Summary
We beschrijven de procedure voor de in vitro differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in neuronale cellen met behulp van de hanging drop-methode. Verder voeren we een uitgebreide fenotypische analyse uit via RT-qPCR, immunofluorescentie, RNA-seq en flowcytometrie.
Abstract
We beschrijven de stapsgewijze procedure voor het kweken en differentiëren van embryonale stamcellen van muizen in neuronale afstammingslijnen, gevolgd door een reeks testen om de gedifferentieerde cellen te karakteriseren. De embryonale stamcellen van de E14-muis werden gebruikt om embryoïde lichamen te vormen via de hanging drop-methode en vervolgens geïnduceerd om te differentiëren in neurale voorlopercellen door retinoïnezuur en uiteindelijk gedifferentieerd in neuronen. Kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-qPCR) en immunofluorescentie-experimenten onthulden dat de neurale voorlopers en neuronen overeenkomstige markers vertonen (nestine voor neurale voorlopers en neurofilament voor neuronen) op respectievelijk dag 8 en 12 postdifferentiatie. Flowcytometrie-experimenten op een E14-lijn die een Sox1-promotorgestuurde GFP-verslaggever tot expressie bracht, toonden aan dat ongeveer 60% van de cellen op dag 8 GFP-positief is, wat wijst op de succesvolle differentiatie van neurale voorlopercellen in dit stadium. Ten slotte werd RNA-seq-analyse gebruikt om de wereldwijde transcriptomische veranderingen te profileren. Deze methoden zijn nuttig voor het analyseren van de betrokkenheid van specifieke genen en paden bij het reguleren van de celidentiteitstransitie tijdens neuronale differentiatie.
Introduction
Sinds hun eerste afleiding van de binnenste celmassa van de zich ontwikkelende muizenblastocysten1,2,zijn embryonale stamcellen van muizen (mESC) gebruikt als krachtige hulpmiddelen om zelfvernieuwing en differentiatie van stamcellen te bestuderen3. Bovendien leidt het bestuderen van mESC-differentiatie tot een enorm begrip van moleculaire mechanismen die de efficiëntie en veiligheid in op stamcellen gebaseerde therapie bij de behandeling van ziekten zoals neurodegeneratieve aandoeningen kunnen verbeteren4. In vergelijking met diermodellen biedt dit in vitro systeem veel voordelen, waaronder eenvoud in praktijk en beoordeling, lage kosten bij het onderhouden van cellijnen in tegenstelling tot dieren en relatief gemak bij genetische manipulaties. De efficiëntie en kwaliteit van gedifferentieerde celtypen worden echter vaak beïnvloed door verschillende lijnen van mESCs en de differentiatiemethoden5,6. Ook zijn de traditionele assays om de efficiëntie van differentiatie te evalueren afhankelijk van kwalitatief onderzoek van geselecteerde markergenen die geen robuustheid hebben en daarom geen wereldwijde veranderingen in genexpressie begrijpen.
Hier willen we een batterij testen gebruiken voor systematische beoordeling van de neuronale differentiatie. Met behulp van zowel traditionele in vitro analyses op geselecteerde markers als RNA-seq, zetten we een platform op voor het meten van de differentiatie-efficiëntie en de transcriptomische veranderingen tijdens dit proces. Op basis van een eerder vastgesteld protocol7genereerden we embryoïde lichamen (EB's) via de hanging drop-techniek, gevolgd door inductie met behulp van suprafysiologische hoeveelheid retinoïnezuur (RA) om neurale voorlopercellen (NPC's) te genereren, die vervolgens werden gedifferentieerd naar neuronen met neuraal inductiemedium. Om de efficiëntie van de differentiatie te onderzoeken, voerden we, naast traditionele RT-qPCR- en immunofluorescentie (IF) -assays, RNA-seq- en flowcytometrie uit. Deze analyses bieden uitgebreide meting van de progressie van de stadiumspecifieke differentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mESC cultuur
- Bestrijk een met weefselkweek behandelde plaat van 10 cm met 0,1% gelatine en laat de gelatine minstens 15-30 minuten uitharden voordat u deze opzuigt.
- Zaad γ doorstraalde embryonale fibroblasten van muizen (MEF's) één dag voordat de mESCs worden gekweekt in het voorverwarmde mESC-medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium (DMEM) met 15% foetaal runderserum (FBS), niet-essentiële aminozuren, β-mercaptoethanol, L-glutamine, penicilline / streptomycine, natriumpyruvaat, LIF, PD0325901 (PD) en Chir99021 (CH)).
- Laat de γ bestraalde MEF's bezinken en hechten aan het plaatoppervlak voordat u E14-cellen kweekt.
- Ontdooi E14 SER's in een waterbad van 37 °C en breng de cellen snel over in een conische buis van 15 cm met warm mESC-medium. Pellet de cellen op 200 x g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspend de cellen in 10 ml mESC-medium en plaats de cellen op de kweekplaat met de γ bestraalde MEF's die eerder zijn gezaaid. Incubeer de celkweek in een incubator van 37 °C onder 5% CO2.
- Voor kweekpassageing, aspirateer e het medium en was de plaat met steriele 1x PBS. Voeg voldoende 0,05% trypsine toe om het plaatoppervlak te bedekken en incubeer bij 37 °C gedurende 3 min.
- Neutraliseer de trypsine met mESC-medium en pipet om eencellige suspensie te genereren. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 200 x g en verwijder het supernatant.
- Tel de cellen met een hemocytometer of celteller en zaai ongeveer 5,0 x 105 cellen in een kweekplaat van 10 cm.
- Resuspend de cellen in 10 ml mESC-medium, plaats de cellen op de met gelatine bedekte weefselkweekplaat en incubeer culturen zoals eerder beschreven.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat mESCs om de 2 dagen worden gepasseerd om te voorkomen dat de cellen differentiëren in hun kolonies. Fenolrood in het medium functioneert uitsluitend als een pH-indicator en afhankelijk van de cellulaire dichtheid kan het eerder dan 2 dagen geelachtig (zuurder) worden. Daarom kan het nodig zijn om het medium elke dag te veranderen. De γ bestraalde MEF's zullen uiteindelijk na een paar passages afsterven.
2. EB, NPC en neuron differentiatie
- Voer het eerder genoemde protocol voor cultuurpassageing uit en tel de cellen (stappen 1.7-1.10).
- Hangende druppelmethode (dag 0)
- Tel voor een celkweekplaat van 10 cm ongeveer 2,5 x 104 cellen waarbij 5,0 x 102 cellen worden gesuspendeerd in een differentiatiemedium van 20 μL (DMEM met 15% FBS, niet-essentiële aminozuren, β-mercaptoethanol, L-glutamine, penicilline / streptomycine en natriumpyruvaat). Ongeveer vijftig druppels van 20 μL die de cellen bevatten, kunnen op één plaat van 10 cm worden verguld.
- Aliquot het juiste aantal cellen en centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 3 minuten bij 200 x g en verwijder het supernatant.
- Resuspend de cellen in het juiste volume differentiatiemedium voor een celdichtheid van 5,0 x10 2 cellen per 20 μL (bijv. 2,5 x 104 cellen in 1 ml differentiatiemedium).
- Plaats met behulp van een micropipette of een repeaterpipet 20 μL druppels van de celsuspensie op het deksel van de weefselkweekplaat. Zorg ervoor dat de druppeltjes niet te dicht bij elkaar staan om te voorkomen dat ze samensmelten.
OPMERKING: De druppels kunnen worden verguld op een met weefselkweek behandelde bevestigingsplaat of ophangplaat, omdat ze op het deksel worden geplaatst en niet op de plaat zelf. Voor een meer haalbare en steriele aanpak plaatst u de druppels op een aanhechtingsweefselkweekplaat en brengt u ze over op een suspensieplaat zoals hieronder beschreven. - Vul de plaat met 5-10 ml 1x PBS en leg het deksel voorzichtig terug op de plaat. Incubeer de kweek in de incubator van 37 °C.
OPMERKING: PBS wordt toegevoegd aan de kweekplaat om te voorkomen dat de druppels opdrogen.
- Gebruik op dag 2een micropipette om de druppels van het deksel te verzamelen en plaats ze in een celcultuursuspensieplaat van 10 cm gevuld met 10 ml differentiatiemedium. Incubeer de cultuur op een orbitale shaker die met lage snelheid in de incubator trilt.
- Op dag 4, om de EB's te oogsten, verzamelt u de cellen, centrifugeert u gedurende 3 minuten bij 200 x g en verwijdert u het supernatant.
OPMERKING: De EB's kunnen ook worden gewassen met 1x PBS volgens de vereisten van volgende experimenten. - Om de procedure voort te zetten en de EB-differentiatie in neurale voorlopercellen (NPC's) te induceren, bereidt u het differentiatiemedium voor met 5 μM retinoïnezuur (RA).
- Verwijder het oude medium door de EB's gedurende 3 minuten te pelleteren op 100 x g of laat de EB's bezinken voordat u het oude medium opzuigt. Voeg 10 ml van het differentiatiemedium met 5 μM RA toe aan de kweekplaat.
- Vervang op dag 6ten minste de helft van het medium door een vers medium met 5 μM RA door de plaat te kantelen en het medium eruit te pipetteren zoals hierboven beschreven.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ten minste de helft van het medium te vervangen door een vers RA-bevattend medium op dag 5 en 7. Let op de fenolrode indicator; als het geelachtig wordt, is het het beste om al het medium te vervangen. - Oogst op dag 8de NPC's door de cellen te verzamelen, gedurende 3 minuten op 200 x g te centrifugeren en het supernatant te verwijderen.
OPMERKING: De NPC's kunnen ook worden gewassen met 1x PBS volgens de behoeften van volgende experimenten. Indien nodig kunnen NPC's worden ingevroren en opnieuw worden ontdooid voor latere kweek en analyse. Als de NPC's moeten worden gekweekt, kan accutase ook worden gebruikt als alternatief voor trypsine. - Om de procedure voort te zetten en NPC's in neuronen te differentiëren, verzamelt u NPC's in een conische buis van 15 ml door centrifugatie, dissocieert u ze met trypsine en incubeert u ze bij 37 °C gedurende 3 minuten. Pipetteer de NPC's om ervoor te zorgen dat alle NPC-aggregaten worden gedissocieerd en neutraliseer het trypsine met het medium.
- Filter de cellen met 40 μm nylon celzeef en tel de cellen voordat u ze platlegt met een dichtheid van 1,5 x 105/ cm2 in N2-medium (DMEM / F12-medium + 3 mg / ml glucose + 3 mg / ml lipiderijk runderserumalbumine (LBSA) + 1:100 N2-supplement + 10 ng / ml bFGF + 50 U / ml pen / streptokokken + 1 mM L-glutamine) op een met weefselkweek behandelde plaat voor daaropvolgende PCR- en western blot-experimenten; of op een weefselkweekkamer voor immunofluorescentie-experimenten.
- Vervang op dag 9het oude medium door een vers N2 medium.
- Schakel op dag 10het N2-medium met N2/B27 medium (50% DMEM/F12 en 50% neurale basaal, 3 mg/ml LBA, 1:200 N2 supplement, 1:100 B27 supplement, 50 U/ml pen/streptokokken en 1 mM L-glutamine).
- Oogst op dag 11-12de neuronen als volgt. Was de cellen met 1x PBS, voeg trypsine toe en incubeer de cultuur in de incubator van 37 °C gedurende 3 minuten voordat u de trypsine neutraliseert met medium en centrifugeer op 200 x g gedurende 3 minuten.
3. Karakterisering van mESCs en gedifferentieerde cellen
- Alkalische fosfatase (AP) assay
- Gebruik een kit om de alkalische fosfatase-activiteit te beoordelen (zie de tabel met materialen).
- Verwijder het medium van de kweekplaat en was de SER's met 1x PBS.
- Voeg 1 ml van de vaste oplossing (bestaat uit formaldehyde en methanol) die bij de kit is geleverd toe aan de plaat en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende 2-5 minuten.
OPMERKING: Overincubatie in de oplossing kan de AP-activiteit in gevaar brengen. - Verwijder de vaste oplossing, was de SER's met 1x PBS en laat een bepaalde hoeveelheid PBS in de plaat zitten.
OPMERKING: Houd de SER's vochtig in PBS om de AP-activiteit niet in gevaar te brengen. - Bereid de AP-oplossing door de A-, B- en C-substraatoplossingen te mengen in een verhouding van 1:1:1. Meng eerst A- en B-oplossingen en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten voordat u de C-oplossing toevoegt.
- Verwijder de 1x PBS en voeg de eerder voorbereide AP-oplossing toe.
- Incubeer de SER's gedurende ongeveer 15 minuten in het donker door de kweekplaat in te pakken met aluminiumfolie of stap 3.5 uit te voeren in een donkere kamer.
- Controleer de reactie en verwijder de reactieoplossing wanneer de oplossing helder wordt om niet-specifieke vlekken te voorkomen.
- Was de SER's twee keer met 1x PBS.
- Voorkom dat het monster uitdroogt door de SER's af te dekken met 1x PBS of montagemedium.
OPMERKING: Er verschijnt een rode of paarse vlek voor ap-expressie. De plaat kan worden bewaard in een koelkast van 4 °C.
- RT-qPCR
- Verzamel cellen in verschillende stadia door de stappen 1.6-1.7 en 2.4 te volgen voor respectievelijk SER's en EG's en NPC's.
- Isoleer RNA met behulp van RNA, DNA en eiwitextractieoplossing (zie Tabel met materialen).
- Genereer cDNA met een reverse transcriptasekit (zie de tabel met materialen)en volg de handleiding van de fabrikant.
- Fixatie en inbedding
- Oogst EB's en NPC's zoals hierboven beschreven (stap 2.6) en fixeer ze met 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in 1x PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de PFA en was het monster met 1x PBS gedurende 5 min.
- Plaats het monster in een seriële verdunning van 1x PBS-, 10%-, 20%- en 30%-sucroseoplossingen bij 25\u201228 °C, waarbij het monster na 30 minuten incubatie wordt overgebracht naar de volgende oplossing.
OPMERKING: Het monster kan worden opgeslagen in de 30% sucrose-oplossing bij 4 °C voordat wordt verdergegaan met de inbeddingsstap. - Maak de pipetpunt nat met sucrose-oplossing voordat u het monster (zonder ze te stapelen) in het midden van de cryovorm plaatst en pipetteer de overtollige vloeistof eruit.
OPMERKING: Filtreerpapier kan ook worden gebruikt om de overtollige oplossing te verwijderen. Het bevochtigen van de pipetpunt met sucrose-oplossing is belangrijk om te voorkomen dat de EB's en NPC's aan de wanden van de punt blijven plakken. - Voeg voorzichtig een optimale snijtemperatuuroplossing (OCT) toe aan de mal zonder de monsters opnieuw uit te geven en verwijder overtollige bubbels met een pipet.
- Plaats de vorm met het monster op een laboratoriummenger met lage snelheid om het monster gedurende 15 minuten licht te roeren. Dit helpt om de EB's en NPC's naar de bodem te vereffenen als ze worden geresuspendeerd in de OCT-oplossing.
- Vries het monster snel in door de mal in vloeibare stikstof of op droogijs te plaatsen.
OPMERKING: Monsters kunnen worden bewaard in een vriezer van -70 °C voordat u doorgaat naar de volgende stap.
- Cryosectie
- Laat de cryostaat afkoelen tot -20 tot -18 °C voordat u het monster naar het instrument overbrengt.
- Maak het bevroren OCT-blok los van de mal en bevestig het op de houder met een beetje OCT-oplossing op het oppervlak van de houder.
- Lijn het OCT-blok zo uit dat de EB's en NPC's zich het dichtst bij het blad bevinden om ervoor te zorgen dat het monster niet verloren gaat tijdens het sectiewerk.
- Snijd voorzichtig 10 μm van het blok en let goed op de plakjes die het monster bevatten.
- Plaats de OCT-plak met het monster snel op de weefselinsluitende glasplaat en laat de OCT-plakjes 1 uur aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De monsters kunnen bij -70 °C worden bewaard voor later gebruik.
- Immunofluorescentie (IF)
- Blok OCT secties of kweekkamers met neuronen in 10% normaal ezelsserum/0,1% Triton X-100 in 1x PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer de monsters in primaire antilichamen verdund in 5% normaal ezelserum/0,05% Triton X-100 in 1x PBS gedurende de nacht bij 4 °C.
- Was monsters in 1x PBS/0,1% Triton X-100 driemaal gedurende 5 minuten per wasbeurt.
- Incubeer de monsters met secundair antilichaam verdund in 5% normaal ezelserum/0,05% Triton X-100 in 1x PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was monsters in 1x PBS/0,1% Triton X-100 driemaal gedurende 5 minuten per wasbeurt en incubeer de monsters vervolgens in 1 μg/ml DAPI.
- Monteer de monsters met een afdekplaat en wat bevestigingsmedium en laat het drogen.
- Bekijk de monsters onder een fluorescentiemicroscoop.
- RNA-seq analyse
- Verzamel de cellen in verschillende stadia en voer RNA-extractie uit (zie stap 3.2).
- Bereid de cDNA-bibliotheken voor, voer diepe sequencing en data-analyse uit volgens het protocol beschreven in Wang et al.8.
- Voer de Gene Ontology (GO) analyse uit met behulp van het R-pakket, clusterProfiler.
- Flowcytometrie
- Verzamel SER's door de stappen 1.6-1.7 te volgen en resuspend de cellen in medium. Verzamel de EB's en NPC's door stap 2.4 te volgen en resuspend de cellen in medium.
- Filter de celsuspensie met behulp van de 40 μm nylon celzeef in een nieuwe conische buis van 15 ml.
- Meet het GFP-signaal van de monsters met behulp van de flowcytometer (uitgevoerd door de kernfaciliteit van de instelling).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als weergave van onze methode voerden we een EB-, NPC- en neurondifferentiatie-experiment uit op E14-cellen. E14-cellen werden gekweekt op γ bestraalde MEF's (figuur 1A) totdat de γ bestraalde MEF-populatie verdunde. We bevestigden de pluripotentie van de E14-cellen door alkalische fosfatase (AP) kleuring(Figuur 1B)en later RT-qPCR (zie hieronder) uit te voeren voor Nanog en Oct4 markers. De γ bestraalde MEF-vrije E14-cellen werden vervolgens geïnduceerd voor differentiatie met behulp van het protocol in figuur 2A. In het kort werden differentiatiemediadruppeltjes van 20 μL met 500 cellen op het deksel van de kweekplaat gezaaid (zie protocolsectie 2 voor details). De gevormde EG's werden vervolgens verzameld en in suspensie geplaatst in verse differentiatiemedia. Vanaf dag 4 tot dag 8 van differentiatie werd 5 μM RA toegevoegd aan de kweekplaten om NPC's te induceren. Gedifferentieerde EG's vertoonden een ronde vorm en hun grootte bleef toenemen tijdens differentiatie (figuur 2B). Op dag 8 werden de NPC's geoogst en trypsineiseerd, en vervolgens werd de resulterende eencellige suspensie verguld in een weefselkweekkamer in DMEM / F12-medium met N2-supplement en later in B27-supplement. Op dag 10 lijken NPC's die zich onderscheiden in neuronen een langwerpige celvorm te hebben(figuur 2B).
Om ons differentiatie-experiment verder te evalueren, voerden we immunofluorescentie (IF) -experimenten uit op E14 NPC's op dag 8 en E14-neuronen op dag 12. We zagen positieve kleuring voor nestine in NPC's en neurofilament (NF) signaal voor neuronen(Figuur 3A). Als alternatief bevestigden RT-qPCR en RNA-seq de inductie van NPC-markergenen en het verlies van pluripotentiegenen in NPC's (Figuur 3B, D, F). Als een kwantitatieve methode om het succes van ESC-differentiatie te testen, onderscheidden we een ESC-lijn van muizen die een Sox1-promotorgestuurde GFP-reporter9uitdrukte, gevolgd door flowcytometrie-analyse op SER's en NPC's. We ontdekten dat 58,7% van de totale cellen in de NPC-fase GFP-positief is, terwijl het GFP-signaal 0,0% is in de ESC-fase(Figuur 3C). Om de transcriptomische veranderingen tijdens differentiatie te profileren, werden RNA-seq-experimenten voor E14 SER's, EB dag 3 en NPC dag 8 uitgevoerd en onthulden genclusters geassocieerd met de respectieve stadia(Figuur 3D). De genen in de RNA-seq heat-map werden gesorteerd op basis van hun expressieniveaus om differentieel tot expressie gebrachte genen in de verschillende stadia tijdens differentiatie te identificeren. Gen Ontology (GO) analyse voor de vier genclusters toonde aan dat deze clusters overeenkomen met verschillende cellulaire functies of routes, wat aangeeft dat de drie celstadia van mESC neuronale differentiatie elk een groep genen hebben die sterk tot expressie komen in hun respectieve stadium, maar niet in andere (Figuur 3E). Genen in Cluster 3 komen bijvoorbeeld sterk tot expressie in E14 NPC's in vergelijking met andere stadia en komen overeen met routes die verband houden met neuronale ontwikkeling. Clusters 1, 2 en 4 bevatten geen sterk tot expressie gebrachte genen die verband houden met specificaties van kiemlaagafstamming, maar ze zijn gerelateerd aan cellulaire groei en proliferatie. Zo toonden de RNA-seq en bijbehorende GO-analyse aan dat de E14-cellen op dag 8 van differentiatie in de neuronale afstammingslijn zijn gedifferentieerd.
Figuur 1: E14 SER's in cultuur. A)De lichtmicroscoopbeelden tonen E14-cellen (zwarte pijl) die groeien in kolonies bovenop de γ bestraalde MEF's. E14-kolonies blijven zich vermenigvuldigen, zoals te zien is in het verschil in koloniegrootte tussen dag 1- en dag 3-culturen. (B) Bevestiging van de pluripotentie van E14 SER's door de alkalische fosfatase (AP) vlek. Paarse pijlen geven de mESCs aan die positief waren voor AP-vlek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: E14 differentiatie in EB's, NPC's en neuronen. (A) Het schema vat de belangrijkste stappen samen voor het differentiëren van E14-cellen in EB's, NPC's en neuronen. B)E14 SER's gekweekt in medium zonder LIF en 2i in een suspensieplaat vormen afzonderlijke bollen van EB's die zichtbaar zijn op dag 2, waar ze in de daaropvolgende dagen blijven groeien en in omvang toenemen. RA wordt toegevoegd op dag 4 van differentiatie om de differentiatie in NPC's te induceren. Na 4 dagen inductie worden deze NPC's verguld voor differentiatie in neuronen, die in het onderste paneel worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van gedifferentieerde cellen. (A)Immunofluorescentiebeelden in het bovenpaneel tonen NPC-bevattende EB's op dag 8 gesondeerd op nestine (groen) en kernen (DAPI, blauw). Het onderste paneel toont immunofluorescentiebeelden voor neuronen op dag 12 gesondeerd op neurofilament (groen). Het rode vak in de samengevoegde afbeeldingen is 3x ingezoomd voor een betere weergave. (B)RT-qPCR-analyse met de pluripotentiemarkers (Nanog en Oct4) en NPC-markers (Pax6, NeuroD1en Nes) van E14 SER's en NPC's. Foutbalken zijn gemiddeld ± SD. (C) E14-cellen die een Sox1-promotorgestuurde GFP-reporter tot expressie brengen, werden gedifferentieerd in NPC's. Zowel de SER's als de NPC's op dag 8 werden gekwantificeerd voor positief GFP fluorescerend signaal met flowcytometrie. DDeheatmap toont de z-scores voor de bepaalde FPKM van de genen die tot expressie komen in de ESC-, EB- en NPC-stadia. Vier verschillende genclusters werden geïdentificeerd die groepen genen betekenen die differentieel tot expressie komen in het ESC-, EB- of NPC-stadium. (E) GO-analyse werd uitgevoerd met behulp van het R-pakket, clusterProfiler, op de vier clusters geïdentificeerd in de RNA-seq. (F) De grafiek toont de FPKM-waarden voor drie andere pluripotentiemarkers, Sox2, Klf4en Myc , evenals neurale markers, NeuN, Map2en Tubb3 voor E14-cellen op de ESC-, EB-dag 3- en NPC-dag 8-stadia. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode voor neurale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen is al tientallen jaren vastgesteld en onderzoekers zijn doorgegaan met het wijzigen van de vorige protocollen of het creëren van nieuwe protocollen voor verschillende doeleinden7,10,11. We gebruikten een reeks assays om de efficiëntie en voortgang van de differentiatiestadia van mESCs naar neuronen uitgebreid te analyseren, die kunnen worden gebruikt bij de analyse van andere afstammingsdifferentiatie van muis of menselijke SER's. Bovendien zijn onze benaderingen nuttige hulpmiddelen gebleken om de impact van specifieke genen of routes op neuronale differentiatie in vitro te evalueren8.
Met onze methoden verbinden pluripotente niet-toegewijde SER's behandeld met retinoïnezuur (RA) zich met een hoge efficiëntie aan de neurale afstamming en worden ze verder geïnduceerd om neuronen te genereren7. Om de succesvolle differentiatie van ES-cellen in neurale cellen te verbeteren en de heterogeniteit te verminderen, is het belangrijk om de ES-cellen in een ongedifferentieerde toestand te houden12. Niet-proliferatieve MEF's, behandeld met γ-bestraling of mitomycine C, functioneren om de pluripotentie van de SER's te behouden en bieden een steiger voor hun groei13,14. Om consistente resultaten te verkrijgen, starten we elk differentiatie-experiment met mESCs gekweekt op γ bestraalde MEF's. Na een paar passages sterven de γ bestraalde MEF's uit en wordt de cultuur uiteindelijk homogeen voor mESC-cellen. Als alternatief kunnen de mESCs ongeveer 45 minuten op gelatine worden voorgedrukt voordat γ doorstraalde MEF's worden gezaaid om ze bij de volgende passage beter te verwijderen. Leukemie remmende factor (LIF) wordt al lang gebruikt om de pluripotentietoestand van gekweekte muis ES-cellen te behouden door de JAK / STAT-route15,16,17te activeren. Meer recent bleken PD0325901 (PD, een MEK-remmer) en CHIR99021 (CH, een GSK-remmer) extra pluripotentieonderhoud van de ES-cellen te bieden3,18. In ons protocol kweken we mESCs met deze remmers samen met LIF om een hoge pluripotentie van mESCs te behouden.
Een andere kritische factor om succesvolle differentiatie te bereiken is de kwaliteit van EB's. We voeren de differentiatie van E14-cellen uit door de hangende druppelmethode, die door andere onderzoekers is toegepast5,19,20. Met deze methode mogen enkele ES-cellen gedurende 2 dagen in de differentiatiemediumdruppel zweven, waar ze spontaan aggregeren en EB's vormen. De resulterende EB's zijn doorgaans beter gedefinieerd in termen van hun morfologie (figuur 2B) in vergelijking met de methode voor het opschorten van geïsoleerde mESCs in medium, wat resulteert in EB-groottes in een veel breder bereik in onze ervaring (gegevens niet getoond). Om te voorkomen dat EB's zich aan de platen hechten, is het belangrijk om vanaf dag 3 een rotatie met lage snelheid uit te voeren en door het differentiatieproces te doorlopen. De EB's worden ertoe aangezet om te differentiëren in NPC's door ze te behandelen met RA. De resulterende NPC's van RA-behandeling op EB dag 4 zijn typisch heterogeen voor neurale cellen zoals oligodendrocyten en astrocyten21. Met behulp van RT-qPCR of immunofluorescentie kan de NPC-populatie worden onderzocht op neuron en andere neurale afstammingsmarkers zoals Gfap voor astrocyten en Olig2 voor oligodendrocyten. Om de differentiatie van NPC's in neuronen verder te induceren, worden de NPC's gekweekt in optimaal neuronmedium waarbij de belangrijkste componenten de N2- en B27-supplementen zijn. N2-supplement functioneert voornamelijk om de NPC's te helpen zich te committeren aan de neuronale afstamming, terwijl het B27-supplement functioneert om de levensduur van de neuronen te behouden.
De monsters kunnen worden verzameld gedurende de differentiatieperiode (bijv. ESC-fase, EB-dag 2, EB-dag 4, NPC-dag 6, NPC-dag 8, neuronen dag 10 en neuronen dag 12) om het differentiatieproces te volgen door RT-qPCR uit te voeren voor pluripotentie en ectodermmarkers. Het vergelijken van de pluripotentiemarkers zoals Oct4, Nanog, Sox2, Klf4en Myc tussen de verschillende celstadia zal de pluripotentie van de mESCs verifiëren (Figuur 3B, F). Om de efficiëntie van de neurale differentiatie te onderzoeken, markers voor de mesodermlaag zoals Hand1, Snai1en Tbxt; en endodermlaag zoals Eomes en Gata4 kunnen ook worden onderzocht (gegevens niet getoond). Verdere verificatie kan worden uitgevoerd met immunofluorescentie (IF) onderzoek naar NPC of neuronale markers(figuur 3A). Deze methoden zijn echter niet kwantitatief en bevooroordeeld ten opzichte van de geselecteerde markers. Om deze beperkingen te overwinnen, nemen we flowcytometrie en RNA-seq-analyses op(Figuur 3C\u2012F). De cellijn die in het flowcytometrie-experiment wordt gebruikt, is een Sox1-GFP E14-cellijn, die specifiek in dit experiment werd gebruikt om de kwaliteit van de NPC-differentiatieprocedure te beoordelen. Sox1 is een van de vroegste specifieke neuronale marker tijdens de ontwikkeling van neuro-ectoderm22, waardoor het een uitstekende marker is voor NPC-afstamming. Sox1 kan worden onderzocht voor het gebruik van RT-qPCR of Western blot om de NPC-populatie te evalueren. Deze analyses zijn bijzonder nuttig om het differentiatiedefect te onderzoeken dat wordt veroorzaakt door genmanipulatie of chemische behandeling.
Het is belangrijk op te merken dat er een paar beperkingen zijn aan ons protocol dat hier wordt gepresenteerd. Allereerst presenteren we alleen de uitgebreide analyse voor één wild-type mESC-cellijn. Andere ESC-lijnen afkomstig van muizen of mensen kunnen veranderingen en verdere optimalisatie in het protocol vereisen om succesvolle en efficiënte neurondifferentiatie te garanderen. Ten tweede presenteren we een in vitro neurondifferentiatiemethode, die van nature zijn eigen beperkingen heeft. Zoals eerder vermeld, worden EB's behandeld met een suprafysiologisch niveau van RA om ze naar de NPC-afstamming te drijven. De resulterende NPC's worden vervolgens in neuron-optimale media geplaatst om de fysiologische omstandigheden na te bootsen en de toewijding, groei en levensduur van de neuronlijn aan te moedigen. Hier worden N2- en B27-supplementen gebruikt om neuronen te kweken, maar andere supplementen zijn ook beschikbaar, zoals NS2123 voor vergelijkbare doeleinden, wat het succes en de efficiëntie van neurondifferentiatie kan veranderen. Deze aandoeningen worden synthetisch gereconstitueerd in de celkweektests, die mogelijk niet volledig fysiologische omstandigheden vertegenwoordigen. De kwaliteit van de EB's, NPC's en neuronen is sterk afhankelijk van de startende mESCs. mESCs die te vaak zijn gepasseerd en langer dan 1 week in cultuur zijn gehouden, beginnen meestal pluripotentie te verliezen en ondergaan mogelijk geen differentiatie met succes. Het in een optimale conditie houden van de mESCs is dus de sleutel om ervoor te zorgen dat ze effectief kunnen differentiëren in EB's, NPC's en neuronen. Andere neuroncultuurmethoden zoals 3D-modellen zijn ook voorgesteld om fysiologische omstandigheden24,25, 26beter na tebootsen, soms ten koste van doorvoer en haalbaarheid27,28. Wij geloven dat onze protocollen nuttig zijn om deze 3D-cultuurmodellen te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen zijn.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH (1R35GM133496-01) aan Z. Gao. We willen Dr. Ryan Hobbs bedanken voor de hulp bij het sectieren. We bedanken de kernfaciliteiten van Penn State College of Medicine, waaronder de Genome Sciences en Bioinformatics, de Advanced Light Microscopy Imaging en de Flow Cytometry. We bedanken ook Dr. Yuka Imamura voor de hulp bij RNA-seq analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
References
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
