Вклад насоса Na⁺/ K⁺ в ритмическое разрывное лопание, исследованный с помощью моделирования и динамического анализа зажима

Summary

Здесь представлен метод исследования ролей насоса Na⁺/ K⁺ и постоянного тока Na⁺ в интернейронах сердца пиявки с использованием динамического зажима.

Abstract

Насос Na⁺/ K^+, часто считающийся фоновой функцией в нейронной активности, вносит внешний ток(I_насос),который реагирует на внутреннюю концентрацию Na⁺ ([Na⁺]_i). В разрывающихся нейронах, таких как те, которые находятся в нейронных сетях центрального генератора паттернов (CPG), которые производят ритмические движения, можно ожидать, что [Na⁺]_i и, следовательно,_насосI , будут изменяться на протяжении всего цикла всплеска. Эта реакция на электрическую активность в сочетании с независимостью от мембранного потенциала наделяет _{I насос} динамическими свойствами, не общими для токов на основе каналов (например, каналов с напряжением или передатчиком или протекающих каналов). Более того, во многих нейронах активность насоса модулируется различными модуляторами, что еще больше расширяет потенциальную роль _{I-насоса} в ритмической разрывной активности. В данной работе показано, как использовать комбинацию методов моделирования и динамического зажима для определения того, как я_{накачиваю} и его взаимодействие с постоянным Na⁺ током влияния ритмической активности в ЦПГ. В частности, в этой статье основное внимание будет уделено протоколу динамического зажима и методам вычислительного моделирования в интернейронах сердца лекарственных пиявок.

Introduction

Сердцебиение у пиявок управляется CPG, состоящим из 9 двусторонних пар сердечных интернейронов (HNs), распределенных по столько же сегментарных ганглиев среднего тела. В ядре ЦПГ находятся взаимно тормозные пары интернейронов, расположенных в^3-м и 4-м сегментаральных^{ганглиях,} образующих полуцентровые осцилляторы (ГКО)(рисунок 1А). Эти нейроны продолжают лопаться при синаптически изолировании фармакологически с использованием бикукулина^1. Другие, такие как пара в^7-х сегментных ганглиях (фокус этого протокола), также являются разрывными, способными производить разрывную активность при синаптически изолированном. Они не связаны друг сном и получают только нисходящий вход, и поэтому легко изолируются путем разрыва ганглия от остальной части нервного кана. Эта независимая разрывная активность чувствительна к введению тока утечки, вызванного проникновением с острыми микроэлектродами для записи, но энергично лопается при регистрации методами рыхлого пластыря^1.

Были смоделированы как отдельные нейроны HN, так и HN HCP (модели одного изопотенциального компартмента нейронов HN на основе Ходжкина-Хаксли, содержащие все экспериментально идентифицированные напряжения и синаптические токи), и все характеристики всплеска живой системы были успешно захвачены^2. Миомодулин, эндогенный нейропептид у пиявок, заметно уменьшает период (Т) ритма разрыва изолированных нейронов HN и HN HPO. Этот модулятор действует для увеличения h-тока (гиперполяризационный активируемый внутренний ток, I_ч)и для уменьшения I_насоса^3. Это наблюдение привело к исследованию того, как I_pump взаимодействует с I_h,и как их комодуляция способствует ритмической активности нейронов HN. Активация насоса путем увеличения [Na⁺]_i (с использованием моненсина ионофора) ускоряет ритм всплеска HN как в HN HCP, так и в изолированных нейронах HN^4. Это ускорение зависело от I_ч. Когда I_ч блокировался (2 мМ^Cs+),период разрыва не изменялся этим методом активации насоса; однако продолжительность всплеска (BD) была сокращена, а интервал между вспышками (IBI) увеличился как в HN HCP, так и в изолированных нейронах HN^4.

Для этого протокола все токи живого нейрона HN(7), включая ток насоса, I_насос,включаются в модель HN следующим образом:

(1)

где C — емкость мембраны (в nF), V — мембранный потенциал (в V), t — время (в s). Подробные описания и уравнения ионных токов были описаны в других местах^2,4. Полная модель нейрона модели HN работает в режиме реальноговремени (рисунок 2). Программное обеспечение будет доступно на GitHub после публикации и будет подходить для работы на плате цифровой обработки сигналов,описанной в Таблице материалов. Здесь в центре внимания находится ток насоса Na⁺/ K⁺ (насосI)и токи с напряжением, способствующие значительному потоку Na^+: быстрый ток Na⁺ (I_Na)и постоянный Ток Na⁺ (I_P). Максимальные проводимости этих токов соответственно. Насос Na⁺/ K⁺ обменивает три внутриклеточных иона Na⁺ на два внеклеточных K⁺ иона, тем самым производя чистый внешний ток. Важно отметить, что он выкачивает в 3 раза больше Na⁺ из нейрона, чем указывает этот ток, что важно для расчета внутриклеточной концентрации Na^+.

Ток насоса ^Na+/K+зависит от внутриклеточных концентраций^Na+ и выражается следующей сигмоидальной функцией:

(2)

где [Na]_i — внутриклеточная концентрация Na^+, — максимальный ток насоса Na⁺/K^+, [Na]_ih — внутриклеточная концентрация Na⁺ для полуактивации насоса Na⁺/K^+, а [Na]_— чувствительность насоса Na⁺/K⁺ к [Na]_i. [Na]_i строится в результате притоков Na^+, переносимых I_P и I_Na, и уменьшается Na⁺ оттоком Na⁺/ K⁺ насоса. Вклад I_h и I_Leak в общий поток^Na+ невелик и не учитывается в модели реального времени.

(3)

где, v — объем (~6,7 пЛ) внутриклеточного^Na+ резервуара, F — постоянная Фарадея, а внеклеточная концентрация Na⁺ поддерживается постоянной.

Дифференцированы проводимость с напряжением и утечкой - они реагируют на мембранный потенциал - от тока насоса, который регулируется расчетной внутриклеточной концентрацией Na⁺ ([Na⁺]_i). [На⁺] _i строится через вход Na⁺ через быстрый ток Na⁺ (I_Na),который производит потенциалы действия (пики) и постоянный Ток Na⁺ (I_P),который обеспечивает деполяризацию для поддержки всплеска. [На⁺] _i, в свою очередь, уменьшается под действием насоса через экструзию^Na+. Были приняты исходные значения HN (5nS) и (150 nS), и мы учитываем любой добавленный динамический зажим.

Цель протокола, описанного здесь, состоит в том, чтобы манипулировать _{I насосом} точно и обратимо в режиме реального времени, чтобы обнаружить, как он взаимодействует с токами с напряжением (постоянный ток Na⁺ в текущем протоколе) для управления ритмическим разрывом в одиночных ХН. Для достижения этой цели был использован динамический зажим, который искусственно вводит по команде точное количество любого тока, который может быть рассчитан по мере работы модели. Этот метод имеет преимущества перед фармакологическими манипуляциями с насосом, который влияет на всю ткань, может иметь нецелевые эффекты, которые часто трудно обратить вспять, и которыми нельзя точно манипулировать. Динамический зажим^5,6 считывает напряжение записанного нейрона в режиме реальноговремени (рисунок 1B)и вычисляет и вводит в режиме реального^{времени} величину любого тока на основе модельных уравнений и заданных значений любого или . Подобные методы могут быть легко применены к любому нейрону, который может быть записан внутриклеточным способом. Однако параметры должны быть перемасштабированы до выбранного нейрона, и нейрон должен быть изолирован от синаптических входов, например, фармакологически.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Предметы экспериментального исследования беспозвоночных животных не регулируются NIH или Университетами штата Эмори и Джорджия. Тем не менее, были приняты все меры, чтобы свести к минимуму страдания пиявок, используемых в этой работе.

1. Подготовьте изолированный ганглий 7 из пиявочного нервного канапа

1. Выдерживайте пиявок Hirudo verbana в искусственной воде пруда (содержащей 0,05% мас./об.морской соли), разбавленной в деионизированной воде при 16 °C в светло-темном цикле 12:12.
2. Подготовьте пиявок к рассечению, обезболив их холодным обезболиванием в ложе измельченного льда в течение >10 мин до неподвижности.
3. Наполните черную, покрытую смолой рассекающую посуду на глубину ~1 см охлажденным физиологическим раствором, содержащим 115 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1,7 мМ CaCl_2,10 мМ D-глюкозы и 10 мМ HEPES в деионизированной воде; pH скорректирован до 7,4 с 1 M NaOH. Приколоть дорсальную сторону пиявки вверх в камере, выстленной черной смолой (не менее 20 см х 10 см с глубиной не менее 2 см над смолой толщиной не менее 2 см).
4. Под стеромикроскопом при 20-кратном увеличении с косой подсветкой световода сделайте продольный разрез длиной не менее 3 см пружинными ножницами 5 мм через стенку тела в ростральной^1/3-й части тела. Используйте булавки, чтобы оттянуть в сторону стенку тела и обнажить внутренние органы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любая хранящаяся кровяная мука может быть удалена путем всасывания с помощью огнеполированной пипетки Пастера.
5. Выделяют отдельный ганглий среднего тела 7 (седьмой свободный сегментарный ганглий каудального к мозгу).
   1. Откройте синус, в котором находится нервный шнур, с помощью пружинных ножниц 5 мм. Обязательно разделите синус дорсально и вентрально, оставив две полоски пазухи. Используйте острые щипцы No 5, чтобы помочь направить реза и удерживать пазуху.
   2. Держите синус прикрепленным к каждому из двух двусторонних нервных корешков, которые выходят из ганглия (он плотно прилипает к каждому корню), чтобы использовать эти полоски синуса для закрепления ганглия.
   3. Удалите ганглий из тела, разрезав ростральные и каудальные соединительные нервные пучки, которые связывают ганглии (как можно дальше от^{7-го ганглия)} и полоски пазух, а затем срежьте корни сбоку туда, где они выходят из пазухи.
6. Закрепите ганглий (используя старые притупленные щипцы No 5) укороченными булавками насекомых, вентральной стороной вверх, в прозрачных, покрытых смолой чашках Петри. Вставьте булавки в полоски пазух и рыхлой ткани, прилипшие к корням и ростральным и каудальным соединениям, как можно дальше от ганглия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смола должна быть не толще 3 мм, если во время записи должно быть достигнуто хорошее освещение снизу. Убедитесь, что ганглий подтянут, как продольно, так и с боковой стороны
7. Увеличьте увеличение стереомикроскопа до 40x или более и отрегулируйте косую освещенность, чтобы тела нейронных клеток можно было легко увидеть на вентральной поверхности ганглия чуть ниже периневриума.
8. Удалите периневрию ганглия (дешину) микроцизисторами.
   1. Начните дешейтинг, разрезав свободную оболочку между корнями с одной стороны, и продолжайте разрез сбоку с другой стороны, следя за тем, чтобы лезвия ножниц были поверхностными и не повредили тела нейронных клеток непосредственно под оболочкой.
   2. Сделайте аналогичный поверхностный срез каудально из бокового разреза вдоль средней линии.
   3. Теперь возьмите каудолатеральный лоскут оболочки с одной стороны с помощью тонких щипцов No 5, оттяните его от ганглия и отрежьте его микроциссорами.
   4. Повторите на другой стороне; эта процедура подвергает оба нейрона HN(7) для записи с помощью микроэлектродов.
9. Поместите блюдо для приготовления в регистривную установку и налейте физиологическим раствором со скоростью потока 5 мл/мин при комнатной температуре.

2. Идентификация и запись интернейронов сердца пиявки с острыми микроэлектродами

1. В течение всего времени записи нейрона HN(7) (записи длятся от 30 до 60 мин) приобретайте и оцифровывайте внутриклеточные следы тока и напряжения от выборки нейрофизиологического электрометра со скоростью 5 кГц с помощью цифровой системы сбора данных (Analog to Digital, A to D) и стимуляции (Digital to Analog, D to A), и отображение на экране компьютера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора данных можно использовать любое коммерческое или специально созданное программное обеспечение и плату A-D/D to A (от A до D). Для динамического зажима требуется от D до A и специально созданное программное обеспечение.
2. Под стеромикроскопом в 50-100x с подсветкой темного поля снизу предварительно идентифицируют нейрон HN(7) двусторонней пары по его каноническому расположению в заднеполостном положении в среднем ганглиозе седьмого тела.
3. Теперь стремитесь проникнуть в мнимый нейрон HN(7) с помощью острого микроэлектрода, заполненного 2 М ацетата калия и 20 мМ KCl с помощью микроманипулятора.
   1. Поместите микроэлектрод очень близко к телу клетки-мишени.
   2. Непрерывно наблюдайте зарегистрированный потенциал с помощью электрометра и устанавливайте этот потенциал на ноль мВ перед проникновением в нейрон.
   3. Проникайте в нейрон с помощью микроэлектрода, медленно приводя электрод вдоль его длинной оси с манипулятором. С помощью функции жужжания электрометра установите продолжительность гудение 100 мс до тех пор, пока не будет наблюдаться отрицательный сдвиг мембранного потенциала и активная пиковая активность.
4. Установите электрометр в прерывистый режим тока-зажима (DCC) ≥ 3 кГц для одновременной регистрации мембранного потенциала и пропуска тока с помощью одного микроэлектрода (компенсация емкости установлена чуть ниже звонка, а затем набирается обратно 10%).
   1. Следите за оседанием электрода во время DCC на осциллографе.
   2. Впрыскивайте постоянный ток -0,1 нА с помощью инжектора постоянного тока электрометра в течение минуты или двух для стабилизации записи.
5. Окончательно идентифицировать нейрон HN(7) по характерной форме шипа и слабой расщеливающей активности(рисунок 1Ci).
6. После завершения эксперимента выполните анализ данных в автономном режиме и сохраните все данные на диске.

3. Постройте HN в реальном времени или другой модельный нейрон

1. Создание пользовательского программного обеспечения с использованием платы цифровой обработки сигналов (DSB; D к A и от A до D) в настольного компьютера для реализации в режиме реального времени модельных^токов,описанных в^2,4 или различных модельных токах для других нейронов или экспериментов.
   1. Используйте уравнения в стиле Ходжкина-Хаксли, поскольку они являются обычно предпочтительным методом представления течений модели.
   2. Смотрите⁷ для подробного описания реализации модели HN в реальном времени и динамического зажима до добавления тока насоса. Обратитесь к разделу введения для описания токов, внутриклеточной концентрации^Na+ и проводимости живого нейрона HN(7) в модели HN.

4. Реализуйте и изменяйте динамические проводки/токи зажима

1. Используйте специально созданное программное обеспечение динамического зажима для DSB для реализации и изменения в реальном времени динамического зажима любого графического пользовательского интерфейса(рисунок 3)(GUI) - доступные, запрограммированная проводимость и токи модели HN в реальном времени нейрона HN(7).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Напоминаем и максимальной проводимостью постоянного тока^Na+ (I_P)и максимального тока насоса(I_pump)соответственно.
2. Используйте поля ввода графического интерфейса в программном обеспечении для внесения изменений по мере работы модели в (pumpMaxL box) и (GpinHNLive box)(рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поля ввода графического интерфейса принимают типированные значения, и шаги 0,1 нА рекомендуются для .
   1. Добавьте небольшое количество и с динамическим зажимом для стабилизации разрыва нейрона HN(7), который ослабляется утечкой, вызванной микроэлектродами, как показано на рисунке 1Cii.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резкое проникновение микроэлектрода вызывает повреждение мембраны, которое выражается в увеличении проводимости утечки или снижении входного сопротивления.
   2. Начните с добавления значения 0,1-0,2 нА, которое компенсирует утечку, вызванную микроэлектродами, но угнетает возбудимость, а затем постепенно увеличивается, что увеличивает возбудимость, пока не последует регулярный разрыв, обычно при ~1-4 нс(рисунок 4А).
3. Систематически совместно изменять эти токи (приращения 0,1 нА для и 1 нс для) к зарегистрированным нейронам HN(7) с динамическим зажимом(рисунок 3)и оценивать их влияние на характеристики всплеска: частоту всплеска (f: обратную от среднего межшпийкового интервала во время всплеска), интервал межрыва (IBI: время между последним всплеском в одном всплеске до первого всплеска в следующем всплеске), длительность всплеска (BD: время между первым всплеском в всплеске и последним всплеском в всплеске) и период всплеска (T: время между первым всплеском в всплеске и первым всплеском в последующем всплеске).
   1. Измените значения и, как в видео-демонстрации, чтобы ознакомиться с техникой, а затем рискнуть выйти.
      1. Удерживайте при определенном фиксированном значении и развертывание с шагом 1 нс в диапазоне поддерживающих регулярную активность разрыва.
      2. Теперь увеличьте фиксированное значение на 0,1 нА и снова размахнуйте диапазон поддерживающей регулярной разрывной активности.
      3. Для каждой реализованной пары параметров соберите данные, содержащие не менее 8 всплесков, чтобы можно было сделать надежные средние измерения f, IBI, BD и T.
      4. Продолжайте развертки до тех пор, пока нейрон остается жизнеспособным, что оценивается сильным всплеском и стабильным базовым потенциалом колебаний.
      5. Соберите данные с нескольких нейронов (от разных животных) для создания составного графа(рисунок 5).

Representative Results

Моделирование с добавлением _насоса^{I 4} привело экспериментальные результаты, представленные во вводном разделе, в более четкий фокус и начало объяснять насосный механизм разрыва. Модель реального времени, продемонстрированная здесь, была настроена (и выбраны параметры) таким образом, что она производит регулярную ритмическую активность, попадающую в пределы нормальной активности, наблюдаемой в экспериментах - f, IBI, BD, T - и продолжает производить такую активность, когда параметры, модулированные миомодулином (максимальный ток насоса) и (максимальная проводимость h-тока), варьируются или колеблируются в модели. Заданные значения параметров могут быть использованы в качестве эталонного или канонического набора для экспериментов по моделированию. В этих модельных случаях _насос I колеблется на протяжении всего цикла всплеска как [Na⁺]_i вокруг базового уровня. I_насос способствует прекращению разрыва во время фазы разрыва, а гиперполяризация, которую он производит, активирует I_h во время IBI; Обратите внимание на максимальный уровень I_h вблизи инициации всплеска(рисунок 2).

Хотя в модели HN в реальном времени реализованы все токи^2,4, доступные для динамического зажима, акцент здесь был сделан на и , которые доступны для изменений, пока модель работает в динамическом зажиме GUI(рисунок 3). Динамический зажим позволяет экспериментатору искусственно добавлять (или вычитать с отрицательным или) любую проводимость или ток в нейрон, который имитирует напряжение и ионную зависимость реальной проводимости или тока. Таким образом, можно полностью исследовать, как конкретная проводимость/ток взаимодействует с эндогенными проводимостями/токами внутри клеток(рисунок 1). Модель HN в реальном времени показывает, что постоянный ток Na⁺ (I_P)в нейронах HN вносит большую часть записи Na^+, сильно влияющей на [Na⁺]_i (рисунок 2)и, таким образом, _{накачку}I. Поскольку I_P активен при относительно отрицательных мембранных потенциалах, он противостоит I_pump даже во время IBI.

Эти наблюдения показывают, что поучительно исследовать взаимодействия между и в изолированных нейронах HN с динамическим зажимом, как обсуждалось^{ранее 8,9,10.} Эти эксперименты (продолжаются) проводятся с резкими микроэлектродными записями в одиночных, синаптически изолированных нейронах HN(7) (седьмой ганглий, оторванный от нервного канатика). На сегодняшний день эти эксперименты показывают, что надежное расщепление восстанавливается в тонально активных нейронах HN (за счет введенной утечки проникновения микроэлектрода) путем совместного добавления _насоса I_P и I с динамическим зажимом(рисунок 4). Это важное наблюдение, указывающее на то, что в этих нейронах доступен механизм разрыва (даже когда утечка скомпрометирована), который является результатом взаимодействия насоса I и I_P. Предварительные результаты указывают на их сильное сложное взаимодействие, которое может быть исследовано в модели и экспериментах(рисунок 5).

В заключение, I_насос в ответ на периодическое увеличение [Na⁺]_i во время разрывной активности способствует ритму разрыва через прекращение разрыва (уменьшение BD). Взаимодействие _насоса I_P и I представляет собой механизм, достаточный для поддержания эндогенной разрывной активности; этот механизм может восстановить устойчивый разрыв в интернейронах HN, зарегистрированных внутриклеточным образом в ганглии 7. Взаимодействие между I_P и I_pump через [Na⁺]_i влияет на период разрыва HN немонотонно и обеспечивает устойчивость автономного разрыва. Эти выводы соответствуют экспериментам и моделированию в системах позвоночных^11,12.

Рисунок 1:Электрическая активность интернейрона сердца пиявки и реализация I_насоса и I_P с динамическим зажимом. (А)Нормальная разрывная активность регистрируется одновременно, внеклеточно (сверху) и внутриклеточно (снизу), в пиявке сердцебиение HCO из третьего ганглия, схема зарегистрированных нейронов и их взаимно тормозных синаптических связей справа. (B)Схема динамического зажима при регистрации интернейрона HN(7) в изолированном ганглии 7; обратите внимание, что нет синаптического взаимодействия между двумя интернейронами HN(7). (Ci) Разрыв в герметичном интернейроне HN(7). (Сii) Более прочное разрывное щелчок может быть произведено путем добавления динамического зажима I_насоса (= 0,1 нА), который компенсирует утечку, вызванную микроэлектродами, но снижает возбудимость, и (1 нс), что повышает возбудимость. Черные пунктирные линии обозначают базовые значения. Сокращения: HN = интернейрон сердца; HCO = полуцентровый осциллятор; I_насос = внешний ток; I_P = постоянный Na⁺ ток; = максимальный Na⁺/K⁺ ток насоса; = максимальная проводимость постоянного Na⁺ тока; Vm = мембранный потенциал; [На⁺] _i = внутренняя концентрация Na⁺. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Модель одного интернейрона HN, показывающая следы мембранного потенциала (Vm), I _h, I_{насоса,}[Na⁺]_iи I_P. Внешние гиперполяризующие токи отрицательны, а внутренние деполяризующие токи положительны. Черные пунктирные линии обозначают базовые значения. Сокращения: HN = интернейрон сердца; I_насос = внешний ток; I_P = постоянный Na⁺ ток; = максимальный Na⁺/K⁺ ток насоса; I_h = активируемый гиперполяризацией внутренний ток; = максимальная проводимость постоянного Na⁺ тока; = максимальная проводимость гиперполяризационного активированного внутрь тока; Vm = мембранный потенциал; [На⁺] _i = внутренняя концентрация Na⁺. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Графический пользовательский интерфейс модели интернейрона сердца в реальном времени (HN) и динамического зажима, реализованный на плате цифровой обработки сигналов. Верхний левый: Красные математические поля - это определяемые пользователем поля параметров для модели реального времени, тогда как синие живые поля - это определяемые пользователем поля параметров, используемые в динамическом зажиме. El = потенциал разворота тока утечки; Gl = проводимость утечки; Gh = максимальная проводимость h-тока; Gp = максимальная проводимость тока P; GCaS = максимальная проводимость тока медленного кальция; PumpMax = максимальный ток насоса; [GSyn2 максимальная синаптическая проводимость к соответствующему нейрону; Порог пересечения всплеска ThreshSyn2 для опосредования синаптического потенциала - они используются для создания гибридного (живого/модельного) полуцентрового осциллятора, не проиллюстрированные здесь.]. Внизу слева для динамического зажима. В самом левом углу находятся 5 вычисляемых значений динамических переменных зажима: I_pump = ток насоса, впрыскиваемый; Ih = h-ток впрыскивается (здесь не используется); IP = потребляемый ток P; NaI = расчетная внутренняя Na⁺ концентрация; ENa = расчетный потенциал обращения натрия. Внизу слева для динамического зажима. Справа от вычисляемых переменных находятся 6 определяемых пользователем поля параметров: GNa = предполагаемое использование эндогенной быстрой максимальной проводимости натрия для расчета Na⁺ потока, связанного с потенциалами действия; PumpMaxL = максимальный ток насоса, впрыскиваемый динамическим зажимом; Найх см. уравнение (2); Gh = максимальная проводимость для определения h-тока, впрыскиваемого динамическим зажимом; Gp = предполагаемое использование максимальной проводимости эндогенного P-тока для расчета^Na+ потока, связанного с эндогенным током P; GpinHNLive = максимальная проводимость для определения тока P, который должен быть введен динамическим зажимом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Динамический анализ зажима независимого разрыва HN(7). Апрегуляция от(A)4,0 нС до(В)9,0 нС замедляет независимый ритм всплеска HN. Экспериментальные следы показывают ритмичное разрыв в изолированном нейроне HN(7) с динамическим зажимом. Диапазоны колебаний [Na⁺]_i и Vm увеличиваются с повышением . Следы сверху вниз: записан Vm, впрыскивается I_насос,вычисляется [Na⁺]_i, и впрыскивается I_P. Черные пунктирные линии обозначают базовые значения. Сокращения: HN = интернейрон сердца; I_насос = внешний ток; I_P = постоянный Na⁺ ток; = максимальный Na⁺/K⁺ ток насоса; = максимальная проводимость постоянного Na⁺ тока; Vm = мембранный потенциал; [На⁺] _i = внутренняя концентрация Na⁺. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5:Динамический анализ зажима независимого разрыва HN(7). Повышение регуляции имеет тенденцию к снижению, за которым следует увеличение периода всплеска HN. В отдельных экспериментах (точках, соединенных линиями) с использованием динамического зажима значения были смещены, в то время как удерживались постоянными. Цвета представляют различные постоянные уровни добавленного, используемые в разных экспериментах. Сокращения: HN = интернейрон сердца; = максимальный Na⁺/K⁺ ток насоса; = максимальная проводимость постоянного Na⁺ тока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Моделирование, динамический зажим и результирующий анализ, который они позволяют, являются полезными методами для изучения того, как отдельные и группы ионной проводимости / токов способствуют электрической активности нейронов(рисунок 1, рисунок 2,рисунок 4и рисунок 5). Использование этих методов показывает, как ток насоса Na⁺/ K⁺ _(насосI)взаимодействует с токами с напряжением, особенно постоянным током Na⁺ (I_P),чтобы способствовать надежному разрыву в сердечнике генератора сердцебиения пиявки. Комбинируя эксперименты с динамическими зажимами и моделирование, можно тестировать модели более непосредственно, чем это возможно с помощью обычных методов регистрации напряжения и тока. Результаты, полученные в ходе экспериментов с динамическим зажимом(рисунок 5), будутиспользованы для дальнейшего уточнения модели HN. Основной метод динамического зажима, продемонстрированный здесь, может быть настроен для отражения свойств любого изучаемого нейрона, если математическая модель нейронных токов может быть определена с помощью экспериментов с зажимом напряжения.

Успешное завершение экспериментов показанного здесь типа требует тщательного прокалывания HN или другого нейрона при использовании острого микроэлектрода, поскольку сильное расщепление ограничивается проникновением электрода^1. (Методы записи цельноклеточных патчей, которые минимизируют вводимую утечку, также применимы к другим нейронам, но не очень хорошо работают на нейронах пиявки.) Крайне важно, чтобы прокалывание нейрона HN нанесло минимальный ущерб нейрону (добавленная утечка), а входное сопротивление должно контролироваться и должно быть в диапазоне 60-100 МОм для успешных экспериментов^4.

Динамический зажим является мощным методом, но он имеет ограничения, налагаемые геометрией^{нейронов,}потому что искусственные проводимости реализуются в месте регистрирующего электрода - обычно тела клетки - а не в месте, где ритм-генерирующие токи обычно локализованы^5,6,10. В нейронах HN пиявки тело клетки электрически близко к зоне интеграции (главному нейриту) нейрона, где локализуется наиболее активные токи и инициируются шипы.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANIMALS
Hirudo verbana	Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches		live leeches 2-3 grams
CHEMICALS
ARTIFICIAL POND WATER
CaCl2	Sigma Aldrich	C5670-100G	1.8 mM add last after adjusting pH
glucose	Sigma Aldrich	G7021-100G	10 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G	10 mM
Instant Ocean (sea salt )	Spectrum Brands Inc., Madison, WI		0.05% (w/v) diluted in deionized water
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	4 mM
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-250G	115 mM
NaOH 0.1 N Solution	Sigma Aldrich	2105-50ML	Adjust to pH 7.4 with NaOH
MICROELECTRODES
K Acetate	Sigma Aldrich	P1190-100G	2 M
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	20 mM
SALINE
EQUIPMENT
#5 Forceps	Fine Science Tools Dumont	11251-30 OR 11251-20	For general leech dissection
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer	Axon Instruments Molecular Devices	2A/2B	For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Black resin	Dow Sylguard	170	Lines general dissect dish
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter	A-M Systems	615000	For fabricating sharp microelectrodes
Clear resin	Dow Sylguard	184	Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy
Dark field condenser	Nikon	Dry 0.95-0.80 MBL 1210	For illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Digidata 1440A	Axon CNS Molecular Devices	1440A	Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Digital signal processing board	dSpace	CLP1104	Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9.
Falming/Brown Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-97	For fabricating sharp microelectrodes
Fiber-Lite high intensity illuminator	Dolan Jenner Industries	170D	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Headstage amplifier for AxoClamp 2A	Axon Instruments	HS-2A Gain:0.1LU	Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp
Light guide	Dolan Jenner Industries	Rev R 38 08 3729107	For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-385	Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes
Micromanipulator controller	Sutter Instruments	MPC-200	Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes
Minuten pins	BioQuip	0.15 mm diameter 1208SA	Should be shortened by curtting to ~5 mm
Optical Breadboard 3' x 5' x 8"	Newport	Obsolete	With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Oscilloscope	HAMEG Instruments	HM303-6	To monitor electrode setteling during DCC
Pascheff-Wolff spring scissors	Moria		Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92
pClamp 9 Software	Axon Instruments	9	Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology
Pneumatic Isolators 28"	Newport	Obsolete	With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology
Simulink / MATLAB software	MathWorks	2006 (Obsolete)	Implements dynamic clamp on the digital signal processing board
Stereomicroscope	Wild	M5A	10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia
Steromicroscope	Wild	M5	20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	91500-09	For general leech dissection