Bijdrage van de Na⁺/ K⁺ Pomp aan ritmische bursting, onderzocht met modellering en dynamische klemanalyses

Summary

Hier wordt een methode gepresenteerd voor onderzoek naar de rollen van de Na^{+ /}K⁺ pomp en persistente Na⁺ stroom in bloedzuiger hart interneuronen met behulp van dynamische klem.

Abstract

De Na⁺/K⁺ pomp, vaak beschouwd als een achtergrondfunctie in neuronale activiteit, draagt bij aan een uitgaande stroom (I_pomp) die reageert op de interne concentratie van Na⁺ ([Na⁺]_i). In barstende neuronen, zoals die gevonden in centrale patroongenerator (CPG) neuronale netwerken die ritmische bewegingen produceren, kan worden verwacht dat de [Na⁺]_i en dus de _I-pomp, gedurende de burst-cyclus variëren. Deze reactie op elektrische activiteit, gecombineerd met onafhankelijkheid van membraanpotentiaal, geeft de_I-pomp dynamische eigenschappen die niet gebruikelijk zijn voor kanaalgebaseerde stromen (bijv. spannings- of zender-gated of lekkanalen). Bovendien wordt in veel neuronen de activiteit van de pomp gemoduleerd door een verscheidenheid aan modulatoren, waardoor de potentiële rol van _I-pomp in ritmische barstactiviteit verder wordt uitgebreid. Dit artikel laat zien hoe een combinatie van modellering en dynamische klemmethoden kan worden gebruikt om te bepalen hoe ik_pomp en de interactie met persistente Na⁺ stroom de ritmische activiteit in een CPG beïnvloeden. Specifiek zal dit artikel zich richten op een dynamisch klemprotocol en computationele modelleringsmethoden in hart-interneuronen van medicinale bloedzuigers.

Introduction

Heartbeat in bloedzuigers wordt aangedreven door een CPG bestaande uit 9 bilaterale paren van hart interneuronen (HNs) verdeeld over evenveel mid-body segmentale ganglia. In de kern van de CPG bevinden zich wederzijds remmende paren van interneuronen in de^3e en^4e segmentale ganglia die half-center oscillatoren (HCO's) vormen (Figuur 1A). Deze neuronen blijven barsten wanneer synaptisch farmacologisch wordt geïsoleerd met behulp van bicuculline¹. Anderen, zoals het paar in de^7e segmentale ganglia (de focus van dit protocol), zijn ook bursters, in staat om barstactiviteit te produceren wanneer synaptisch geïsoleerd. Ze zijn niet onderling verbonden en ontvangen alleen dalende input en kunnen dus gemakkelijk worden geïsoleerd door het ganglion van de rest van de zenuwstreng af te snijden. Deze onafhankelijke barstactiviteit is gevoelig voor geïntroduceerde lekstroom veroorzaakt door penetratie met scherpe micro-elektroden voor opname, maar krachtig barsten wanneer opgenomen met losse patchmethoden¹.

Zowel individuele HN-neuronen als HN-HCO's zijn gemodelleerd (Hodgkin-Huxley-gebaseerde enkele isopotentiële compartimentmodellen van HN-neuronen die alle experimenteel geïdentificeerde spannings-gated en synaptische stromen bevatten), en alle burst-kenmerken van het levende systeem zijn met succes vastgelegd². Myomoduline, een endogene neuropeptide in bloedzuigers, vermindert duidelijk de periode (T) van het burst-ritme van geïsoleerde HN-neuronen en HN-HCO's. Deze modulator werkt om de h-stroom te verhogen (hyperpolarisatie-geactiveerde inwaartse stroom, I_h) en om I_pomp³te verlagen . Deze observatie leidde tot de verkenning van hoe ik_pomp interageert met I_h, en hoe hun co-modulatie bijdraagt aan de ritmische activiteit van HN-neuronen. Activering van de pomp door het verhogen van [Na⁺]_i (met behulp van de ionofoor monensin) versnelt het HN-barstritme in zowel HN-HCO's als geïsoleerde HN-neuronen⁴. Deze versnelling was afhankelijk van I_h. Toen I_h werd geblokkeerd (2 mM Cs⁺), werd de barstperiode niet gewijzigd door deze methode van pompactivering; de burstduur (BD) werd echter ingeperkt en het interburstinterval (IBI) nam toe in zowel HN-HCO's als geïsoleerde HN-neuronen⁴.

Voor dit protocol zijn alle stromen van een levend HN(7)-neuron, inclusief de pompstroom, _I-pomp, als volgt in het HN-model opgenomen:

(1)

waarbij C de membraancapaciteit is (in nF), V de membraanpotentiaal (in V), t tijd (in s). Gedetailleerde ionische stroombeschrijvingen en vergelijkingen zijn elders beschreven^2,4. Het volledige HN-modelneuron draait in real time(figuur 2). De software zal na publicatie beschikbaar worden gesteld op GitHub en zal geschikt zijn om te draaien op de digitale signaalverwerkingskaartdie wordt beschreven in de Tabel met Materialen . Hier is de focus van het onderzoek de Na⁺/ K⁺ pompstroom(I_pomp)en de spanningsgepoorte stromen die een significante Na⁺ flux bijdragen: een snelle Na⁺ stroom (I_Na) en een aanhoudende Na⁺ stroom (I_P). De maximale geleidingen van deze stromen zijn respectievelijk. De Na⁺/K⁺ pomp wisselt drie intracellulaire Na⁺ ionen uit voor twee extracellulaire K⁺ ionen, waardoor een netto uitgaande stroom ontstaat. Belangrijk is dat het 3 keer zoveel Na⁺ uit het neuron pompt als deze stroom aangeeft, wat belangrijk is voor het berekenen van de intracellulaire Na⁺ -concentratie.

De Na⁺/K⁺ pompstroom is afhankelijk van intracellulaire Na⁺ concentraties en wordt uitgedrukt door de volgende sigmoïdale functie:

(2)

waarbij [Na]_i de intracellulaire Na⁺ concentratie is, de maximale Na⁺/K⁺ pompstroom, [Na]_ih de intracellulaire Na⁺ concentratie is voor de halve activering van de Na⁺/ K⁺ pomp, en [Na] de gevoeligheid is van de Na⁺/ K⁺ pomp tot [Na]_i. [Na]_i bouwt als gevolg van de Na⁺ instroom gedragen door I_P en I_Na en wordt verminderd door de Na⁺ efflux van de Na^{+ /}K⁺ pomp. De bijdrage van I_h en I_Leak aan de totale Na⁺ flux is klein en wordt niet meegenomen in het real-time model.

(3)

waarbij v het volume (~6,7 pL) van het intracellulaire^Na+ reservoir is, F de constante van Faraday en de extracellulaire Na⁺ concentratie constant wordt gehouden.

Spannings- en lekgeleidingen zijn gedifferentieerd - deze reageren op membraanpotentiaal - van de pompstroom, die wordt geregeld door de berekende intracellulaire Na⁺ -concentratie ([Na⁺]_i). [Na⁺] _i wordt opgebouwd via Na⁺ entry via de snelle Na⁺ stroom (I_Na) die actiepotentiaalen (spikes) produceert en de aanhoudende Na⁺ stroom (I_P) die de depolarisatie biedt om spiking te ondersteunen. [Na⁺] _i wordt op zijn beurt verminderd door de werking van de pomp door de extrusie van Na⁺. Baseline levende HN-waarden van (5nS) en (150 nS) zijn aangenomen en we houden rekening met eventuele toegevoegde dynamische klem .

Het doel van het hier beschreven protocol is om _I-pomp nauwkeurig en omkeerbaar in realtime te manipuleren om te ontdekken hoe het interageert met voltage-gated stromen (persistente Na⁺ stroom in het huidige protocol) om ritmische bursting in enkele HNs te regelen. Om dit doel te bereiken, werd een dynamische klem gebruikt, die op commando kunstmatig een precieze hoeveelheid van elke stroom introduceert die kan worden berekend terwijl het model draait. Deze methode heeft voordelen ten opzichte van farmacologische manipulatie van de pomp, die het hele weefsel beïnvloedt, off-target effecten kan hebben die vaak moeilijk terug te draaien zijn en niet precies kunnen worden gemanipuleerd. Dynamische klem^5,6 leest de spanning van een opgenomen neuron in real time(Figuur 1B)en berekent en injecteert, in real time, de hoeveelheid stroom op basis van modelvergelijkingen en de ingestelde waarden van een of . Vergelijkbare methoden kunnen gemakkelijk worden toegepast op elk neuron dat intracellulair kan worden geregistreerd. Parameters moeten echter worden aangepast aan het gekozen neuron en het neuron moet worden geïsoleerd uit synaptische inputs, bijvoorbeeld farmacologisch.

Protocol

OPMERKING: Ongewervelde proefdieren worden niet gereguleerd door de NIH of Emory en Georgia State Universities. Alle maatregelen werden niettemin genomen om het lijden van de bloedzuigers die in dit werk werden gebruikt te minimaliseren.

1. Bereid geïsoleerd ganglion 7 voor uit het bloedzuigerzenuwstreng

1. Onderhoud bloedzuigers Hirudo verbana in kunstmatig vijverwater (met 0,05% w / v zeezout) verdund in gedeïoniseerd water bij 16 °C op een licht-donkercyclus van 12:12.
2. Bereid de bloedzuigers voor op dissectie door ze koud te verdoven in een bed van gemalen ijs gedurende >10 minuten tot ze onbeweeglijk zijn.
3. Vul een zwarte, met hars beklede ontleedschaal tot een diepte van ~1 cm met gekoelde zoutoplossing met 115 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,7 mM CaCl_2,10 mM D-glucose en 10 mM HEPES in gedeïoniseerd water; pH aangepast naar 7,4 met 1 M NaOH. Pin de bloedzuiger dorsale zijde omhoog in de met zwarte hars beklede kamer (minstens 20 cm x 10 cm met een diepte van minstens 2 cm boven de hars die minstens 2 cm dik is).
4. Maak onder een steromicroscoop bij 20x vergroting met schuine lichtgeleidingsverlichting een lengterichting van minstens 3 cm lang met een veerschaar van 5 mm door de carrosseriewand in het rostrale 1/3e deel van het lichaam. Gebruik pinnen om de lichaamswand opzij te trekken en de inwendige organen bloot te leggen.
   OPMERKING: Elk opgeslagen bloedmeel kan worden verwijderd door afzuiging met een vuurgepolijste Pasteur-pipet.
5. Isoleer een individueel ganglion van het middenlichaam 7 (zevende vrije segmentale ganglion caudaal naar de hersenen).
   1. Open de sinus waarin het zenuwkoord zich bevindt met de 5 mm veerschaar. Zorg ervoor dat u de sinus dorsaal en ventraal splitst en twee stroken sinus achterlaat. Gebruik een scherpe # 5 tang om het snijden te begeleiden en de sinus vast te houden.
   2. Houd de sinus bevestigd aan elk van de twee bilaterale zenuwwortels die uit het ganglion komen (het hecht zich stevig aan elke wortel) om deze stroken sinus te gebruiken voor het uitpinnen van het ganglion.
   3. Verwijder het ganglion uit het lichaam door de rostrale en caudale bindzenuwbundels te snijden die de ganglia (zo ver mogelijk van het^7e ganglion) en de sinusstroken verbinden en snijd vervolgens de wortels lateraal af naar waar ze uit de sinus komen.
6. Pin het ganglion (met behulp van oude stompe #5 tang) met verkorte minuten insectenspelden, ventrale kant naar boven, in heldere, met hars beklede petrischaaltjes. Steek pinnen in de stroken sinus en los weefsel dat zich hecht aan de wortels en de rostrale en caudale bindmiddelen, zo ver mogelijk van het ganglion.
   OPMERKING: De hars mag niet dikker zijn dan 3 mm om tijdens de opname een goede verlichting van onderaf te bereiken. Zorg ervoor dat het ganglion strak is, zowel in de lengterichting als zijdelings
7. Verhoog de vergroting van de stereomicroscoop tot 40x of meer en pas de schuine verlichting aan zodat de neuronale cellichamen gemakkelijk kunnen worden gezien op het ventrale oppervlak van het ganglion net onder het perineurium.
8. Verwijder het perineurium van het ganglion (desheath) met microscissors.
   1. Begin met het ontwarmen door de losse schede tussen de wortels aan de ene kant af te snijden en vervolg de snede zijdelings naar de andere kant, zorg ervoor dat de schaarbladen oppervlakkig blijven en de neuronale cellichamen direct onder de schede niet beschadigen.
   2. Maak een soortgelijke oppervlakkige snede caudaal van de laterale snede langs de middellijn.
   3. Pak nu de caudolaterale flap van de schede aan één kant met de fijne # 5-tang, trek hem weg van het ganglion en snijd hem af met de microscissors.
   4. Herhaal dit aan de andere kant; deze procedure stelt beide HN(7)-neuronen bloot voor opname met micro-elektroden.
9. Plaats de bereidingsschaal in de opname-opstelling en superfuseer met zoutoplossing met een stroomsnelheid van 5 ml / min bij kamertemperatuur.

2. Identificeer en registreer bloedzuigerhart interneuronen met scherpe micro-elektroden

1. Voor de duur van de opname van het HN(7)-neuron (opnames duren tussen 30 en 60 minuten), verwerf en digitaliseer de intracellulaire stroom- en spanningssporen van een neurofysiologische elektrometerbemonstering met een snelheid van 5 kHz met een digitaal gegevensverzamelingssysteem (analoog naar digitaal, A tot D) en stimulatiesysteem (digitaal naar analoog, D naar A), en weergeven op een computerscherm.
   OPMERKING: Alle commerciële of op maat gemaakte software en A tot D/D tot A-bord kunnen worden gebruikt voor gegevensverzameling (A tot D). D tot A en op maat gemaakte software zijn vereist voor dynamische klem.
2. Identificeer onder een steromicroscoop op 50-100x met donkere veldverlichting van onderaf voorzichtig een HN(7)-neuron van het bilaterale paar aan de zijde van zijn canonieke locatie op de achterste positie in het ganglion zeven van het middenlichaam.
3. Probeer nu het vermeende HN(7)-neuron te penetreren met een scherp micro-elektrode gevuld met 2 M kaliumacetaat en 20 mM KCl met behulp van een micromanipulator.
   1. Plaats de micro-elektrode zeer dicht bij het doelcellichaam.
   2. Observeer continu de geregistreerde potentiaal met de elektrometer en stel deze potentiaal in op nul mV voordat het neuron wordt binnendrongen.
   3. Penetreer het neuron met de micro-elektrode, door de elektrode langzaam langs zijn lange as met de manipulator te rijden. Met behulp van de elektrometer buzz-functie, ingesteld op 100 ms buzz-duur, totdat een negatieve verschuiving in membraanpotentiaal en krachtige spiking-activiteit wordt waargenomen.
4. Stel de elektrometer in de discontinue stroomklemmodus (DCC) in ≥ 3 kHz om tegelijkertijd de membraanpotentiaal en passstroom te registreren met de enkele micro-elektrode (capaciteitscompensatie ingesteld op net onder het rinkelen en vervolgens teruggedraaid 10%).
   1. Controleer de bezinking van de elektrode tijdens DCC op een oscilloscoop.
   2. Injecteer een constante stroom van -0,1 nA met de elektrometer steady current injector gedurende een minuut of twee om de opname te stabiliseren.
5. Identificeer het HN(7)-neuron definitief aan de kenmerken van de piekvorm en zwakke barstactiviteit(figuur 1Ci).
6. Voer gegevensanalyse offline uit nadat het experiment is voltooid en sla alle gegevens op een schijf op.

3. Bouw een real-time HN of een ander modelneuron

1. Bouw aangepaste software met behulp van een digitale signaalverwerkingskaart (DSB; D tot A en A tot D) in een desk-top computer om in real time de modelstromen beschreven in^2,4 of verschillende modelstromen voor andere neuronen of experimenten te implementeren.
   1. Gebruik Hodgkin-Huxley-stijlvergelijkingen omdat deze de over het algemeen geprefereerde methode zijn voor het weergeven van modelstromen.
   2. Zie⁷ voor een gedetailleerde beschrijving van de implementatie van het real-time HN-model en de dynamische klem voorafgaand aan de toevoeging van de pompstroom. Raadpleeg de inleiding voor de beschrijving van de stromen, intracellulaire Na⁺ concentratie en geleidingen van het levende HN(7) neuron in het HN-model.

4. Implementeer en varieer dynamische klemgeleidingen / stromen

1. Gebruik de op maat gemaakte dynamische klemsoftware voor de DSB om in realtime dynamische klem te implementeren en te wijzigen in een van de grafische gebruikersinterface(Figuur 3)(GUI) toegankelijke, geprogrammeerde geleidingen en stromen van het HN real-time model van het HN(7) neuron.
   OPMERKING: Ter herinnering, en zijn de maximale geleiding van de persistente Na⁺ stroom (I_P) en de maximale pompstroom (I_pomp), respectievelijk.
2. Gebruik GUI-invoervakken in de software om wijzigingen aan te brengen, terwijl het model wordt uitgevoerd, in de (PumpMaxL-box) en (GpinHNLive box) (Figuur 3).
   OPMERKING: De GUI-invoervakken accepteren getypte waarden en stappen van 0,1 nA worden aanbevolen voor en stappen van 1 nS worden aanbevolen voor .
   1. Voeg kleine hoeveelheden van en met dynamische klem toe om het barsten van het HN(7)-neuron te stabiliseren, dat verzwakt is door een door micro-elektrode geïnduceerd lek, zoals weergegeven in figuur 1Cii.
      OPMERKING: Scherpe micro-elektrodepenetratie veroorzaakt membraanschade die wordt uitgedrukt als verhoogde lekgeleiding of verminderde invoerweerstand.
   2. Begin met het toevoegen van een waarde van 0,1-0,2 nA, die het micro-elektrode-geïnduceerde lek goedmaakt, maar de prikkelbaarheid onderdrukt, en neem vervolgens geleidelijk toe , wat de prikkelbaarheid verhoogt, totdat regelmatig barsten volgt, meestal bij ~ 1-4 nS (Figuur 4A).
3. Varieer deze stromen systematisch samen (stappen van 0,1 nA voor en 1 nS voor ) met het geregistreerde HN(7) neuron met dynamische klem (figuur 3) en beoordeel hun effecten op de barstkarakteristieken: piekfrequentie (f: de reciproke van het gemiddelde van het interspike-interval tijdens een burst), interburstinterval (IBI: de tijd tussen de laatste piek in één burst tot de eerste piek in de volgende burst), burstduur (BD: de tijd tussen de eerste spike in een burst en de laatste spike in een burst) en burst-periode (T: de tijd tussen de eerste spike in een burst en de eerste spike in de volgende burst).
   1. Verander de waarden van en , zoals in de videodemonstratie, om vertrouwd te raken met de techniek en ga er vervolgens op uit.
      1. Houd vast aan een specifieke vaste waarde en veeg in stappen van 1 nS over een bereik van ondersteunende regelmatige bursting-activiteit.
      2. Verhoog nu de vaste waarde van 0,1 nA en veeg opnieuw over een bereik van ondersteunende regelmatige barstactiviteit.
      3. Verzamel voor elk geïmplementeerd parameterpaar gegevens met ten minste 8 bursts, zodat betrouwbare gemiddelde metingen van f, IBI, BD en T kunnen worden gemaakt.
      4. Ga door met vegen zolang het neuron levensvatbaar blijft, zoals beoordeeld door sterke spiking en een stabiel basislijnpotentieel van oscillatie.
      5. Verzamel gegevens van verschillende neuronen (van verschillende dieren) om een samengestelde grafiek te genereren(figuur 5).

Representative Results

Modellering met de toevoeging van I_pump⁴ bracht de experimentele bevindingen die in de introductiesectie werden gepresenteerd scherper in beeld en begon het pompondersteunde mechanisme van barsten uit te leggen. Het hier gedemonstreerde real-time model is afgestemd (en parameters gekozen) zodat het regelmatige ritmische activiteit produceert die binnen de grenzen van normale activiteit valt zoals waargenomen in experimenten - f, IBI, BD, T - en dergelijke activiteit blijft produceren wanneer de myomodulin-gemoduleerde parameters (de maximale pompstroom) en (maximale geleiding van h-stroom) gevarieerd of gelijktijdig gevarieerd zijn in het model. De vastgestelde parameterwaarden kunnen worden gebruikt als benchmark of canonieke set voor modelleringsexperimenten. In deze modelinstanties _pomp ik oscillaten gedurende de burst-cyclus als [Na⁺]_i rond een basislijnniveau. _I-pomp draagt bij aan burst-beëindiging tijdens de burst-fase en de hyperpolarisatie die het produceert activeert I_h tijdens de IBI; let op het maximale niveau van I_h in de buurt van burst initiatie (Figuur 2).

Hoewel het real-time HN-model alle geïmplementeerde stromen^2,4 beschikbaar heeft voor dynamische klemming, lag de focus hier op en , die beschikbaar zijn voor wijzigingen terwijl het model draait in de dynamische klem GUI ( Figuur 3). Dynamische klem stelt de experimentator in staat om kunstmatig elke geleiding of stroom in een neuron op te tellen (of af te trekken met een negatief of ) die de spanning en ionische afhankelijkheid van een reële geleiding of stroom nabootst. Het is dus mogelijk om volledig te onderzoeken hoe een bepaalde geleiding/stroom interageert met de endogene geleidingen/stromen in cellen(figuur 1). Het real-time HN-model geeft aan dat de persistente Na⁺ -stroom (I_P) in HN-neuronen een groot deel van de Na⁺ -vermelding sterk beïnvloedt [Na⁺]_i (Figuur 2) en dus _pompik. Omdat I_P actief is bij relatief negatieve membraanpotentiaalen, verzet het zich zelfs tijdens de IBI tegen ik_pomp.

Deze observaties geven aan dat het leerzaam is om interacties tussen en in geïsoleerde HN-neuronen met dynamische klem te onderzoeken zoals eerder besproken ^8,9,10. Deze experimenten (doorlopend) worden uitgevoerd met scherpe micro-elektrode-opnames in enkele, synaptisch geïsoleerde HN(7) neuronen (zevende ganglion afgesneden van de zenuwstreng). Tot op heden tonen deze experimenten aan dat robuuste barsten wordt hersteld in tonisch actieve HN-neuronen (als gevolg van micro-elektrodepenetratie geïntroduceerd lek) door gelijktijdige toevoeging van I_P en I pomp met dynamische klem (Figuur 4). Dit is een belangrijke observatie die aangeeft dat er een barstend mechanisme beschikbaar is in deze neuronen (zelfs wanneer het lek wordt aangetast) dat het gevolg is van de interactie van I_pomp en I_P. Voorlopige resultaten wijzen op hun sterke gecompliceerde interactie, die kan worden onderzocht in het model en experimenten (figuur 5).

Kortom, ik_pomp als reactie op periodieke verhogingen van [Na⁺]_i tijdens bursting-activiteit draagt bij aan het burst-ritme door burst-beëindiging (afnemende BD). De interactie van I_P en I_pomp vormt een mechanisme dat voldoende is om endogene barstactiviteit te ondersteunen; dit mechanisme kan robuuste bursting herstellen in HN-interneuronen die intracellulair zijn geregistreerd in ganglion 7. De interactie tussen I_P en I_pompt door [Na⁺]_i beïnvloedt de HN-burstperiode niet-monotoon en zorgt voor robuustheid van autonome bursting. Deze conclusies zijn in lijn met experimenten en modellering in gewervelde systemen^11,12.

Figuur 1: Bloedzuigerhart interneuron elektrische activiteit en implementatie van I_pomp en I_P met dynamische klem. (A) Normale bursting activiteit gelijktijdig geregistreerd, extracellulair (boven) en intracellulair (onder), in een bloedzuiger hartslag HCO van een derde ganglion, een schema van de geregistreerde neuronen en hun wederzijds remmende synaptische verbindingen rechts. B)Dynamisch klemschema bij registratie van een HN(7) interneuron in een geïsoleerd ganglion 7; merk op dat er geen synaptische interactie is tussen de twee HN(7) interneuronen. (Ci) Barsten in een lek-gecompromitteerde HN(7) interneuron. (Cii) Robuustere barsten kunnen worden geproduceerd door toevoeging van dynamische klem _I-pomp ( = 0,1 nA), die het door micro-elektrode geïnduceerde lek goedmaakt, maar de prikkelbaarheid onderdrukt, en (1 nS), wat de prikkelbaarheid verhoogt. Zwarte stippellijnen geven basislijnwaarden aan. Afkortingen: HN = heart interneuron; HCO = half-center oscillator; Ik_pomp = uitgaande stroom; I_P = persistent Na⁺ stroom; = maximale Na⁺/K⁺ pompstroom; = maximale geleiding van de persistente Na⁺ stroom; Vm = membraanpotentiaal; [Na⁺] _i = interne concentratie van Na⁺. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Enkel HN-interneuronmodel met sporen voor membraanpotentiaal (Vm), I _h, I_pomp,[Na⁺]_ien I_P. Uitgaande hyperpolariserende stromingen zijn negatief en inwaartse depolariserende stromingen zijn positief. Zwarte stippellijnen geven basislijnwaarden aan. Afkortingen: HN = heart interneuron; Ik_pomp = uitgaande stroom; I_P = persistent Na⁺ stroom; = maximale Na⁺/K⁺ pompstroom; I_h = hyperpolarisatie-geactiveerde inwaartse stroom; = maximale geleiding van de persistente Na⁺ stroom; = maximale geleiding van de door hyperpolarisatie geactiveerde inwaartse stroom; Vm = membraanpotentiaal; [Na⁺] _i = interne concentratie van Na⁺. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Grafische gebruikersinterface van real-time heart interneuron (HN) model en dynamische klem geïmplementeerd op een digitale signaalverwerkingskaart. Linksboven: Rode wiskundevakken zijn door de gebruiker bepaalde parametervakken voor het realtime model, terwijl Blauwe Live-vakken door de gebruiker bepaalde parametervakken zijn die in de dynamische klem worden gebruikt. El = de omkeerpotentiaal van de lekstroom; Gl = lekgeleiding; Gh = h-stroom maximale geleiding; Gp = P huidige maximale geleiding; GCaS = langzame calciumstroom maximale geleiding; PumpMax = pomp maximale stroom; [GSyn2 maximale synaptische geleiding naar het betreffende neuron; ThreshSyn2-piek overschrijdt de drempel voor het bemiddelen van een synaptisch potentieel - deze worden gebruikt om een hybride (levend / model) half-centrum oscillator te maken die hier niet wordt geïllustreerd.]. Linksonder voor Dynamische klem. Helemaal links staan 5 berekende waarden van dynamische klemvariabelen: I_pomp = pompstroom geïnjecteerd; Ih = h-stroom geïnjecteerd (hier niet gebruikt); IP = P stroom geïnjecteerd; NaI = berekende interne Na⁺ concentratie; ENa = berekend natriumomkeerpotentiaal. Linksonder voor Dynamische klem. Rechts van de berekende variabelen bevinden zich 6 door de gebruiker bepaalde parametervakken: GNa = verondersteld endogene snelle natrium maximale geleidingsgebruik om Na⁺ flux geassocieerd met actiepotentiaalen te berekenen; PumpMaxL = maximale pompstroom die door een dynamische klem moet worden geïnjecteerd; Naih zie vergelijking (2); Gh = maximale geleiding om de h-stroom te bepalen die door een dynamische klem moet worden geïnjecteerd; Gp = veronderstelde endogene P-stroom maximale geleidingsgebruik om Na⁺ flux geassocieerd met endogene P-stroom te berekenen; GpinHNLive = maximale geleiding om de P-stroom te bepalen die door een dynamische klem moet worden geïnjecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Dynamische klemanalyse van onafhankelijke HN(7) barsten. Upregulatie van (A) 4,0 nS tot (B) 9,0 nS vertraagt het onafhankelijke HN-burstritme. Experimentele sporen tonen ritmische barsten in geïsoleerd HN(7) neuron met dynamische klem. Het oscillatiebereik van [Na⁺]_i en Vm neemt toe met upregulated . Sporen van boven naar beneden: opgenomen Vm, geïnjecteerde I_pomp,berekend [Na⁺]_i, en geïnjecteerd I_P. Zwarte stippellijnen geven basislijnwaarden aan. Afkortingen: HN = heart interneuron; Ik_pomp = uitgaande stroom; I_P = persistent Na⁺ stroom; = maximale Na⁺/K⁺ pompstroom; = maximale geleiding van de persistente Na⁺ stroom; Vm = membraanpotentiaal; [Na⁺] _i = interne concentratie van Na⁺. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Dynamische klemanalyse van onafhankelijke HN(7) barsten. De opregulatie van de neiging om af te nemen, gevolgd door een verhoogde HN-burstperiode. In individuele experimenten (punten verbonden door lijnen) met behulp van dynamische klem, werden waarden geveegd terwijl ze constant werden gehouden. Kleuren vertegenwoordigen verschillende constante niveaus van toegevoegde die in verschillende experimenten worden gebruikt. Afkortingen: HN = heart interneuron; = maximale Na⁺/K⁺ pompstroom; = maximale geleiding van de persistente Na⁺ stroom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Modellering, dynamische klem en de resulterende analyses die ze mogelijk maken, zijn nuttige technieken om te onderzoeken hoe individuele en groepen ionische geleiding / stromen bijdragen aan de elektrische activiteit van neuronen(figuur 1, figuur 2,figuur 4en figuur 5). Het gebruik van deze technieken laat zien hoe de Na⁺/ K⁺ pompstroom(I-pomp)interageert met spannings-gated stromen, met name de persistente Na⁺ stroom (I_P), om robuuste barsten in de kern-HNs van de bloedzuigerhartslagpatroongenerator te bevorderen. Door dynamische klemexperimenten en modellering te combineren, is het mogelijk om modellen directer te testen dan mogelijk is met gewone spanningsregistratie en stroomklemtechnieken. De resultaten van de dynamische klemexperimenten (figuur 5) zullen worden gebruikt om het HN-model verder te verfijnen. De hier gedemonstreerde basismethode van dynamisch klemmen kan worden aangepast om de eigenschappen van elk neuron dat wordt bestudeerd weer te geven als een wiskundig model van neuronale stromen kan worden bepaald met spanningsklemexperimenten.

Succesvolle voltooiing van de experimenten van het hier getoonde type vereist een zorgvuldige impalement van een HN of ander neuron bij gebruik van een scherpe micro-elektrode, omdat sterke barsten wordt beperkt door elektrodepenetratie¹. (Whole-cell patch recording technieken, die geïntroduceerde lekkage minimaliseren, zijn ook van toepassing op andere neuronen, maar werken niet goed op bloedzuigerneuronen.) Het is van cruciaal belang dat de impalement van het HN-neuron minimale schade aan het neuron veroorzaakt (toegevoegd lek), en de ingangsweerstand moet worden bewaakt en moet in het bereik van 60-100 MOhms liggen voor succesvolle experimenten⁴.

Dynamische klem is een krachtige techniek, maar het heeft beperkingen opgelegd door neuronale geometrie omdat de kunstmatige geleidingen worden geïmplementeerd op de plaats van de opname-elektrode - meestal het cellichaam - niet op de plaats waar ritmegenererende stromen meestal worden gelokaliseerd^5,6,10. In bloedzuiger HN-neuronen bevindt het cellichaam zich elektrisch dicht bij de integratiezone (hoofdneuriet) van het neuron waar de meeste actieve stromen zijn gelokaliseerd en pieken worden geïnitieerd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANIMALS
Hirudo verbana	Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches		live leeches 2-3 grams
CHEMICALS
ARTIFICIAL POND WATER
CaCl2	Sigma Aldrich	C5670-100G	1.8 mM add last after adjusting pH
glucose	Sigma Aldrich	G7021-100G	10 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G	10 mM
Instant Ocean (sea salt )	Spectrum Brands Inc., Madison, WI		0.05% (w/v) diluted in deionized water
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	4 mM
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-250G	115 mM
NaOH 0.1 N Solution	Sigma Aldrich	2105-50ML	Adjust to pH 7.4 with NaOH
MICROELECTRODES
K Acetate	Sigma Aldrich	P1190-100G	2 M
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	20 mM
SALINE
EQUIPMENT
#5 Forceps	Fine Science Tools Dumont	11251-30 OR 11251-20	For general leech dissection
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer	Axon Instruments Molecular Devices	2A/2B	For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Black resin	Dow Sylguard	170	Lines general dissect dish
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter	A-M Systems	615000	For fabricating sharp microelectrodes
Clear resin	Dow Sylguard	184	Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy
Dark field condenser	Nikon	Dry 0.95-0.80 MBL 1210	For illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Digidata 1440A	Axon CNS Molecular Devices	1440A	Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Digital signal processing board	dSpace	CLP1104	Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9.
Falming/Brown Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-97	For fabricating sharp microelectrodes
Fiber-Lite high intensity illuminator	Dolan Jenner Industries	170D	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Headstage amplifier for AxoClamp 2A	Axon Instruments	HS-2A Gain:0.1LU	Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Light guide	Dolan Jenner Industries	Rev R 38 08 3729107	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-385	Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes
Micromanipulator controller	Sutter Instruments	MPC-200	Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes
Minuten pins	BioQuip	0.15 mm diameter 1208SA	Should be shortened by curtting to ~5 mm
Optical Breadboard 3' x 5' x 8"	Newport	Obsolete	With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Oscilloscope	HAMEG Instruments	HM303-6	To monitor electrode setteling during DCC
Pascheff-Wolff spring scissors	Moria		Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92
pClamp 9 Software	Axon Instruments	9	Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Pneumatic Isolators 28"	Newport	Obsolete	With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Simulink / MATLAB software	MathWorks	2006 (Obsolete)	Implements dynamic clamp on the digital signal processing board
Stereomicroscope	Wild	M5A	10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia
Steromicroscope	Wild	M5	20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	For general leech dissection