Summary
Vi beskriver prosedyren for in vitro differensiering av musen embryonale stamceller i nevronale celler ved hjelp av hengende dråpemetode. Videre utfører vi en omfattende fenotypisk analyse gjennom RT-qPCR, immunfluorescens, RNA-seq og strømningscytometri.
Abstract
Vi beskriver den trinnvise prosedyren for dyrking og differensiering av museembreniske stamceller i nevronale avstamninger, etterfulgt av en rekke analyser for å karakterisere de differensierte cellene. E14-musens embryonale stamceller ble brukt til å danne embryoide kropper gjennom den hengende dråpemetoden, og deretter indusert til å skille seg ut i nevrale stamceller ved retinoinsyre, og til slutt differensiert til nevroner. Kvantitative omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) og immunfluorescenseksperimenter viste at nevrale forfedre og nevroner viser tilsvarende markører (nestin for nevrale forfedre og nevrofilament for nevroner) på henholdsvis dag 8 og 12 postdifferensiering. Flow cytometrieksperimenter på en E14-linje som uttrykker en Sox1 promotordrevet GFP-reporter viste at omtrent 60% av cellene på dag 8 er GFP-positive, noe som indikerer vellykket differensiering av nevrale stamceller på dette stadiet. Til slutt ble RNA-seq-analyse brukt til å profilere de globale transkripsjonsendringene. Disse metodene er nyttige for å analysere involvering av spesifikke gener og veier for å regulere celleidentitetsovergangen under nevronal differensiering.
Introduction
Siden deres første avledning fra den indre cellemassen til de utviklende mus blastocystene1,2, har musens embryonale stamceller (mESC) blitt brukt som kraftige verktøy for å studere stamcelle selvfornyelse og differensiering3. Videre fører studier av mESC-differensiering til enorm forståelse av molekylære mekanismer som kan forbedre effektiviteten og sikkerheten i stamcellebasert terapi ved behandling av sykdommer som nevrodegenerative lidelser4. Sammenlignet med dyremodeller gir dette in vitro-systemet mange fordeler, inkludert enkelhet i praksis og vurdering, lave kostnader ved å opprettholde cellelinjer i motsetning til dyr, og relativt enkel i genetiske manipulasjoner. Effektiviteten og kvaliteten på differensierte celletyper påvirkes imidlertid ofte av forskjellige linjer med MESCer samt differensieringsmetodene5,6. De tradisjonelle analysene for å evaluere differensieringseffektivitet er også avhengige av kvalitativ undersøkelse av utvalgte markørgener som mangler robusthet, og de klarer derfor ikke å forstå globale endringer i genuttrykk.
Her tar vi sikte på å bruke et batteri av analyser for systematisk vurdering av nevronal differensiering. Ved hjelp av både tradisjonelle in vitro-analyser på utvalgte markører og RNA-seq etablerer vi en plattform for måling av differensieringseffektivitet samt transkripsjonsendringer under denne prosessen. Basert på en tidligere etablert protokoll7genererte vi embryoide legemer (EBs) gjennom hengende dråpeteknikk, etterfulgt av induksjon ved hjelp av stikkfysiologiske mengder retinoinsyre (RA) for å generere nevrale stamceller (NPCer), som senere ble differensiert til nevroner med nevral induksjonsmedium. For å undersøke effektiviteten av differensiering, i tillegg til tradisjonelle RT-qPCR og immunfluorescence (IF) analyser, utførte vi RNA-seq og strømningscytometri. Disse analysene gir omfattende måling av progresjonen av den scenespesifikke differensieringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mESC kultur
- Belegge en 10 cm vevskulturbehandlet plate med 0,1% gelatin og la gelatinet sette i minst 15-30 min før du aspirerer det ut.
- Frø γ bestrålet mus embryonale fibroblaster (MEF-er) en dag før kultivering av mESC i det forvarmede mESC-mediet (Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med 15% fosterbovinserum (FBS), ikke-essensielle aminosyrer, β-mercaptoetanol, L-glutamin, penicillin/streptomycin, natriumpyuvatt, LIF, PD0325901 (PD) og Chir99021 (CH)).
- La de γ bestrålede MEF-ene slå seg ned og festes til plateoverflaten før du dyrker E14-celler.
- Tine E14 EESC i 37 °C vannbad og overfør cellene raskt i et konisk rør på 15 cm med varmt mESC-medium. Pellet cellene på 200 x g i 3 min og fjern supernatanten.
- Resuspend cellene i 10 ml mESC medium og plate cellene på kulturplaten som inneholder γ-bestrålet MEFs frø tidligere. Inkuber cellekulturen i en 37 °C inkubator under 5 % CO2.
- For kulturpassasje, aspirerer du mediet og vasker platen med steril 1x PBS. Tilsett nok 0,05% trypsin til å dekke plateoverflaten og inkubere ved 37 °C i 3 minutter.
- Nøytraliser trypsin med mESC medium og pipette for å generere encellet suspensjon. Sentrifuger cellene på 200 x g i 3 min og fjern supernatanten.
- Tell cellene med et hemocytometer eller celleteller og frø ca 5,0 x 105 celler i en 10 cm kulturplate.
- Resuspend cellene i 10 ml mESC medium, plate cellene på gelatin-belagt vev kultur plate og inkubere kulturer som beskrevet tidligere.
MERK: Det anbefales at mESCer passeres annenhver dag for å forhindre at cellene differensierer i koloniene sine. Fenolrød i mediet fungerer utelukkende som en pH-indikator, og avhengig av cellulær tetthet kan den bli gulaktig (surere), raskere enn 2 dager. Derfor kan det være nødvendig å endre mediet hver dag. De γ bestrålede MEF-ene vil til slutt dø av etter et par passasjer.
2. EB, NPC og neuron differensiering
- Utfør kulturpassasjeprotokollen som er nevnt tidligere, og tell cellene (trinn 1.7–1.10).
- Hengende slippmetode (dag 0)
- For en 10 cm cellekulturplate teller omtrent 2,5 x 104 celler der 5,0 x 102 celler vil bli suspendert i 20 μL differensieringsmedium (DMEM med 15% FBS, ikke-essensielle aminosyrer, β-mercaptoethanol, L-amin glut, penicillin / streptomycin og natriumpyminat). Omtrent femti 20 μL dråper som inneholder cellene kan belagt på en 10 cm plate.
- Aliquot riktig antall celler, og sentrifuger deretter cellene på 200 x g i 3 min og fjern supernatanten.
- Resuspend cellene i riktig volum av differensieringsmedium for en celletetthet på 5,0 x 102 celler per 20 μL (f.eks. 2,5 x 104 celler i 1 ml differensieringsmedium).
- Bruk en mikropipette eller en repeaterpipette, plasser 20 μL dråper av cellefjæringen på lokket på vevskulturplaten. Kontroller at dråpene ikke er for nær hverandre for å hindre at de flettes.
MERK: Dråpene kan belegges enten på en vevskulturbehandlet festeplate eller opphengsplate, da de vil bli plassert på lokket og ikke selve platen. For en mer gjennomførbar og steril tilnærming, skriv dråpene på en festevevskulturplate og overfør dem til en suspensjonsplate som beskrevet nedenfor. - Fyll opp platen med 5-10 ml 1x PBS og sett lokket forsiktig tilbake på platen. Inkuber kulturen i 37 °C inkubatoren.
MERK: PBS legges til kulturplaten for å hindre at dråpene tørker opp.
- På dag 2, bruk en mikropipette for å samle dråpene fra lokket og plassere dem i en 10 cm cellekulturopphengsplate fylt med 10 ml differensieringsmedium. Inkuber kulturen på en orbital shaker risting ved lav hastighet i inkubatoren.
- På dag 4, for å høste EBs, samle cellene, sentrifuge på 200 x g i 3 min, og fjern supernatanten.
MERK: EB-ene kan også vaskes med 1x PBS i henhold til kravene til påfølgende eksperimenter. - For å fortsette prosedyren og indusere EB-differensiering i nevrale stamceller (NPCer), forberede differensieringsmediet med 5 μM retinoinsyre (RA).
- Fjern det gamle mediet ved å pelletere EB-ene på 100 x g i 3 minutter eller la EB-ene slå seg ned før du aspirerer ut det gamle mediet. Tilsett 10 ml av differensieringsmediet som inneholder 5 μM RA til kulturplaten.
- På dag 6erstatter du minst halvparten av mediet med et friskt medium som inneholder 5 μM RA ved å vippe platen og pipettere ut mediet som beskrevet ovenfor.
MERK: Det anbefales at minst halvparten av mediet byttes ut med fersk RA-inneholdende medium på dag 5 og 7. Legg merke til fenolrødindikatoren; Hvis det blir gulaktig, er det best å erstatte hele mediet. - På dag 8, høst NPC ved å samle cellene, sentrifugere på 200 x g i 3 min, og fjerne supernatanten.
MERK: NPC-ene kan også vaskes med 1x PBS i henhold til behovene til påfølgende eksperimenter. Om nødvendig kan NPC-er fryses ned og tines igjen for senere kultur og analyse. Hvis NPC-ene skal dyrkes, kan accutase også brukes som et alternativ til trypsin. - For å fortsette prosedyren og for å differensiere NPCer i nevroner, samle NPCer i et 15 ml konisk rør ved sentrifugering, dissosiere dem med trypsin og inkubere dem ved 37 °C i 3 minutter. Pipette NPC-ene for å sikre at alle NPC-aggregater blir dissosiert og nøytraliserer trypsinet med mediet.
- Filtrer cellene med 40 μm nyloncellesil og tell cellene før du plating dem med en tetthet på 1,5 x 105/cm2 i N2 medium (DMEM / F12 medium + 3 mg / ml glukose + 3 mg / ml lipidrik bovint serumalbumin (LBSA) + 1:100 N2 supplement + 10 ng/ml bFGF + 50 U/ml penn/strep + 1 mM L-glutamin) på en vevskulturbehandlet plate for påfølgende PCR og vestlige blot eksperimenter; eller på et vevskulturkammer for immunfluorescenseksperimenter.
- På dag 9erstatter du det gamle mediet med et friskt N2-medium.
- På dag 10bytter du N2-mediet med N2/B27 medium (50 % DMEM/F12 og 50 % nevral basal, 3 mg/ml LBA, 1:200 N2-tillegg, 1:100 B27-tillegg, 50 U/ml penn/strep og 1 mM L-glutamin).
- På dag 11-12, høst nevronene som følger. Vask cellene med 1x PBS, tilsett trypsin, og inkuber kulturen i 37 °C inkubatoren i 3 minutter før du nøytraliserer trypsinet med middels og sentrifuger ved 200 x g i 3 minutter.
3. Karakterisering av mESC og differensierte celler
- Alkalisk fosfatase (AP)-analyse
- Bruk et sett til å vurdere alkalisk fosfataseaktivitet (se materialtabellen).
- Fjern mediet fra kulturplaten og vask ESCene med 1x PBS.
- Tilsett 1 ml av festeløsningen (består av formaldehyd og metanol) som følger med settet til platen og inkuberer det ved romtemperatur i 2-5 min.
MERK: Overinkubasjon i løsningsløsningen kan kompromittere AP-aktiviteten. - Fjern fikseringsløsningen, vask ESCene med 1x PBS og la litt PBS ligge i platen.
MERK: Hold ESC-ene fuktige i PBS for ikke å kompromittere AP-aktiviteten. - Forbered AP-løsningen ved å blande substratløsningene A, B og C med forholdet 1:1:1. Bland A- og B-løsningene først og inkuber blandingen ved romtemperatur i 2 minutter før du tilsetter C-løsningen.
- Fjern 1x PBS og legg til AP-løsningen som er utarbeidet tidligere.
- Inkuber ESC-ene i ca. 15 minutter i mørket ved å pakke inn kulturplaten med aluminiumsfolie eller utføre trinn 3.5 i et mørkt rom.
- Overvåk reaksjonen og fjern reaksjonsløsningen når løsningen blir lys for å unngå ikke-spesifikk farging.
- Vask ESCene to ganger med 1x PBS.
- Unngå at prøven tørker ved å dekke ESCene med 1x PBS eller monteringsmedium.
MERK: En rød eller lilla flekk vises for AP-uttrykk. Platen kan oppbevares i kjøleskap på 4 °C.
- RT-qPCR
- Samle celler på ulike stadier ved å følge henholdsvis trinn 1.6–1.7 og 2.4 for ESC og EBs og NPCer.
- Isoler RNA ved hjelp av RNA, DNA og proteinekstraksjonsløsning (se Materialtabell).
- Generer cDNA med et omvendt transkripsjonssett (se materialtabellen) og følg produsentens bruksanvisning.
- Fiksering og innebygging
- Høst EBs og NPCs som beskrevet ovenfor (trinn 2.6) og fest dem med 4% paraformaldehyd (PFA) løsning i 1x PBS i 30 minutter ved romtemperatur.
- Fjern PFA og vask prøven med 1x PBS i 5 min.
- Plasser prøven i en seriell fortynning av 1x PBS, 10%-, 20% og 30% sukrose løsninger ved 25\u201228 °C der prøven overføres til neste løsning etter 30 min inkubasjon.
MERK: Prøven kan oppbevares i 30 % sukroseoppløsning ved 4 °C før du fortsetter med innebyggingstrinnet. - Fukt pipettespissen med sukroseoppløsning før du plasserer prøven (uten å stable dem) i midten av kryoformen og pipetten ut overflødig væske.
MERK: Filterpapir kan også brukes til å fjerne overflødig oppløsning. Fukting av pipettespissen med sukroseløsning er viktig for å hindre at ES-ene og NPCene fester seg til spissens vegger. - Tilsett forsiktig optimal skjæretemperatur (OCT) løsning på formen uten å bruke prøvene på nytt og fjern overflødige bobler med en pipette.
- Plasser formen med prøven på en laboratorieblander ved lav hastighet for å lett agitere prøven i 15 minutter. Dette bidrar til å gjøre EB-ene og NPC-ene til bunns hvis de blir resuspendert i OCT-løsningen.
- Frys prøven raskt ved å plassere formen i flytende nitrogen eller på tørris.
MERK: Prøver kan oppbevares i en -70 °C fryser før du fortsetter til neste trinn.
- Kryoosectioning
- Sett kryostaten til å avkjøles ned til -20 til -18 °C før du overfører prøven til instrumentet.
- Løsne den frosne OCT-blokken fra formen og fest den på holderen med en liten OCT-løsning plassert på overflaten av holderen.
- Juster OCT-blokken slik at EB-ene og NPC-ene er nærmest bladet for å sikre at prøven ikke går tapt under seksjonering.
- Forsiktig § 10 μm av blokken og vær oppmerksom på skivene som inneholder prøven.
- Plasser OCT-skiven som inneholder prøven, raskt på vevsinnbyggingsglasset og la OCT-skivene lufttørke i 1 time ved romtemperatur.
MERK: Prøvene kan oppbevares ved -70 °C for senere bruk.
- Immunfluorescens (IF)
- Blokker OCT seksjoner eller kulturkamre som inneholder nevroner i 10% normalt eselserum / 0,1% Triton X-100 i 1x PBS i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber prøvene i primært antistoff fortynnet i 5 % normalt eselserum/0,05 % Triton X-100 i 1x PBS over natten ved 4 °C.
- Vask prøver i 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre ganger i 5 min hver vask.
- Inkuber prøvene med sekundært antistoff fortynnet i 5% normalt eselserum / 0,05% Triton X-100 i 1x PBS i 1 time ved romtemperatur.
- Vask prøver i 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre ganger i 5 min hver vask og inkuber deretter prøvene i 1 μg/ml DAPI.
- Monter prøvene med en dekslelip og noe monteringsmedium og la den tørke.
- Vær oppmerksom på prøvene under et fluorescensmikroskop.
- RNA-seq analyse
- Samle cellene på ulike stadier og utfør RNA-ekstraksjon (se trinn 3.2).
- Forbered cDNA-bibliotekene, utfør dyp sekvensering og dataanalyse i henhold til protokollen beskrevet i Wang et al.8.
- Utfør Gene Ontology (GO)-analysen ved hjelp av R-pakken, clusterProfiler.
- Flowcytometri
- Samle ESC ved å følge trinnene 1.6-1.7 og resuspend cellene i medium. Samle EBs og NPCs ved å følge trinn 2.4 og resuspend cellene i medium.
- Filtrer celleopphenget ved hjelp av 40 μm nyloncellesil i et nytt konisk rør på 15 ml.
- Mål GFP-signalet til prøvene ved hjelp av strømningscytometeret (utført av institusjonens kjerneanlegg).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en representasjon av vår metode utførte vi et EB-, NPC- og neurondifferensieringseksperiment på E14-celler. E14-celler ble dyrket på γ-bestrålede MEF-er (figur 1A) til den γ bestrålede MEF-populasjonen ble fortynnet. Vi bekreftet pluripotensen til E14-cellene ved å utføre alkalisk fosfatase (AP) farging (figur 1B) og senere RT-qPCR (se nedenfor) for Nanog- og Okt4-markører. De γ utstrålede MEF-frie E14-cellene ble deretter indusert for differensiering ved hjelp av protokollen som er skissert i figur 2A. Kort sagt ble differensieringsmediedråper på 20 μL som inneholder 500 celler sådd på lokket på kulturplaten (se protokoll avsnitt 2 for detaljer). EB-ene som ble dannet ble deretter samlet inn og plassert i suspensjon i friske differensieringsmedier. Fra dag 4 til dag 8 av differensiering ble 5 μM RA lagt til kulturplatene for å indusere NPCer. Differensierte EBer viste rund form og deres størrelse fortsatte å øke under differensiering (Figur 2B). På dag 8 ble NPCene høstet og prøvet, og deretter ble den resulterende enkeltcellefjæringen belagt i et vevskulturkammer i DMEM / F12 medium med N2-tilskudd og senere i B27 supplement. Ved dag 10 ser det ut til at NPCer som skiller seg ut i nevroner, har langstrakt celleform (Figur 2B).
For å evaluere differensieringseksperimentet vårt ytterligere utførte vi immunfluorescens (IF) eksperimenter på E14 NPC på dag 8 og E14 nevroner på dag 12. Vi observerte positiv farging for nestin i NPCer og nevrofilament (NF) signal for nevroner (figur 3A). Alternativt bekreftet RT-qPCR og RNA-seq induksjonen av NPC-markørgener og tap av pluripotensgener i NPCer (Figur 3B, D, F). Som en kvantitativ metode for å teste suksessen til ESC-differensiering, differensierte vi en mus ESC-linje som uttrykte en Sox1 promotordrevet GFP-reporter9, etterfulgt av flytcytometrianalyse på ESCer og NPCer. Vi fant at 58,7 % av de totale cellene på NPC-stadiet er GFP-positive, mens GFP-signalet er 0,0 % på ESC-stadiet (figur 3C). For å profilere de transkripsjonsendringene under differensiering ble RNA-seq-eksperimenter for E14 ESC, EB dag 3 og NPC dag 8 utført og avslørt genklynger knyttet til de respektive stadiene (Figur 3D). Genene i RNA-seq varmekartet ble sortert basert på deres uttrykksnivåer for å identifisere differensialt uttrykte gener i de ulike stadiene under differensiering. Gen ontologi (GO) analyse for de fire genklyngene viste at disse klyngene tilsvarer distinkte cellulære funksjoner eller veier som indikerer at de tre cellestadiene av mESC nevronal differensiering hver har en gruppe gener som er sterkt uttrykt i deres respektive stadium, men ikke andre (Figur 3E). For eksempel er gener i Klynge 3 sterkt uttrykt i E14 NPC sammenlignet med andre stadier og tilsvarer veier knyttet til nevronutvikling. Klyngene 1, 2 og 4 inneholder ikke sterkt uttrykte gener relatert til spesifikasjoner for bakterielagslinje, men de er relatert til cellulær vekst og spredning. Dermed viste RNA-seq og tilhørende GO-analyse at E14-cellene har differensiert seg til nevronal avledning etter dag 8 av differensiering.
Figur 1: E14 ESC i kultur. (A) Lysmikroskopbildene viser E14-celler (svart pil) som vokser i kolonier på toppen av de γ bestrålede MEF-ene. E14-koloniene fortsetter å spre seg sett i kolonistørrelsesforskjellen mellom dag 1 og dag 3 kulturer. (B) Bekreftelse av pluripotensen til E14 ESC ved alkalisk fosfatase (AP) flekk. Lilla piler indikerer mESC-ene som var positive for AP-flekk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: E14-differensiering i ES, NPCer og nevroner. (A) Skjematisk oppsummerer de viktigste trinnene for å differensiere E14-celler i EBer, NPCer og nevroner. (B) E14 ESC dyrket i medium uten LIF og 2i i en opphengsplate danner individuelle sfærer av EBs synlig på dag 2 hvor de fortsetter å vokse og utvide i størrelse i de påfølgende dagene. RA legges til på dag 4 av differensiering for å indusere differensiering i NPCer. Etter 4 dager med induksjon er disse NPCene belagt for differensiering i nevroner, som vises i bunnpanelet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av differensierte celler. (A) Immunfluorescence bilder i topppanelet viser NPC-inneholdende EB på dag 8 probed for nestin (grønn) og kjerner (DAPI, blå). Det nederste panelet viser immunfluorescensbilder for nevroner på dag 12 undersøkt for nevrofilament (grønn). Den røde boksen i de sammenslåtte bildene zoomes inn 3x for bedre visning. (B) RT-qPCR-analyse som viser pluripotensmarkørene (Nanog og Okt4) og NPC-markører (Pax6, NeuroD1og Nes) for E14 ESC og NPCer. Feilfelt er gjennomsnittlig ± SD. (C) E14-celler som uttrykker en Sox1 promotordrevet GFP-reporter ble differensiert i NPCer. Både ESC-ene og NPC-ene på dag 8 ble kvantifisert for positivt GFP-fluorescerende signal med strømningscytometri. (D) Varmekartet viser z-skårene for den bestemte FPKM av genene uttrykt i ESC-, EB- og NPC-stadiene. Fire forskjellige genklynger ble identifisert som betegner grupper av gener som er differensialt uttrykt i enten ESC, EB eller NPC-scenen. (E) GO-analysen ble utført ved hjelp av R-pakken, clusterProfiler, på de fire klyngene som er identifisert i RNA-seq. (F) Grafen viser FPKM-verdiene for tre andre pluripotency-markører, Sox2, Klf4og Myc, i tillegg til nevrale markører, NeuN, Map2og Tubb3 for E14-celler på ESC-, EB-dag 3- og NPC-dag 8-trinn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden for nevral differensiering av musens embryonale stamceller har blitt etablert i flere tiår, og forskere har fortsatt å endre de tidligere protokollene eller lage nye for ulike formål7,10,11. Vi benyttet en rekke analyser for å analysere effektiviteten og fremdriften av differensieringsstadiene av mESC til nevroner, som kan brukes til analyse av annen avstamningsdifferensiering av mus eller menneskelige ESCer. Videre har våre tilnærminger vist seg å være nyttige verktøy for å evaluere virkningen av spesifikke gener eller veier på nevronal differensiering in vitro8.
Med våre metoder forplikter pluripotente ikke-engasjerte ESCer behandlet med retinoinsyre (RA) seg til nevral avstamning med høy effektivitet og blir ytterligere indusert for å generere nevroner7. For å forbedre den vellykkede differensiering av ES-celler i nevrale celler og redusere heterogeniteten, er det viktig å holde ES-cellene i en uavklart tilstand12. Ikke-proliferative MEFer, behandlet med γ-bestråling eller mitomycin C, funksjon for å opprettholde pluripotensen til ESC-ene og gi et stillas for veksten13,14. For å oppnå konsistente resultater starter vi hvert differensieringseksperiment med mESCer dyrket på γ bestrålede MEF-er. Etter noen få passasjer dør de γ bestrålede MEF-ene ut og kulturen blir til slutt homogen for mESC-celler. Alternativt kan mESC-ene forhåndsbelagt på gelatin i ca. 45 minutter før γ bestrålede MEF-er blir sådd for bedre å fjerne dem ved neste passasje. Leukemi hemmende faktor (LIF) har lenge vært brukt til å opprettholde pluripotenstilstanden til dyrkede mus ES-celler ved å aktivere JAK / STAT-banen15,16,17. Mer nylig ble PD0325901 (PD, en MEK-hemmer) og CHIR99021 (CH, en GSK-hemmer) funnet å gi ytterligere pluripotensvedlikehold av ES-cellene3,18. I vår protokoll dyrker vi MESC-er med disse inhibitorene sammen med LIF for å opprettholde høy pluripotens av mESCs.
En annen kritisk faktor for å oppnå vellykket differensiering er kvaliteten på EBs. Vi utfører differensiering av E14-celler ved hengende dråpemetode, som har blitt brukt av andre etterforskere5,19,20. Med denne metoden har enkle ES-celler lov til å suspendere i differensieringsmediedråpen i 2 dager der de spontant aggregerer og danner EB-er. De resulterende EB-ene er vanligvis mer veldefinerte når det gjelder morfologi (figur 2B) sammenlignet med metoden for å suspendere isolerte mESCer i medium, noe som resulterer i EB-størrelser i et mye bredere spekter i vår erfaring (data ikke vist). For å forhindre at EB-er fester seg til platene, er det viktig å gjøre en rotasjon med lav hastighet fra dag 3 som fortsetter gjennom differensieringsprosessen. EB-ene blir indusert til å differensiere seg i NPCer ved å behandle dem med RA. De resulterende NPCene fra RA-behandling på EB dag 4 er vanligvis heterogene for nevrale celler som oligodendrocytter og astrocytter21. Ved hjelp av RT-qPCR eller immunfluorescence kan NPC-populasjonen undersøkes for nevron og andre nevrale avstamning markører som Gfap for astrocytter og Olig2 for oligodendrocytter. For ytterligere å indusere differensiering av NPCer i nevroner, dyrkes NPCene i optimalt nevronmedium der de viktigste komponentene er N2- og B27-tilskuddene. N2 supplement hovedsakelig funksjoner for å hjelpe NPC å forplikte seg til nevronal avledning mens B27 supplement funksjoner for å opprettholde levetiden til nevronene.
Prøvene kan samles inn på tvers av differensieringsperioden (f.eks. ESC-trinn, EB dag 2, EB dag 4, NPC dag 6, NPC dag 8, nevroner dag 10 og nevroner dag 12) for å spore differensieringsprosessen ved å utføre RT-qPCR for pluripotens- og ektodermmarkører. Sammenligning av pluripotensmarkører som Okt4, Nanog, Sox2, Klf4og Myc mellom de ulike cellestadiene vil bekrefte pluripotensen til mESCene (Figur 3B, F). For å undersøke effektiviteten til nevral differensiering, markører for mesodermlaget som Hand1, Snai1og Tbxt; og endodermlag som Eomes og Gata4 kan også undersøkes for (data ikke vist). Ytterligere verifikasjon kan utføres med immunfluorescens (IF) som undersøker NPC eller nevronmarkører (figur 3A). Disse metodene er imidlertid ikke kvantitative og partiske mot de valgte markørene. For å overvinne disse begrensningene inkorporerer vi strømningscytometri og RNA-seq analyser (Figur 3C\u2012F). Cellelinjen som brukes i flowcytometrieksperimentet er en Sox1-GFP E14 cellelinje, som ble brukt spesielt i dette eksperimentet for å vurdere kvaliteten på NPC-differensieringsprosedyren. Sox1 er en av de tidligste spesifikke nevronmarkørene under nevroectoderm utvikling22 og dermed gjør det til en utmerket markør for NPC-avstamning. Sox1 kan undersøkes for bruk av RT-qPCR eller vestlig flekk for å evaluere NPC-populasjonen. Disse analysene er spesielt gunstige for å undersøke differensieringsfeil forårsaket av genmanipulering eller kjemisk behandling.
Det er viktig å merke seg at det er noen begrensninger i vår protokoll presentert her. Først av alt presenterer vi bare den omfattende analysen for en wild-type mESC-cellelinje. Andre ESC-linjer som stammer fra mus eller mennesker, kan kreve endringer og ytterligere optimalisering i protokollen for å sikre vellykket og effektiv nevrondifferensiering. For det andre presenterer vi en in vitro neuron differensieringsmetode, som naturlig bærer sitt eget sett med begrensninger. Som nevnt tidligere blir EBs behandlet med et suprafysiologisk nivå av RA for å drive dem mot NPC-avstamning. De resulterende NPCene plasseres deretter i nevron-optimale medier for å etterligne de fysiologiske forholdene og oppmuntre til nevron avledningsforpliktelse, vekst og levetid. Her er N2 og B27 kosttilskudd vant til å dyrke nevroner, men andre kosttilskudd er også tilgjengelige som NS2123 for lignende formål, noe som kan endre suksessen og effektiviteten av nevrondifferensiering. Disse forholdene er syntetisk rekonstituert i cellekulturanalysene, som kanskje ikke fullt ut representerer fysiologiske forhold. Kvaliteten på EB-er, NPC-er og nevroner er svært avhengig av start-MESC-ene. mESCs som har blitt passeret for mange ganger og holdt i kultur i mer enn 1 uke, begynner vanligvis å miste pluripotens og kan ikke lykkes med å gjennomgå differensiering. Dermed er det viktig å opprettholde mESC-ene i en optimal tilstand for å sikre at de effektivt kan skille seg ut i EB-er, NPCer og nevroner. Andre nevronkulturmetoder som 3D-modeller har også blitt foreslått for bedre å etterligne fysiologiske forhold24,25,26 noen ganger på bekostning av gjennomstrømning og gjennomførbarhet27,28. Vi mener at protokollene våre er nyttige for å karakterisere disse 3D-kulturmodellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere erklærer at det ikke er konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (1R35GM133496-01) til Z. Gao. Vi vil takke Dr. Ryan Hobbs for hjelpen med seksjonering. Vi takker Penn State College of Medicines kjernefasiliteter, inkludert Genome Sciences and Bioinformatics, Advanced Light Microscopy Imaging og Flow Cytometry. Vi takker også Dr. Yuka Imamura for hjelpen i RNA-seq analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
References
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
