים מציגים סמנים מתאימים (קטין לאבות עצביים ו neurofilament עבור נוירונים) ביום 8 ו -12 לאחר בידול, בהתאמה. ניסויי ציטומטריית זרימה על קו E14 המבטאים כתב GFP מונחה מקדם Sox1 הראו כי כ -60% מהתאים ביום 8 הם חיוביים GFP, המציין את ההבחנה המוצלחת של תאי אב עצביים בשלב זה. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח RNA-seq כדי לפרופיל השינויים התמלוליים הכלליים. שיטות אלה שימושיות לניתוח מעורבותם של גנים ומסלולים ספציפיים בוויסות המעבר לזהות התא במהלך בידול עצבי.

Introduction

מאז ההפקה הראשונה שלהם מן מסת התא הפנימי של blastocysts העכבר המתפתח1,2, תאי גזע עובריים עכבר (mESC) שימשו ככלים רבי עוצמה כדי ללמוד התחדשות עצמית של תאי גזע ובידול3. יתר על כן, לימוד בידול mESC מוביל להבנה עצומה של מנגנונים מולקולריים שעשויים לשפר את היעילות והבטיחות בטיפול מבוסס תאי גזע בטיפול במחלות כגון הפרעות ניווניות4. בהשוואה למודלים של בעלי חיים, מערכת במבחנה זו מספקת יתרונות רבים, כולל פשטות בפועל והערכה, עלות נמוכה בשמירה על קווי תאים בניגוד לבעלי חיים, וקלות יחסית במניפולציות גנטיות. עם זאת, היעילות והאיכות של סוגי תאים מובחנים מושפעים לעתים קרובות מקווים שונים של mESCs, כמו גם משיטות הבידול5,6. כמו כן, הבדיקות המסורתיות להערכת יעילות הבידול מסתמכות על בדיקה איכותית של גנים נבחרים של סמן חסרי חוסן ולכן הם אינם מצליחים לתפוס שינויים גלובליים בביטוי הגנים.

כאן אנו שואפים להשתמש בסוללה של התקפות להערכה שיטתית של ההבחנה העצבית. באמצעות ניתוחי הפריה במבחנה מסורתיים על סמנים נבחרים ו- RNA-seq, אנו מקימים פלטפורמה למדידת יעילות הבידול, כמו גם את השינויים התמלוליים במהלך תהליך זה. בהתבסס על פרוטוקול שהוקם בעבר7, יצרנו גופים עובריים (EBs) באמצעות טכניקת טיפה תלויה, ואחריו אינדוקציה באמצעות כמות על-פיזיולוגית של חומצה רטינואית (RA) כדי ליצור תאי אב עצביים (NPCs), אשר לאחר מכן הובדלו נוירונים עם מדיום אינדוקציה עצבית. כדי לבחון את היעילות של הבידול, בנוסף לבדיקות RT-qPCR ואימונופלואורסצנטיות (IF) מסורתיות, ביצענו רנ"א-סק וציטומטריית זרימה. ניתוחים אלה מספקים מדידה מקיפה של התקדמות הבידול הספציפי לשלב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות mESC

  1. יש לצפות צלחת 10 ס"מ שטופלו בתרבית הרקמות עם 0.1% ג'לטין ולאפשר לג'לטין להתקבע לפחות 15-30 דקות לפני שהוא שואף החוצה.
  2. זרע γ עכבר עוברי (MEFs) יום אחד לפני פולחן mESCs במדיום mESC מחומם מראש (המדיום הנשר (DMEM) של Dulbecco עם 15% סרום בקר עוברי (FBS), חומצות אמינו לא חיוניות, β-mercaptoethanol, L-גלוטמין, פניצילין / סטרפטומיצין, נתרן פירובט, LIF, PD0325901 (PD) ו Chir99021 (CH)).
  3. אפשרו ל-MEFs המוקרנים γ להתיישב ולהצמיד למשטח הלוח לפני שאתם פולחים תאי E14.
  4. להפשיר E14 ESCs באמבט מים 37 °C ולהעביר במהירות את התאים בצינור חרוט 15 ס"מ עם בינוני mESC חם. גלולה את התאים ב 200 x g במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
  5. resuspend התאים ב 10 מ"ל של בינוני mESC צלחת התאים על צלחת התרבות המכילה את MEFs המוקרן γ זרע קודם לכן. לדגור על תרבית התא באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2.
  6. עבור תרבות passaging, לשאוף e המדיום לשטוף את הצלחת עם PBS סטרילי 1x. מוסיפים מספיק 0.05% טריפסין כדי לכסות את משטח הצלחת ודגור ב 37 °C (3 דקות).
  7. לנטרל את טריפסין עם בינוני mESC ו pipette כדי ליצור השעיה של תא יחיד. צנטריפוגות התאים ב 200 x g במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
  8. לספור את התאים עם hemocytometer או מונה התא ולזרוע על 5.0 x 105 תאים בצלחת תרבית 10 ס"מ.
  9. Resuspend התאים ב 10 מ"ל של בינוני mESC, צלחת התאים על צלחת תרבית רקמות מצופה ג'לטין ותרביות דגירה כפי שתואר קודם לכן.
    הערה: מומלץ להעביר mESCs כל יומיים כדי למנוע מהתאים להבדיל במושבות שלהם. פנול אדום בפונקציות בינוניות אך ורק כמו מחוון pH ובהתאם לצפיפות התא, זה יכול להפוך צהבהב (חומצי יותר), מוקדם יותר מ 2 ימים. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך לשנות את המדיום כל יום. ה-MEFs המוקרנים γ בסופו של דבר ימותו אחרי כמה קטעים.

2. EB, NPC, ובידול נוירונים

  1. בצע פרוטוקול העברת תרבית שהוזכר קודם לכן וספור את התאים (שלבים 1.7-1.10).
  2. שיטת טיפה תלויה (יום 0)
    1. עבור צלחת תרבית תאים 10 ס"מ, לספור בערך 2.5 x 104 תאים שבהם 5.0 x 102 תאים יושעו 20 μL הבחנה בינונית (DMEM עם 15% FBS, חומצות אמינו לא חיוניות, β-mercaptoethanol, L-גלוטמין, פניצילין / סטרפטומיצין, ונתרן pyruvate). בערך חמישים 20 טיפות μL המכילות את התאים ניתן צלחת אחת 10 ס"מ.
    2. Aliquot המספר המתאים של תאים, ולאחר מכן צנטריפוגה התאים ב 200 x g במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
    3. resuspend התאים בנפח המתאים של מדיום בידול עבור צפיפות תא של 5.0 x 102 תאים לכל 20 μL (למשל, 2.5 x 104 תאים ב 1 מ"ל של בינוני בידול).
    4. באמצעות מיקרופיפט או פיפטה מהדרת, מניחים 20 טיפות μL של השעיית התא על המכסה של צלחת תרבית הרקמות. ודא כי טיפות אינן קרובות מדי זה לזה כדי למנוע מהם להתמזג.
      הערה: הטיפות יכולות להיות מצופות על צלחת קובץ מצורף שטופלו בתרבית הרקמות או צלחת השעיה מכיוון שהן יונחו על המכסה ולא על הצלחת עצמה. לקבלת גישה ריאלית וסטרילית יותר, צלחת את הטיפות על צלחת תרבית רקמות מצורף ולהעביר אותם לצלחת השעיה כמתואר להלן.
    5. ממלאים את הצלחת ב-5-10 מ"ל של 1x PBS ומחזירים בזהירות את המכסה לצלחת. לדגור על התרבות באינקובטור 37 °C (37 °F).
      הערה: PBS מתווסף לצלחת התרבות כדי למנוע את הטיפות להתייבש.
  3. ביום 2, להשתמש micropipette כדי לאסוף את הטיפות מהמכסה ומניחים אותם בצלחת השעיה תרבית תא 10 ס"מ מלא 10 מ"ל של מדיום בידול. לדגור את התרבות על שייקר מסלולי רועד במהירות נמוכה באינקובטור.
  4. ביום 4, כדי לקצור את EBs, לאסוף את התאים, צנטריפוגה ב 200 x g במשך 3 דקות, ולהסיר את supernatant.
    הערה: EBs ניתן גם לשטוף עם 1x PBS בהתאם לדרישות של ניסויים הבאים.
  5. כדי להמשיך את ההליך ולעורר את בידול EB לתאי אב עצביים (NPCs), להכין את מדיום הבידול עם 5 מיקרומטר חומצה רטינואית (RA).
  6. הסר את המדיום הישן על ידי גלולה EBs ב 100 x g במשך 3 דקות או לאפשר EBs להתיישב לפני שאיפה את המדיום הישן. הוסף 10 מ"ל של מדיום הבידול המכיל 5 μM RA ללוח התרבות.
  7. ביום 6, להחליף לפחות מחצית המדיום עם מדיום טרי המכיל 5 μM RA על ידי הטיית הצלחת וצינור החוצה המדיום כמתואר לעיל.
    הערה: מומלץ להחליף לפחות מחצית מהמדיום במדיום רענן המכיל RA בימים 5 ו -7. שימו לב למדד האדום פנול; אם זה הופך צהבהב, עדיף להחליף את כל המדיום.
  8. ביום 8, לקצור את NPCs על ידי איסוף התאים, centrifuging ב 200 x g במשך 3 דקות, והסרת supernatant.
    הערה: NPCs ניתן גם לשטוף עם PBS 1x בהתאם לצרכים של ניסויים הבאים. במידת הצורך, NPC יכול להיות קפוא ולהפשיר שוב לתרבות וניתוח מאוחרים יותר. אם NPC הם להיות תרבותי, accutase יכול לשמש גם כחלופה טריפסין.
  9. כדי להמשיך את ההליך ולהבדיל NPCs לנוירונים, לאסוף NPCs בצינור חרוט 15 מ"ל על ידי צנטריפוגה, לנתק אותם עם טריפסין ולדגירה אותם ב 37 °C (3 דקות). Pipette NPCs כדי להבטיח כי כל אגרגטים NPC מנותקים ולנטרל את טריפסין עם המדיום.
  10. לסנן את התאים עם מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר ולספור את התאים לפני ציפוי אותם בצפיפות של 1.5 x 105/cm2 בינוני N2 (DMEM / F12 בינוני + 3 מ"ג / מ"ל גלוקוז + 3 מ"ג / מ"ל שור עשיר בשומנים אלבומין בסרום (LBSA) + תוספת 1:100 N2 + 10 ננוגרם / מ"ל bFGF + 50 U / mL עט / סטרפטוקומין + 1 mM L-גלוטמין) על צלחת שטופלו תרבית רקמות לניסויי PCR וכתם מערביים הבאים; או על תא תרבית רקמות לניסויים אימונופלואורסצנטיים.
  11. ביום 9, להחליף את המדיום הישן עם מדיום N2 טרי.
  12. ביום 10, לעבור את N2 בינוני עם N2/B27 בינוני (50% DMEM / F12 ו 50% בזלת עצבית, 3 מ"ג / מ"ל LBA, 1:200 תוספת N2, תוספת 1:100 B27, 50 U / mL עט / סטרפטופון, ו 1 מ"מ L-גלוטמין).
  13. בימים 11-12, לקצור את הנוירונים כדלקמן. לשטוף את התאים עם 1x PBS, להוסיף טריפסין, ודגרה את התרבות באינקובטור 37 °C במשך 3 דקות לפני נטרול טריפסין עם בינוני צנטריפוגה ב 200 x g במשך 3 דקות.

3. אפיון של mESCs ותאים מובחנים

  1. אלקליין פוספטאז (AP) אסייד
    1. השתמש בערכה להערכת פעילות הפוספטאז האלקליין (ראה טבלת החומרים).
    2. הסר את המדיום מצלחת התרבות ושטוף את ה- ESCs עם PBS 1x.
    3. הוסף 1 מ"ל של פתרון התיקון (מורכב פורמלדהיד ומתנול) המסופק עם הערכה לצלחת ודגר אותה בטמפרטורת החדר במשך 2-5 דקות.
      הערה: דגירה יתר בפתרון התיקון עלולה לסכן את פעילות AP.
    4. הסר את פתרון התיקון, לשטוף את ESCs עם 1x PBS ולהשאיר כמות מסוימת של PBS בצלחת.
      הערה: שמור על ה- ESCs לחים ב- PBS כדי לא לסכן את פעילות AP.
    5. הכן את פתרון AP על-ידי ערבוב פתרונות המצע A, B ו- C ביחס של 1:1:1. מערבבים תחילה את הפתרונות A ו- B ודגרים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות לפני הוספת תמיסה C.
    6. הסר את PBS 1x והוסף את פתרון AP שהוכן קודם לכן.
    7. לדגור על ESCs במשך כ 15 דקות בחושך על ידי עטיפת צלחת התרבות עם רדיד אלומיניום או ביצוע שלב 3.5 בחדר חשוך.
    8. נטר את התגובה והסר את פתרון התגובה כאשר הפתרון הופך בהיר כדי למנוע כתמים לא ספציפיים.
    9. לשטוף את ESCs פעמיים עם PBS 1x.
    10. מנעו את הייבוש של הדגימה על-ידי כיסוי ה-ESCs באמצעות PBS 1x או הרכבה בינונית.
      הערה: כתם אדום או סגול יופיע עבור ביטוי AP. ניתן לאחסן את הצלחת במקרר של 4 מעלות צלזיוס.
  2. RT-qPCR
    1. לאסוף תאים בשלבים שונים על-ידי ביצוע שלבים 1.6-1.7 ו- 2.4 עבור ESCs ו- EBs ו- NPC, בהתאמה.
    2. לבודד RNA באמצעות RNA, DNA, פתרון מיצוי חלבון (ראה טבלה של חומרים).
    3. צור cDNA עם ערכת תמלול הפוכה (ראה טבלת החומרים) ופעל לפי מדריך היצרן.
  3. קיבוע והטבעה
    1. קציר EBs ו- NPCs כמתואר לעיל (שלב 2.6) ולתקן אותם עם 4% פתרון paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הסר PFA ולשטוף את המדגם עם 1x PBS במשך 5 דקות.
    3. מקם את המדגם בדילול טורי של 1x PBS, 10%-, 20%-, ו 30%-סוכרוז פתרונות ב 25\u201228 °C שבו המדגם מועבר לפתרון הבא לאחר 30 דקות של דגירה.
      הערה: ניתן לאחסן את המדגם בתמיסת סוכרוז 30% ב- 4 °C (70 °F) לפני שתמשיך בשלב ההטבעה.
    4. מרטיבים את קצה הפיפטה עם תמיסת סוכרוז לפני שמניחים את המדגם (מבלי לערום אותם) במרכז תבנית הקריו ומכניסים את הנוזל העודף.
      הערה: נייר סינון יכול לשמש גם כדי להסיר את הפתרון העודף. הרטבת קצה הפיפטה עם פתרון סוכרוז חשובה כדי למנוע את EBs ו- NPCs מלהידבק לקירות הקצה.
    5. בזהירות להוסיף טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) פתרון לתבנית מבלי resuspending הדגימות ולהסיר בועות עודף עם pipette.
    6. מניחים את התבנית עם המדגם על מערבל מעבדה במהירות נמוכה כדי להתסיס קלות את המדגם במשך 15 דקות. פעולה זו מסייעת ליישב את ה- EBs וה- NPC לתחתית אם הם תלויים מחדש בפתרון OCT.
    7. להקפיא במהירות את המדגם על ידי הצבת התבנית בחנקן נוזלי או על קרח יבש.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות במקפיא של -70 °C לפני שתמשיך לשלב הבא.
  4. קריוזקציה
    1. הגדר את cryostat להתקרר -20 כדי -18 °C (50 °F) לפני העברת המדגם למכשיר.
    2. לנתק את בלוק OCT קפוא מן התבנית ולאבטח אותו על המחזיק עם פתרון OCT קטן הניח על פני השטח של המחזיק.
    3. ישר את בלוק OCT כך שה- EBs וה- NPC יהיה הקרוב ביותר ללהב כדי להבטיח שהדגימה לא תאבד במהלך ניתוח.
    4. בזהירות סעיף 10 מיקרומטר של הבלוק ולשים לב לפרוסות המכילות את המדגם.
    5. הניחו במהירות את פרוסת OCT המכילה את הדגימה על מגלשת הזכוכית המטביעה רקמות ואפשרו לפרוסות OCT להתייבש באוויר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
      הערה: ניתן לאחסן את הדגימות ב- -70 °C (70 °F) לשימוש מאוחר יותר.
  5. אימונופלואורסצנטיות (IF)
    1. בלוק מקטעי OCT או תאי תרבות המכילים נוירונים בסרום חמור רגיל 10% / 0.1% Triton X-100 ב 1x PBS עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    2. לדגור את הדגימות בנוגדן ראשוני מדולל בסרום חמור רגיל 5% / 0.05% Triton X-100 ב 1x PBS לילה ב 4 °C (5 °F).
    3. לשטוף דגימות ב 1x PBS / 0.1% Triton X-100 שלוש פעמים במשך 5 דקות כל לשטוף.
    4. לדגור על הדגימות עם נוגדן משני מדולל בסרום חמור רגיל 5% / 0.05% טריטון X-100 ב 1x PBS עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    5. לשטוף דגימות 1x PBS / 0.1% Triton X-100 שלוש פעמים במשך 5 דקות כל לשטוף ואז לדגור על הדגימות 1 מיקרוגרם / mL DAPI.
    6. הר את הדגימות עם כיסוי וכמה בינוני הרכבה ולאפשר לו להתייבש.
    7. שימו לב לדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  6. ניתוח RNA-seq
    1. לאסוף את התאים בשלבים שונים ולבצע מיצוי RNA (ראה שלב 3.2).
    2. הכן את ספריות cDNA, בצע רצף עמוק וניתוח נתונים בהתאם לפרוטוקול המתואר בוונג ואח'8.
    3. בצע את ניתוח אונטולוגיה גנטית (GO) באמצעות חבילת R, clusterProfiler.
  7. ציטומטריית זרימה
    1. אסוף ESCs על-ידי ביצוע השלבים 1.6-1.7 וקבע מחדש את התאים במצב בינוני. אסוף את ה- EBs וה- NPC על-ידי ביצוע השלב 2.4 והידוק מחדש של התאים במצב בינוני.
    2. לסנן את השעיית התא באמצעות מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש 15 מ"ל.
    3. מדוד את אות GFP של הדגימות באמצעות cytometer הזרימה (מבוצע על ידי מתקן הליבה של המוסד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כייצוג של השיטה שלנו, ביצענו ניסוי בידול EB, NPC, נוירונים על תאי E14. תאי E14 היו בתרבית על MEFs המוקרנים γ (איור 1A) עד שאוכלוסיית MEF המוקרנת γ מדוללת. אישרנו את הפלוריפוטנס של תאי E14 על ידי ביצוע כתמי פוספטאז אלקליין (AP)(איור 1B)ומאוחר יותר RT-qPCR (ראה להלן) עבור סמני ננוג ואוקטובר 4. תאי ה-E14 נטולי ה-MEF המוקרנים γ הושרו לאחר מכן לצורך בידול באמצעות הפרוטוקול המתואר באיור 2A. בקצרה, טיפות מדיה בידול של 20 μL המכיל 500 תאים נזרעו על המכסה של צלחת התרבות (ראה פרוטוקול סעיף 2 לפרטים). EBs שנוצר אז נאספו והושמו בהשעיה במדיה בידול טרי. מהיום הרביעי ועד היום 8 של בידול, 5 μM RA נוספה ללוחות התרבות כדי לגרום NPCs. EBs מובחן הראה צורה עגולה וגודלם המשיך לגדול במהלך בידול (איור 2B). ביום 8, NPCs נקצרו ו trypsinized, ולאחר מכן השעיה תא יחיד וכתוצאה מכך היה מצופה בתא תרבית רקמות ב DMEM / F12 בינוני עם תוספת N2 ומאוחר יותר תוספת B27. ביום 10, נראה כי NPC המבדילים לנוירונים הם בעלי צורת תא מוארכת(איור 2B).

כדי להעריך עוד יותר את ניסוי הבידול שלנו, ביצענו ניסויים אימונופלואורסצנטיים (IF) בנוירונים ביום 8 ו- E14 ביום 12. ראינו כתמים חיוביים עבור קינון ב- NPC ואות neurofilament (NF) עבור נוירונים (איור 3A). לחלופין, RT-qPCR ו- RNA-seq אישרו את האינדוקציה של גנים של סמן NPC ואובדן גנים pluripotency ב- NPCs (איור 3B, D, F). כשיטה כמותית כדי לבדוק את ההצלחה של בידול ESC, הבחנו קו ESC עכבר מבטא Sox1 מונחה מקדם GFP כתב9, ואחריו ניתוח ציטומטריית זרימה על ESCs ו- NPC. מצאנו כי 58.7% מכלל התאים בשלב NPC הם GFP חיובי בעוד אות GFP הוא 0.0% בשלב ESC(איור 3C). כדי לפרופיל השינויים התמלוליים במהלך ההבחנה, ניסויי RNA-seq עבור E14 ESCs, EB day 3 ו- NPC יום 8 בוצעו וגילו אשכולות גנים הקשורים לשלבים המתאימים (איור 3D). הגנים במפת החום של RNA-seq מוינו על סמך רמות הביטוי שלהם כדי לזהות גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי בשלבים השונים במהלך הבידול. ניתוח ג'ין אונטולוגיה (GO) עבור ארבעת צבירי הגנים הראה כי אשכולות אלה תואמים לפונקציות תאיות או מסלולים שונים המצביעים על כך שלשלושת שלבי התאים של ההבחנה העצבית של mESC יש קבוצה של גנים המתבטאים מאוד בשלב שלהם אך לא באחרים (איור 3E). לדוגמה, גנים באשכול 3 באים לידי ביטוי רב ב- E14 NPCs בהשוואה לשלבים אחרים ומתאימים למסלולים הקשורים להתפתחות העצבית. אשכולות 1, 2 ו-4 אינם מכילים גנים בעלי ביטוי רב הקשורים למפרטי שושלת השכבה של שכבת הנבט, אך הם קשורים לצמיחה ולהתפשטות תאית. לכן, RNA-seq וניתוח GO הנלווה הראו כי תאי E14 נבדלו לתוך השושלת העצבית ביום 8 של בידול.

Figure 1
איור 1: E14 ESCs בתרבות. (A)תמונות מיקרוסקופ האור מראות תאי E14 (חץ שחור) הגדלים במושבות על גבי ה- MEFs המוקרנים γ. מושבות E14 ממשיכות להתרבות כפי שניתן לראות בהבדל גודל המושבה בין תרבויות יום 1 ליום 3. (B)אישור של pluripotency של E14 ESCs על ידי כתם פוספטאז אלקליין (AP). חצים סגולים מצביעים על mESCs שהיו חיוביים עבור כתם AP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: בידול E14 ל- EBs, NPC ונוירונים. (A)הסכמטי מסכם את השלבים העיקריים להבחנה בין תאי E14 ל- EBs, NPC ונוירונים. (B)E14 ESCs בתרבית בינוני ללא LIF ו 2i בלוח השעיה טופס ספירות בודדות של EBs גלוי ביום 2 שבו הם ממשיכים לגדול ולהתרחב בגודל בימים הבאים. RA מתווסף ביום 4 של בידול כדי לגרום לבידול לתוך NPC. לאחר 4 ימים של אינדוקציה, NPCs אלה מצופים לבידול לתוך נוירונים, אשר מוצגים בלוח התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אפיון תאים מובחנים. (A)תמונות אימונופלואורסצנטיות בפאנל העליון מראות EBs המכיל NPC ביום 8 שנבדק עבור קינון (ירוק) וגרעין (DAPI, כחול). הלוח התחתון מציג תמונות אימונופלואורסצנטיות עבור נוירונים ביום 12 נחקר עבור neurofilament (ירוק). התיבה האדומה בתמונות הממוזגות מוגדלת ב- 3x לתצוגה טובה יותר. (B)ניתוח RT-qPCR המציג את סמני הפלוריפוטנציה (Nanog ו- Oct4) וסמני NPC (Pax6, NeuroD1 ו- Nes) של E14 ESCs ו- NPCs. סרגלי שגיאה הם ממוצעים ± SD. (C) תאי E14 המבטאים כתב GFP מונחה מקדם Sox1 הובחנו ל- NPC. הן ESCs והן NPCs ביום 8 היו כימותו עבור אות פלואורסצנטי GFP חיובי עם ציטומטריית זרימה. (D)מפת החום מציגה את ציוני z עבור FPKM הנחוש של הגנים המבוטאים בשלבי ESC, EB ו- NPC. זוהו ארבעה צבירי גנים נפרדים המסמלים קבוצות של גנים המתבטאות באופן דיפרנציאלי בשלב ESC, EB או NPC. (E)ניתוח GO בוצע באמצעות חבילת R, clusterProfiler, בארבעת האשכולות שזוהו ב- RNA-seq. (F)הגרף מציג את ערכי FPKM עבור שלושה סמני פלוריפוטנציה אחרים, Sox2, Klf4 ו- Myc, כמו גם סמנים עצביים, NeuN, Map2 ו- Tubb3 עבור תאי E14 בשלבי ESC, יום EB 3 ו- NPC יום 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה לבידול עצבי של תאי גזע עובריים של עכבר הוקמה במשך עשרות שנים והחוקרים המשיכו לשנות את הפרוטוקולים הקודמים או ליצור חדשים למטרות שונות7,10,11. השתמשנו בסדרה של בדיקות כדי לנתח באופן מקיף את היעילות וההתקדמות של שלבי הבידול של mESCs לנוירונים, אשר עשוי לשמש בניתוח של בידול שושלת אחרים של עכבר או ESCs אנושיים. יתר על כן, הגישות שלנו הוכיחו להיות כלים שימושיים כדי להעריך את ההשפעה של גנים ספציפיים או מסלולים על הבחנה עצבית במבחנה8.

עם השיטות שלנו, pluripotent לא מחויב ESCs שטופלו בחומצה ריטינואית (RA) להתחייב שושלת העצבית עם יעילות גבוהה והם מושרה עוד יותר כדי ליצור נוירונים7. כדי לשפר את ההבחנה המוצלחת של תאי ES לתאים עצביים ולהפחית את ההטרוגניות, חשוב לשמור על תאי ES במצב לא מובחן12. MEFs שאינם נפוצים, מטופלים עם γ-הקרנה או mitomycin C, פונקציה כדי לשמור על pluripotency של ESCs ולספק פיגום לצמיחתם13,14. כדי להשיג תוצאות עקביות, אנו מתחילים כל ניסוי בידול עם mESCs בתרבית על MEFs המוקרנים γ. לאחר כמה קטעים, MEFs המוקרנים γ למות והתרבות בסופו של דבר הופך הומוגני עבור תאי mESC. לחלופין, ניתן למצפות מראש את ה-mESCs על ג'לטין למשך כ-45 דקות לפני γ-מוקרן MEFs כדי להסיר אותם טוב יותר במעבר הבא. גורם מעכב לוקמיה (LIF) שימש זמן רב כדי לשמור על מצב pluripotency של תאי עכבר מתורבתים ES על ידי הפעלת מסלול JAK / STAT15,16,17. לאחרונה, PD0325901 (PD, מעכב MEK) ו CHIR99021 (CH, מעכב GSK) נמצאו לספק תחזוקה pluripotency נוסף של תאי ES3,18. בפרוטוקול שלנו, אנו תרבות mESCs עם מעכבים אלה יחד עם LIF כדי לשמור על שפע גבוה של mESCs.

גורם קריטי נוסף להשגת בידול מוצלח הוא איכות ה- EBs. אנו מבצעים את ההבחנה של תאי E14 על ידי שיטת טיפה תלויה, אשר יושם על ידי חוקרים אחרים5,19,20. בשיטה זו, תאי ES בודדים רשאים להשעות בטיפה בינונית בידול למשך יומיים שבהם הם מצטברים באופן ספונטני ויוצרים EBs. ה- EBs המתקבלים מוגדרים בדרך כלל בצורה טובה יותר מבחינת המורפולוגיה שלהם (איור 2B) בהשוואה לשיטה להשעות mESCs מבודדים במצב בינוני, מה שמביא לגדלי EB בטווח רחב בהרבה מניסיוננו (נתונים שאינם מוצגים). כדי למנוע EBs מלהיצמד ללוחות, חשוב לעשות סיבוב במהירות נמוכה החל מהיום 3 ממשיך דרך תהליך הבידול. EBs מושרה להבדיל לתוך NPC על ידי טיפול בהם עם RA. NPCs וכתוצאה מכך מטיפול RA ביום EB 4 הם בדרך כלל הטרוגניים עבור תאים עצביים כגון אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים21. באמצעות RT-qPCR או אימונופלואורסצנטיות, ניתן לחקור את אוכלוסיית NPC עבור נוירונים וסמני שושלת עצבית אחרים כגון Gfap עבור אסטרוציטים ואוליג2 עבור אוליגודנדרוציטים. כדי לגרום עוד יותר את הבידול של NPCs לתוך נוירונים, NPCs הם מתורבתים במדיום נוירון אופטימלי שבו הרכיבים החשובים ביותר הם תוספי N2 ו- B27. תוספת N2 בעיקר פונקציות כדי לעזור NPCs להתחייב שושלת העצבית בעוד פונקציות תוספת B27 כדי לשמור על אריכות ימים של הנוירונים.

הדגימות ניתן לאסוף על פני תקופת הבידול (למשל, שלב ESC, יום EB 2, יום EB 4, יום NPC 6, NPC יום 8, נוירונים יום 10, נוירונים יום 12) כדי לעקוב אחר תהליך הבידול על ידי ביצוע RT-qPCR עבור pluripotency וסמני ectoderm. השוואת סמני הפלוריפוטנציה כגון Oct4, Nanog, Sox2, Klf4 ו- Myc בין שלבי התא השונים תא תאים את הפלוריפוטנציה של mESCs(איור 3B,F). כדי לחקור את היעילות של ההבחנה העצבית, סמנים לשכבת mesoderm כגון Hand1, Snai1, ו Tbxt; ושכבת אנדודרם כגון Eomes ו- Gata4 ניתן גם לבדוק (נתונים שאינם מוצגים). אימות נוסף יכול להתבצע עם בדיקת אימונופלואורסצנטיות (IF) עבור NPC או סמנים עצביים(איור 3A). עם זאת, שיטות אלה אינן כמותיות ומוטה כלפי הסמנים שנבחרו. כדי להתגבר על מגבלות אלה, אנו משלבים ציטומטריית זרימה וניתוחי RNA-seq(איור 3C\u2012F). קו התא המשמש בניסוי ציטומטריית הזרימה הוא קו תאים Sox1-GFP E14, אשר שימש במיוחד בניסוי זה כדי להעריך את איכות הליך הבידול NPC. Sox1 הוא אחד הסמן העצבי הספציפי המוקדם ביותר במהלך התפתחות נוירוקטודרם22 ומכאן מה שהופך אותו סמן מצוין עבור שושלת NPC. Sox1 ניתן לחקור לשימוש RT-qPCR או כתם מערבי כדי להעריך את אוכלוסיית NPC. ניתוחים אלה מועילים במיוחד לחקור את פגם הבידול שנגרם על ידי מניפולציה גנטית או טיפול כימי.

חשוב לציין כי ישנן מספר מגבלות לפרוטוקול שלנו המוצגות כאן. קודם כל, אנחנו מציגים רק את הניתוח המקיף עבור קו תא MESC אחד מסוג פראי. קווי ESC אחרים שמקורם בעכברים או בבני אדם עשויים לדרוש שינויים ואופטימיזציה נוספת בפרוטוקול כדי להבטיח בידול נוירונים מוצלח ויעיל. שנית, אנו מציגים שיטת בידול נוירון במבחנה, אשר באופן טבעי נושאת מערכת מגבלות משלה. כאמור, EBs מטופלים ברמה על-פיזיולוגית של RA כדי להסיע אותם לכיוון שושלת NPC. לאחר מכן, NPCs המתקבלים ממוקמים במדיה אופטימלית של נוירונים כדי לחקות את התנאים הפיזיולוגיים ולעודד מחויבות, צמיחה ואריכות ימים של שושלת נוירונים. כאן, תוספי N2 ו- B27 משמשים נוירונים תרבות אבל תוספי מזון אחרים זמינים גם כגון NS2123 למטרות דומות, אשר עשוי לשנות את ההצלחה והיעילות של בידול נוירון. תנאים אלה משוחזרים באופן סינתטי בבדקות תרבית התא, אשר לא יכול לייצג באופן מלא תנאים פיזיולוגיים. איכות ה- EBs, ה- NPC והנוירונים תלויה מאוד ב- mESCs ההתחלתיים. mESCs שעברו במשך פעמים רבות מדי ונשמרו בתרבות במשך יותר משבוע אחד בדרך כלל מתחילים לאבד פלוריפוטנציה וייתכן שלא יעברו בידול בהצלחה. לכן, שמירה על mESCs במצב אופטימלי היא המפתח להבטיח כי הם יכולים להבדיל ביעילות לתוך EBs, NPC, נוירונים. שיטות אחרות של תרבית נוירונים כגון מודלים תלת-ממדיים הוצעו גם לחקות טוב יותר את התנאים הפיזיולוגיים24,25,26 לפעמים על חשבון תפוקה והיתכנות27,28. אנו מאמינים שהפרוטוקולים שלנו שימושיים כדי לאפיין את מודלי התרבות התלת-ממדיים האלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ- NIH (1R35GM133496-01) ל- Z. Gao. ברצוננו להודות לד"ר ריאן הובס על הסיוע בחתך. אנו מודים למתקני הליבה של מכללת פן סטייט לרפואה, כולל מדעי הגנום וביואינפורמטיקה, הדמיית מיקרוסקופיה אור מתקדמת, ואת Cytometry הזרימה. אנו מודים גם לד"ר יוקה אימאמורה על הסיוע בניתוח RNA-seq.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X Corning 25-052-CV
0.1% Gelatin Sigma G1890-100G Prepared in de-ionized water
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28908 Diluted in 1X PBS
40-μm cell strainer Falcon 352340
Albumax Thermo Fisher Scientific 11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11001 Antibody was diluted at 1:500 for IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit II Stemgent 00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox Azura Genomics AZ-2105
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
BD FACSCanto BD 657338
bFGF Sigma 11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626
Chir99021 Cayman Chemicals 13122
Chloroform C298-500 Fisher Chemical
DAPI Invitrogen R37606
DMEM Corning 10-017-CM
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320033
EB buffer Qiagen 19086
Ethanol 111000200 Pharmco Diluted in de-ionized water
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY-401-2501
Isopropanol BDH1133-4LG BDH VWR Analytical Diluted in de-ionized water
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030024
LIF N/A N/A Collected from MEF supernatant
m18srRNA primers IDTDNA N/A 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acids Corning 25-025-Cl
mNanog primers IDTDNA N/A 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primers IDTDNA N/A 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primers IDTDNA N/A 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primers IDTDNA N/A 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primers IDTDNA N/A 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
Nestin primary antibody Millipore MAB5326 Antibody was diluted at 1:200 for IF
Neural basal Thermo Fisher Scientific 21103049
Neurofilament primary antibody DSHB 2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit BioO Scientific NOVA-5138-07
PD0325901 Cayman Chemicals 13034
Penicillin/streptomycin Corning 30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS) N/A N/A Prepared in de-ionized water
- Potassium chloride P217-500G VWR
- Potassium phosphate monobasic anhydrous 0781-500G VWR
- Sodium chloride BP358-10 Fisher Bioreagents
- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate SX0715-1 Milipore
Random hexamer primer Thermo Scientific SO142
Retinoic acid Sigma R2625 Prepared in DMSO
Sodium pyruvate Corning 25-000-Cl
Sucrose Sigma 84097 Diluted in 1X PBS
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen 18064022
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura 4583
TriPure Isolation Reagent Sigma-Aldrich 11667165001
TruSeq Rapid Illumina 20020616
β-mercaptoethanol Fisher BioReagents BP176-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
  3. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  4. Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
  5. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  6. McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
  7. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  8. Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
  9. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
  10. Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
  11. Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
  12. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
  13. Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  14. Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
  15. Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
  16. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
  17. Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  18. Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  19. Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
  20. Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
  21. Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
  22. Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
  23. Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
  24. Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
  25. Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
  26. Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 159 תאי גזע עובריים של עכבר גופים עובריים תא אב עצבי נוירונים בידול טיפה תלויה E14
בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hanafiah, A., Geng, Z., Wang, Q.,… More

Hanafiah, A., Geng, Z., Wang, Q., Gao, Z. Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (159), e61446, doi:10.3791/61446 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter